一种妥布霉素单克隆抗体及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】一种妥布霉素单克隆抗体及其制备方法与应用，属于食品安全免疫检测领域。该单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No.9307的小鼠杂交瘤细胞株G号（1A10）产生的。其制备方法为：（1）用戊二醛法将妥布霉素上的氨基活化后再与载体蛋白上的氨基偶联，得到的偶联物用硼氢化钠将戊二醛与氨基形成的西弗氏碱的C=N还原成稳定的C-N结构，即最终稳定的偶联物，作完全抗原。（2）将步骤（1）的完全抗原经免疫、融合、筛选；扩大培养、小鼠腹腔诱导产腹水，得到用于特异性检测妥布霉素的单克隆抗体。（3）用DCC法活化丁二酸的羧基，将活化液与卵清蛋白氨基反应得到卵清蛋白-丁二酸的羧基化蛋白，透析后再应用EDC法将妥布霉素与蛋白上的羧基缩合制备筛选抗体的包被。
CGMCC No.9307
2014.05.28
【专利说明】一种妥布霉素单克隆抗体及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]一种妥布霉素单克隆抗体及其制备方法与应用，涉及杂交瘤细胞株IAlO (单克隆细胞株G号)产生的抗妥布霉素特异性单克隆抗体。本发明属于食品安全免疫检测领域。
【背景技术】
[0002]妥布霉素(Tob)是第二代氨基糖苷类抗生素，相对第一代氨基糖苷类抗生素而言，其疗效更好、毒性更低，通常用于注射给药，治疗严重的G菌感染，成为目前世界临床应用最为广泛的氨基糖甙类抗生素之一。妥布霉素在兽药领域也获得了较广泛的使用，因此其在肉类、奶类等人们常用的食品中也有存在。由于其安全的治疗浓度为4mg/L?8mg/L，长时间血药浓度超过8mg/L就可能引起严重的肾毒性与耳毒性。所以在有关食品等样品中对妥布霉素进行快速、灵敏的测定很有必要。
[0003]目前，常用的妥布霉素的分析方法主要有微生物法、毛细管电泳法、高效液相色谱法、液质联用等。微生物法是耗时且重复性和专一性较差。高效液相色谱法因为妥布霉素缺少强紫外吸收的基团，故在使用紫外检测时需要衍生。
[0004]免疫分析方法相对于仪器检测方法低成本、高灵敏、对技术人员要求低等特点，适用于大量样品的快速筛查，这些特点使其成为非常具有推广价值的食品安全快速筛查方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种对妥布霉素具有较好检测灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法。本发明提供一种抗妥布霉素通用单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对妥布霉素检测灵敏度高，可以用来建立妥布霉素的免疫学检测方法。
[0006]本发明的技术方案:一株单克隆细胞株G号，即能分泌抗妥布霉素单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株G号，又命名1A10，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.9307。
[0007]所述单克隆细胞株G号分泌产生的抗妥布霉素的单克隆抗体，其由单克隆细胞株G号，即能分泌抗妥布霉素单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株IAlO所分泌产生。
[0008]所述抗妥布霉素的单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤:
(O制备完全抗原:用戊二醛法将妥布霉素上的氨基活化后再与载体蛋白上的氨基偶联；得到的偶联物用硼氢化钠将戊二醛与氨基形成的西弗氏碱的C=N还原成稳定的C-N结构，作完全抗原；
(2)将步骤(I)的完全抗原免疫小鼠，间接ELISA检测，取免疫小鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合，筛选出阳性杂交瘤细胞株；扩大培养该阳性杂交瘤细胞株，将阳性杂交瘤细胞株注入同系小鼠腹腔诱导产生腹水，得到抗妥布霉素的单克隆抗体。
[0009]将步骤(I)的完全抗原透析纯化后免疫6?8周龄BALB/c小鼠，与等量QuickAntibody免疫佐剂?混合均匀后，通过腿部肌肉注射免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接ELISA筛选和三次亚克隆筛选出阳性杂交瘤细胞株；扩大培养该阳性杂交瘤细胞株，将阳性杂交瘤细胞株注入同系小鼠腹腔诱导产生腹水，得到可用于特异性检测妥布霉素的单克隆抗体。
[0010]所述步骤(I)制备完全抗原:取20mg Tob (妥布霉素)溶于ImL pH 7.4,0.0lM的PBS缓冲液，将新鲜配制的1%的戊二醛溶液0.5mL缓慢滴加入所述溶液中，室温搅拌活化8min ;另取1mg BSA/HSA溶解于I mL的0.05 M、pH 9.6的CBS溶液中；将上述活化后的妥布霉素溶液慢速逐滴加入BSA/HSA溶液中，室温搅拌反应Ih ;将溶液在4°C条件下预冷，称取一定量的硼氢化钠使反应体系的硼氢化钠的终浓度为4mg/mL，搅拌2h，最终的偶联物4°C透析三天，-20°C分装保存。
[0011]所述步骤(2)用于免疫的小鼠为6?8周龄BALB/c小鼠；免疫方法为:透析纯化后妥布霉素完全抗原I mg/mL与等量QuickAntibody免疫佐剂?混合均勻后,通过腿部肌肉注射免疫BALB/c小鼠,每只100 μ L,每次免疫间隔时间为28天,共免疫8只小鼠；所述步骤(2)中，小鼠骨髓瘤细胞为小鼠骨髓瘤细胞SP 2/0。
[0012]所述抗妥布霉素的单克隆抗体的制备方法，所述方法还包括所述抗妥布霉素单克隆抗体的纯化步骤。
[0013]抗体建立的用于间接竞争ELISA检测的妥布霉素包被抗原Tob-OVA的制备，先用DCC法将丁二酸连接到卵清蛋白的氨基上，得到的羧基化的蛋白通过透析去除多余的小分子后，再用EDC活化羧基化的蛋白，加入妥布霉素小分子偶联得到筛选的包被抗体。
[0014]取丁二酸17mg, DCC (N, N’- 二环己基碳二亚胺)20mg, NHS (N_N_轻基琥拍酰亚胺)1mg溶于ImL的DMF中活化过夜，离心去除沉淀，取上清滴加入溶于9mL 0.2M BB (硼酸盐缓冲溶液)含50mg卵清蛋白的溶液中偶联过夜；将羧基化的卵清蛋白4°C透析三天；
取上述羧基化的卵清蛋白1mg溶于ImL 0.0lM的PBS中，加入8mg EDC和5mg NHS，搅拌15min后，将事先溶解于2mL 0.05M的CBS溶液中6.8mg的妥布霉素逐滴加入蛋白液中偶联4h，4°C透析三天，_20°C分装保存。
[0015]所述抗妥布霉素的单克隆抗体的应用，用于检测食品中妥布霉素残留。
[0016]本发明提供IAlO细胞株(CGMCC N0.9307)的制备基本步骤为:(I)免疫原的制备与鉴定:妥布霉素通过戊二醛法与蛋白载体相连，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过SDS-PAGE鉴定；(2)小鼠的免疫:将抗原与QuickAntibody免疫佐剂?混合均匀后，通过腿部肌肉注射免疫BALB/c小鼠。通过间接ELISA检测血清效价和抑制；
(3)细胞融合与细胞株建立:通过聚乙二醇(PEG4000)法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株IAlO ; (4)杂交瘤细胞株性质的鉴定:抗体亚型的鉴定采用小鼠单克隆抗体亚型检测试剂盒方法，IC5tl值。
[0017]本发明的有益效果:本发明的优点在于:(1)本发明获得抗妥布霉素单克隆抗体细胞株的制备方法简便，完全抗原和包被抗原合成方便快捷；(2)获得的细胞株分泌的抗体有较好的灵敏度(IC5tl值为0.3ng/mL)。单克隆抗体不仅能应用于妥布霉素的酶标记抗体、荧光标记抗体、胶体金标记抗体等；而且在后续的竞争实验中，满足剂量依赖性的要求，为间接竞争ELISA试剂盒的研发推广奠定了基础。
[0018]生物材料样品保藏:一株单克隆细胞株G号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2014年5月28日，保藏编号为CGMCC N0.9307。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1 免疫原电泳表征，1、BSA，2、Tob-GA-BSA ;
图2 IAlO单克隆抗体对妥布霉素抗原竞争反应的对数曲线。
【具体实施方式】
[0020]本发明下面的实施例仅作为本
【发明内容】
的进一步说明，不作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
[0021]骨髓瘤细胞SP2/0种子来源于北京康为世纪生物科技有限公司。6周龄的BALB/c纯系雌性小鼠购自北京维通利华实验动物中心。胎牛血清(上海洛神，Lot20090525)，细胞融合用 PEG 4000 (sigma), 50XHAT 储液(sigma，H0262，093K8931)，50XHT (sigma H0317，Lot 064K8927), 1640 培养基(Gibco，Lot )DMS0 (Amresco 0231)，石蜡油(国药试剂公司)。BSA (Sigma, A7638), OVA (Sigma，A5378)。
[0022]实施例1:杂交瘤细胞株IAlO的获得及其产生的抗妥布霉素的单克隆抗体的鉴定
一、杂交瘤细胞株IAlO的获得
1、妥布霉素完全抗原Tob-BSA/Tob-HSA的制备
取20mg Tob (妥布霉素)溶于ImL pH 7.4的PBS (0.0lM磷酸盐缓冲液)，将新鲜配制的1%的戊二醛溶液0.5mL缓慢滴加入该小分子溶液中，室温搅拌活化8min。另取1mgBSA(HSA)溶解于I mL的0.05 M、pH 9.6的CBS溶液中。将上述活化后的妥布霉素溶液慢速逐滴加入BSA(HSA)溶液中，室温搅拌反应lh。将溶液在4°C条件下预冷，称取一定量的硼氢化钠使反应体系的硼氢化钠的终浓度为4mg/mL，搅拌2h。4°C透析三天，_20°C分装保存。
[0023]2、妥布霉素包被抗原Tob-OVA的制备
取丁二酸17mg，DCC 20mg, NHS 1mg溶于ImL的DMF中活化过夜，离心去除沉淀，取上清滴加入溶于9mL 0.2M BB液的含50mg卵清蛋白的溶液中偶联过夜。将羧基化的蛋白4°C
透析三天。
[0024]取1mg上述羧基化的卵清蛋白溶于ImL 0.0lM的PBS中，加入8mg EDC和5mgNHS,搅拌15min后，将事先溶解于2mL 0.05M的CBS溶液中6.8mg的妥布霉素逐滴加入蛋白液中偶联4h。4°C透析三天，_20°C分装保存。
[0025]3、动物免疫
选择健康的6?8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取妥布霉素完全抗原(I mg/mL)与等量QuickAntibody免疫佐剂?混合均匀后，通过腿部肌肉注射免疫BALB/c小鼠，每只100μ L，间隔时间为28天。在第四次加强免疫后的第7天，对小鼠进行尾部静脉取血，用间接ELISA法测定效价，其中，包被Tob-OVA的浓度为0.0Syg/mL。选择抑制最好的小鼠进行一次冲击免疫，进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行细胞融合。
[0026]4、细胞融合在冲击免疫三天后，按照常规PEG (聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下:(1)无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；(2)收集SP2/0细胞，悬浮于RPM1-1640基础培养液中，进行细胞计数；(3)将脾细胞和SP2/0细胞按照1: 10的比例混合，离心后用50% PEG融合，时间Imin,之后按照从慢到快，加入RPM1-1640基础培养液，离心后悬浮于含20%胎牛血清的2%的50XHAT的RPM1-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37 °C，5%C02的培养箱中培养。
[0027]5、细胞筛选与细胞株建立在细胞融合的第三天对融合细胞进行RPM1-1640筛选培养液半换液，第6天进行用含20%胎牛血清、1%的100 XHT的RPM1-1640过渡培养液进行全换液，在第9天取细胞上清进行筛选。筛选分两步:第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用妥布霉素为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。
[0028]具体方法为:
用50mM碳酸缓冲液(pH9.6)稀释包被抗原至0.05ug/ml,加入到96孔酶联板中进行包被，每孔100yL，4°C包被12-24小时；充分洗涤后用含1%明胶的CBS封闭，每孔200 μ L ;每孔加入各个克隆孔上清液50yL，37°C温育30min，充分洗涤后加入10yL1:3000的酶标二抗(HRP-山羊抗小鼠IgG)，37°C温育20min后，加入底物显色，1min后终止，读取A 450nm。A 450nm值大于1.0以上的孔挑出来继续进行抑制的检测。将包好并封闭好的板置于室温，空白孔加入50 μ L的PBS，相对应的加标孔加入浓度为0.3ppb妥布霉素标准品50yL，再同时在空白孔和加标孔加入50μ L克隆孔上清液。读取空白孔的A45。?为A (空白)，加标孔的A 450ηα为A (加标)。抑制率=1-A (加标)/ A (空白)。抑制率越大表明克隆孔中细胞株分泌抗体灵敏度越高。挑出高抑制率的孔采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株1Α10。
[0029]二、单克隆抗体的制备与鉴定
1、获取抗体腹水和纯化
选取4周龄BALB/c小鼠，接种细胞前7?14天预先腹腔注射液体石蜡ImL/只。用生理盐水调整杂交瘤细胞株IAlO浓度至2.0X10 6个/ mL，腹腔接种杂交瘤细胞，将腹水通过辛酸-DEAE-硫酸铵法纯化。腹水和pH4.0的乙酸钠溶液1:1混合后加入辛酸，振荡0.5h,9000rpm 离心 lOmin，取上清加入 1:1 的 pH 8.2 的 Tris。DEAE 柱子先用 1mL PBS冲洗，之后加入腹水上清。用离心管收集流出的液体，再加入1mL的PBS淋洗，收集淋洗液。加入固体饱和硫酸铵使得最终淋洗液的硫酸铵浓度为50%。振荡溶解后4°C放置2h。9000rpm离心15min,去除上清,用PBS溶解沉淀,4°C透析三天,将获得的单抗置于_20°C保存。
[0030]2、抗体亚型鉴定
采用单克隆抗体亚型检测试剂盒(Southern B1tech Cat N0.530005)对步骤I获得的抗体进行免疫球蛋白亚型的鉴定，具体方法为:用Tob-OVA以0.0Syg/mL包被在96孔酶联板(每孔0.lmL)，4°C过夜，弃包被液，洗涤3次，按0.2mL/孔的量加入封闭液(含1%BSA的PBS)，37°C孵育I h后，弃封闭液，洗涤3次，用PBS以1: 50000比例稀释妥布霉素单克隆抗体，按0.1mL/孔的量加入到酶联板内，37°C孵育I h后洗涤3次，加入用PBS以1: 5000稀释的辣根过氧化物酶标记的各类抗体(小鼠IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA及IgM)37°C、孵育0.5h后洗涤3次，按0.1mL/孔的量加入辣根过氧化物酶底物反应液(lmg/mL TMB)，37°C反应10 min，出现蓝色即为阳性结果，最后按0.05mL/孔的量加入2mol/L H2 SO 4终止反应。结果表明杂交瘤细胞IAlO分泌的抗体为IgGl亚类。
[0031]实施例2.用杂交瘤细胞株IAlO分泌的抗体建立间接竞争ELISA方法的应用
将杂交瘤细胞株IAlO通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于妥布霉素ELISA添加回收试验，具体步骤如下:
(I)用碳酸盐缓冲液(CBS)稀释好的0.05 μ g/mL Tob-OVA作为包被原包被96孔酶标板，每孔100yL，37°C包被2 h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔250 μ L，每次3 min，拍干。
[0032](2)用含0.1%酪蛋白的CBS进行封闭，每孔200yL，37°C封闭2 h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔250 μ L,每次3 min,拍干。
[0033](3)用磷酸盐缓冲液(PBS)分别配制 0,0.625,1.25,2.5，5，10，20，40 μ g/L 的妥布霉素标准溶液。将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50 μ L，每个样品重复3个孔，再每孔加入50 μ L I: 50000稀释的抗妥布霉素单克隆抗体，37°C反应0.5h后，洗板拍干。
[0034](4)每孔加入100 UL用含0.01%明胶的PBS I: 3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG 二抗，37°C反应0.5h后，洗板拍干。
[0035](5)每孔加入100 μ L TMB显色液，37°C显色15 min后，每孔加入50 μ L 2Μ H2SO4终止液，450 nm测吸光值。
[0036](6)添加回收及样品前处理:称取ImL液态牛奶置入2mL聚四氟乙烯离心管中，分别添加3ng、10 ng和30ng Tob0用样品稀释液(0.0lM PBS)稀释30倍后，直接作为ELISA样品检测液，采用间接竞争ELISA进行添加回收试验，其回收率分别为80%，98%，102%。
[0037]溶液的配制:
碳酸盐缓冲液(CBS):称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至lOOOmL，4°C贮存备用。
[0038]磷酸盐缓冲液(PBS):8.00 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.2 g KH2PO4, 2.9 g Na2HPO4.12H2O,溶于800 mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2?7.4，定容至1000 mL ；
PBST:含 0.05% 吐温 20 的 PBS ；
TMB 显色液:A 液=Na2HPO4.12H20 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至 1000 mL ；B 液:60 mg TMB溶于100 mL乙二醇中。A、B液按1: 5混合即为TMB显色液，现用现混。
[0039]综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一株单克隆细胞株G号，即能分泌抗妥布霉素单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株G号，又命名1A10，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.9307。
2.权利要求1所述单克隆细胞株G号分泌产生的抗妥布霉素的单克隆抗体，其特征在于:其由单克隆细胞株G号，即能分泌抗妥布霉素单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株IAlO所分泌产生。
3.权利要求2所述抗妥布霉素的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (O制备完全抗原:用戊二醛法将妥布霉素上的氨基活化后再与载体蛋白上的氨基偶联；得到的偶联物用硼氢化钠将戊二醛与氨基形成的西弗氏碱的C=N还原成稳定的C-N结构，作完全抗原； (2)将步骤(I)的完全抗原免疫小鼠，间接ELISA检测，取免疫小鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合，筛选出阳性杂交瘤细胞株；扩大培养该阳性杂交瘤细胞株，将阳性杂交瘤细胞株注入同系小鼠腹腔诱导产生腹水，得到抗妥布霉素的单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述抗妥布霉素的单克隆抗体的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)制备完全抗原:取20mg妥布霉素溶于ImL pH 7.4,0.0lM的PBS缓冲液，将新鲜配制的1%的戊二醛溶液0.5mL缓慢滴加入所述溶液中，室温搅拌活化8min ;另取1mg BSA/HSA溶解于I mL的0.05 M、pH 9.6的CBS溶液中；将上述活化后的妥布霉素溶液慢速逐滴加入BSA/HSA溶液中，室温搅拌反应Ih ;将溶液在4°C条件下预冷，称取一定量的硼氢化钠使反应体系的硼氢化钠的终浓度为4mg/mL，搅拌2h，最终的偶联物4°C透析三天，_20°C分装保存。
5.根据权利要求3所述抗妥布霉素的单克隆抗体的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)用于免疫的小鼠为BALB/c小鼠；免疫方法为:妥布霉素完全抗原I mg/mL与等量QuickAntibody免疫佐剂?混合均匀后，通过腿部肌肉注射免疫BALB/c小鼠，每只100 μ L，每次免疫间隔时间为28天，共免疫8只小鼠；所述步骤(2)中，小鼠骨髓瘤细胞为小鼠骨髓瘤细胞SP 2/0。
6.根据权利要求3所述抗妥布霉素的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述方法还包括所述抗妥布霉素单克隆抗体的纯化步骤。
7.根据权利要求3所述抗妥布霉素的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，用于间接ELISA检测的妥布霉素包被抗原Tob-OVA的制备:取丁二酸17mg，N, N’ - 二环己基碳二亚胺DCC 20mg, N-N-羟基琥珀酰亚胺NHS 1mg溶于ImL的DMF中活化过夜，离心去除沉淀，取上清滴加入溶于9mL 0.2M硼酸盐缓冲溶液BB含50mg卵清蛋白的溶液中偶联过夜；将羧基化的卵清蛋白4°C透析三天； 取上述羧基化的卵清蛋白1mg溶于ImL 0.0lM的PBS中，加入8mg EDC和5mg NHS，搅拌15min后，将事先溶解于2mL 0.05M的CBS溶液中6.8mg的妥布霉素逐滴加入蛋白液中偶联4h，4°C透析三天，_20°C分装保存。
8.权利要求2所述抗妥布霉素的单克隆抗体的应用，其特征在于用于检测食品中妥布霉素残留。
【文档编号】G01N33/577GK104312978SQ201410510516
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】匡华, 曹珊珊, 胥传来, 徐丽广, 马伟, 刘丽强, 宋珊珊, 吴晓玲 申请人:江南大学