在acs4基因中具有非转基因改变的番茄植物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物生物技术和植物育种的领域。提供了包含具有一个或多个突变的 acs4等位基因的番前（Solanum Iycopersicum)植物，所述突变导致产生与野生型Acs4蛋 白相比acs4蛋白功能丧失的或活性降低的突变acs4蛋白。本发明提供了植物，与野生型 Acs4等位基因纯合型的番茄相比，所述植物的果实显示出更低的乙烯产生和/或更慢的果 实成熟和/或更长的贮藏期。此外，本发明提供了本发明的番茄植物的番茄果实、种子、花 粉、植物部分和后代。本发明还提供了包含本发明植物果实或由其组成的食品和食品产品。
[0002] 本发明还提供了内源性acs4基因和由所述基因编码的acs4蛋白，具有至少一个 人工诱导的非转基因突变。
[0003] 在另一个实施方案中，本文提供了用来制备在其基因组中包含一个或多个突变 acs4等位基因的番茄植物的方法。
【背景技术】
[0004] 番茄的育种的目的在于产生被最佳地改造为适于生长和贮藏条件的商业品种。育 种者面临的挑战是在收获后的果实硬度与消费者对味道、质感和颜色的需求之间寻找一种 改进的平衡。这些消费者需求与果实成熟密切相关。果实成熟是一个复杂的发育过程，其负 责将含种子的器官转化成能吸引种子传播者（seed dispenser)和农业消费者的组织。与 果实成熟相关的改变（特别是收获后软化）限制了新鲜番茄的贮藏期。
[0005] 对于番茄果实的生长和发育，可以识别出许多连续的阶段：花发育，授粉，接着发 生特征为高频率的细胞分裂的早期果实发育，而且所述果实的大小快速增大，这主要是由 于细胞扩增。在第三阶段结束时，果实达到绿熟期。在第四阶段期间，发生果实成熟，其以 颜色和味道以及果实硬度和质感的变化来表征。
[0006] 番茄红素和胡萝卜素的累积致使形成番茄果实的特征性红色。一般而言，可区 分不同的着色阶段：绿熟期（mature green)、破色期（breaker)、粉红期（pink)和红熟期 (red)。在破色期阶段，开始了典型的红色色素沉积。红熟阶段或红熟收获果实阶段是果实 在其主要部分上都达到其成熟颜色的阶段。
[0007] 除了所述颜色改变，在果实成熟过程中，酶活性导致细胞壁的中间层状区域发生 降解，该降解导致表现为果实软化和果实质感丧失的细胞松弛。通常，果实软化的测量方式 为对压缩的外部抵抗力，这可以通过例如果实硬度计（penetrometer)进行量化。
[0008] 对已知参与成熟的单个基因的修饰还没有获得正常成熟但具有最小的组织软化 的果实。
[0009] 乙烯促进呼吸跃变型果实例如番茄的成熟和衰老。乙烯通过增加1-氨基环丙 烷-1-羧酸（ACC)合酶（ACS)和ACC氧化酶（ACO)而自我催化其自身的生物合成。ACS也 称作1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶；Le-ACS ;或S-腺苷基-L-甲硫氨酸甲基硫代腺苷-裂 解酶。因此，ACS和ACO的数量增加导致L-甲硫氨酸到乙烯的转化增加。在番茄中已经鉴 定了至少八种 ACS 基因（LEACS1A、LEACS1B 和 LEACS2-7) (Alexander et. al.，Journal of Experimental Botany，Vol 53，No 377, pp2039-2055, 2002)，并且各种 ACS 具有不同的表达 方式。
[0010] ACC合酶（ACS)是催化从S-腺苷基甲硫氨酸合成1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC) 的酶。然后ACO催化ACC转化为乙稀。例如Stearns和Glick(Biotechnology Advances 2003, vol 21pp 193-210)描述了乙烯的生物合成，其以引用的方式纳入本文。
[0011] ACS属于5' -磷酸吡哆醛（PLP)依赖酶的α-家族，并且与该家族的其他成员 (如天冬氨酸氨基转移酶（AATase)和酪氨酸氨基转移酶（TATase))具有适度水平的相 似性。Capitani等人已经描述了来自不同来源的ACS的结构。在对八种ACS蛋白（苹 果（Malus domestica)、绿豆（Phaseolus aureus)、马铃薯（Solanum tuberosum)、天竺 葵（Pelargonium hortorum)、烟草（Nicotiana tabacum)、甜瓜(Cucumis melo)、番前 (Lycopersicon esculentum)和甘蓝（Brassica oleracea))的序列比对中，他们描述了 在所述Capitani的出版物的图1中以红色和黄色指示的保守区。定义了三个结构域： 第52-318位残基的一个大结构域，以及第20-49位和第333-430位残基的两个小结构 域。定义了连接所述大结构域和第二小结构域的螺旋α 12 (Capitani et al·，Journal of Molecular Biology, 1999, vol 294,pp 745-756)〇
[0012] 已经提出了在呼吸跃变型植物调节乙烯产生中起作用的两个系统。第一个在正 常的营养生长中起作用（系统1);它是自我抑制的并且负责产生基础乙烯水平，所述基础 乙烯水平在所有组织（包括非呼吸跃变型植物的那些组织）内都可以检测到。系统1在 果实发育中继续直到获得达到果实成熟的能力。然后到达过渡期，在此期间，LEACS1A和 LEACS4被激活，导致乙烯水平升高。乙烯水平的升高诱导LEACS2的表达，所述LEACS2启 动在呼吸跃变型果实的成熟过程中发挥作用的系统2。在系统2中，乙烯的产生是自我催 化的。已经在转基因植物中使用LEACS2的反义抑制来研宄乙烯调节的这种复杂性（Barry et al.，Plant Physiology vol 123, pp 979-986, 2000)〇
[0013] W02005/016504公开了 "保绿"植物，即与标准对照相比其叶片衰老延缓的植物表 型。其公开了具有中断的ACS2、ACS6、ASC7基因的植物，所述中断抑制了所述ACS的表达或 活性。
[0014] Yokotani等人描述了所有已知LeEIL基因（乙稀不敏感类基因 （Ethylene Insensitive Like gene))均被抑制的转基因番前以研宄乙稀生物合成的调节机制 (Yokotani et al, Journal of Experimental Botany, vol 60,pp 3433-3442, 2009)〇
[0015] 因此，需要具有改良的乙烯产生的栽培番茄植物，与野生型番茄植物相比，其番茄 果实的成熟延缓和/或贮藏期更长。
【发明内容】
[0016] 因此，本发明的目的是产生并鉴定番茄种的栽培植物，所述栽培植物的果实具有 延迟的成熟和/或更长的果实贮藏期。
[0017] 因此，本发明涉及包含具有一个或多个突变的acs4等位基因的番茄种的栽培植 物，所述突变导致产生与野生型Acs4蛋白相比acs4蛋白功能丧失或活性降低的突变acs4 蛋白，但是当所述突变等位基因以杂合或纯合形式存在时，所述突变acs4蛋白具有足够的 功能以使番茄果实成熟到红熟期。
[0018] 一般性定义
[0019] 术语"核酸序列"（或核酸分子）是指单链或双链形式的DNA或RNA分子，尤其是 编码本发明的蛋白质或蛋白质片段的DNA。"分离的核酸序列"是指这样的核酸序列，即其 不再处于分离出其的天然环境中，例如，在细菌宿主细胞中或者在植物细胞核或质体基因 组中的核酸序列。
[0020] 术语"蛋白质"或"多肽"可互换使用并且指的是由氨基酸链组成的分子，不管具体 的作用模式、大小、三维结构或来源。因此，Acs4蛋白的"片段"或"部分"仍可以称作"蛋 白质"。"分离的蛋白质"用于指不再处于其天然环境中的蛋白质，例如在体外或者在重组的 细菌或植物宿主细胞中。
[0021] 术语"基因"指DNA序列，其包含与适合的调节区（例如启动子）可操作地连接的 区域（转录区），所述区域（转录区）在细胞中被转录为RNA分子（例如mRNA或RNAi分 子）。因此，基因可以包含若干个可操作地连接的序列，例如启动子、含有例如参与翻译起始 的序列的5'前导序列、（蛋白质）编码区（cDNA或基因组DNA)和含有例如转录终止位点 的3'非翻译序列。基因可以是内源基因（在来源的物种中）或是嵌合基因（例如转基因 或同源转基因（cis-gene))。
[0022] "基因的表达"指与适合的调节区（特别是启动子）可操作地连接的DNA区域转录 为RNA的过程，所述RNA具有生物活性，即其能够被翻译为有生物活性的蛋白质或肽（或活 性肽片段）或其本身具有活性（例如，在转录后基因沉默或RNAi中具有活性）。编码序列 可以是有义方向的并编码所需的、有生物活性的蛋白质或多肽、或活性肽片段。
[0023] "活性蛋白质"或"功能性蛋白质"是具有在体外（例如通过体外活性测定）和/ 或在体内（例如通过所述蛋白质赋予的表型）可测量的蛋白质活性的蛋白质。"野生型"蛋 白质是存在于野生型植物中的完全功能性蛋白质。本文的"突变蛋白质"是在编码该蛋白 质的核酸序列中包含一个或多个突变的蛋白质，其中所述突变导致（所述突变核酸分子编 码的）"功能降低"或"功能丧失"的蛋白质，例如在体内可测量的（例如通过所述突变等 位基因赋予的表型可测量的）。
[0024] "功能降低的acs4蛋白"或"活性降低的acs4蛋白"是指突变acs4蛋白，与野生 型Acs4蛋白相比，其具有降低的催化由S-腺苷甲硫氨酸合成ACC的催化活性，从而导致 乙烯合成减少。当编码所述突变蛋白的等位基因以纯合或杂合形式存在于番茄植物中时， 所述acs4蛋白的催化活性的降低影响了包含这类功能降低的acs4蛋白的果实的成熟行 为，即果实的成熟延迟或贮存期更长。这种功能降低的acs4蛋白可以通过"部分敲除突变 acs4等位基因"（例如，在其核酸序列中包含一个或多个突变的野生型Acs4等位基因）的 转录和翻译来获得。在一个方面，这种部分敲除突变acs4等位基因是包含一个或多个突变 的野生型Acs4等位基因，所述突变优选地导致产生其中至少一个保守的和/或功能性的氨 基酸被另一个氨基酸置换以使得生物活性显著降低但不完全消失的asc4蛋白。但是，番茄 Acs4等位基因中的其他突变（例如一个或多个无义、错义、剪接位点或移码突变）也可以 导致功能降低的acs4蛋白，并且这种功能降低的蛋白与野生型ACS4蛋白相比，可以有一个 或多个氨基酸被替换、插入或缺失。这种部分敲除突变acs4等位基因也可以编码显性负性 的acs4蛋白，该蛋白能够对同一细胞内的其他Acs4蛋白的生物活性产生不利影响。这种 显性负性的acs4蛋白可以是这样的acs4蛋白：其仍然能够如野生型Acs4蛋白一样与相 同的元件相互作用但是阻断了其功能的一些方面。显性负性的acs4蛋白的实例是这样的 acs4蛋白：其缺少对于激活的关键的特定氨基酸残基缺失，或在所述特定的氨基酸残基中 具有修饰，但是仍然包含其结合结构域，使得不仅其自身的生物活性降低或消失，而且它们 还通过与存在于细胞中的野生型和/或部分敲除acs4蛋白竞争结合位点从而降低细胞内 的总acs4活性。突变等位基因可以是"天然突变"等位基因（其是天然存在的突变等位基 因，例如，没有人工应用诱变剂的情况下而自发产生的）或"诱导突变"等位基因（其是由 人工干扰诱导的，例如，通过诱变）。
[0025] "功能丧失的acs4蛋白"指突变acs4蛋白，其与野生型Acs4蛋白相比基本上没有 催化从S-腺苷甲硫氨酸合成ACC的催化活性，致使与野生型Acs4蛋白相比乙烯合成减少。 当编码所述突变蛋白的等位基因以纯合或杂合的形式存在于番茄植物中时，所述缺失催化 活性的合成影响了包含这种功能丧失的acs4蛋白的果实的成熟行为。这种"功能丧失的 acs4蛋白"的纯合型番茄植物的果实仍可以产生由其他蛋白（例如其他Acs蛋白如AcslA) 催化的乙烯。因此，这种"功能丧失的acs4蛋白"的纯合型番茄植物的果实仍可以成熟，但 是成熟可能延迟和/或贮存期可能更长。
[0026] 编码蛋白质的核酸分子中的"突变"是与野生型序列相比一个或多个核苷酸的改 变，例如通过一个或多个核苷酸的置换、缺失或插入。"点突变"是单个核苷酸的置换，或单 个核苷酸的插入或缺失。
[0027] "无义"突变是编码蛋白质的核酸序列中的（点）突变，由此一个密码子变为终止 密码子。这导致在mRNA中存在提前终止密码子并导致截短的蛋白。截短的蛋白可能具有 降低的功能或丧失功能。
[0028] "错义"或非同义突变是编码蛋白质的核酸序列中的（点）突变，由此一个密码子 变为编码不同氨基酸的密码子。所产生的蛋白质可能具有降低的功能或丧失功能。
[0029] "剪接位点"突变是编码蛋白质的核酸序列中的突变，由此前mRNA(pre-mRNA)的 RNA剪接发生改变，产生了具有与野生型不同的核苷酸序列的mRNA和具有与野生型不同的 氨基酸序列的蛋白质。所产生的蛋白质可能具有降低的功能或丧失功能。
[0030] "移码"突变是编码蛋白质的核酸序列中的突变，由此mRNA的读码框发生改变，产 生不同的氨基酸序列。所产生的蛋白质可能具有降低的功能或丧失功能。
[0031] 调节序列（例如基因的启动子）中的突变是例如通过一个或多个核苷酸的置换、 缺失或插入造成的与野生型序列相比的一个或多个核苷酸的改变，从而导致例如产生减少 的或不产生所述基因的mRNA转录产物。
[0032] "沉默"指下调或完全抑制靶基因或基因家族的基因表达。
[0033] 基因沉默方法中的"靶基因"是这样的基因或基因家族（或基因的一个或多个具 体等位基因）：当嵌合沉默基因（或"嵌合RNAi基因"）被表达并且例如产生沉默RNA转录 产物（例如能够沉默内源靶基因表达的dsRNA或发夹RNA)时，其内源性基因表达被下调或 完全抑制（沉默）。在诱变方法中，靶基因是待突变的内源基因，导致基因表达的改变（降 低或丧失）或所编码的蛋白质的功能的改变（降低或丧失）。
[0034] 本文使用的术语"可操作地连接"指处于功能性关系中的多核苷酸元件的连接。当 一种核酸与另一核酸序列置于功能性关系中时，该核酸被"可操作地连接"。例如，如果启动 子（或者更确切地说是转录调控序列）影响编码序列的转录，则该启动子与所述编码序列 可操作地连接。可操作地连接意指所连接的DNA序列通常是相邻，并且当需要连接两种蛋 白质编码区时所连接的DNA序列是邻近的且处于读码框中以产生"嵌合蛋白"。"嵌合蛋白" 或"杂合蛋白"是由不同的蛋白"结构域"（或基序）组成的蛋白质，所述蛋白本身不是天然 存在的，但是连接后形成了显示出被连接的结构域的功能的功能性蛋白。嵌合蛋白也可以 是两个或更多个天然存在的蛋白的融合蛋白。
[0035] 术语"食品"是被消耗以给机体提供营养支持的任何物质。其通常是植物或动物 来源的，并且包含必需营养物质（例如碳水化合物、脂肪、蛋白质、维生素或矿物质）。所述 物质被生物体摄取并被生物体的细胞吸收以努力产生能量、维持生命或刺激生长。术语食 品包括被消耗以给人类和动物机体提供营养支持的物质。
[0036] 术语"贮藏期"或"收获后贮藏期"是指在果实被认为不适合出售或食用（'坏的'） 之前给予果实的（平均）时间长度。贮藏期是产品能被储存的时间段，在该时期内所定义的 具体比例货物的质量在预期的分配、储藏和展示的条件下仍然是可接受的。贮藏期受以下 几个因素的影响：光和热的暴露、气体的传送（包括湿度）、机械应力和例如微生物的事物 的污染。通常围绕所述果实的硬度/柔软度参数对产品质量进行数学建模。可将贮藏期定 义为植物株系的果实开始变坏并且不适合出售或食用时所花费的（平均）时间，例如从植 物的第一果实进入破色期或转色期（turning stage)开始或从第一果实完全变红开始或从 收获时开始。在一个实施方案中，本发明的突变体具有比野生型植物的贮藏期显著更长的 贮藏期，例如，当植物在相同的条件下生长并且果实被用相同的方式处理且在相同的条件 下保存时，从第一果实处于破色期（或转色期、粉红期、红熟期或从收获时起）直到所述第 一果实开始变'坏'并且不适合出售或食用的天数是明显更长的，例如，比对照植物（例如 野生型Acs4/Acs4植物）的果实的贮藏期长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天。因 此，为了确定从特定阶段（例如从破色期或其后期阶段）到变'坏'阶段所需要的天数，例 如，可以将野生型对照植物（在与突变体植物相同的条件下生长的并且处于相同的发育阶 段）的第一果实进入特定阶段（例如，