短的acs4蛋白，其包含SEQ ID N0:1或其变体 的第1-450位、第1-400位、第1-350位、第1-300位、第1-250位或第1-203位氨基酸。
[0103] 本发明还涉及含有编码cDNA(mRNA)的内源性acs4基因的番茄种子、植物和植物 部分，所述cDNA(mRNA)与SEQ ID N0:8具有基本序列同一性并且在所述内源性acs4基因 具有至少一个非转基因突变，其中所述至少一个非转基因突变导致产生与野生型Acs4蛋 白相比acs4蛋白功能丧失或活性降低的突变acs4蛋白。优选地，与编码SEQ ID NO: 1的 蛋白或其功能性变体的功能性野生型Acs4等位基因纯合型的番茄相比，所述突变导致降 低的乙烯产生和/或更加缓慢的果实成熟和/或更长的贮藏期。本文任何位置中描述的突 变可以是人工诱导的或其可以是自然突变。优选地，所述植物是栽培的番茄植物。在一个 实施方案中，所述突变产生终止密码子或氨基酸置换。在一个实施方案中，选自野生型Acs4 蛋白的Ala248、Val250、Ser279、Thr316和Leu321的氨基酸被置换为不同的氨基酸，例如 Ala248Val、Val250Glu、Ser279Asn、Thr316Ile 和 Leu321Phe。在另一个实施方案中，所述 突变选自 SEQ ID N0:8 的 G836A、C743T、A610T、G963T、T749A*C947T。
[0104] 在另一方面，本发明涉及含有内源性突变acs4基因的番茄种子、植物和植物部 分，其中所述非转基因突变在由acs4基因编码并由其转录并翻译产生的acs4蛋白中产生 氨基酸的改变，其中所述氨基酸改变选自SEQ ID N0:1的S279N、A248V、L321F、V250E、T316I 及第204至476位氨基酸的完全缺失。
[0105] 在另一方面，本发明涉及与SEQ ID N0:2具有基本序列同一性的acs4蛋白。在另 一方面，本发明涉及与SEQ ID N0:3具有基本序列同一性的acs4蛋白。在另一方面，本发 明涉及与SEQ ID N0:4具有基本序列同一性的acs4蛋白。在另一方面，本发明涉及与SEQ ID N0:5具有基本序列同一性的acs4蛋白。在另一方面，本发明涉及与SEQ ID N0:6具有 基本序列同一性的acs4蛋白。在另一方面，本发明涉及与SEQ ID N0:7具有基本序列同一 性的acs4蛋白。本发明还涉及含有编码这些蛋白质的核苷酸序列的番茄种子、植物和植物 部分。
[0106] 在另一方面，本发明涉及本发明的植物的番茄果实、种子、花粉、植物部分和/或 后代。优选地，本发明涉及本发明的植物的果实或种子。更优选地，本发明涉及具有延迟的 成熟和/或增加的收获后贮藏期的番茄果实，所述延迟的成熟和/或增加的收获后贮藏期 是所描述的至少一个acs4等位基因中的非转基因突变引起，由本文别处所述。
[0107] 在一方面，本发明番茄植物具有延迟的破色期，意指本发明突变体的第一果实和/ 或所有果实与野生型Acs4/Acs4对照相比需要显著更多的天数（例如多1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10天或更多天）来进入破色期。
[0108] 在另一方面，本发明番茄植物的果实从破色期进入红熟期需要更多的天数，例如， 本发明植物的果实从破色期进入红熟期需要的天数比野生型Acs4/A CS4对照多1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13 或 14 或更多天。
[0109] 在另一方面，本发明涉及本发明植物的果实，所述果实具有的贮藏期与野生型 Acs4等位基因纯和型的番茄果实的贮藏期相比长至少2天。在另一方面，本发明涉及具有 降低的乙烯产生的本发明植物的果实，所述降低的乙烯产生与野生型Acs4等位基因纯和 型的番茄相比降低至少15%或降低至少20%。
[0110] 在一个具体的方面，本发明的番茄植株具有与野生型植物的贮藏期相比显著更长 的贮藏期，例如，当在相同的条件下种植植物且用相同方式处理果实并在相同条件下保存 果实时，从第一果实处于破色期（或转色期、粉红期、红熟期或从收获时起）直到其开始变 '坏'并不适合出售或食用的天数与对照植物（例如野生型Acs4/A CS4植物）的果实相比显 著更长，例如，长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天。
[0111] 延迟的成熟和/或延长的贮藏期可以具有这样的优势，即有更多的时间可以用于 将采摘的果实运输至例如零售商和超市，和/或消费者可以将果实保存更长的时间。可以 在绿熟期或破色期或其后收获番茄。在破色期之前收获时，需要乙烯暴露，而在破色期附近 或其后收获则不需要乙烯接触，这是由于果实自身产生乙烯。如图2中所示，本发明的成熟 延迟的突变体在粉红期和红熟期与野生型果实相比产生更少的乙烯，但是产生的乙烯足以 使其成熟到红熟期。在本发明的一个方面，提供了含有编码功能丧失的acs4蛋白或功能 降低的acs4蛋白的突变acs4等位基因的番茄植物，其中所述植物的果实与野生型（Acs4/ Acs4)植物相比产生明显更少的乙烯。"明显更少的乙烯"是指在粉红期或红熟期所述果实 产生的乙稀等于或少于纯合型Acs4/Acs4果实所产生的乙稀的75%、等于或少于70%、等 于或少于65%、等于或少于60%、等于或少于55%、等于或少于50%、等于或少于45%、等 于或少于40%、等于或少于35%、等于或少于30%、等于或少于25%、等于或少于20%、或 者等于或少于15%。因此，在一方面，在粉红期产生的乙烯低于约3.5ηV (h · g)，例如等 于或低于约3nl/(h · g)、或等于或低于约2. 5nl/(h · g)、或等于或低于约2. 0nl/(h · g)、 或等于或低于约I. 5nl/(h · g)、或等于或低于约I. 0nl/(h · g)、或等于或低于约0. 5nl/ (h · g)。在一方面，在红熟期产生的乙稀低于约6nl/(h · g)，例如等于或低于约5. 5nl/ (h · g)、或等于或低于约5. 0nl/(h · g)、或等于或低于约4. 5nl/(h · g)、或等于或低于约 3. 5nl/(h · g)、或等于或低于约3nl/(h · g)、或等于或低于约2. 5nl/(h · g)、或等于或低于 约2. Onl/ (h · g)、或等于或低于约I. 5nl/ (h · g)、或等于或低于约1.0 nl/ (h · g)、或等于或 低于约 0. 5nl/ (h · g)。
[0112] 在另一方面，本发明涉及具有由至少一个acs4等位基因中的非转基因突变引起 的更长的成熟期和/或增加的收获后贮藏期的本发明植物的番茄果实，其中所述更长的成 熟期和/或更长的收获后贮藏期为野生型Acs4等位基因纯合型的番茄果实的成熟期和/ 或收获后贮藏期的至少110%。优选地，所述成熟期和/或收获后贮藏期为野生型Acs4等 位基因纯合型的番茄果实的成熟期和/或收获后贮藏期的至少115%，更优选至少120%， 甚至更优选至少125%。在另一方面，所述成熟期和/或收获后贮藏期为野生型Acs4等位 基因纯合型的番茄果实的成熟期和/或收获后贮藏期的至少135%，更优选至少150%，甚 至更优选至少165%。在另一方面，所述成熟期和/或收获后贮藏期为野生型Acs4等位基 因纯合型的番茄果实的成熟期和/或收获后贮藏期的至少180 %，更优选至少200 %，甚至 更优选至少250%。
[0113] 在本发明的另一方面，提供了具有与本发明番茄植物相同或相似的延迟的成熟 和/或增加的IC藏期的番前植物，所述番前植物的代表性种子由Nunhems B. V.保藏并根 据布达佩斯条约按照Expert Solution(EPC2000, Rule 32(1))于2012年8月21日被接 受保藏在NCMB Ltd.(英国苏格兰，阿伯丁郡AB21 9YA，巴克斯本，克莱伯斯通区，弗格 森大厦(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn Aberdeen, Scotland AB21 9 YA，UK))。种子被给予以下保藏号：NCMB 42034(突变体2477)、NCMB 42037(突变体 4043)、NCMB 42038(突变体 4222)、NCMB 42039(突变体 4691)、NCMB 42041(突变体 5251)〇
[0114] 根据另一方面，本发明提供了本发明的番茄植物的细胞培养物或组织培养物。所 述细胞培养物或组织培养物包含可再生细胞。这类细胞可从叶、花粉、胚胎、子叶、下胚轴、 分生细胞、根、根尖部、花药、花、种子和茎中获得。
[0115] 还提供了可用于生长出本发明植物的种子，以及含有这类种子的包装物 (package)。本发明的植物的无性繁殖物也是本文涵盖的一个方面。同样的，涵盖了用于新 鲜食用的或用于加工的或以经加工形式的收获的果实和果实的部分。可以将果实分级、按 大小分类和/或进行包装。可以将果实切成片状或切成块状或进一步加工。
[0116] 在另一方面，本发明涉及本发明植物的一个或多个细胞。
[0117] 本发明还涉及整合本发明番茄植物的果实或果实的部分的食品和/或食品产品。 本文使用的食品指被人或动物物种食用的营养物质。实例是三明治、色拉、调味酱（sauce)、 番前酱等。
[0118] 在另一方面，本发明涉及产生本发明番茄植物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0119] a.从番茄植物中获得植物材料；
[0120] b.用诱变剂处理所述植物材料以产生诱变的植物材料；
[0121] c.分析所述诱变的植物材料以鉴定在至少一个和SEQ ID NO: 1或其变体具有基本 序列同一性的acs4等位基因上具有至少一个突变的植物。
[0122] 所述方法还可以包括对所选择的植物或所述植物的后代的番茄果实的成熟期和/ 或贮藏期进行分析，并选择其果实具有延迟的成熟和/或延长的贮藏期的植物。
[0123] 在一方面，所述突变可以选自acs4蛋白的大结构域和/或acs4蛋白的第二小结 构域（第339-438位氨基酸）中的突变。在一方面，所述突变选自导致选自以下氨基酸置 换的突变：S279N、A248V、L321F、V250E、T316I，或选自引起SEQIDN0:1的第 204 至 476 位 氨基酸或其一部分的缺失的终止密码子突变。在另一方面，所述突变选自引起选自以下的 cDNA 改变的突变：SEQ ID N0:8 的 68364、07431\46101\69631\了7494和09471'。在本方法 中，步骤a)的植物材料优选地选自番茄植物株系或栽培种的种子、花粉、植物细胞或植物 组织。更优选植物种子。在另一方面，本方法使用的诱变剂是甲基磺酸乙酯。在步骤b)和 步骤c)中，所述诱变的植物材料优选地是突变群体，例如番茄TILLING群体。
[0124] 因此，在一方面，提供了用于产生具有延迟的果实成熟和/或更长的果实贮藏期 的番茄植物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0125] a)提供番茄 TILLING 群，
[0126] b)筛选所述TILLING群的acs4基因上的突变体，特别是编码大结构域的核苷酸序 列上的突变体，和
[0127] c)从b)的突变植物中选择出其果实与野生型（Acs4/ACS4)果实相比具有降低的 乙烯产生和/或延迟的成熟和/或更长的贮藏期的那些植物（或那些植物的后代）。
[0128] 优选地将突变植物（Ml)自交一次或多次以产生用于表型分析的例如M2群或优选 M3或M4群。在M2群中，所述突变等位基因以1(突变等位基因纯合型）：2(突变等位基因 杂合型）：1(野生型等位基因纯合型）的比例存在。
[0129] 在另一方面，本发明涉及用于产生杂交番茄植物的方法，所述方法包括：
[0130] (a)获得本发明的第一番茄植物和
[0131] (b)用第二番前植物与所述第一番前植物杂交；
[0132] 其中所述杂交番茄植物包含具有一个或多个突变的acs4等位基因。其中所述突 变导致产生与野生型Acs4蛋白相比acs4蛋白功能丧失或活性降低的突变acs4蛋白。
[0133] 本发明的植物和植物部分（例如果实、细胞等）可以是所述突变acs4等位基因纯 合型或杂合型的。
[0134] 优选地，包含一个或多个突变acs4等位基因（或变体）并且产生与野生型Acs4 蛋白相比acs4蛋白功能丧失或活性降低的突变acs4蛋白的本发明植物不会产生与野生型 植物相比更少的果实。因此，优选地，每个植株的果实数目不减少。
[0135] 可通过计算机（in silico)来鉴定其他推定的ACS4基因/蛋白质，例如通过在已 有的核酸或蛋白质数据库（例如GENBANK、SWISSPROT、TrEMBL)中使用标准的序列分析软 件（例如序列相似性搜索工具（BLASTN、BLASTP、BLASTX、TBLAST、FASTA等））来鉴定核酸 或蛋白质序列。
[0136] 在一个实施方案中，提供了 acs4蛋白功能丧失或功能降低的突变Acs4蛋白（包 括变体或直系同源物，例如野生番茄近缘种的acs4蛋白）以及在其基因组中含有一个或多 个acs4等位基因的植物或植物部分，所述acs4等位基因编码acs4蛋白功能丧失或功能降 低的突变体，由此所述降低的功能赋予了与野生型Acs4等位基因纯合型的番茄相比降低 的乙烯产生和/或更慢的果实成熟和/或更长的贮藏期。
[0137] 任何类型的突变都可能导致所编码Acs4蛋白的功能降低，例如在包含所述 cDNA(SEQ ID N0:8或其变体）的所述基因组DNA中一个或多个核苷酸的插入、缺失和/或 置换。在一个优选的实施方案中，提供了与野生型Acs4等位基因纯合型的番茄相比，能够 减少乙烯产生和/或赋予更慢的果实成熟和/或更长的贮藏期的acs4核苷酸序列，藉此由 于在大结构域中的一个或多个突变而使所述核酸序列编码功能丧失的acs4蛋白或功能降 低的Acs4蛋白。
[0138] 如本文所描述，可以通过确定该突变等位基因对乙烯产生和/或成熟期和/或贮 藏期的影响来检测这类蛋白在体内的acs4蛋白功能丧失或功能降低。如本领域已知的，可 以例如使用例如诱变来产生并通过TILLING来鉴定或使用EcoTILLING来鉴定这样的植物， 即其包含编码此类突变的功能丧失的acs4蛋白或功能降低的蛋白的核酸序列并且具有与 野生型Acs4等位基因纯合型的番茄相比降低的乙烯产生和/或更慢的果实成熟和/或更 长的贮藏期。还可以使用转基因方法来检测编码突变acs4蛋白的突变acs4等位基因的体 内功能性。可以将突变等位基因与植物启动子可操作地连接，并可以通过转化将所得嵌合 基因引入番茄植物中。可以检测再生植物（或后代，例如通过自交获得的后代）的乙烯产 生和/或果实成熟期和/或贮藏期。例如可以转化包含无功能的acs4等位基因的番茄植 物以检测所述转基因 acs4等位基因的功能性。
[0139] TILLING(定向诱导基因组局部损伤）是一种常用的反向遗传技术，该技术使用常 规的化学诱变方法产生诱变个体文库，然后对所述诱变个体文库进行高通量筛选以发现突 变。TILLING将化学诱变与对混合的PCR产物的突变筛选相结合，导致对靶基因的错义和无 义突变等位基因的分离。因此，TILLING使用常规的化学诱变（例如EMS或MNU诱变）或 其他诱变方法（例如辐射，如UV)，随后高通量筛选特定靶基因（例如本发明Acs4)中的突 变。使用Sl核酸酶（例如CELl或END01)切割突变体和野生型靶DNA的异源双链体并使 用例如电泳（如LI-COR凝胶分析仪系统）检测切割产物，参见例如Henikoff et al. Plant Physiology 2004,135:630-636。TILLING已经应用于很多植物物种，例如番茄（参见
[0140] http: //tilling, ucdavis. edu/index. php/Tomato Tilling)、 稻(Till et al.2007，BMC Plant Biol 7:19)、拟南芥（Till et al. 2006,Methods Mol Biol 323:127-35)、芸苔、玉米（Till et al. 2004, BMC Plant Biol 4:12)等。
[0141] EcoTILLING也被广泛使用，由此检测天然群中的突变体，参见Till et al. 2006(Nat Protoc 1:2465-77)和 Comai et al. 2004 (Plant J 37:778-86)。
[0142] 在本发明的一个实施