可使用基于激光的乙稀检测器（ETD-300, Sensor Sense B.V. ,Nijmegen, the Netherlands)结合气体处理系统（Cristecu et al·, 2008)进行的实 时测量来测量乙烯产生。
[0178] 实施例1
[0179] 诱夺
[0180] 将商业化加工番茄育种中使用的高度纯合的近交株系用于使用下述的方案的诱 变处理。种子在湿润的 1Whatman?:纸上萌发24h后，将被分为各2500粒的8批次的约 20, 000粒种子浸泡在锥形烧瓶中的100mL超纯水和1%浓度的甲基磺酸乙酯（EMS)中。将 烧瓶在室温下轻轻振荡16小时。最后，在流水下将EMS冲洗掉。在EMS处理后，将种子直接 播种于温室中。在60%的萌发种子中，将其中的10600株小植株（plantlet)移植到田里。 在这10600株小植株中，有1790株不育或在产生果实之前死亡。对于每个其余的Ml突变 植物，收获一个果实并分离其种子。所得到的群体（命名为M2群体）由各代表一个M2家 族的8810个种子批组成。其中有585个家族由于种子形成率较低（low seed set)而将其 从所述群中排除。
[0181] 从源自每个M2种子批的10粒种子的混合物中提取DNA。对于每个突变株系，将 10粒种子在96孔深孔板的Micronic*深孔管（http://www. micronic, com)中混合，在 每个管中加入2个不锈钢球。将所述管和种子在液氮中冷冻1分钟并立即将种子在深孔 振荡器（Vaskon 96grinder，Belgium;http://www.vaskon.com)中在 16·8Ηζ(最大速度的 80% )下持续2分钟以研磨至成细粉。将300 μ L来自AGOWA? Plant DNA Isolation Kit(http://www. agowa. de)的AgOWa?裂解缓冲液P加入到样品板中，并通过在深孔振 荡器中在16. 8Hz下振荡1分钟将所述粉末悬浮于溶液中。将板以4000rmp离心10分钟。 使用 Janus MDT? (Perkin Elmer, USA ;http://www. perkinelmer.com)平台（96 个分 液头）将75 μ L上清液移液至96孔Kingfisher板上。使用Perkin Elmer Janus*液体 处理装置（liquid handler robot)和 96 Kingfisher? (Thermo labsystems，Finland ; http://www.thermo.com)进行下述步骤。用结合缓冲液（150 μ L)和磁珠（20 μ L)稀释含 有DNA的上清液。一旦DNA结合到所述磁珠上，进行两步连续的洗涤步骤（洗涤缓冲液1 : 1/3的Agowa洗脱缓冲液1、1/3的乙醇、1/3的异丙醇；洗涤缓冲液2 :70%乙醇、30% Agowa 洗涤缓冲液2)并最后将其在洗脱缓冲液（IOOyL MQ、0. 025 μ L Tween)中洗脱。
[0182] 研磨的10粒番茄种子产生了足以使所述磁珠饱和的DNA，因此，获得了全部样品 的高度均匀且相当的DNA浓度。和ADNA参照比较，估计各样品浓度为30ng/μ 1。将2倍 稀释的DNA进行4倍平板混合（4fold flat pooled)。将2 μ 1混合的DNA用于多重PCR以 进行突变检测分析。
[0183] 使用计算机程序（Primer3, http://primer3. sourceforge. net/)设计用于扩增 HRM的基因片段的引物。扩增产物的长度被限制在200和400个碱基对之间。通过应当产 生单一产物的测试PCR反应来测定所述引物的质量。
[0184] 聚合酶链式反应（PCR)扩增基因片段。将IOng基因组DNA与4 yL反应缓冲液 (5X 反应缓冲液）、2 μ L IOxLC 染料（LCGreen+染料，Idaho Technology Inc. ,UT, USA)、 各 5pmole 的正向和反向引物、4nmole dNTPs(Life Technologies，NY，USA)和 1 单位 DNA 聚 合酶（Hot Start II DNA聚合酶）混合，总体积为10 μ L。反应条件为：98°C 30秒，接着40 个循环的98°C 10秒、60°C 15秒、72°C 25秒，最后72°C 60秒。
[0185] 已经证明，高分辨熔解曲线分析（HRM)在人类和植物遗传学中是灵敏且高通量 的方法。HRM是一种非酶学筛选技术。在PCR扩增过程中，染料（LCGreen+染料，Idaho Technology Inc.，UT, USA)分子插入到双链DNA分子的每对退火的碱基对之间。在所述分 子中被捕获时，所述染料在470nm处激发后在5IOnm处发射荧光。当DNA样品被逐渐加热 时，焚光检测器（LightScanner, Idaho Technology Inc.，UT, USA)中的照相机记录焚光强 度。在取决于DNA螺旋的序列特异性的稳定性的温度下，双链PCR产物开始熔解，释放出所 述染料。染料的释放导致被荧光检测器记录为熔解曲线的荧光降低。含有突变的混合物在 PCR后的片段混合物中形成异质双链体。与同质双链体相比，这些被鉴定为差异熔解温度曲 线。
[0186] 选择表现出成熟延迟的突变体并确定其acs4基因中的突变类型。
[0187] 通过重复对来自所鉴定的相应DNA混合物的单个M2种子批的DNA进行HRM分析 来确认单个植物中具体突变的存在情况。当基于HRM图谱在所述4个单个M2家族的DNA 样品的一个中确认了所述突变的存在时，则对PCR片段进行测序以鉴定基因中的突变。
[0188] -旦知道了突变，则使用计算机程序C0DDLe(用于选择密码子以优化有害损伤的 发现http://www. proweb. org/coddle/)来预测这个突变的作用，所述程序鉴定了用户所 选择的基因和其编码序列的区域，在该区域中所期望的点突变最有可能对基因功能产生有 害效应。
[0189] 播种来自含有对蛋白质活性有预期作用的突变的M2家族的种子，用于所述植物 的表型分析。
[0190] 在自交和随后的选择后选择或获得纯合型的突变体。确定所述突变对所述植物的 相应蛋白质和表型的效应。
[0191] 使含有所述不同的鉴定的突变的种子萌发，并将植物在温室中种植在带有土壤的 花盆（pot)中，所述温室的光暗方案（regime)是16/8,夜间温度18°C，日间温度22-25°C。 对于每种基因型，种植了 5株植物。将第二、第三和第四花序用于分析。修剪所述花序，在 每个花序上留下6朵花，使所述6朵花能够通过自花授粉结出果实。记录第一和第六朵花 的果实形成的日期以及所述第一和第六颗果实的破色期和红熟期的日期。在第六颗果实的 破色期，收获番茄串（truss)并将其储存于温室中的开口盒子里。在整个成熟阶段记录所 述果实的果实状况。
[0192] 在后期，基于对果实的视觉评估来确定果实状况，并记录最老的果实变"坏"的日 期，并进一步记录果实变质情况（由通过夹紧果实所评估的进一步果实软化度，以及对脱 水/失水、果皮破损和真菌生长的视觉评估所指示）。
[0193] 鉴定了下述突变体：突变体2477、突变体4043、突变体4222、突变体4691和突变 体5251，并将种子以上文给出的登录号保藏在NCMB。
[0194] 在SEQ ID NO 8中示出了野生型Acs4的cDNA，其对应SEQ ID NOl中描述的蛋白 序列。
[0195] 突变体 2477 (NCMB 42034)
[0196] 在突变体2477中，如SEQ ID N0:9所示，第836位核苷酸从G变为A，将起始密码 子ATG的A计数为核苷酸位置1。该突变导致所表达的蛋白中第279位氨基酸从丝氨酸变 为天冬酰胺。该S279N突变位于ACS4蛋白的大结构域中。SEQ ID NO: 2描述了突变体2477 的蛋白序列。
[0197] 突变体 4043 (NCMB 42037)
[0198] 在突变体4043中，如SEQ ID NO: 10所示，第743位核苷酸从C变为T，将起始密码 子ATG的A计数为核苷酸位置1。该突变导致所表达的蛋白中第248位氨基酸从丙氨酸变 为缬氨酸。该A248V突变位于ACS4蛋白的大结构域中。SEQ ID NO: 3描述了突变体4043 的蛋白序列。
[0199] 突变体 4222 (NCMB 42〇38)
[0200] 在突变体4222中，如SEQ ID N0:11所示，第610位核苷酸从A变为T，将起始密码 子ATG的A计数为核苷酸位置1。该A610T突变导致赖氨酸的密码子（AAA)变为终止密码 子（TAA)，以致在翻译过程中形成具有203个氨基酸残基的截短的蛋白，而所述天然蛋白具 有476个氨基酸残基。所表达的蛋白质中氨基酸248从丙氨酸变为缬氨酸。SEQ ID N0:4 描述了突变体4222的截短的蛋白序列。
[0201] 突变体 4303
[0202] 在突变体4303中，如SEQ ID NO: 12所示，第963位核苷酸从G变为T，将起始密码 子ATG的A计数为核苷酸位置1。该突变导致所表达的蛋白中第321位氨基酸从亮氨酸变 为苯丙氨酸。该L32IF突变位于ACS4蛋白的第二小结构域中。SEQ ID NO: 5描述了突变体 4303的蛋白序列。
[0203] 突变体 4的 1(NCMB 42〇39)
[0204] 在突变体4691中，如SEQ ID NO: 13所示，第749位核苷酸从T变为A，将起始密 码子ATG的A计数为核苷酸位置1。该突变导致所表达的蛋白中第250位氨基酸从缬氨酸 变为谷氨酸。该V250E突变位于ACS4蛋白质的大结构域中。SEQ ID N0:6描述了突变体 4691的蛋白序列。
[0205] 突变体 525I (NCMB 42〇41)
[0206] 在突变体5251中，如SEQ ID NO: 14所示，第947位核苷酸从C变为T，将起始密码 子ATG的A计数为核苷酸位置1。该突变导致所表达的蛋白中第316位氨基酸从苏氨酸变 为异亮氨酸。该T316I突变位于ACS4蛋白的第二小结构域中。SEQ ID NO: 7描述了突变体 5251的蛋白序列。
[0207] 在所述靶序列中含有突变的植物（例如上文的突变植物或由其得到（例如通过自 交或杂交）并含有突变acs4等位基因的植物）与野生型植物相比，除番茄果实的成熟外， 所有植物部分都表现为正常的营养生长。对在所述靶序列中含有突变的植物的果实成熟、 乙烯产生和贮藏期进行表型上的筛选。
[0208] 实施例2
[0209] 所述acs4突变体的成熟行为
[0210] 使含有所述不同突变的种子萌发，并将植物在温室中种植在带有土壤的花盆中， 所述温室的光暗方案是16/8,夜间温度18°C，日间温度22-25°C。对于每种基因型，种植了 5株植物。将第二、第三和第四花序用于分析。修剪所述花序，在每个花序上留下6朵花，使 所述6朵花能够通过自花授粉结出果实。记录第一和第六朵花的果实形成的日期，以及第 一和第六颗果实的破色期和红熟期的日期。在第四颗果实的红熟期，收获番茄串（truss) 并将其储存于温室中的开口盒子里。在整个成熟阶段通过从每个番茄串拍摄照片来记录所 述果实的果实状况。收获后，对含有来自一种基因型的所有番茄串的每个盒子拍摄照片。
[0211] 在后期，基于对果实的视觉评估来确定果实状况，并记录最老的果实变"坏"的日 期，并进一步记录果实变质情况（由通过夹紧果实所评估的进一步果实软化度，以及对脱 水/失水、果皮破损和真菌生长的视觉评估所指示。）
[0212] 图3示出了果实的成熟行为。将野生型植物的第一果实进入破色期的那天记为第 一天。对此后的天数以连续的天数进行编号。突变体表现出成熟延迟，即所述突变体的果 实需要更多天来变红。特别是，突变体2477和突变体4222表现出数天的显著延迟。突变 体4222表现出从第一颗果实处于破色期至100%的果实处于红熟期花费了更多的时间。
[0213] 本发明植物的果实的特征在于破色期开始较晚（例如突变体2477、4222、4691、 5251)。下文示出了收获后的特征。
[0214]
【主权项】
1. 一种番前（Solanum lycopersicum)种的栽培植物，其包含具有一个或多个突变 的acs4等位基因，所述突变导致产生与野生型Acs4蛋白相比功能丧失或功能降低的突变 acs4蛋白。
2. 权利要求1的栽培植物，其中所述一个或多个突变导致与野生型ACS4等位基因纯合 型的番茄相比降低的乙烯产生和/或延迟的果实成熟和/或更长的贮藏期。
3. 权利要求1或2的栽培植物，其中所述一个或多个突变导致与野生型Acs4等位基因 纯合型的番茄相比，所述番茄的果实需要明显更多天以达到红熟期。
4. 权利要求1至3任一项的栽培植物，其中所述一个或多个突变导致与野生型Acs4等 位基因纯合型的番茄相比，所述植物的番茄果实的乙烯产生降低至少20%。
5. 权利要求1至4任一项的植物，其中所述突变acs4蛋白的功能丧失或功能降低是由 于与SEQ. ID NO: 1的野生型Acs4蛋白相比一个或多个氨基酸被缺失、置换和/或插入。
6. 前述权利要求任一项的植物，其中所述突变acs4蛋白具有功能性的大结构域。
7. 权利要求1至5任一项的植物，其中所述突变acs4蛋白具有功能性的小结构域。
8. 前述权利要求中任一项的植物，其中所述突变acs4蛋白的功能丧失或功能降低是 由于在大结构域中一个或多个氨基酸被缺失、置换和/或插入。
9. 前述权利要求任一项的植物，其中所述突变acs4蛋白具有一个或多个选自以下的 改变的氨基酸：A248V、S279N、L321F、V250E、S253P和T316I ;或其中在所述突变acs4蛋白 中丢失了 SEQ ID NO: 1的全部第204位至第476位氨基酸。
10. 权利要求1至9任一项的植物，其中所述植物是Fl代杂交植物。
11. 可以生长出前述权利要求任一项的植物的种子。
12. 包含具有一个或多个突变的acs4等位基因的权利要求1-10任一项的植物的番茄 果实、种子、花粉、植物部分或后代，所述突变导致产生与野生型Acs4蛋白相比功能丧失或 功能降低的突变acs4蛋白。
13. 权利要求12的番茄果实，其中所述番茄果实与野生型Acs4等位基因纯合型的番茄 植物的果实相比，具有降低的乙烯产生和/或延迟的成熟和/或增加的贮藏期。
14. 权利要求13的果实，其中所述贮藏期比野生型Acs4等位基因纯合型的番茄果实的 贮藏期长至少2天。
15. 权利要求13的果实，其中所述降低的乙烯产生与野生型Acs4等位基因纯合型的番 茄相比降低至少15%。
16. 含有权利要求12至15中任一项的果实或所述果实的果实部分或者由权利要求12 至15中任一项的果实或所述果实的果实部分组成的食品或食品产品。
17. -种用于产生杂交番茄植物的方法，所述方法包括： (a) 获得权利要求1-7中任一项的或来自权利要求8的种子的第一番前植物；和 (b) 将所述第一番茄植物与第二番茄植物杂交以获得杂交种子； 其中由所述杂交种子生长出的所述杂交番茄植物包含具有一个或多个突变的acs4等 位基因，其中所述突变导致产生与野生型Acs4蛋白相比功能丧失或功能降低的突变acs4 蛋白。
【专利摘要】本发明涉及番茄种的栽培植物，其包含具有一个或多个突变的acs4等位基因，所述突变导致产生与野生型Acs4蛋白相比acs4蛋白功能丧失或功能降低的突变acs4蛋白。NCIMB 4203920120821NCIMB 4203820120821NCIMB 4203720120821NCIMB 4203420120821NCIMB 4204120120821
【IPC分类】C12N15-82, C12N9-88
【公开号】CN104812897
【申请号】CN201380062228
【发明人】W·H·维里森
【申请人】纽海姆有限公司
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2013年9月25日
【公告号】CA2886130A1, EP2900817A1, US20150237816, WO2014049002A1