专利名称：一种油菜叶片乙酰乳酸合成酶活力快速检测方法
技术领域：
本发明涉及油菜检测领域，尤其涉及一种油菜叶片乙酰乳酸合成酶活力快速检测 方法。
背景技术：
油菜是我国主要的油料作物和蜜源作物之一，油菜的种植面积占全国油料作物总 面积的40%以上，产量占全国食用植物油总产量的60%以上，居世界首位。油菜不同时期 的生长状况影响到油菜籽的产量和质量。油菜叶片中的乙酰乳酸合成酶(Acetolactate synthase, ALS)的活力是油菜生长过程中一项非常重要的生理指标。ALS能够反映油菜叶 片的生长状况，因此可以通过检测油菜叶片中的ALS，得到油菜的生长状况。近年来，由于农 村劳动力的减少，油菜种植中使用了大量的除草剂。有些除草剂是一种ALS抑制剂，例如丙 酯草醚，可以阻止直链氨基酸的生物合成，具有对油菜安全、杀草谱较广、除草活性高、持效 期长，且低毒、低残留，与环境相容等特点。对油菜叶片中ALS活力的检测，可以反映出某些 除草剂对油菜生长状况的影响，对实现油菜生长状况的大田检测和连续监测，提高油菜籽 的产量和质量有重要意义。传统的乙酰乳酸合成酶(ALS)检测方法，需将油菜叶片离体采回，在实验室进 行破坏性的试验。剪取油菜叶片，称量，剪碎，加人液氮速冻样品，研磨成粉末状。再按 1 2(mL)比例加入提取缓冲液，充分研磨后，浸提过滤出粗酶液，待用。整个提取过程 在-4°C的低温冰浴条件下进行。1. OmL酶促反应缓冲液中加入ALS粗酶液0. 5mL，立即置于 37°C恒温水槽中启动反应，水浴Ih后加入0. ImL的3mol/L浓硫酸溶液终止反应(空白对 照试管在反应前加浓硫酸)；将待测液置于60°C的恒温水浴槽中脱羧反应15min ；再顺次加 人0.5%肌酸和5% α-萘酚的10% NaOH溶液各l.OmL，置于60°C的恒温水浴槽中显色反 应15min。取出后，冷却至室温，5000g离心IOmin ；上清液用紫外分光光度仪在530nm波长 下测定其吸光度，得到ALS活力，单位用(0D53CI/g Fff/h)表示。该方法测量过程费时、费力、 化学消耗品昂贵，且对环境造成一定污染。因此，急需研究一种简单、快速、无损的ALS检测 方法和技术。可见/近红外光谱可以反映物质内部的有机成分，特别是C-H、0-H、N-H等基团的 倍频和合频吸收，可用于定量测定物质有机物质的含量。光谱技术已广泛应用于农业、食 品、石油化工、制药、饲料等行业。在植物生命信息快速检测研究中具有广泛的应用潜力。
发明内容
本发明提供了一种油菜叶片乙酰乳酸合成酶活力快速检测方法，解决了现有检测 方法费时、费力、操作复杂、成本高、污染环境等问题。一种油菜叶片乙酰乳酸合成酶活力快速检测方法，包括以下步骤(1)将油菜叶片杀青、烘干后粉碎，得到叶片粉末；(2)分别采集波长 2366nm、1494nm、1776nm、1730nm、2292nm、1424nm、1528nm、2432nm、2266nm、1676nm、1190nm、1346nm、1400nm、2106nm 和 2052nm 光波所对应的叶片粉末
的反射率；(3)将各反射率分别代入多元线性回归方程y = 10100λ1+10890λ 2+11830 λ3-6870 λ 4-8123 λ 5-6991 λ 6-9756 λ 7-4364 λ 8+1123 λ 9-360· 601 λ 1(ι+4608 λ η-5178 λ 12+2310 λ 13-2548 λ 14+3639 λ 15+99. 385，计算得到油菜叶片乙酰乳酸合成酶活力；方程中y为油菜叶片乙酰乳酸合成酶活力；A1 λ15分别为波长2366nm、 1494nm、1776nm、1730nm、2292nm、1424nm、1528nm、2432nm、2266nm、1676nm、1190nm、1346nm、 1400nm、2106nm和2052nm光波所对应的油菜叶片粉末样本的反射率。步骤(1)中，叶片粉末为40 80目，杀青温度为95 115°C，杀青时间为20 40min。该杀青温度和杀青时间较为适宜，有利于油菜叶片中主成分的保留，特别是乙酰乳 酸合成酶。步骤(1)中，烘干温度为70 90°C，将叶片烘干至恒重，该烘干温度适宜，不会 烤焦叶片。因为油菜叶片粉末样本是非透明介质，当光波照射在其表面时，除部分被吸收外， 其余均发生反射，而光波吸收的多少(或者反射率)是跟油菜叶片内部化学物质含量是相 关的，而针对乙酰乳酸合成酶这类具体物质的活力仅仅跟少数某些特征波长光波的反射率 相关。应用连续投影算法在1100 2500nm波长范围内进行特征波长的选取，得到这些 特征波长分别为 2366nm、1494nm、1776nm、1730nm、2292nm、1424nm、1528nm、2432nm、2266nm、 1676nm、1190nm、1346nm、1400nm、2106nm和2052nm。将上述波长的反射率值作为多元线性
回归模型的输入变量，乙酰乳酸合成酶活力作为输出变量，计算得到上述多元线性回归方程。本发明通过少数特征波长进行多元线性回归分析，快速准确检测油菜叶片中乙酰 乳酸合成酶活力，大大缩短了检测的时间，减少了环境污染，降低了检测成本。
图1为本发明建模集样本预测结果散点分布图；图2为本发明预测集样本预测结果散点分布图。
具体实施例方式随机收集248片油菜叶片，为使所采集的油菜叶片样本更具有代表性和多样性， 所采集的248片叶片中不仅包括正常生长状态下的油菜叶片(共62片)，还包括喷施过不 同浓度(100，500，1000mg/L)丙酯草醚除草剂的油菜叶片186片(100，500，1000mg/L每个 浓度梯度采集油菜叶片62片)，喷洒时间为五叶一心期，喷洒方式为叶面喷施。丙酯草醚除 草剂是一种ALS抑制剂，对油菜叶片ALS具有抑制作用，可以使油菜叶片中的ALS含量具有 更大的范围，使得所建模型具有更好的适应性和鲁棒性。将248片油菜叶片放在105°C的烘箱中杀青30分钟后于80°C下烘干至恒重。再 用研钵将烘干后的油菜叶片样品磨成粉末，并过60目筛。在室温下测定油菜叶片粉末样本 在波长 2366nm、1494nm、1776nm、1730nm、2292nm、1424nm、1528nm、2432nm、2266nm、1676nm、 1190nm、1346nm、1400nm、2106nm 和 2052nm 处的反射率值(Foss NIR Systems 5000)，然后随机选择186个油菜叶片样本作为建模集样本，其余62个作为预测集样本，利用背景技术 所提及的传统方法测量上述248片油菜叶的乙酰乳酸合成酶活力。以建模集样本186片油 菜叶片的各特征波长反射率值作为输入变量，以相应的乙酰乳酸合成酶活力测量值作为输 出变量，利用多元线性回归法(Multiple linear regression,MLR)得到如下多元线性回归 方程y = 10100 λ !+10890 λ 2+11830 λ 3_6870 λ 4_8123 λ 5_6991 λ 6_9756 λ 厂4364 λ 8+11 23 λ 9-360· 601 λ 1(ι+4608 λ η-5178 λ 12+2310 λ 13-2548 λ 14+3639 λ 15+99. 385，计算得到油菜 叶片乙酰乳酸合成酶活力。方程中y为油菜叶片乙酰乳酸合成酶活力，单位为0D53Q/g Fff/h ； λ i λ 15分别 为波长 2366nm、1494nm、1776nm、1730nm、2292nm、1424nm、1528nm、2432nm、2266nm、1676nm、 1190nm、1346nm、1400nm、2106nm和2052nm光波所对应的油菜叶片粉末样本的反射率。然后利用上述多元线性回归方程对建模集和预测集油菜叶片样本的乙酰乳酸合 成酶活力进行预测，并对预测结果进行评价。评价指标中相关系数和斜率越接近于1，均方 根误差、偏差的绝对值和截距的绝对值越小，说明预测值越接近于测量值，模型预测性能越 好，预测值评价结果如下表所示 对建模集和预测集进行预测，油菜叶片乙酰乳酸合成酶活力的预测值与真实化学 方法测量值之间的相关系数均大于0. 92，获得了满意的预测精度。建模集和预测集样本预 测结果的散点分布图如图1和图2所示，图中样本靠近分布于回归直线两侧，具有很好的线 性预测效果。上述结果说明应用本发明的方法能够快速准确地实现油菜叶片乙酰乳酸合成 酶活力的检测。
权利要求
一种油菜叶片乙酰乳酸合成酶活力快速检测方法，包括以下步骤(1)将油菜叶片杀青、烘干后粉碎，得到叶片粉末；(2)分别采集波长2366nm、1494nm、1776nm、1730nm、2292nm、1424nm、1528nm、2432nm、2266nm、1676nm、1190nm、1346nm、1400nm、2106nm和2052nm光波所对应的叶片粉末的反射率；(3)将各反射率分别代入多元线性回归方程y＝10100λ1+10890λ2+11830λ3 6870λ4 8123λ5 6991λ6 9756λ7 4364λ8+1123λ9 360.601λ10+4608λ11 5178λ12+2310λ13 2548λ14+3639λ15+99.385，计算得到油菜叶片乙酰乳酸合成酶活力；方程中y为油菜叶片乙酰乳酸合成酶活力；λ1～λ15分别为波长2366nm、1494nm、1776nm、1730nm、2292nm、1424nm、1528nm、2432nm、2266nm、1676nm、1190nm、1346nm、1400nm、2106nm和2052nm光波所对应的油菜叶片粉末样本的反射率。
2.根据权利要求1所述的油菜叶片乙酰乳酸合成酶活力快速检测方法，其特征在于 所述的叶片粉末为40 80目。
3.根据权利要求1所述的油菜叶片乙酰乳酸合成酶活力快速检测方法，其特征在于 步骤(1)中，杀青温度为95 115°C，杀青时间为20 40min。
4.根据权利要求1所述的油菜叶片乙酰乳酸合成酶活力快速检测方法，其特征在于 步骤(1)中，烘干温度为70 90°C。全文摘要
本发明公开了一种油菜叶片乙酰乳酸合成酶活力快速检测方法，包括以下步骤将油菜叶片杀青、烘干后粉碎，得到叶片粉末；分别采集波长2366、1494、1776、1730、2292、1424、1528、2432、2266、1676、1190、1346、1400、2106和2052nm光波所对应的叶片粉末的反射率；将各反射率分别代入多元线性回归方程，计算得到油菜叶片乙酰乳酸合成酶活力。本发明通过少数特征波长进行多元线性回归分析，快速准确检测油菜叶片中乙酰乳酸合成酶活力，大大缩短了检测的时间，减少了环境污染，降低了检测成本。
文档编号G01N21/49GK101900676SQ20101021899
公开日2010年12月1日 申请日期2010年7月5日 优先权日2010年7月5日
发明者何勇, 刘飞, 孔汶汶 申请人:浙江大学