n 4691)，包含导致所编码的蛋白质的第 250位氨基酸处从缬氨酸（Val或V)变为谷氨酸（Glu或E)的突变。所述V250E突变位于 ACS4蛋白的大结构域中。SEQ ID N0:6描述了突变体4691的蛋白序列。所述氨基酸的置 换是由于SEQ ID NO: 1的第749位核苷酸的T变为A，将起始密码子ATG的A计数为核苷酸 位置1。SEQ ID NO: 13描述了该突变cDNA。
[0060] 本发明所鉴定的赋予降低的乙烯产生和/或延迟的成熟和/或延长的贮藏期的另 一个示例性突变acs4等位基因（突变体5251或Nun 5251)，包含导致所编码的蛋白质的第 316位氨基酸从苏氨酸（Thr或T)变为异亮氨酸（lie或I)的突变。所述T316I突变位于 ACS4蛋白的第二小结构域中。SEQ ID N0:7描述了突变体5251的蛋白序列。所述氨基酸 的置换是由于SEQ ID NO: 1的第947位核苷酸的C变为T，将起始密码子ATG的A计数为核 苷酸位置1。SEQ ID NO: 14描述了该突变cDNA。
[0061] 本文中的"突变等位基因"是指与野生型等位基因相比在编码序列（mRNA、cDNA或 基因组序列）中含有一个或多个突变的等位基因。这类突变（例如，一个或多个核苷酸的 插入、倒位、缺失和/或置换）可导致所编码的蛋白具有降低的体外和/或体内功能（功能 降低）或没有体外和/或体内功能（功能丧失），例如，由于所述蛋白例如被截短或者具有 其中一个或多个氨基酸被缺失、插入或置换的氨基酸序列。这类改变可导致蛋白质具有不 同的3D构象、被靶向到不同的亚细胞区室、具有经修饰的催化结构域、具有经修饰的对核 酸或蛋白质的结合活性等。
[0062] 本文中的"野生型植物"和"野生型果实"或"正常成熟"的植物/果实是指含有编 码完全功能性Acs4蛋白的野生型（WT)Acs4等位基因（Acs4/A CS4)的两个拷贝的番茄植物 (例如不同于含有突变acs4等位基因的"突变植物")。这些植物为例如在表型测定中的合 适的对照。优选地，野生型和/或突变植物是"栽培的番茄植物"。例如栽培种Moneymaker、 栽培种Ailsa Craig、栽培种Tapa以及许多其他栽培种都是野生型植物。
[0063] "番茄植物"或"栽培的番茄植物"是这样的番茄的植物：即人工栽培并具有优 良的农艺学特征的番茄种的品种、育种系或栽培种；优选地，这类植物不是"野生植物"， 所述野生植物即一般具有比栽培植物差得多的产量和差得多的农艺特征以及例如在野生 群中天然生长的植物。"野生植物"包括例如物种的生态型、PI (植物引种）系、当地品种 (Iandrace)或野生登记物或野生近缘种。所谓的传统品种（heirloom variety)或栽培 种一一即，通常在人类历史的较早时期被种植并通常被改造为适于特定地理区域的自由授 粉品种或栽培种一一在本文中被作为栽培番茄植物被涵盖在本发明的一个方面中。
[0064] 番前的野生近缘种（wild relative)包括：S. arcanum、克梅留斯基番 前（S. chmielewskii)、小花番前（S. neorickii = L. parviflorum)、契斯曼尼番前 (S. cheesmaniae)、多腺番前（S. galapagense)、细叶番前（S. pimpinellifolium)、智利 番前（S. chilense)、S. corneliomulleri、多毛番前（S. habrochaites = L. hirsutum)、 S. huaylasense、赤前（S. sisymbriifolium)、秘鲁番前（S. peruvianum)、多毛番前 (S. hirsutum)或潘那利番前（S.pennellii)。
[0065] 本文中的"平均"是指算数平均值。
[0066] 序列表说明
[0067] SEQ ID NO: 1示出了从基于Genbank登录号AAA34131. 1的mRNA获得的番茄野生 型、完全功能性ACS4蛋白序列（由Genbank登录号M63490. 1的cDNA编码）。
[0068] SEQ ID NO:2示出了番茄突变体2477 acs4蛋白序列。
[0069] SEQ ID NO:3示出了番茄突变体4043 acs4蛋白序列。
[0070] SEQ ID NO:4示出了番茄突变体4222 acs4蛋白序列。
[0071] SEQ ID NO:5示出了番茄突变体4303 acs4蛋白序列。
[0072] SEQ ID N0:6示出了番茄突变体4691 acs4蛋白序列。
[0073] SEQ ID N0:7示出了番茄突变体5251 acs4蛋白序列。
[0074] SEQ ID N0:8 示出 了基于 Genbank 登录号 M63490. 1 的番茄野生型 Acs4 cDNA。
[0075] SEQ ID N0:9 示出了番茄突变体 2477 acs4 cDNA。
[0076] SEQIDN0:10示出了番茄突变体 4043 acs4cDNA。
[0077] SEQ ID N0:11 示出了番茄突变体 4222 acs4 cDNA。
[0078] SEQIDN0:12示出了番茄突变体 4303 acs4cDNA。
[0079] SEQIDN0:13示出了番茄突变体 4691 acs4cDNA。
[0080] SEQIDN0:14示出了番茄突变体 5251 acs4cDNA。
[0081] SEQ ID勵：15示出了番茄野生型八〇84基因组0嫩。
【附图说明】
[0082] 图 I :本图不出了 Capitani 等人（Journal of Molecular Biology, 1999, vol 194, pp 745-756)的图I中给出的5个序列的氨基酸序列（甜瓜、天竺葵、甘蓝、绿豆和马铃 薯）与SEQ ID NO 1中给出的野生型番茄ACS4氨基酸序列的比对。
[0083] 图2 :在粉红期和红熟期以nV(h · g)(也写作nl · IT1 · f1)测量的番茄果实的乙 稀释放。Tapa是商业野生型栽培种（Acs4/Acs4)。
[0084] 图3 :本图示出了处于红熟期的果实的百分比，其是在野生型对照果实开始进入 破色期[在第一天，野生型的第一颗果实处于破色期]后的不同天数时确定的。与野生型 (wt)相比，本发明的突变植物的所有果实都需要更多天才能成熟，"Ho"是指特定acs4突变 纯合型（acs4/a CS4)的突变植物（前面的编号所指示的）的果实；He是指特定acs4突变 杂合型（Acs4/aCS4)的突变体（前面的编号所指示的）的果实。
[0085] 图4 :SEQ ID NO: 1-7的比对。还描述了 Acs4的结构域（浅灰色）及突变（加粗 并加下划线）。
【具体实施方式】
[0086] 本发明公开了包含具有一个或多个突变的acs4等位基因的番茄种的栽培植物， 所述突变导致产生与野生型Acs4蛋白相比功能丧失和/或功能降低的突变acs4蛋白。 [0087] 所述Acs4蛋白序列含有3个结构域："大结构域"，是指本申请的图4所示的第65 至327位氨基酸残基；以及两个小结构域，分别指本申请的图4所示的第33至62及339至 438位氨基酸残基。Acs4催化中心被认为位于"大结构域"中。
[0088] 在一方面，本发明涉及包含具有一个或多个突变的acs4等位基因的番茄种的栽 培植物和/或其部分（例如果实），所述突变导致产生与野生型Acs4蛋白相比功能丧失或 功能降低的突变acs4蛋白，其中与野生型完全功能性Acs4等位基因（编码SEQ ID N0:1 的功能性Acs4蛋白或功能性变体）纯合型（Acs4/Acs4)的番前植物相比，所述一个或多个 突变导致降低的乙烯产生和/或延迟的果实成熟和/或更长的贮藏期。
[0089] 编码SEQ ID NO: 1的蛋白的番茄植物是例如栽培种UC82B或其他。
[0090] 在一方面，SEQ ID NO: 1的功能性变体是编码Genbank登录号CAH56694、CAH56504 或CAH56693的蛋白质的Acs4等位基因。编码SEQ ID N0:1的功能性变体的番茄植物是例 如栽培种 San Marzano Vesuvio、San Marzano Nano 或 Tondino0
[0091] 在一方面，本发明涉及包含具有一个或多个突变的acs4等位基因的番茄种的栽 培植物和/或其部分（例如果实），所述突变导致产生与野生型Acs4蛋白相比acs4蛋白功 能丧失或功能降低的突变acs4蛋白，其中与野生型完全功能性Acs4等位基因（编码SEQ ID N0:1的功能性Acs4蛋白或功能性变体）纯合型（Acs4/Acs4)的番前植物相比，所述一 个或多个突变导致降低的乙烯产生和/或延迟的果实成熟和/或更长的贮藏期，其中所述 番茄植物不包含编码Genbank登录号CAH56694、CAH56504或CAH56693的蛋白质的Acs4等 位基因。在另一方面，本发明植物的一个或多个突变导致与野生型Acs4等位基因纯合型的 番茄相比降低的乙烯产生。
[0092] 在另一方面，本发明植物的一个或多个突变导致与野生型Acs4等位基因纯合型 的番茄相比延迟的果实成熟和/或更长的贮藏期。
[0093] 在另一方面，本发明涉及包含具有一个或多个突变的acs4等位基因的番茄种的 栽培植物，所述突变导致产生功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白，其中所述一个 或多个突变存在于"大结构域"中，即在Acs4等位基因编码的野生型、功能性Acs4蛋白的第 65-327位氨基酸区域的编码部分中，并且所述突变导致产生与野生型Acs4蛋白相比acs4 蛋白功能丧失或功能降低的突变acs4蛋白，其中所述一个或多个突变导致与野生型Acs4 等位基因纯合型的番茄相比降低的乙烯产生和/或延迟的果实成熟和/或更长的贮藏期。 在一个优选的方面中，所述一个或多个突变是SEQ ID NO: 1的第241至251位氨基酸的区 域内和/或第304至327位氨基酸的区域内的一个或多个氨基酸的置换、缺失和/或插入； 在另一个方面，所述一个或多个突变导致第200、201或203位氨基酸下游的大结构域的一 部分或全部缺失，或所述突变导致截短的acs4蛋白，所述截短的acs4蛋白至少缺少第二小 结构域和/或大结构域的一部分，例如终止密码子存在于SEQ ID NO:8的第600位核苷酸 后的任何位置处。
[0094] 在另一方面，本发明涉及包含编码功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白 的acs4等位基因的番茄植物，所述蛋白包含功能性"大结构域"，即导致降低的乙烯产生和 /或延迟的成熟和/或延长的贮藏期的所述突变位于"大结构域"外。因此，在一个实施方 案中，所述突变acs4等位基因在一个或两个所述小结构域中（来自包含功能性"大结构域" 的SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 1变体的第33至62位和/或第339至438位氨基酸）包含 一个或多个突变，并且还在SEQ ID NO: 1的第33至62位和/或第339至438位氨基酸中 包含（核苷酸序列编码的）至少一个氨基酸插入、缺失或置换，所述至少一个插入、缺失或 置换导致番茄植物果实的降低的乙烯产生和/或延迟的成熟和/或更长的贮藏期。
[0095] 在一个实施方案中，导致功能丧失的acs4蛋白或acs4蛋白的功能降低的一个或 多个突变位于野生型Acs4蛋白的"大结构域"中，即所述蛋白包含功能性"小结构域"，因此 在一个实施方案中，在SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 1变体的第65至327位氨基酸中一个或 多个氨基酸被插入、缺失或置换。在另一个实施方案中，导致功能丧失的acs4蛋白或acs4 蛋白的功能降低的一个或多个突变位于野生型Acs4蛋白的C-末端中，因此在一个实施方 案中，在SEQ ID N0:1(或SEQ ID N0:1变体）的第444至476位氨基酸中一个或多个氨基 酸被插入、缺失或置换。
[0096] 因此，在本发明的一个实施方案中，本发明的番茄植物包含内源性（非转基因）突 变acs4等位基因，所述突变acs4等位基因编码功能丧失的acs4蛋白或功能降低的突变 acs4蛋白，由此所述植物的果实确实能够成熟到红熟期（优选比编码完全功能性Acs4蛋白 的野生型等位基因纯合型的植物慢）。在本发明的另一个实施方案中，本发明的番茄植物包 含人工诱导的非转基因突变acs4等位基因，所述突变acs4等位基因编码功能降低的突变 acs4蛋白和/或功能丧失的acs4蛋白。在另一个实施方案中，这类突变acs4等位基因来 源自栽培的番茄（例如育种系、品种或传统品种）或番茄的野生近缘种和/或在其中产生。 这种人工诱导的突变可以例如使用EP1963505中描述的定向诱变来诱导。随后，番茄的野 生近缘种中产生的突变acs4等位基因可以很容易地通过育种转入栽培的番茄中。
[0097] 在另一方面，本发明涉及具有编码功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白 的内源性acs4等位基因的本发明植物，所述功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白 与SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:1的变体具有基本序列同一性，其中所述蛋白包含一个或多 个氨基酸的置换、缺失和/或插入。
[0098] 在另一方面，本发明涉及包含与野生型（Acs4/ACS4)植物相比降低的乙烯产生和 /或延迟的成熟和/或更长的贮藏期的本发明的植物，这是由于所述植物含有编码功能丧 失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白的内源性acs4等位基因，所述功能丧失的acs4蛋 白或功能降低的acs4蛋白与SEQ ID N0:2或与SEQ ID N0:3或与SEQ ID N0:4或与SEQ ID N0:5或与SEQ ID N0:6或与SEQ ID N0:7具有基本序列同一性。在一个具体方面中， 本发明涉及含有acs4等位基因的栽培的番茄植物，所述acs4等位基因以一个或两个拷 贝（即以纯合或杂合的形式）存在于以登录号NCMB 42034、NCMB 42037、NCMB 42038、 NCMB42039或NCMB 42041保藏的种子中。在杂合的形式中，另一个等位基因可以是野生 型Acs4等位基因或另一个突变acs4等位基因，例如来自本文所提供的其他突变体中的任 何一个，或是编码本文所述的功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白的任何其他突 变acs4等位基因。因此，在杂合的形式中，所述另一个等位基因可以是功能降低的acs4等 位基因。
[0099] 在另一方面，本发明涉及内源性acs4等位基因或涉及其编码的功能丧失的acs4 蛋白或功能降低的acs4蛋白，所述功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白与SEQ ID N0:2 与或 SEQ ID N0:3 或与 SEQ ID N0:4 或与 SEQ ID N0:5 或与 SEQ ID N0:6 或与 SEQ ID N0:7具有基本序列同一性，所述等位基因或蛋白存在于（及来自于）以登录号NCHffi 42034、NCMB 42037、NCMB 42038、NCMB 42039 或 NCMB 42041 保藏的种子中。
[0100] 在另一方面，本发明涉及包含编码功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白 的内源性acs4等位基因的本发明的番茄植物，所述功能丧失的acs4蛋白或功能降低的 acs4 蛋白与 SEQ ID N0:2 或与 SEQ ID N0:3 或与 SEQ ID N0:4 或与 SEQ ID N0:5 或与 SEQ ID N0:6或与SEQ ID N0:7具有100%序列同一性。
[0101] 在另一方面，本发明涉及包含编码功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白 的内源性acs4等位基因的本发明植物，所述功能丧失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白 在所述"大结构域"中具有至少一个氨基酸缺失、插入或置换。优选地，所述acs4蛋白包含 功能性小结构域，例如SEQ ID NO: 1的小结构域（第33至62位和/或第339至438位氨 基酸残基）或SEQ ID N0:1的（功能性）变体的小结构域。在一个实施方案中，所述acs4 蛋白还包含SEQ ID NO: 1的C-末端（第444至476位氨基酸）或SEQ ID NO: 1的（功能 性）变体的C-末端。
[0102] 在一方面，所述acs4蛋白不长于203个氨基酸，优选为开始的203个氨基酸。因 此，在一个实施方案中，所述番茄植物编码截