专利名称：：使用变异型乙酰乳酸合成酶基因的转化方法
技术领域：
：本发明涉及使用在野生型乙酰乳酸合成酶的规定位置上导入变异的变异型乙酰乳酸合成酶的转化方法及植物培育方法。
背景技术：
：已知乙酰乳酸合成酶(以下称为"ALS")是酪氨酸、缬氨酸和异亮氨酸等支链氨基酸生物合成途径中的控速酶，是植物生长所必须的酶。众所周知ALS广泛存在于高等植物整体中，也在各种微生物例如酵母菌(Saccharomycescerevisiae)、大肠軒菌(Escherichiacoli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)等中发现了上述酶的存在。已知大肠杆菌及鼠伤寒沙门氏菌中存在3种ALS的同工酶。上述各种同工酶是由承担酶的催化活性的分子量大的催化亚单位和通过与支链氨基酸结合发挥反馈抑制剂功能的分子量小的控制亚单位形成的杂j氐聚4勿(Chipmanetal.,Biochim.Biophys.Acta.1385,401—419,1998[非专利文献1])。催化亚单位分别位于IlvIH、IlvGM、IlvBN操纵子。另一方面，酵母菌中，ALS虽然为单一的酶，但与细菌一样，由催化亚单位和控制亚单位形成(Pangetal.,Biochemistry,38,5222-5231,1999[非专利文献2]),催化蛋白质亚单位位于ILV2位点。也已知植物中的ALS与上述微生物相同，由催化亚单位和控制亚单位形成(Hersheyetal.，PlantMolecularBiology.40，795-806，1999)[非专利文献3])。例如，作为双子叶植物的烟草中，ALS的催化亚单位被SuRA及SuRB2个基因位点编码(Leeetal.，EMBOJ.7，1241-1248，1988[非专利文献4])，为玉米时，ALS的催化亚单位被alsl及als22个基因4立点编石马(Burretal.，TrendsinGenetics7，55—61,1991[非专利文献5];Lawrenceetal.,PlantMol.Biol.18,1185—1187,1992[非专利文献6])。关于编码催化亚单位的基因，为双子叶植物时，不仅烟草，拟南芥(Arabidopsis)、油菜、棉、苍耳(Xanthium)、反枝苋(Amaranthus)以及地肤(kochia)等均已完全确定了石咸基序歹'J(参见Chipmanetal.,Biochim.Biophys.Acta.1385，401-419，1998[非专利文献l]及国际公开公报WO97/08327[专利文献1])。单子叶植物中，玉米或水稻也完全确定了碱基序列。已知磺酰脲类除草剂、咪唑啉酮类除草剂、三唑嘧啶类除草剂以及嘧咬基羧基类除草剂(pyrimidinylcarboxyherbicide)(以下，称为"PC类除草剂"。)等除草剂通过抑制该ALS来控制植物的生长(Ray，PlantPhysiol.75,827—831,1984[非专利文献7];Shaneretal.，PlantPhysiol.76，545-546,1984[非专利文献8];Subramanianetal.,PlantPhysiol.96,310-313,1991[非专利文献9];Shimizuetal.，J.Pestic.Sci.19,59-67,1994[非专利文献10])。作为对上述除草剂具有抗性的植物，在编码ALS的基因中具有引起不分种类而存在的保守区域中的1个或2个氨基酸置换的1个或2个碱基置换的植物是已知的。例如可以举出，编码对磺酰脲类除草剂具有强抗性的ALS的基因(参见Kathleenetal.,EMBOJ.7,1241-1248，1988〔非专利文献11〕；Mouradetal.，Planta,188,491—497,1992[非专利文献12];Guttierietal.,WeedSci.43,175-178,1995[非专利文献13];Bernasconietal.,J.Biol.Chem.270,17381-17385,1995[非专利文献14]及特开昭63-71184号/>才艮[专利文献2]),编码对咪唑啉酮类除草剂具有强抗性的ALS的基因(参见Mouradetal.,Planta,188,491-497,1992[非专利文献12];Leeetal.,FEBSLett.452,341-345，1999[非专利文献15]及特开平5-227964号公报[专利文献3]),编码对PC除草剂具有强抗性的ALS的基因(参见WO02/44385Al[专利文献4]及W003/083118A1[专利文献5])或编码对^黄酰脲类除草剂、咪唑啉酮类除草剂、PC除草剂具有抗性的ALS的基因(参见Kathleenetal.，EMBOJ.7,1241-1248,1988[非专利文献11];Bernasconietal.，J.Biol.Chem.270，17381-17385,1995[非专利文献14];Hattorietal.,Mol.Gen.Genet.246，419-425,1995[非专利文献16];Alisonetal.,PlantPhysiol.lll,1353，1996[非专利文献17];Rajasekarauetal.,PlantSci.119,115-124,1996[非专利文献18]、特开昭63-71184号公报[专利文献2]、特开平4-311392号公报[专利文献6]、Bernasconietal.，USPatent5633437,1997[专利文献7]、WO02/44385Al[专利文献4]及WO03/083118Al[专利文献5])。另外，人们尝试了使具有对磺酰脲类除草剂显示特异抗性的ALS的个体与具有对咪唑啉酮类除草剂显示特异抗性的ALS的个体杂交，制作对两者显示抗性的植物(Mouradetal.,Mol.Gen.Genet，243，178-184,1994[非专利文献19])。并且，也人为地将编码ALS的基因转化为除草剂抗性基因(参见Ottetal.，J.Mol.Bio1.263,359-368,1996[非专利文献20]、特开昭63-71184号7>净艮[专利文献2]、特开平5-227964号公报[专利文献3]、特表平ll-504213号7>净艮[专利文献8])，明确了缺失l个氨基酸对磺酰脲类除草剂和咪唑啉酮类除草剂两者均显示抗性(参见特开平5-227964号公报[专利文献3])。如上所述地潜心研究了对除草剂具有抗性的ALS及编码ALS的基因，但至今尚无以PC类除草剂抗性为指标，仅对PC类除草剂具有特异的抗性的变异ALS基因的报告。如果能得到对特定的除草剂具有特异的抗性的变异ALS基因，则可以在各种用途中使用该变异ALS基因，但至今没有关于在对PC类除草剂的特异性方面有用的变异ALS基因的报告。Chipmanetal.,Biochim.Biophys.Acta.1385,401非专利文献l-419，1998非专利文献2非专利文献3806,1999非专利文献4非专利文献5非专利文献6Pangetal.，Biochemistry,38，5222-5231,1999Hersheyetal.,PlantMolecularBiology.40，795-Leeetal.，EMBOJ.7,1241-1248,1988Burretal.,TrendsinGenetics7，55—61,1991Lawrenceetal.,PlantMol.Biol.18,1185—1187,1992非专利文献7Ray,PlantPhysiol.75,827-831，1984非专利文献8Shaneretal.，PlantPhysio1.76,545-546，1984Subramanianetal.,PlantPhysiol.96，310—313,非专利文献91991非专利文献IO非专利文献ll非专利文献12非专利文献13非专利文献1417385,1995非专利文献15非专利文献16非专利文献17非专利文献18非专利文献191994非专利文献20专利文献l专利文献2专利文献3专利文献4专利文献5专利文献6专利文献7专利文献8Shimizuetal.,J.Pestic.ScU9，59-67，1994Kathleenetal.，EMBOJ.7,1241-1248,1988Mouradetal.,Planta，188,491-497,1992Guttierietal.，WeedSci.43,175-178,1995Bernasconietal.，J.Biol.Chem,270,17381-Leeetal.，FEBSLett.452,341-345,1999Hattorietal.,Mol.Gen.Genet.246,419-425，1995Alisonetal.,PlantPhysiol.l11，1353，1996Rajasekarauetal.,PlantSci.l19,115-124,1996Mouradetal.,Mol.Gen.Genet，243,178-184,Ottetal.，J.Mol.Biol.263,359-368,1996国际公开公报W097/08327号特开昭63-71184号/>才艮特开平5-227964号公报国际公开公报W002/44385号国际公开公报W003/083118号特开平4-311392号公报Bernasconietal.，美国专利号USP5,633，437号特表平11-504213号公报
发明内容鉴于上述实际情况，本发明的目的在于提供可以使用对PC类除草剂的特异性优异的变异ALS基因，有效地选择转化细胞的方法。为了达到上述目的，本发明人进行了深入的研究，结果明确了具有特定变异的ALS对PC类除草剂显示极高的抗性，并且发现可以使用编码具有该变异的ALS的基因作为选择标记物，从而完成了本发明。即，本发明包含以下内容。(1)一种转化方法，所述方法包括以下步骤使用含有目标基因和编码变异型乙酰乳酸合成酶的基因的重组载体，转化宿主细胞的步骤，上述变异型乙酰乳酸合成酶是相当于来自水稻的野生型乙酰乳酸合成酶的氨基酸序列中的第95位的甘氨酸变异为丙氨酸的变异型乙酰乳酸合成酶；和在嘧啶基羧基类除草剂的存在下培养上述步骤中所得的转化细胞的步骤，其特征在于，使用编码上述变异型乙酰乳酸合成酶的基因作为选择标记物。(2)如(1)所述的转化方法，其特征在于，编码上述变异型乙酰乳酸合成酶的基因为编码以下的(a)或(b)的蛋白质的基因。(a)由序列号2中记载的氨基酸序列形成的蛋白质。(b)由序列号2中记载的氨基酸序列的第95位的丙氨酸之外的至少l个以上氨基酸被置换、缺失或加成的氨基酸序列形成，且对嘧啶基羧基类除草剂具有抗性，具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质。(3)如(1)所述的转化方法，其特征在于，上述宿主细胞是植物细胞。(4)一种植物培育方法，所述方法包括以下步骤使用含有目标基因和编码变异型乙酰乳酸合成酶的基因的重组载体，转化植物细胞的步骤，上述变异型乙酰乳酸合成酶是相当于来自水稻的野生型乙酰乳酸合成酶的氨基酸序列中的第95位的甘氨酸变异为丙氨酸的变异型乙酰乳酸合成酶；和在嘧啶基羧基类除草剂的存在下培养上述步骤中所得的转化植物的步骤，其特征在于，使用编码上述变异型乙酰乳酸合成酶的基因作为选择标记物。(5)如(4)所述的植物培育方法，其特征在于，编码上述变异型乙酰乳酸合成酶的基因为编码以下的(a)或(b)的蛋白质的基因。(a)由序列号2中记载的氨基酸序列形成的蛋白质。(b)由序列号2中记载的氨基酸序列的第95位的丙氨酸之外的至少l个以上氨基酸被置换、缺失或加成的氨基酸序列形成，且对嘧啶基羧基类除草剂具有抗性，具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质。本i兌明书包含作为本申请优先权基础的日本专利申i青2005-136186号说明书及/或附图中所记载的内容。图1表示比较来自水稻的变异型ALS蛋白质的氨基酸序列和来自水稻的野生型ALS蛋白质的氨基酸序列得到的结果。图2-1表示比较来自水稻的变异型ALS基因的碱基序列和编码来自水稻的野生型ALS蛋白质的基因的碱基序列得到的结果。图2-2表示比较来自水稻的变异型ALS基因的碱基序列和编码来自水稻的野生型ALS蛋白质的基因的碱基序列得到的结果。图2-3表示比较来自水稻的变异型ALS基因的碱基序列和编码来自水稻的野生型ALS蛋白质的基因的碱基序列得到的结果。图3是表示观察来自含有双草醚钠(bispyribac-sodium)的生根培养基中的G95A-1系统及G95A-2系统的克隆个体中的生根情况得到的结果的照片。图4是说明G95A变异型ALS表达载体的制作方法的模式图。图5是表示以对野生型ALS的抑制达到50%的浓度为基准的G95A变异型ALS的药物抗性比(RS比)的特性图。具体实施方式下面详细说明本发明。本发明的乙酰乳酸合成酶蛋白质(以下称为"变异型ALS蛋白质")可以通过使野生型ALS蛋白质中的规定部位变异而得到。在来自水稻的野生型ALS蛋白质中，从N末端的曱硫氨酸开始数的第95位氨基酸是甘氨酸。本发明的变异型ALS蛋白质中，该第95位甘氨酸被置换为丙氨酸。即，来自水稻的本发明的变异型ALS蛋白质具有第95位甘氨酸被置换为丙氨酸(标记为G95A)的氨基酸序列。编码来自水稻的变异型ALS蛋白质的基因(以下称为"变异型ALS基因")的碱基序列及变异型ALS蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号1及序列号2。图1表示比较来自水稻的变异型ALS蛋白质的氨基酸序列和来自水稻的野生型ALS蛋白质的氨基酸序列的结果。需要说明的是，图1中，第1列氨基酸序列表示变异型ALS蛋白质，第2列氨基酸序列表示野生型ALS蛋白质。来自水稻的变异型ALS基因(序列号1)与编码来自水稻的野生型ALS蛋白质的基因相比较，编码野生型ALS蛋白质中的第95位的甘氨酸的密码子被置换为编码丙氨酸的密码子。图2-1~图2-3表示比较来自水稻的变异型ALS基因的碱基序列和编码来自水稻的野生型ALS蛋白质的基因的碱基序列得到的结果。需要说明的是，图2-1~图2-3中，第一列碱基序列表示变异型ALS基因，第二列碱基序列表示编码野生型ALS蛋白质的基因。该变异型ALS基因可以通过在编码存在于日本型水稻品种台中65号的基因组DNA中的野生型ALS蛋白质的基因中导入上述变异而得到。作为导入变异的方法，可以使用现有的公知方法，例如可以使用部位特异性变异导入法。部位特异性变异导入法可以使用市售的试剂盒、例如Mutan-K(宝酒造抹式会社制)、GeneEditor(普洛麦格(Promega)#土制)、ExSite(stratagene牙土制)等力口以实施。需要i兌明的是，编码变异ALS蛋白质的基因可以由变异抹培养细胞中得到，所述变异抹培养细胞是在PC类除草剂存在下培养PC类除草剂敏感性的野生抹培养细胞后表现出对PC类除草剂的抗性的细胞。本发明的变异型ALS基因不限定于序列号1所示的来自水稻的基因，可以广泛从来自植物的ALS基因中得到。例如，可以通过在来自玉米、小麦、大麦、大豆、棉、油菜、糖萝卜、黑麦草(Loliummultiflorum)、烟草及拟南芥(ThaleCress)等的ALS基因中导入相同的变异，得到本发明的变异型ALS基因。此处，所谓相同的变异是指将相当于来自水稻的野生型ALS蛋白质的第95位甘氨酸(因植物的不同，有时不是第95位)的甘氨酸变异为丙氨酸的变异。来自玉米的2种变异型ALS蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号3和4。来自小麦的2种变异型ALS蛋白质的部分氨基酸序列分别示于序列号5和6。来自棉的2种变异型ALS蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号7和8。来自油菜的2种变异型ALS蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号9和10。来自烟草的2种变异型ALS蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号11和12。来自黑麦草的变异型ALS蛋白质的氨基酸序列示于序列号13。来自拟南芥的变异型ALS蛋白质的氨基酸序列示于序列号14。变异型ALS蛋白质无论来自何种植物，只要相当于来自水稻的野生型ALS蛋白质的第95位甘氨酸的甘氨酸被置换为丙氨酸，就对PC类除草剂特异性地显示抗性。变异型ALS蛋白质与野生型ALS蛋白质相比较，对PC类除草剂具有优异的抗性。其可以通过将编码变异型ALS蛋白质的基因组合入大肠杆菌等的表达载体，确定由被该表达载体转化的大肠杆菌得到的变异型ALS的除草剂敏感性来判断。此处，作为PC类除草剂，如化学式l所示，可以举出双草醚钠、嘧硫草醚钠(pyrithiobac_sodium)、嘧草醚(pyriminobac)。化学式1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>作为咪唑啉酮类除草剂，如化学式3所示，可以举出咪唑奮啉酸(imazaquin)、咪口坐烟酸(imazapyr)。化学式3嘧硫草醚钠嘧草醚对PC类除草剂特异性地显示抗性是指对除PC类除草剂之外的磺酰脲类除草剂、咪唑啉酮类除草剂的抗性显著低于对PC类除草剂的抗性。需要说明的是，作为磺酰脲类除草剂，如化学式2所示，可以举出氯磺隆(chlorsulfuron)、千嘧石黄隆(bensulfuron一methyl)、p比口密石黄隆(pyrazosulfuron-ethyl)、口坐p比口密石黄隆(imazosulfuron)。化学式2咪峻P套啉酸咪峻烟酸本发明中，可以构筑通过利用变异型ALS基因，能有效地转化目标基因的转化方法。即，变异型ALS基因可以用作植物转化试验中的选择性标记物。例如，使用目标基因转化植物细胞时，将具有变异型ALS基因与目标基因的重组载体导入植物细胞内后，在PC类除草剂的存在下培养该植物细胞。结果判定目标基因与变异型ALS基因一起导入在PC类除草剂的存在下生存的植物细胞中。另外，目标基因以及编码变异型ALS蛋白质的基因是否被导入植物细胞的染色体中可以在观察该植物的表现型后，通过基因组杂交(genomicsouthernhybridization)或PCR调查上述基因是否存在于基因组上而确认。作为转化才直物的方法，可以4吏用现有的/>知方法。例如，可以举出<吏用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)将外来基因导入目标才直物细月包的方法。具体而言，在含有根癌农杆菌的Ti质粒的T-DNA序列的双载体中插入变异型ALS基因以及目标基因。将该Ti质粒转化至大肠杆菌等中。然后，将在大肠杆菌等中增殖的保持变异型ALS基因以及目标基因的双载体转化至含有辅助质粒(helperplasmid)的根癌农杆菌中。接下来，使该根癌农杆菌转染作为目标的植物后，鉴定转化植物。被鉴定的转化植物为培养细胞时，可以通过现有的公知方法使该植物细胞再生为完整的植物。另外，将具有变异型ALS基因以及目标基因的重组载体转化至目标植物时，可以使用现有的公知方法直接导入植物体中。并且，作为转化具有变异型ALS基因以及目标基因的重组载体的方法，可以使用聚乙二醇法、电穿孑L(ElectroPoration)法、基因枪(particlegun)法等。另一方面，变异型ALS基因以及目标基因可以转化到单子叶植物和双子叶植物等所有种类的植物中。作为转化编码变异型ALS蛋白质的基因的对象作物，例如可以举出水稻、玉米、小麦、大麦、大豆、棉、油菜、黑麦草以及烟草等。并且，通过导入变异型基因和目标基因，可以转化草坪草或树木等。任一情况下，都可以通过将变异型ALS基因转化到植物中而赋予该植物对PC类除草剂的特异抗性。特别是由于PC类除草剂与磺酰脲类除草剂或咪唑啉酮类除草剂不同，为水溶性，故容易处理，可以排除有机溶剂对宿主细胞的影响，所以，优选用作转化中的药物。另外，PC类除草剂显示比咪唑啉酮类除草剂强约1OO倍的ALS抑制活性，故用微量的PC除草剂即可筛选转化体。下面，使用实施例更加详细地说明本发明。但本发明的技术范围并不限定于下述实施例。诱导来自花药培养的愈伤组织(callus)在水稻品种"台中65号"孕穗期，选取能够最多地获得单核期花药的叶耳间距68cm的幼穗。此时，茎在旗叶前的叶的节下进行在水中剪枝，将直接包裹幼穗的旗叶和旗叶前的叶的2片叶子以外的叶子除去。用含水的纸巾包裹茎的基部，用聚乙烯袋纟皮覆，在黑暗中'1(TC下进行510天的低温处理。然后，用干净的4t子取出幼穗，用70%乙醇灭菌10分钟，在灭菌后的纸巾(Crecia,东京)上吸干水分。用灭菌后的镊子打开含有单核期的花药的半透明的颖花，仅取出花药，放置于愈伤组织诱导培养基(N6CI培养基，表l)中。将其在持续明亮的环境中'30。C下进行培养，每隔三周在新的培养基上进行传代培养。表l.愈伤组织i秀导培养基(N6CI)pH5.8_N6无机盐N6维生素蔗糖30g/l2.4-D2mg/1L(-)-脯氨酸2'878g/1脱乙酰吉兰糖胶(gelrite)3g/1酪蛋白氨基酸(Casaminoacids)0.3g/l用双草醚钠筛选花药培养愈伤组织将愈伤组织诱导后第5周的来自花药培养的愈伤组织在含有0.25jiM双草醚钠的愈伤组织诱导培养基中培养4周。然后，将增殖的愈伤组织用含有0.5^iM双草醚钠的再分化培养基(表2)培养4周，得到白化的再分化植物。传代培养均隔2周进行。表2-再分化培养基(pH5.8)1吏总量为1升，；改入高压釜中，加入双草醚钠[实施例3]双草醚钠抗性鉴定以上述方法筛选的个体的2个系统为G95A-1系统和G95A-2系统，由于为白化个体，故用MS培养基培养，分林进行增殖。为了鉴定双草醚钠抗性的程度，将从G95A-l系统中分出的克隆个体移植在含有O、1、5、10、20jiM的双草醚钠的生根培养基(表3)中(图3A:培养皿的左侧，由于白化而呈白色)。克隆个体少的G95A-2系统仅用5pM进行鉴定。作为对照区，使用播种后第2周的野生型台中65号(图3各培养皿右侧)，观察移植后第l周(图3B)、第2周(图3C)的植物体。结果为G95A-1及G95A-2两个系统均在所有浓度的双草醚钠的培养基中可见新的生根，显示了抗性，对照区的野生型在含有双草醚钠的培养基中均枯死。MS无才几盐N6维生素蔗糖30山梨醇502.4-D2itNAAlnBAP2n酪蛋白氨基酸2g/1L(-)-脯氨酸2.878g/l脱乙酰吉兰糖胶4g/lwU>^3)表3-生根鉴定培养基(pH5.8)_MS无才几盐N6维生素蔗糖30g/l琼脂_^_使总量为l升，；故入高压釜中，加入双草醚钠双草醚钠抗性的白化系统的ALS基因序列解析将上述2个系统的叶(约0.5xlcm)放入1.5ml管中，在50。C下使其干燥2小时以上。在管内放入4粒直径为3mm的玻璃珠BZ-3(井内盛荣堂)，用混合机MM300(Retsch)粉碎叶后，加入300pl的提取緩沖液(200mMTris—HC1(pH7.5)、250mMNaCl、25mMEDTA、0.5%SDS),混悬。将该混悬液以14,000rpm的转速离心5分钟，将200fil上清液转移至新管中，加入200(il异丙醇。将其以14，000rpm的转速离心5分钟，除去上清液，将所得的沉淀真空干燥3分钟。在该沉淀中加入50(il的l/5xTE后，再以14,000rpm的转速离心1分钟，以其为基因组DNA溶液。以制得的基因组DNA为模板，使用以下所示的引物，通过PCR-定向测序(directsequencing)解析ALS基因的整个区域的序列。PCR中，使用ExTaq(宝日医生物技术(takara-bio)林式会社)。反应在9^C下初期变性l分钟后，将94。C30秒、58。C30秒、72。C40秒的循环进行40次。组合ALSF2和ALS2R的引物时，加入PCRx增强子(英杰(invitrogen)社)，在94。C下初期变性1分钟后，将94。C1分钟、5(TC1分钟、72。Cl分钟的循环进行40次。对各个PCR产物实施琼脂糖凝胶电泳，使用MiniEluteGelExtractionkit(QIAGEN社)进行精制。以该PCR产物为才莫寿反，<吏用ABISequencingkit,由下述引物进4亍测序反应。使用ALSF2、ALS2R的引物时，加入测序Rx增强子溶液A(英杰社)。测序反应条件为将96。C10秒、50。C5秒、60。C4分钟的循环进行35次。测序反应后，用ABIPRISM310GeneticAnalyzer(AppliedBiosystems,U.S.A.)确定石成基序列。ALSF2(5，-CCACCACCCACCATGGCTACG-3，，正义引物，与ALS基因的第-12-9位对应；序列号15)ALS2R(5，-GAAGAGGTGGTTGGTGATGA-3，，反义引物，与ALS基因的第326-345位对应；序列号16)ALS12(5,-GCAACCAACCTCGTGTCCGC—3,正义引物，与ALS基因的第436-455位相对应；序列号17)ALS22(5，—GAAGGCTTCCTGTATGACGC-3，，反义引物，与ALS基因的第620-639位相对应；序列号18)ALS13(5，-GAATTGCGCTGGTTTGTTGA-3,，正义引物，与ALS基因的第868-887位相对应；序列号19)ALS23(5，_CTCAATTTTCCCTGTCACACG-3，，反义引物，与ALS基因的第1051—1071位相对应;序列号20)ALS24F(5，-GGTAGCTTCCTCATGAACAT-3',正义引物，与ALS基因的第1537-1556位相对应；序列号21)ALS24R(5，-AATGTTCATGAGGAAGCTAC_3，，反义引物，与ALS基因的第1538-1557位相对应；序列号22)ALS25(5，—CATTCAGGTCAAACATAGGCC—3，，反义引物，与ALS基因的第1919-1989位相对应；序列号23)由此确定上述2系统的ALS基因序列，结果两者的ALS的第95位氨基酸均通过l个碱基置换从甘氨酸(GGC)置换为丙氨酸(GCC)。制作表达GST融合G95A变异型ALS的载体导入pUC18载体中的来自水稻的W548L/S62712点变异型ALS(参见WO02/44385A1)为模板，将用缩聚了第95位的甘氨酸部分的密码子得到的正义引物ALS_M5(5，-TACCCGGGCNNNGCGTCCATGGAGATCCA-3，与氨基酸序列中的第92-IOI位相对应；序列号24)和与第191-196位氨基酸序列对应的反义引物ALS-RspA(5，-TGTGCTTGGTGATGGA-3，；序列号25)扩增的PCR生成物克隆至pT7Blue-T载体，用该载体通过常规方法转化大肠杆菌(HB-101林)。由相同的引物组合进行菌落PCR，进行序列解析，得到第95位的甘氨酸(GGC)部分变异为丝氨酸(AGC)、半胱氨酸(TGC)、酪氨酸(TAT)、丙氨酸(GCA)、缬氨酸(GTG)、亮氨酸(CTG)、异亮氨酸(ATA)、甲硫氨酸(ATG)、色氨酸(TGG)、苯丙氨酸(TTT)、天冬氨酸(GAT)、谷氨酸(GAG)、精氨酸(CGG)的菌落。对于丙氨酸变异体，液体培养大肠杆菌后，提取质粒，用SmaI切断。电泳后，由琼脂糖凝胶精制变异型ALS基因片段，用SmaI消化后，进行BAP处理将其精制，将得到的来自水稻的W548L/S62712点变异型ALS基因连接到pUC18载体上。由得到的带有G95A/W548L/S627I3点变异型ALS基因的pUC18载体上切下含有G95A部分的NcoI片革殳，Ncol处理后，与BAP处理后的导入了野生型ALS基因的大肠杆菌蛋白质表达载体(pGEX-2T)进行连接，得到具有G95Al点变异型ALS基因的pGEX-2T表达载体(图4)。确认导入了G95A变异型ALS基因的pGEX-2T载体的碱基序列将由该载体转化得到的大肠杆菌(JM109林)在2mP10根中37。C下培养12小时，用质粒^是取装置(TOMYDP-480)提取(500^1)质粒后，通过离心浓缩，浓缩至200^il左右。用GFXPCR和GelPurificationkit(AmershamBioscience)进行脱盐，最终用200^il灭菌水洗脱。使用BigDyeTerminatorver,l.lcyclesequencingkit(AppliedBiosystems)，对该质粒进行测序反应。[总容量20ial(模板DNA13pl、质粒(3.2pmol/pl)l(il、pre-mix4|il、稀释緩冲液2pl),反应条件初期变性96°C(5分钟)、将变性96。C(5秒)-退火50。C(5秒)-延伸60。C(4分钟)的循环进行40次，最终循环的延伸为60。C(9分钟)]测序反应后，<吏用AutoSeqG-50column(AmershamBioscience)，用凝胶过滤除去反应液中的荧光碱基。将反应样品用ABIPRIZM310geneticanalyser进行测定，确il序列。作为测序用的引物，^吏用以下序列的引物。PGEX-5(5，-GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG-3，，正义引物，ALS基因的上游；序列号26)ALS-RspC(5，-CAGCGACGTGTTCGCCTA-3，，正义引物，与ALS基因的第258-275位对应；序列号27)ALS-Ml(5，-CCCCAGCCGCATGATCGGCACCGACGCCTT-3，，正义引物，与ALS基因的第510-539位对应；序列号28)ALS-Rsp3(5，-CTGGGACACCTCGATGAAT—3，，正义引物，与ALS基因的第720-738位对应；序列号29)ALS-RSp7(5'-AACTGGGATACCAGTCAGCTC-3，，反义引物，与ALS基因的第886-906位对应；序列号30)ALS-Rspl(5，-GCTCTGCTACAACAGAGCACA-3',正义引物，与ALS基因的第1192-1212位对应；序列号31)3-1—3(5，-GATTGCCTCACCTTTCG—3，，反义引物，与ALS基因的第1346-1362位对应；序列号32)4—83—10(5'-CAGCCCAAATCCCATTG-3',反义引物，与ALS基因的第1457-1473位对应；序列号33)3-1-4(5，-AGGTGTCACAGTTGTTG-3',正义引物，与ALS基因的第1506-1522位对应；序列号34)ALS-RspB(5'-TCAAGGACATGATCCTGGATGG-3',正义引物，与ALS基因的第1892-1913位对应；序列号35)ALS-Rsp2(5，—AGTCCTGCCATCACCATCCAG—3，，反义引物，与ALS基因的第1卯6-1926位对应；序列号36)pGEX—3(5，一CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG—3，，反义引物，ALS基因的下游；序列号37)G95A变异型ALS的表达与ALS的配制比ffl#A,1/;A1佴AAII^mn《a沐S—刑-2T以及具有野生型ALS基因的pGEX-2T(参见WO02/44385Al)转化的大肠杆菌在27。C下分别在含有2ml氨卡西林的LB液体培养基中振荡培养(前培养)。使用lml该前培养液，在含有250ml氨节西林的LB液体培养基中分别进行主培养。培养一夜后，加入lmMIPTG,进一步培养3小时4小时，由此进行GSP融合蛋白质的表达诱导。需要说明的是，菌体用ALS提取緩冲液(含有30%甘油和0.5mMMgCl2的磷酸钾緩冲液pH7.5)洗涤后在-80。C下保存。按照下述方法由大肠杆菌配制和精制ALS。首先，将预先保存在-80°〇的大肠杆菌的颗粒混悬在八1^提取緩沖液中(相对于由50ml培养液中得到的颗粒，添加2.5mlALS提取緩冲液)。对该混悬液进行超声波处理(HeatSystems-Ultrasonics社制，SonicatorW-225R,微型芯片，输出控制8，间隔约l秒，40秒2次)后，在4。C、15000xg下离心20分钟，以该上清液作为粗酶溶液。由此，配制GST融合G95A变异型ALS蛋白质以及GST融合野生型ALS蛋白质的粗酶溶液。测定表达ALS的活性用于活性测定反应的反应溶液是在由20mM的丙酮酸钠、0.5mM的硫胺素焦磷酸、0.5mMMgCl2、10nM黄素腺嘌呤二核苷酸、10mM缬氨酸(为了抑制来自大肠杆菌的ALS活性而添加)以及20mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)形成的溶液中，混合作为活性测定对象的GST融合ALS得到的溶液。使用0.5ml该反应溶液。测定反应在添加作为测定对象的GST融合ALS后，在37。C下进行30分钟。另外，测定反应通过添加0.05ml6N硫酸使其停止。然后，将反应结束后的反应溶液在37。C下培养60分钟。由此，使反应溶液中所含的乙酰乳酸转化为3-羟基丁酮。接下来，为了定量反应溶液中所含的3-羟基丁酮，添加0.05ml0.5%(w/v)的肌酸和0.05ml溶解在2.5N氬氧化钠中的5。/。(w/v)的a-萘酚，在37。C下培养10分钟。然后，通过比色反应溶液在525nm下的吸光度，对3-羟基丁酮进行定量，评价ALS活性。需要说明的是，以反应O小时作为对照区。测定药物的抑制活性时，将双草醚钠和嘧硫草醚钠制成100倍浓度的水溶液，添加至反应液中。水溶性低的嘧草醚、氯-黄隆、节嘧磺隆、咪唑会啉酸以及咪唑烟酸制成100倍浓度的丙酮溶液，添加至反应液中。G95A变异型ALS的药物感受性果为双草醚钠、嘧碌^草醚钠以及嘧草醚的抑制活性极弱(以100pM实现50%以下的抑制活性)，氯磺隆的抑制活性强，另外，千嘧磺隆、。米唑卩奎啉酸以及口米唑烟酸也显示抑制活性(表4)。表4G95A变异型ALS的药物感受性BSPSPMCSBMIQIP第l次17.9%12.1%22.9%0.00230.2681.65346.041第2次16.8%12.8%23.3%0.00300.2941.88644.612第3次18.4%18.1%29.2%0.00270.2711.84849.705第4次-一—0.0028一一—第5次———0.0021一——第6次-——0.0019一——平均17.7%14.3%25.1%0.00250.2781.8046.8SE0.47%1.9%2.0%0.00020.0080.071.52BS:双草醚钠；PS:嘧」琉草醚钠，PM:嘧草醚CS:氯磺隆；BM:节嘧磺隆IQ:咪哇奮啉酸；IP:咪唑烟酸需要说明的是，表4中没有单位的数值均为抑制50%的浓度，单位为pM，单位为。/。的数值表示在100[iM时的抑制百分比。SE为标准误差。比较各药物将G95A变异型ALS抑制50%的浓度与将野生型ALS(GST融合野生型ALS)抑制50%的浓度，算出以将野生型ALS抑制50。/o的浓度为基准的G95A变异型ALS的药物抗性比(RS比)，双草醚钠、嘧硫草醚钠以及嘧草醚的RS比分别为16,000倍以上、9，1OO倍以上、13,000倍以上，但氯石黄隆、节嘧磺隆、咪唑会啉酸以及咪唑烟酸的RS比为0.19、40、0.82、4.9,G95A变异型ALS对PC除草剂特异性地显示强抗性(表5及图5)。需要说明的是，图5中，BS为双草醚钠，PS为嘧硫草醚钠，PM为嘧草醚，CS为氯磺隆，BM为卡嘧磺隆，IQ为咪唑p奎p林酸，IP为。米唑烟酸。表5G95A变异型ALS的药物抗性比<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>[总结]由以上的实施例可知，在来自水稻的野生型ALS蛋白质中导入了G95A变异的变异型ALS蛋白质对嘧啶基羧基类除草剂特异性地显示抗性。通过利用上述显示优异的特异性的变异型ALS蛋白质的特性，能确实有效地在PC类除草剂的存在下筛选表达变异型ALS蛋白质的细胞和不表达的细胞。需要说明的是，上述实施例中，使用来自水稻的ALS基因，但本发明的技术范围不限定于使用来自水稻的变异型ALS基因的转化方法。通常，已知ALS基因在不同的植物间显示高同源性。另外，ALS基因中的特定变异对多种植物赋予相同的影响。由此，通过本实施例可知，例如来自玉米、小麦、大麦、大豆、棉、油菜、黑麦草以及烟草的具有与G95A变异相同的变异的变异型ALS蛋白质也同样对嘧咬基，1基类除草剂特异性地显示抗性。产业上的可利用性如以上详细说明所述，根据本发明，利用对PC类除草剂显示极高的抗性的变异型乙酰乳酸合成酶作为选择标记物，可以提供高效的转化方法o本说明书中引用的所有刊物、专利和专利申请直接作为参考引入本说明书中。权利要求1、一种转化方法，所述方法包括以下步骤使用含有目标基因和编码变异型乙酰乳酸合成酶的基因的重组载体，转化宿主细胞的步骤，所述变异型乙酰乳酸合成酶是相当于来自水稻的野生型乙酰乳酸合成酶的氨基酸序列中的第95位的甘氨酸变异为丙氨酸的变异型乙酰乳酸合成酶；和在嘧啶基羧基类除草剂的存在下培养上述步骤中所得的转化细胞的步骤，其特征在于，使用编码所述变异型乙酰乳酸合成酶的基因作为选择标记物。2、如权利要求1所述的转化方法，其特征在于，编码所述变异型乙酰乳酸合成酶的基因为编码以下的(a)或(b)的蛋白质的基因，(a)由序列号2中记载的氨基酸序列形成的蛋白质；(b)由序列号2中记载的氨基酸序列的第95位的丙氨酸之外的至少l个以上氨基酸被置换、缺失或加成的氨基酸序列形成，且对嘧啶基羧基类除草剂具有抗性，具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质。3、如权利要求1所述的转化方法，其特征在于，所述宿主细胞是植物细胞。4、一种植物培育方法，所述方法包括以下步骤使用含有目标基因和编码变异型乙酰乳酸合成酶的基因的重组载体，转化植物细胞的步骤，所述变异型乙酰乳酸合成酶是相当于来自水稻的野生型乙酰乳酸合成酶的氨基酸序列中的第95位的甘氨酸变异为丙氨酸的变异型乙酰乳酸合成酶；和在嘧啶基羧基类除草剂的存在下培养上述步骤中所得的转化植物的步骤，其特征在于，使用编码所述变异型乙酰乳酸合成酶的基因作为选择标记物。5、如权利要求4所述的植物培育方法，其特征在于，编码所述变异型乙酰乳酸合成酶的基因为编码以下的(a)或(b)的蛋白质的基因，(a)由序列号2中记载的氨基酸序列形成的蛋白质；(b)由序列号2中记载的氨基酸序列的第95位的丙氨酸之外的至少l个以上氨基酸被置换、缺失或加成的氨基酸序列形成，且对嘧啶基羧基类除草剂具有抗性，具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质。全文摘要使用对PC类除草剂的特异性优异的变异ALS基因，有效地选择转化细胞。包括以下步骤，即使用含有目标基因和编码相当于来自水稻的野生型乙酰乳酸合成酶的氨基酸序列中的第95位的甘氨酸变异为丙氨酸的变异型乙酰乳酸合成酶的基因的重组载体，转化宿主细胞的步骤；和在嘧啶基羧基类除草剂的存在下培养上述步骤中所得的转化细胞的步骤，使用编码所述变异型乙酰乳酸合成酶的基因作为选择标记物。文档编号C12N5/10GK101175849SQ20068001603公开日2008年5月7日申请日期2006年5月9日优先权日2005年5月9日发明者奥崎文子,河合清,清水力,角康一郎,鸟山钦哉申请人:组合化学工业株式会社;国立大学法人东北大学