专利名称：葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯的制备方法
技术领域：
本发明涉及葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯的制备方法，更具体的地
说，其特征在于使蔗糖氧化，制成蔗糖羧酸(及其盐)(葡糖醛酸基-果 糖苷，P-D-果糖基-(2—l)-a-D-葡糖醛酸及其盐)，然后加入酵母等微生 物，将其果糖部分水解，同时进行同化，收集生成的葡糖醛酸和/或葡糖 醛酸内酯。
背景技术：
葡糖醛酸以及葡糖醛酸内酯或其衍生物可广泛应用于药物、药物原 料。已知这些葡糖醛酸或葡糖醛酸内酯的合成方法有多种。通常的方法 是以葡萄糖衍生物或淀粉等葡萄糖衍生物作为原料，使用硝酸等氮化合 物进行氧化，水解，获得葡糖醛酸和葡糖眵酸内酯的方法(参照专利文献 1、 2)。
但是，上述方法作为可以以工业化规模进行的合成方法，其中用作 氧化剂的氮氧化物成本较高。另外，副生的一氧化氮气体发泡，使规模 增大，并且该副生的气体成为公害的原因。因此，在环境问题日益严峻 的今天，必须考虑增加回收装置。也有一些改良的发明，这些方法虽然 解决了副生气体的问题，但是仍有产率提高等未解决的问题(参照专利文 献3、 4)。
还有保护葡萄糖的C-l位、接着氧化C-6位、然后水解、脱保护、 获得葡糖醛酸和葡糖醛酸内酯的方法。该方法存在脱保护步骤复杂的问 题(参照专利文献5)。
另夕卜，还有通过氧化催化剂6,6-四曱基哌啶N-氧化物(TEMPO)进行 选择性氧化的方法(参照专利文献6)。该方法转化效率高，优选的原料 是保护葡萄糖C-l位的曱基葡糖苷等的单糖衍生物。另外，以TEMPO 为代表的胺氧化物的制造成本高，并且可能对人体产生不良影响。
有人提出了一种解决这些问题的方法，其特征在于使用吸附树 脂，使作为催化剂的胺氧化物与含卣素的氧化物或含卣素化合物的电解 氧化物反应(参照专利文献7)。
但是，该方法中，虽然葡萄糖衍生物向糖醛酸的转化效率高，催化 剂容易回收，但是催化剂依然价格昂贵。并且，虽然原料葡萄糖衍生物
中也含有蔗糖，但优选的是较为昂贵的曱基-a-葡糖苷、异丙基-a和卩葡 糖苦。作为所使用的原料，生成卣酸离子的次氯酸钠等不能说是安全的 原料。该方法中，由甲基-a-吡喃葡糖苷基糖醛酸等的所得到的葡糖醛酸 衍生物进行的葡糖醛酸内酯的合成必须进行规定方法的水解反应的步骤。
目前，还公开了以海藻糖为原料，使用氧化铂、载钯碳、铂碳等氧 化催化剂制备海藻糖羧酸(a-D-葡糖醛酸基-a-D-葡糖醛酸盐)，使用氧或 酶水解，获得目标葡糖醛酸和葡糖醛酸内酯的方法(参照专利文献8)。
该方法中，原料的收率好，但是氧化催化剂所需量多，成本高，并 且中间原料海藻糖羧酸的葡糖苷键稳定，因此如果不进行比较剧烈的酸 水解反应，葡糖醛酸不会游离。也有使用a-葡糖醛酸糖苷酶等酶的方 法，其价格通常较为昂贵，并且水解能力不高。
专利文献1:日本特公昭46-3871号公报
专利文献2:英国专利第900977号
专利文献3:日本特公昭42-2595号公报
专利文献4'.日本特公昭43-5882号公报
专利文献5:日本特公昭44-7325号公净艮
专利文献6:日本特开平2-107790号公报
专利文献7:日本特开平11-147043号公报
专利文献8:日本特开平10-251263号公报
发明内容
针对上述情况，本发明的目的在于提供高收率、廉价、容易且安全 地制备葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯的方法。
本发明人进行了深入研究，结果发现以蔗糖作为原料制备蔗糖羧 酸(和/或其盐)(葡糖醛酸基-果糖苷)，使酵母等具有转化酶(^ >《'》夕 —七)活性的微生物与其作用，可以以高收率获得目标葡糖醛酸和/或葡 糖醛酸内酯。
在该制备步骤中，不使用硝酸等氮氧化物等作为氧化剂，或者即使 使用其量也很少，因此可安全且对环境没有影响地制备目标产物。
对酵母等的添加量、反应条件、脱盐、结晶化方法进行研究，得出 了可以进行比以往更简便且效率高的生产方法的认识，从而完成了本发明。
权利要求1的本发明是葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯的制备方法，其
特征在于使蔗糖氧化，制成蔗糖羧酸或其盐，接着加入具有转化酶活 性的微生物水解并同化该蔗糖羧酸或其盐的果糖部分，收集生成的葡糖 醛酸和/或葡糖醛酸内酯。
权利要求2的本发明是权利要求1的制备方法，其中，具有转化酶 活性的微生物是酵母。
权利要求3的本发明是权利要求1的制备方法，其中，蔗糖是精制
糖、清净汁(7 7 4 > y力)、原料糖、甜菜糖、加糖调制品、槭糖浆
或废糖蜜。
权利要求4的本发明是权利要求1的制备方法，其中，向蔗糖羧酸 或其盐中加入具有转化酶活性的微生物，使该蔗糖羧酸或其盐的果糖部 分水解的反应是在温度0-60。C、 pH3-10下，使该微生物与浓度为1-50% 的蔗糖羧酸或其盐水溶液作用进行的。
本发明不仅由低成本的原料蔗糖生产，还可以以非常高的收率获得 目标葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯。
并且如上所述，在其制备步骤中，不使用硝酸等氮氧化物等作为氧 化剂，或者即使使用其量也极少，因此可安全且对环境没有影响地制备 目标产物。并且设备投资也较少。
因此，本发明的葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯的制备方法与现有方法 比较，是生产效率更为优异的工业化方法。
附图简述
图1表示蔗糖羧酸钠盐的HPLCi普。
图2表示将蔗糖羧酸钠盐进行酵母同化后的葡糖醛酸和/或葡糖醛 酸内酯的结晶原液的HPLC镨。
图3表示所得葡糖醛酸内酯的HPLC谱。
实施发明的最佳方式
以下详细说明本发明。
本发明的葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯的制备方法中的 一 系列反应 如下所示。 [化1]<formula>formula see original document page 6</formula>
本发明中使用的蔗糖(化学式CuHuO! 0是植物通过光合作用合成 的非还原性二糖类，主要是由甘蔗、甜菜的榨汁液反复纯化、结晶制备。 本发明中，对于蔗糖的来源等没有限制，优选为精制糖，进一步优
选为清净汁、原料糖、甜菜糖、槭糖浆等。只要含有蔗糖均可使用，例
如有废糖蜜、加糖调制品、果糖低聚糖等含蔗糖的物质等，可以考虑价
格和制备步骤适当选择。
对于将蔗糖氧化的方法可利用现有方法。即，可将硝酸、亚硝酸以
及它们的盐等无机氮化合物，锰、铬、铅化合物等金属化合物，其它的
卤素、臭氧、氧等作为氧化剂。还可以使用氧化铂、铂碳、氧化钒、载
钯碳等作为氧化剂，但该方法中产生副产物。
因此，优选如专利文献7所示，与吸附有胺氧化物的树脂一起使用
电解氧化的含卣素化合物，对构成蔗糖的葡萄糖部分的伯羟基(1級水
酸基)进行选择性氧化，制备葡糖醛酸基-果糖苷。
最有效的方法如日本专利第3556690号记载，是通过 尸^wc/og/wcowoZ ac^ race /^rayb&gewM等微生物进行氧化发酵。
该方法中，对构成蔗糖的葡萄糖部分的伯羟基进行选择性氧化，可 以制备葡糖醛酸基-果糖苷(P-D-果糖基-(2—l)-a-D-葡糖醛酸及其盐)。
酶作用，可制备蔗糖羧酸(葡糖醛酸基-果糖苷)(及其盐)。微生物发酵或 使用酶进行的氧化反应可在温和条件下进行，因此可以安全且对环境没 有影响地制备目标产物。并且设备投资较少。
总之，可以将构成蔗糖的葡萄糖部分的伯羟基进行选择性氧化，制 备含有蔗糖羧酸(及其盐)(葡糖醛酸基-果糖苷)的反应液。
为了获得目标葡糖醛酸或葡糖醛酸内酯，可以使酵母等具有转化酶 活性的微生物与上述方法中制备的蔗糖羧酸或其盐(葡糖基-果糖苷)作 用。酵母等可以水解并同化葡糖醛酸基-果糖苷的果糖部分。结果可获得 目标葡糖醛酸或葡糖醛酸内酯。
使酵母等与蔗糖羧酸或其盐(葡糖醛酸基-果糖苷)作用时的条件只 要是酵母等可以水解并同化葡糖醛酸基-果糖苷的果糖部分的条件即 可。
上述反应中，用于溶解蔗糖羧酸或其盐(葡糖醛酸基-果糖苦)的溶剂 优选水。
上述反应中，蔗糖羧酸或其盐(葡糖醛酸基-果糖苷)的浓度通常为
1-50%,优选5-30%。
上述反应的温度通常是0-60。C的范围，优选15-4(TC,只要是通过 酵母等水解并同化果糖部分进行的水解且同化将其从该体系中除去的
条件即可，并没有限定。
上述反应的pH通常为3-10,优选4-8，根据酵母等的种类，其最佳 值也不同，因此，只要是供试酵母等可以水解并同化果糖部分的条件即 可，对此并没有特别限定。
通常反应进行的同时pH有降低的倾向，但只要在上述范围内则无 需调节pH值。反应时优选进行搅拌，由此可以使酵母等的增殖和同化 得到进展。
可用于水解蔗糖羧酸或其盐的微生物是具有转化酶活性的微生 物，特别优选酵母。酵母的种类是以例如面包酵母、酿酒酵母为代表的 酵母属，包括假丝酵母属(C"^fe/")、毕赤氏酵母属(尸ZC/H")、裂殖糖 酵母属(Sc/^oracc/^rom，e力等。除此之外，即使是真菌、细菌，只要 具有转化酶活性、可同化果糖部分即可，均可在本发明中使用。
考虑到由本发明得到的葡糖醛酸或葡糖醛酸内酯的安全性、以及这 些化合物在食品、药物等领域中的应用，微生物优选使用面包酵母、啤 酒酵母为代表的酵母属的酵母。进一步优选使用价格便宜且转化酶活性 强的面包酵母。
向反应体系中添加的酵母的量根据反应时间、温度、浓度、pH等 条件而不同，通常为0.1-10%,优选1-5%。
反应时间通常为1-240小时，优选24-120小时，只要是酵母等可水 解果糖部分且可同化的条件即可，对此没有限定。
酵母等可以采用海藻酸钠等已报道的方法等固定，由此使用后可以 回收，可以降低成本，因此是优选的方案。
反应进行过程中，果糖通过同化被从反应体系中除去，然后除去酵 母等，浓缩，脱色，脱盐。
酵母在同化被水解的果糖并增殖的同时生成乙醇和二氧化碳、甘 油、有机酸等。其中，乙醇和二氧化碳可通过加热或浓缩时除去。乙醇 可回收另行使用。
含有所得葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯的反应液含有盐、有机酸、着 色物、来自微生物的蛋白质等，因此可使用具有酸性或碱性、或者两者
性质的树脂除去。还可根据需要使用活性碳、电透析装置等。
可使用对糖或糖衍生物进行结晶时的常用方法由含有脱色、脱盐的
葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯的溶液获得目标产物。具体来说，将该溶液
浓缩，然后接种葡糖醛酸内酯或葡糖醛酸的晶体，使其结晶。
通常，通过一定的温度和时间，葡糖醛酸和葡糖醛酸内酯实现平
衡。葡糖醛酸内酯容易结晶，因此通常可将浓度调节成固体成分含量
40-70%,接种葡糖醛酸内酯的晶体，使目标产物晶析。而想获得葡糖醛 酸的晶体时，可以将固体成分含量浓缩至65%或以上，使葡糖醛酸的晶 体晶析。
含有晶体的溶液可通过离心等分离，再次浓缩，再次结晶，将上述 步骤反复进行，可以高效回收目标产物。
通过上述一系列反应，可以以重量比20-40%的高收率由原术+蔗糖 制备目标产物。本发明中，通过使用廉价的蔗糖作为原料，可以低成本 制备目标产物。
如日本特许第3556690号记载，通过使用微生物进行蔗糖的氧化反 应，可以在整个步骤中采用温和的条件制备目标产物，因此对环境的不 良影响小。
由本发明的制备方法得到的葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯具有与由 已知方法得到同等或更高的纯度，因此与以往同样，作为具有肝功能恢 复作用、恢复疲劳作用、缀合解毒作用、抗类风湿作用等的物质，在药 品工业、食品工业、化妆品工业、化学合成品工业等各领域中具有广泛 用途。
实施例1
通过以下实施例进一 步详细说明本发明，但本发明并不受其限定。 (1)蔗糖羧酸钠盐的制备
按照日本特许第3556690号实施例1所述方法，使用氧化酶生产 菌，由360 kg蔗糖(白砂糖)制备等量的蔗糖羧酸钠盐(葡糖醛酸基-果糖 苷)的溶液。即，向发酵罐中加入30kg蔗糖和250L水，溶解，再向上 述所制备的溶液中加入50 L在同等量的发酵罐中另外制备的 尸^ewc/og/wcowo6a"er racc/zaro^"ogewes洗涂菌液，使总量为300 L。 接 着在32。C下一边以200rpm搅拌一边以100 L/分钟的比例通入空气，进
行24小时反应，得到目标蔗糖羧酸钠盐。接着除去菌体，根据活性有
无再次使用，将上述方法进行12次，制备360kg蔗糖一羧酸钠盐(葡糖
酪酸基-果糖苦)固体成分的溶液。
(2) 蔗糖一羧酸钠盐的分解
将上述(1 )得到的60 kg蔗糖羧酸钠盐的固体成分的量的溶液浓缩至 30%,然后在37。C下添加按固体成分计为3% (10.8 kg)的面包酵母 (Oriental Yeast Co., Ltd.制备、FD-1),进行72小时水解反应。反应中并 未进行体系的pH控制，但pH最终还是在4附近。水解结束后，在80 。C下加热5分钟进行灭菌，进行UF过滤，回收滤液。滤液用浓缩装置((株) 大川原制作所制造、旋转蒸发)浓缩至50%,回收滤液中所含的乙醇(通 过酵母同化水解产物生成)。将同样的方法重复6次，得到蔗糖羧酸浓缩 液。
接着浓缩液分6次过50 L活性^碳柱(白鹭、日本EnviroChemicals ,Ltd. 制备)、50 L石咸性离子交换树脂(Amberlite IRA-96SB、Organo Corporation 制备)、150L强酸性离子交换树脂(DiaionPK-216、三菱化学(林)制备)， 进行脱色、脱盐。
(3) 葡糖醛酸内酯的结晶
将上述所得脱盐液用浓缩装置((林)大川原制作所制造、旋转蒸发) 浓缩至50%,制成结晶原液。该结晶原液转移到结晶罐(月岛机械(株) 制造)中，浓缩至62%,在45。C附近使反应液中的葡糖醛酸和葡糖醛酸 内酯的比例平衡改变，增加葡糖醛酸内酯的含量，然后加入50g内酯种 晶，自然冷却过夜，使其结晶。
第二天， 一边减压浓缩一边使晶体生长(68%、 42°C),然后升温至 45-60。C。接着提高溶液的流动性，然后转移到助晶机(月岛机械(林)制造) 中， 一昼夜间冷却至20°C (2。C/小时)。所得的内酯晶体通过离心(1200 rpm)回收，用70%乙醇洗涤，用晾架式干燥机在5(TC下干燥。
以上操作中， 一次结晶可以得到28.1 kg晶体。回收滤液，进行同 样的结晶，可回收100kg葡糖醛酸内酯。
结晶原液中的在酵母同化步骤中生成的甘油和未知成分可简单地 通过结晶除去。
所得葡糖醛酸内酯的纯度通过HPLC (柱岛津制作所SCR-101H 柱、流动层20mM硫酸、检测IR、流速0.5ml/分钟)确认，纯度为 99.9%或以上。HPLC的洗脱时间与葡糖醛酸内酯试剂的相同。
实施例2
按照实施例1的方法，由15kg蔗糖制备等量的蔗糖羧酸钾盐。
从其中取100g蔗糖羧酸钾盐，向其中加入7g市售的面包酵母(干 酵母)，在37。C下进行水解反应以及同化反应。
结果，24小时以内蔗糖羧酸被水解，得到含有葡糖醛酸和葡糖醛酸 内酯的溶液。接着，将该溶液过1 L活性石友柱(白鹭、日本 EnviroChemicals ,Ltd.制备)、1 L碱性离子交换树脂(Amberlite IRA-96SB、 Organo Corporation制备)、3 L强酸性离子交换树脂(Diaion PK-216、三菱化学(抹)制备)，进行脱色、脱盐。
该脱盐液在4(TC下浓缩至65%，加入0.2 g葡糖醛酸的种晶，自然 冷却。将析出的晶体离心，得到40g葡糖醛酸。
所得葡糖醛酸的纯度通过HPLC(柱岛津制作所SCR-101H柱、流 动层20mM硫酸、检测IR、流速0.5ml/分钟)确认，纯度为99.9% 或以上。
实施例3
按照实施例1记载的方法，由15 kg原料糖制备等量的蔗糖羧酸钠盐。
接着同样按照实施例1的方法，将15 kg蔗糖羧酸钠盐溶液浓缩至 30%,然后按固体成分计添加3。/o面包酵母(Oriental Yeast Co., Ltd.制 备、FD-1)，在37。C下反应72小时。
将反应液同样过活性碳柱和脱盐树脂柱，脱色、脱盐。所得脱盐液 在50。C下浓缩至58%,加入20 g葡糖醛酸内酯的种晶，使晶体析出。 接着进行离心，得到2kg葡糖醛酸内酯。
实施例4
按照实施例1的方法，由20 kg甜菜糖制备等量的蔗糖羧酸钠盐。 以下同样按照实施例1的方法，将20kg蔗糖羧酸钠盐溶液浓缩至30。/0,
然后按照固体成分计添加4。/。面包酵母(Oriental Yeast Co., Ltd.制备、 FD-1),在37。C下反应72小时。
将反应液同样过活性碳柱、脱盐树脂柱，脱色、脱盐。将所得脱盐 液在50。C下浓缩至58%,加入20g葡糖醛酸内酯的种晶，使晶体析出。 然后进行离心，得到4kg葡糖醛酸内酯。
产业实用性
根据本发明，可以以高收率由廉价的原料蔗糖制备葡糖醛酸和/或葡 糖醛酸内酯。
并且在该制备步骤中，不使用硝酸等氮氧化物等作为氧化剂，或者 即使使用其量也极少，因此可以安全且对环境没有影响地制备目标产物。
权利要求
1.葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯的制备方法，其特征在于使蔗糖氧化，制成蔗糖羧酸或其盐，接着加入具有转化酶活性的微生物水解并同化该蔗糖羧酸或其盐的果糖部分，收集生成的葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯。
2. 权利要求1的制备方法，其中，具有转化酶活性的微生物是酵母。
3. 权利要求1的制备方法，其中，蔗糖是精制糖、清净汁、原料 糖、甜菜糖、加糖调制品、槭糖浆或废糖蜜。
4. 权利要求1的制备方法，其中，向蔗糖羧酸或其盐中加入具有 转化酶活性的微生物、使该蔗糖羧酸或其盐的果糖部分水解的反应是在 温度0-6(TC、 pH3-10下使该微生物与浓度为1-50%的蔗糖羧酸或其盐水 溶液作用进行的。
全文摘要
本发明的目的在于提供可以高收率、廉价、容易且安全地制备D-葡糖醛酸和D-葡糖醛酸内酯的方法。涉及葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯的制备方法，其特征在于将蔗糖氧化，制成蔗糖羧酸(及其盐)(葡糖醛酸基-果糖苷，β-D-果糖基-(2→1)-α-D-葡糖醛酸及其盐)，接着加入酵母等，将该蔗糖羧酸(及其盐)的果糖部分水解，同时同化，收集生成的葡糖醛酸和/或葡糖醛酸内酯。
文档编号C12P19/00GK101171341SQ20068001589
公开日2008年4月30日 申请日期2006年3月30日 优先权日2005年5月11日
发明者伊藤哲也, 原耕三, 岸野惠理子, 滨保健一, 田所宏基, 藤田孝辉 申请人:盐水港精糖株式会社