方案中，编码所述突变acs4蛋白的（cDNA或基因组）核酸 序列包含一个或多个无义和/或错义突变，例如转换（将嘌呤置换为另一嘌呤（A μ G )或将嘧啶置换为另一嘧啶（C 〇 T ))或颠换（将嘌呤置换为嘧啶，或反之亦然 (C/T ο A/G ))。在一个实施方案中，所述一个或多个无义和/或错义突变位于编码任 意Acs4外显子的核苷酸序列中，更优选位于ACS4大结构域或Acs4蛋白变体的基本相似 的结构域中，即位于和SEQ ID NO: 1或其变体的第65-327位氨基酸具有至少80%、90%、 95 %、98 %、99 %的氨基酸同一性的结构域中。
[0143] 在一个实施方案中，提供了在一个外显子-编码序列上含有一个或多个无义和/ 或错义突变的acs4核苷酸序列，以及含有这种导致与野生型Acs4等位基因纯合型的番茄 相比降低的乙烯产生和/或延迟的果实成熟和/或更长的贮藏期的突变等位基因的植物。
[0144] 在本发明的一个具体的实施方案中，提供了含有功能丧失或功能降低的突变acs4 等位基因的番茄植物和植物部分（果实、种子等）。
[0145] 在一个实施方案中，所述功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白是截短的 蛋白，即上文进一步定义的任一种Acs4蛋白（包括其变体）的蛋白片段。通常，EMS(甲基 磺酸乙酯）诱导鸟嘌呤/胞嘧啶到腺嘌呤/胸腺嘧啶的置换。在谷氨酰胺（Gln或Q，由核 苷酸CAA或CAG编码）或精氨酸（Arg或R，由核苷酸CGA编码）密码子的情况下，将胞嘧 啶置换为胸腺嘧啶可导致在阅读框中引入终止密码子（例如CAA/CAG/CGA变为TAA/TAG/ TGA)，从而产生截短的蛋白。
[0146] 还提供了编码功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白的核酸序列（基因组 DNA、cDNA、RNA)，例如所述acs4蛋白是SEQ ID N0:2、3、4、5、6或7中描述的acs4;或上文 所定义的其变体（包括任何嵌合或杂合蛋白或突变蛋白或截短蛋白）。由于遗传密码的简 并性，不同的核酸序列可编码相同的氨基酸序列。所提供的核酸序列包括天然存在的、人工 或合成的核酸序列。在Genbank登录号为M63490. 1的SEQ ID N0:8(野生型cDNA)中提供 了编码Acs4的核酸序列。
[0147] 应当理解，当序列以DNA序列描述并同时提及RNA时，所述RNA分子的实际碱基序 列是相同的，差异在于胸腺嘧啶（T)被尿嘧啶（U)替换。当本文中提到核苷酸序列（例如 DNA或RNA)时，使用斜体，例如acs4等位基因，而当提到蛋白时不使用斜体，例如acs4蛋 白。突变体用小写字母（例如acs4等位基因或acs4蛋白），而野生型/功能性的形式以大 写字母开头（Acs4等位基因或Acs4蛋白）。
[0148] 还提供了编码突变acs4蛋白（即如上文所述的功能丧失的acs4蛋白或功能降低 的acs4蛋白）的核酸序列（基因组DNA、cDNA、RNA)，以及含有所述突变序列的植物和植物 部分。例如，在野生型Acs4编码序列上含有一个或多个无义和/或错义突变的acs4核酸 序列，使得所编码的蛋白质在体内功能丧失或功能降低。还提供了具有其他突变的序列，例 如剪接位点突变体（即导致前mRNA异常剪接的基因组acs4序列上的突变）、和/或移码突 变、和/或一个或多个核酸的插入（例如转座子插入）和/或缺失。
[0149] 显然，可以使用很多方法（例如核酸杂交、PCR技术、计算机分析和核酸合成等）来 鉴定、合成或分离acs4核酸序列的变体或片段。SEQ ID N0:8的变体既可以编码野生型、功 能性Acs4蛋白，也可以编码所述蛋白的任一种的acs4蛋白功能丧失或功能降低的突变等 位基因（例如通过例如诱变产生的和/或通过例如TILLING或EcoTILLING的方法或其他 方法鉴定的）。
[0150] 可将本发明的植物用于传统的植物育种方案中以产生更多的具有相同特征的植 物，或者用于将所述突变acs4等位基因引入到相同或相近植物物种的其他植物株系或品 种中。
[0151] 还可以通过本领域中已知的植物转化和再生技术使用本发明的突变acs4核苷酸 序列来产生转基因植物。可以选择"良种事件（elite event)"，其为将所述嵌合基因（包 含与编码功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白的核苷酸序列可操作地连接的启动 子）插入到基因组中的特定位点并且所述插入导致所需表型的良好表达的转化事件。
[0152] 如上文所述的本发明植物是突变acs4等位基因纯合型或杂合型的。为产生含有 纯合形式的突变等位基因的植物，可以使用自交。可以通过传统的育种技术（例如杂交、自 交、回交等）将本发明的突变acs4等位基因转移到任何其他番茄植物中。因此，可以产生 任何类型的由于存在至少一个本发明的突变acs4等位基因而具有延迟的成熟和/或更长 的贮藏期的番茄。可以产生和/或鉴定在其基因组中含有至少一个突变acs4等位基因并 产生与野生型Acs4蛋白相比具有acs4蛋白功能丧失或活性降低的acs4蛋白的任何番前。 因此，所述番茄植物可以是任何栽培的番茄、任何商业品种、任何育种系或其它，其可以是 确定或不确定的、自由授粉或杂交的，可以产生具有任何颜色、形状和大小的果实。可以通 过育种（与含有突变等位基因的植物杂交然后选择含有所述突变等位基因的子代）容易地 将在具体的番茄植株中或在番茄的性相容近缘种中产生和/或鉴定的突变等位基因转移 到任何其他的番茄植物中。
[0153] 任何番茄植物或植物部分中的本发明的突变acs4等位基因的存在或不存在和/ 或所述等位基因到后代植物的遗传，都可以从表型上和/或使用分子工具来确定（例如使 用直接或间接的方法检测acs4核苷酸或acs4蛋白的存在或不存在）。
[0154] 在一个实施方案中，在栽培植物中产生或鉴定所述突变等位基因，但是也可以在 野生植物或非栽培植物中产生和/或鉴定所述突变等位基因，然后使用例如杂交和选择 (任选地使用种间杂交与例如胚胎拯救来转移所述突变等位基因）将其转移到栽培植物 中。因此，可以在番茄或其他茄属种中产生（使用诱变技术诱变所述靶acs4基因或其变 体的人工诱导突变）和/或鉴定（自发的或天然的等位基因变异）突变Acs4等位基因， 然后通过传统育种技术将其转移到栽培的茄属植物例如番茄中，所述茄属种包括例如番茄 的野生近缘种，如契斯曼尼番前、智利番前、多毛番前（(S. habrochaites, L. hirsutum))、 克梅留斯基番前、S. Iycopersicum X S.peruvianum、多腺番前（S.glandulosum)、多毛番 前（S.hirsutum)、小花番前（S.minutum)、小花番前（S.parviflorum)、潘那利番前、秘鲁番 前、S. peruvianum var. humifusum和细叶番前。术语"传统育种技术"在本文中包括育种者 已知的杂交、自交、选择、双单倍体产生、胚胎拯救、原生质体融合、通过中间物种的转移等， 即除了遗传修饰之外的可转移等位基因的方法。
[0155] 在另一个实施方案中，将含有突变acs4等位基因的植物（例如番茄）与相同种或 相近种的另一植物杂交，以产生含有所述突变acs4等位基因的杂交植物（杂交种子）。所 述杂交植物也是本发明的一个实施方案。
[0156] 在一个实施方案中，提供了Fl代杂交番茄种子（即，可以用于生长出Fl代杂交 番茄植物的种子），其含有至少一个本发明的acs4等位基因。Fl代杂交种子是从两个近交 番茄亲本植株之间的杂交中收获的种子。所述Fl代杂种可以包含一个或两个本发明的突 变acs4等位基因。因此，在一个实施方案中，将本发明的植物用作亲本植物以产生Fl代杂 种，所述Fl代杂种的果实与野生型Acs4/A CS4植物相比具有降低的乙烯产生和/或延迟的 成熟和/或更长的贮藏期。
[0157] 还提供了将突变acs4等位基因转移到另一植物的方法，所述方法包括提供在其 基因组中含有突变acs4等位基因的植物，由此所述突变等位基因产生与野生型Acs4等位 基因纯合型的番茄相比表现出降低的乙烯产生和/或更慢的果实成熟和/或更长的贮藏期 的果实（如上文所述），将所述植物与另一植物杂交并获得所述杂交的种子。任选地，可以 将从这些种子获得的植物进一步自交和/或杂交，并选择这样的后代，即其含有所述突变 等位基因且由于所述突变等位基因的存在而产生与含有野生型Acs4等位基因的植物相比 具有延迟的成熟和/或更长的贮藏期和/或降低的乙烯产生的果实。
[0158] 如所述，应当理解，其他诱变和/或选择方法可以等同的用于产生本发明的突 变植物。例如可以对种子进行辐射或化学处理以产生突变群体。也可使用acs4的直接 基因测序来筛选诱变的植物群中的突变等位基因。例如，KeyPoint筛选是可以用于鉴 定含有突变acs4等位基因的植物的基于测序的方法（Rigola et al.PloS One, March 2009, Vol4(3) :e4761) 〇
[0159] 因此，提供了非转基因的突变番茄植物，所述番茄植物在果实中产生更低水平的 野生型Acs4蛋白、或在果实中完全缺失野生型Acs4蛋白，并且由于一个或多个内源性acs4 等位基因中的一个或多个突变而在果实中产生功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋 白。可以通过诱变方法例如TILLING或其变型来产生这些突变体，或可以通过EcoTILLING 或通过任何其他方法来鉴定所述突变体。可以将编码功能丧失的acs4蛋白或功能降低的 acs4蛋白的Acs4等位基因分离并测序，或可以通过传统育种方法将其转移到其他植物中。
[0160] 提供了基因组中含有本发明的突变acs4等位基因的所述植物或其后代的任意部 分，包括收获的果实、收获的组织或器官、种子、花粉、花、子房等。还提供了在其基因组中含 有突变acs4等位基因的植物细胞培养物或植物组织培养物。优选地，所述植物细胞培养 物或植物组织培养物可再生为在其基因组中含有突变acs4等位基因的完整植株。本文还 包括通过对含有acs4突变等位基因的单倍体细胞进行染色体加倍而产生的双单倍体植物 (以及可以用于生长出所述双单倍体植物的种子），和其基因组中含有突变acs4等位基因 的杂交植物（以及可以用于生长出所述杂交植物的种子），籍此所述双单倍体植物和杂交 植物产生本发明的成熟延迟和/或贮藏期更长的果实。
[0161] 优选地，所述突变植物还具有良好的其他农艺学特征，即与野生型植物相比，它们 的果实数目不减少和/或果实质量不降低。在一个优选的实施方案中，所述植物是番茄植 物，所述果实是番茄果实，例如具有任何形状、大小或颜色的加工的番茄、生鲜市场番茄。因 此，还提供了含有一个或两个突变acs4等位基因的植物或植物部分的收获产品。所述产品 包括下游的经加工产品，例如番茄糊、番茄酱、番茄汁、切开的番茄果实、灌装果实、干燥的 果实、去皮的果实等。可以通过其基因组DNA中含有所述突变等位基因来鉴定所述产品。
[0162] 种子保藏
[0163] 实施例1的五种番茄TILLING突变体的代表性种子样本由Nunhems B. V.保藏并 根据布达佩斯条约按照Expert Solution(EPC 2000，Rule 32(1))于2012年8月21日 被接受保藏在NCMB Ltd(英国苏格兰阿伯丁郡AB21 9YA，巴克斯本，克莱伯斯通区，弗格 森大厦(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn Aberdeen, Scotland AB21 9YA，UK))。种子被给予以下保藏号：NCMB 42034(突变体2477)、NCMB 42037(突变体 4043)、NCMB 42038(突变体 4222)、NCMB 42039(突变体 4691)、NCMB 42041(突变体 5251)〇
[0164] 申请人要求，依据Rule 32(1)EPC或具有类似条款和规章的国家或条约的相关法 规，所述生物材料及其衍生的任何材料的样本只向指定的专业人员提供，直至专利授权公 告或者提交之日起20年（如果所述申请被驳回、撤回或视为撤回）。
[0165] 在本申请未决期间，由美国专利局主任确定的有资格的人员可请求并获得所述保 藏。受37C.F.R. § 1.808(b)的制约，在专利授权时，保藏者针对所保藏材料的公众可得性 提出的所有限制都会被永久取消。所述保藏在最近一次请求之后会被维持30年或5年的 时间，或被维持到专利的有效寿命期，以较长时间为准，在此期间如果所述保藏一旦不能存 活，都要将其替换。申请人不会放弃任何本申请的专利或植物品种保护法（7USC 2321 et seq.)授予的任何权利。
[0166] 实施例
[0167] 一般方法
[0168] 通过服务公司（BaseClear, The Netherlands, http://www. baseclear. com/)使用 与用于扩增的引物相同的引物对PCR扩增产物直接测序。使用计算机程序（CLC Bio Main Work Bench, Denmark, www. clcbio. com)对所得到的序列进行比对以鉴定核苷酸的改变。
[0169] 材料
[0170] 用于分析和诱变的水是在Milli-Q水整合系统--配有Q-gard T2筒和Quantum TEX筒的Milli-Q型Reference A+--中过滤的自来水。水的电阻为> =18M0hm。
[0171] 甲基磺酸乙酯（EMS)(纯）获得自Sigma，产品编号为M0880。
[0172] 番茄成熟和/或贮藏时间或周期的测量
[0173] 可通过本领域已知的多种方法测定番茄成熟和/或贮藏时间或周期，所述方法例 如定期对果实进行视觉上的评估和/或测量果实硬度或软化度、测量番茄果实中番茄红 素的含量、果实的乙烯产生、果实的颜色或任何替代方法，或者方法的组合。针可以例如 通过对使用装配有适当探针（例如3mm的探针）的果实硬度计测量的单位为例如0.1mm 的变形阻力进行评估，来测量果实的硬度（Mutschler et al，1992, Horscience 27pp 352-355) (MaAcs4ez et al 1995Acta Horticulturae 412pp 463-469)。本领域中存在替 代的方法，例如使用食品质地测定计（Bui et al. 2010 ;International Journal of Food Properties,第 13 卷，第 4 版）。
[0174] 可通过新鲜番前等级的美国标准（U. S. Dept of Agriculture, 1973, US standards for grades of fresh tomatoes, U. S. Dept Agr. Agr. Mktg. Serv.，Washington D. C.)用比 色计测量颜色（Mutschler et al, 1992, Horscience 27pp 352-355)，或通过将所述颜色与 比色图表如英国皇家园艺学会（RHS)比色图表进行比较（www. rhs.org. uk)来对果实颜色 进行分类。
[0175] 可根据 Fish et al. A quantitative assay for lycopene that utilizes reduced volumes of organic solvents. J. Food Compos. Anal. 2002, 15, 309-317 的有机溶 剂的体积降低的方法来确定番茄红素含量。可以将该方法用于测定在完整的番茄果实上直 接测量的番茄红素的含量，并同时评估以下基本理化特征：颜色、硬度、可溶性固体、酸度和 pH(Clement et al, J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 9813-9818)〇
[0176] 可以通过将果实放置在密闭空间中（例如在0. 5L的玻璃容器（glass holder) 中）来测量乙烯释放。可在1小时后提取Iml容器气体并可使用配有合适的检测单元（例 如火焰离子化检测器）和合适的柱子（例如内径为3. 5_并含有80/100目的活性氧化铝 的3m不锈钢柱）的气相色谱仪（例如Hewlett-Packard 5890)对产生的乙稀气体量进行定 量。乙稀产生可以表示为每小时每克果实放出的乙稀的纳升（nl)数（nl g^tT1) (MaAcs4ez et al 1995Acta Horticulturae 412pp 463-469)〇
[0177] 或者，如下文进一步所述，