肿瘤相关抗原sm5－1的特异性抗体及其应用的制作方法

专利名称：肿瘤相关抗原sm5－1的特异性抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于肿瘤免疫学领域，具体涉及一种特异性存在于黑色素瘤、乳腺癌和肝细胞癌的抗原、其特异性的单克隆抗体，以及该单克隆抗体应用于其特异抗原相关的肿瘤诊断和/或治疗的方法。
背景技术：
恶性肿瘤是危害人类健康的重大疾病之一，其中，黑色素瘤、肝细胞癌和乳腺癌均是恶性肿瘤中较为常见的。
恶性黑色素瘤是一种恶性程度很高的肿瘤，发生在头颈者约占全身的20％，主要发生于皮肤与腔、窦粘膜。人恶性黑色素瘤通常始于有害的黑痣，这些黑痣在辐射刺激后生长，形成破坏性的转移黑色素瘤。黑色素瘤极易向全身扩散，在临床上难以控制。化学治疗和放射性治疗通常对黑色素瘤不起作用。
目前，黑色素瘤免疫组织化学检测通常使用的抗体是HMB-45、抗S-100和NKI/C3(参见Smoller BR，PATHOLOGYState of the Art Reviews，2371-383，1994)。这些抗体还存在着一些缺陷，HMB-45敏感性较低(其敏感性介于67％-93％之间)，会有一定量的黑色素瘤漏诊(参见Wick MR et al.，J CutanPathol 1988；15201-207；Ordonez NG et al.，Am.J.Clin.Pathol.1988；90385-390)。S-100蛋白的抗体比HMB-45具有更高的敏感性(参见Nakajima Tet al.，Cancer 1982；50912-918；Kindblom LG et al.Acta.Pathol.Macrobial.Immunol.Scand.1984；92219-230)，但是它的特异性很差。NKI/C3抗体能作用于许多良性的或恶性的肿瘤，这种非特异性活性使NKI/C3抗体在黑色素瘤诊断上的使用受到了很大的限制。
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。据统计，全球每年约有120余万妇女患乳腺癌，50万妇女死于乳腺癌。其中北美洲、西欧、北欧等发达国家乳腺癌发病率最高，非洲发病率最低。乳腺癌的发病在世界范围内呈明显上升趋势，无论在高发区还是低发区，乳腺癌发病率均以5-20％的速度上升。
肝癌是我国发病率最高的恶性肿瘤之一，其与肝炎有关。目前已经进行了较深入研究的肝癌抗原主要有PHC，F062，25T和Hab18等(Preparat ion ofmonoclonal antibody against apoptosis-associated antigens of hepatomacells by subtractive immunization Lian-Jun Yang，Wen-Liang Wang WorldJ Gastroenterol 2002；8(5)808-814)。研究发现，甲胎蛋白(AFP)在肝癌患者的血液中表达，在卵巢癌、睾丸癌等癌细胞也有表达。肝癌特异性Hab18单抗已经进行了部分研究，但该抗体的靶抗原未能成为治疗肝癌的有效靶点。
目前，虽已制备了许多恶性肿瘤免疫治疗的单克隆抗体，但是这些单克隆抗体的特异性及中和能力均不够理想。因此，需要开发新的针对恶性肿瘤的高特异性和中和力的单克隆抗体(包括人源化抗体)。

发明内容
本发明公开了一种能与表达于黑色素瘤、乳腺癌及肝细胞癌表面的SM5-1抗原特异结合的抗体(如单克隆抗体)、多克隆抗体以及多肽。这种抗原的分子量为230kD及180kD。这种抗原可用本发明的抗体自黑色素瘤、乳腺癌和/或肝细胞癌细胞中分离获得。
一个方面，本发明提供了一种人源SM5-1特异性单克隆抗体(huSM5-1)。人源SM5-1特异性单克隆抗体(huSM5-1)重链及轻链可变区如表1所示。
在某些具体的情况下，该发明为一种抗体或包含huSM5-1片段或区域的多肽。一种具体的情况是片段为huSM5-1表1所示的重链；另一具体的情况是片段为表1所示的轻链；第三种具体的情况是片段为包含huSM5-1中SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的轻链和/或重链一个或多个可变区的氨基酸序列；第四种具体的情况是片段为包含表1所示的huSM5-1重链和/或轻链的互补决定簇区(CDR)。
另一个方面，本发明提供了可竞争抑制huSM5-1与SM5-1靶抗原特异结合的抗体。在某些具体的情况下，抗体重链的可变区包含SEQ ID NO9中31-35，50-66和99-108的氨基酸序列，抗体轻链的可变区包含SEQ ID NO10中24-40，56-62和95-102的氨基酸序列。另一具体的情况是抗体重链的可变区包含SEQ IDNO9的氨基酸序列。第三种具体的情况是抗体轻链的可变区包含SEQ ID NO10的氨基酸序列。第四种具体的情况是抗体重链可变区包含SEQ ID NO9的氨基酸序列，抗体轻链的可变区包含SEQ ID NO10的氨基酸序列。在某些具体的情况下，抗体为人源抗体。
另一个方面，本发明提供了一种鼠源性SM5-1特异性的单抗(mSM5-1)(其重链及轻链可变区序列如表2)。mSM5-1重链可变区包含SEQ ID NO3的氨基酸序列， 轻链可变区包含SEQ ID NO4的序列。
在某些具体的情况下，本发明是一种抗体或包含mSM5-1一个片段或区域的多肽。另一具体的情况是片段为包含mSM5-1中SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的轻链和/或重链一个或多个可变区的氨基酸序列。第三种具体的情况是片段为包含SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的mSM5-1重链和/或轻链的互补决定簇区(CDR)。
另一个方面，本发明提供了可竞争抑制mSM5-1与SM5-1靶抗原特异结合的抗体。在某些具体的情况下，抗体重链的可变区包含SEQ ID NO3中31-35，50-66和99-108的氨基酸序列，抗体轻链的可变区包含SEQ ID NO4中24-40，56-62和95-102的氨基酸序列。另一具体的情况是抗体重链的可变区包含SEQ IDNO9的氨基酸序列。第三种具体的情况是抗体轻链的可变区包含SEQ ID NO10的氨基酸序列。第四种具体的情况是抗体重链可变区包含SEQ ID NO9的氨基酸序列，抗体轻链的可变区包含SEQ ID NO10的氨基酸序列。在某些具体的情况下，抗体人源化抗体。
另一个方面，SM5-1抗原特异性的抗体为嵌合抗体，其重链可变区包含SEQ ID NO3的氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO4的氨基酸序列另一方面，本发明的抗体是人源化抗体，其重链可变区包含SEQ ID NO1的氨基酸序列和/或轻链可变区包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。另一具体的情况是本发明是一种抗体或包含该人源化抗体一个片段或区域的多肽。第三种具体的情况是片段为包含人源化抗体的SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的轻链和/或重链一个或多个可变区的氨基酸序列。第四种具体的情况是片段为包含人源化抗体的SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的轻链和/或重链一个或多个CDR。该发明还提供了可以抑制人源化抗体结合SM5-1抗原的抗体。
这里描述的某些具体情况下，本发明的抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，Fab片段，Fab′片段，F(ab′)2片段，Fv片段，双体，单链抗体，或这些片段形成的多特异性抗体。
另一方面，本发明还提供了包括编码上述抗体重链和/或轻链或其片段核酸序列的分离的核酸分子。在某些具体的情况下，核酸分子包含了编码SEQ IDNO9和/或SEQ ID NO10氨基酸序列的核酸序列。另一具体的情况是核酸分子包含了SEQ ID NO11和/或SEQ ID NO12的核酸序列。第三种具体的情况是核酸分子包含了编码SEQ ID NO3和/或SEQ ID NO4氨基酸序列的核酸序列。第四种具体的情况是核酸分子包含了SEQ ID NO7和/或SEQ ID NO8的核酸序列。第五种具体的情况是核酸分子包含了编码SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO2的氨基酸序列的核酸序列。第六种具体的情况是核酸分子包含了SEQ ID NO5和/或SEQ ID NO6的核酸序列。
另一方面，本发明提供了与上述所有核酸序列互补的分离的核酸分子。
另一方面，本发明提供了含有上述任何核酸分子的载体。所述载体可能包含与上述编码抗体的核酸序列操作性相连的表达调控序列。
另一方面，本发明还提供了含有上述核酸分子的重组细胞。在某些具体的情况下，重组细胞为真核细胞。另一具体的情况是重组细胞为CHO细胞。
另一方面，本发明提供了制备上述任何抗体或其片段的方法，包括培养含有编码抗体或其片段的核酸分子并由其表达的重组细胞；还包括抗体或其片段的表达。在某些具体的情况下，该方法还包括了抗体或其片段的分离和/或纯化方法。
另一方面，本发明提供了一种药物组合物，包含有效剂量的上述任何抗体以及药学上可以接受的载体或赋形剂。在某些具体的情况下，该药学组合物为包括有效剂量的人源SM5-1特异性的单克隆抗体及药学上可以接受的载体或赋形剂，该人源SM5-1特异性单克隆抗体重链可变区包含SEQ ID NO9中的31-35，50-66和99-108氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO10中的24-40，56-62和95-102氨基酸序列。在另一具体的情况下，该药学组合物为包括有效剂量的人源化SM5-1特异性的单克隆抗体及药学上可以接受的载体或赋形剂，该人源化SM5-1特异性单克隆抗体重链可变区包含SEQ ID NO1中的31-35，50-66和99-108氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO2中的24-40，56-62和95-102氨基酸序列。
本发明还提供了包含有效剂量上述抗体的试剂盒以及应用抗体的方法说明。
另一方面，本发明还提供了治疗哺乳动物肿瘤的方法，该方法包括应用有效剂量的上述抗体于需要该种处理的哺乳动物。在某些具体的情况下，哺乳动物为人类。在某些具体的情况下，肿瘤为黑色素瘤，乳腺癌或肝细胞癌。另一具体的情况是，抗体通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)或补体依赖的细胞毒作(CDC)用发挥抗肿瘤效应。另一具体的情况是抗体为人源抗体。还有另外的具体情况是抗体为人源化抗体。
另一方面，本发明提供了一种组合物，该组合物包括a)有效剂量的上述抗体；b)有效剂量的抗肿瘤制剂。在某些具体的情况下，抗肿瘤制剂为治疗黑色素瘤，乳腺癌或肝细胞癌的制剂。
本发明还提供了一种治疗哺乳动物肿瘤的方法，该方法包括将有效剂量的上述组合物施用于需要该种处理的哺乳动物。
另一方面，本发明还提供了诱导caspase-10介导的细胞凋亡的方法，该方法包括包括应用有效剂量的上述抗体于需要该种诱导的细胞。在某些具体的情况下，细胞为黑色素瘤细胞。在某些具体情况下，细胞位于哺乳动物体内。
另一方面，本发明还提供了一种偶联物，该偶联物包含结合毒素和/或放射性同位素的上述抗体。
另一方面，本发明还提供了一种分析样本中SM5-1(如人源SM5-1靶抗原)靶抗原的方法，该方法包括a)从受试者获取样本；b)在适当的条件下，上述抗体与可能存在于样本中的SM5-1靶抗原的结合；c)分析抗体与SM5-1靶抗原的结合，从而判断样本中是否含有和/或SM5-1靶抗原的量。在某些具体的情况下，该方法用于肿瘤的诊断及预后。在某些具体情况下，肿瘤为黑色素瘤，乳腺癌或肝细胞癌。
该发明还提供了一种分析样本中SM5-1(如人源SM5-1靶抗原)靶抗原的试剂盒，该试剂盒包括a)上述的任何抗体；b)通过分析抗体与SM5-1靶抗原的结合，从而判断样本中是否含有和/或SM5-1靶抗原的量的方法。


图1显示了本发明所用表达载体pMG18-3K，标明了其中的元件及酶切位点。HCMV pro，人巨细胞病毒Major Immediate早期启动子；Ck，人κ链恒定区基因；CH，人γ1链恒定区基因；pA，多聚腺苷化信号；DHFR，二氢叶酸还原酶基因；pUC origin，质粒复制起始位点；Amp为氨苄青霉素抗性基因。
图2显示了人源化SM5-1抗体(ReSM5-1)重链及轻链的可变区。选择人抗体KOL重链可变区作为人源化抗体重链的框架区，人本-周蛋白REI轻链可变区作为人源化抗体轻链的框架区。“—”表示与人抗体KOL或REI相应序列相同的氨基酸。括号中为CDR区。氨基酸顺序根据Kabat(Kabat et al.，″Sequences ofProteins of Immunological Interest，5th ed.，US Department of Heal thand Human Services，National Institute of Health，Bethesda.1991)标记。
图3显示了使用流式细胞仪测定huSM5-1抗体结合到各乳腺癌细胞系、黑色素瘤细胞系及肝癌细胞系的FACS图谱。
图4显示了SM5-1抗原的免疫印迹反应图谱。
图5显示了用huSM5-1处理的QYC和XJC细胞中caspase-10活性的变化。
图6显示了chSM5-1、reSM5-1单抗对肝细胞癌细胞系QYC的体外抑制增殖曲线；其中A为chSM5-1单抗对QYC的体外抑制增殖曲线，B为reSM5-1单抗对QYC的体外抑制增殖曲线。
图7显示了(A)chSM5-1和(B)reSM5-1单抗对QYC的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用。
图8显示了(A)chSM5-1和(B)reSM5-1单抗对QYC的补体依赖的细胞毒作用。
图9显示了chSM5-1及reSM5-1对QYC荷瘤裸鼠的治疗作用。
图10显示了125I标记的chSM5-1及reSM5-1尾静脉注射QYC荷瘤裸鼠后组织分布。
具体实施例方式
该研究建立在新近发现的一个新抗原SM5-1基础之上，该抗原过量表达于黑色素瘤、乳腺癌和肝细胞癌。其存在糖基化和非糖基化两种形式。Western blot研究显示，本发明抗体与分子量分别为230kD(命名为A230)和180kD(命名为A180)的两种分子结合。
本发明还提供了抗SM5-1的特异性人源(huSM5-1，其可变区见表1)、人源化(ReSM5-1，其可变区见表3)及嵌合抗体(chSM5-1，其可变区见表2)。这些抗体可以和黑色素瘤、乳腺癌和肝细胞癌表面的抗原结合，并且可以抑制细胞生长和/或增殖，诱导这些细胞进入caspase-10介导的凋亡。由此可见，SM5-1提供了此类恶性肿瘤治疗的靶点。
为了清楚阐明本发明，本发明进一步具体描述如下，这些描述不用于限定本发明A.通用技术除非特别指明，本发明所用技术均为分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学领域的常规技术，一般技术人员均可实施。此类技术在文献中均有详细阐述，如《分子克隆实验指南》第二版(Sambrook et al.，1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，ed.，1984)；《分子生物学方法》Humana Press；Cell BiologyA Laboratory Notebook(J.E.Cellis，ed.，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，ed.，1987)；Cell and Tissue CultureLaboratory Procedures(A.Doyle，J.B.Griffiths，and D.G.Newell，eds.，1993-1998)J.Wiley and Sons；Methods inEnzymology(Academic Press，Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller and M.P.Calos，eds.，1987)；Current Protocols in MolecularBiology(F.M.Ausubel et al.，eds.，1987)；PCRThe Polymerase ChainReaction，(Mullis et al.，eds.，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.，eds.，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wileyand Sons，1999)；Immunobiology(C.A.Janeway and P.Travers，1997)；Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodiesa practical approach(D.Catty.，ed.，IRL Press，1988-1989)；Monoclonal antibodiesa practical approach(P.Shepherd and C.Dean，eds.，Oxford University Press，2000)；Usingantibodiesa laboratory manual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring HarborLaboratory Press，1999)；The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra，eds.，Harwood Academic Publishers，1995)；and CancerPrinciples and Practice ofOncology(V.T.DeVita et al.，eds.，J.B.Lippincott Company，1993).
B.定义除非特别指明，本发明中提到的技术和科学术语同本领域研究人员一般理解的含义。本专利书中提到的所有专利、专利申请、出版的专利申请和其他出版物均全部纳入本文作为参考。如果该专利书中提到的定义与其他文书中提到的不同或者相反，以本专利书为准。
在本文中，一个(“a”或“an”)表示至少有一个(“at least one”)或者一个或者更多(“one or more”)。
所谓“抗体”就是能够通过至少一个抗原识别位点，和靶分子(包括糖、多聚核酸、脂类、多肽等)特异性结合的免疫球蛋白。在本文中，该定义不但包括完整的多克隆或者单克隆抗体，也包括各种抗体片段(如Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv)、单链抗体(Scfv)，二体，由抗体片段形成的多特异性抗体，及其突变体含有抗体片段的融合蛋白，以及任何经过改造但包含所需特异性识别位点的免疫球蛋白分子。抗体包括各种类别，如IgG，IgA，或IgM(或由此而来的各种亚型)，不属于上述任一类别的抗体。依据抗体重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为多个类别，主要有5种IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM。其中某些又可以分为多个亚型，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1以及IgA2。不同类别免疫球蛋白重链恒定区结构域分别称为alpha，delta，epsilon，gamma，及mu。有关不同类别免疫球蛋白亚单位结构、三维构象等知识均为本领域研究人员所熟知。
所谓“单克隆抗体”是指包含参与选择性结合某一抗原氨基酸结构(自然或者经改建)的同一抗体群。单克隆抗体具有高度特异性，针对某一单一抗原位点。该定义不但包括完整的单克隆抗体和全长的单克隆抗体，也包括各种抗体片段(如Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv)、单链抗体(ScFv)，二体，由抗体片段形成的多特异性抗体，及其突变体含有抗体片段的融合蛋白，以及任何经过改造但包含所需特异性识别位点的免疫球蛋白分子。抗体的来源或者其制备方法并不受限制，例如通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等。
所谓抗体的“可变区”是指抗体轻链的可变区、或者重链的可变区、或者二者共同形成的可变区。无论重链还是轻链的可变区均由通过三个互补决定区(complementarity determining regions，CDRs，又称为高变区)及将其联结起来的四个框架区(framework regions，FR)组成。每条链的CDRs被FRs拉近，并且和来自另外一条链的CDRs一起，形成抗体的抗原结合位点。目前至少有两种技术手段可以确定CDRs一种是基于跨种属的序列可变性(i.e.，Kabat et al.Sequencesof Proteins of Immunological Interest，(5th ed.，1991，Nat ional Institutesof Health，Bethesda MD))；另外一种基于抗原-抗体复合物的晶体结构研究(Chothia et al.(1989)Nature 342877；Al-lazikani et al.(1997)J.Molec.Biol.273927-948)。我们这里提到的CDRs可以是通过二者任一技术获得的CDRs。
所谓抗体的“恒定区”是指抗体轻链的恒定区、或者重链的恒定区、或者二者共同形成的恒定区。
所谓“人源化”是指一个分子的抗原结合部分来自非人源的免疫球蛋白，而其余部分则基于人免疫球蛋白分子和/或序列构建。抗原结合位点可以由完整的可变区融合到恒定区构成，也可以只是互补决定区(CDRs)移植到可变区适当的框架结构上。抗原结合位点可以是野生型的，也可以通过替换一个或者多个氨基酸加以改造(譬如，可以通过改造使其更象人自身的免疫球蛋白)。某些形式的人源化抗体保留所有的CDRs序列，如(含有鼠抗体的所有6个CDR区的人源化鼠抗体。也有一些人源化抗体只保留一个或者几个CDRs(一、二、三、四、五、六个)，这些CDRs根据原来的抗体改造，也称为来自原来源抗体CDRs的CDRs。
所谓“嵌合抗体”是指一个抗体的轻链和重链中一部分氨基酸序列来自一个种属或者属于一个类别，而其余部分来自另外一个种属或者为另外一个类别。典型的嵌合抗体中，其轻链和重链的可变区来自某种哺乳动物种属，而恒定区来自另外一个种属。这样一个显而易见的优点是，其可变区可以来自已有的或者容易获得的非人杂交瘤或者B细胞，而恒定区来自人的细胞，二者联合即可获得。其可变区容易获得，特异性不受来源影响；而恒定区为人源，注射于人体后不易引起免疫反应。但是需要指出的是，该定义不仅局限于此例。
本文中“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白”用来描述不同长度的氨基酸序列。这些多聚分子可以是线性的，也可能具有分支结构；可能含有经过改造的氨基酸，也可能含有其他非氨基酸分子。该定义还包括自然或者通过干预修饰的氨基酸多聚分子，如二硫键的形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或者其他任何修饰改造，如与某种标记分子偶连。该定义还包括其中含有氨基酸类似物的多肽(如非自然状态下存在的氨基酸)以及其他任何本领域研究人员所熟知的修饰手段。应该可以理解的是，因为此类多肽均来自抗体，因而它们可以是单链分子也可以是由几条链构成。
在本文中，“核酸”是指各种形式的脱氧核糖核酸(DNA)和/或者核糖核酸(RNA)，包括单链、双链、三链、线形、环状等各种形式。另外还包括多聚核苷酸、寡聚核苷酸、核苷酸嵌合物以及由此而来的各种类似物。该文描述的核苷酸是本领域研究人员所熟知的由四种硷基(胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤)或者其衍生物构成的DNA或者RNA。另外，各种形式的带有稀有的磷酸二酯骨架的寡聚核苷酸衍生物也包括在内，如磷酸三酯，多聚肽核酸(PNA)，甲基磷酸酯(methylphosphonate)，硫代磷酸酯(phosphorothioate)，多聚核苷酸引物，锁核酸(LNA)等。
所谓“宿主细胞”是指能够或者已经作为载体接受细胞的某个细胞或者细胞培养体系，这些载体用来整合多聚核苷酸。宿主细胞包括一个宿主细胞的子细胞，但是由于自然、偶然或者特意突变等原因它们并不一定与其来源细胞完全一样(无论是形态学或者DNA序列)。宿主细胞包括体内转入本发明中寡聚核苷酸的细胞。
所谓“处理”是指为了获得某种有益目的，特别是为了增强临床效果所采用的方法。本文中所指的有益目的和临床效果包括但是不局限于以下内容抑制肿瘤细胞的增殖或者杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞的转移、减小肿瘤瘤块体积、减轻疾病症状、提高病人的生存质量、减少其他药物用药剂量、延缓疾病进程和/或延长病人生存期。
所谓抗体、药物或者任何药物成分的“有效量”是指足以取得有益目的和临床效果的量；所谓有益目的和临床效果包括抑制肿瘤细胞的增殖或者杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞的转移、减小肿瘤瘤块体积、减轻疾病症状、提高病人的生存质量、减少其他药物用药剂量、通过增加靶向性提高其他药物治疗效果、延缓疾病进程和/或延长病人生存期。有效量可以通过一次或者几次给药获得。本发明中，所谓“有效量”是指通过直接或者间接机制足以抑制肿瘤细胞的增殖或者杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞的转移的量。在肿瘤临床实践中，由于一种药物的有效量可能受到其他药物的影响，因此，如癌症临床领域人员所知道的那样，有效量的药物、化合物或药物组合物可以与其他药物、化合物或药物组合物联用。因此，“有效量”可应用于施用一种或多种治疗剂的场合。单一治疗剂可以以有效量给予，而且如果可以实现有利的结果，还可以与一种或多种其他治疗剂联用。
所谓“生物学样品”包括来自某一个体、用于诊断或监测的各种样品。该定义包含血样、生物来源的其他液体样品、固体组织样品(包括活检标本以及由此得来的组织培养物或细胞培养)。该定义还包括了经过各种处理的样品，如经过各种试剂处理、溶解、蛋白质、多聚核酸富集或者包埋于半固体或固体基质。该定义既包括来自临床的样品，也包括培养的细胞、培养上清、细胞裂解物、血清、血浆、生物液体和组织样品。
C、组合物及制备方法该发明提供了能够和SM5-1抗原特异性结合的抗体或多肽。在某些具体情况下，该抗体是单克隆抗体；该抗体可以是人来源的、人源化的、或者嵌合性的抗体。
在某些具体情况下，该发明系能够和SM5-1抗原特异性结合的抗体或者多肽。抗体的重链可变区含有SEQ ID NO9中的氨基酸序列(31-35，50-66和99-108)，轻链可变区含有SEQ ID NO10中的氨基酸序列(24-40，56-62和95-102)，或者二者同时存在。在某些情况下，抗体的重链可变区含有SEQ ID NO9中的氨基酸序列。在某些情况下，抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO10中的氨基酸序列。在某些情况下，抗体的重链可变区含有SEQ ID NO9中的氨基酸序列，而轻链可变区含有SEQ ID NO10中的氨基酸序列。在某些情况下，抗体如表一所示为huSM5-1。
某些具体情况下，该发明系能够和SM5-1抗原特异性结合的抗体或者多肽。抗体的重链可变区含有SEQ ID NO3中的氨基酸序列(31-35，50-66和99-108)，轻链可变区含有SEQ ID NO4中的氨基酸序列(24-40，56-62和95-102)，或者二者同时存在。在某些情况下，抗体的重链可变区含有SEQ ID NO3中的氨基酸序列。在某些情况下，抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO4中的氨基酸序列。在某些情况下，抗体的重链可变区含有SEQ ID NO3中的氨基酸序列，而轻链可变区含有SEQ ID NO4中的氨基酸序列。在某些情况下，抗体为人源化抗体。在某些具体情况下，人源化抗体重链可变区含有SEQ ID NO1中的氨基酸序列，而轻链可变区含有SEQ ID NO2中的氨基酸序列。
在某些具体情况下，该发明为嵌合性抗体，抗体的重链可变区含有SEQ ID NO3中的氨基酸序列。在另外一些情况下，该发明为嵌合性抗体，其轻链可变区含有SEQ ID NO4中的氨基酸序列。在某些情况下，该发明中的嵌合性抗体，重链可变区含有SEQ ID NO3中的氨基酸序列，而轻链可变区含有SEQ ID NO4中的氨基酸序列。
该发明也提供了能够竞争抑制本文提到的任何特异性结合SM5-1抗体的抗体(如单克隆抗体)和多肽。一般情况下，抗原固定于多孔板，从而检测未标记抗体阻断标记抗体的情况。一般抗体标记通过标记放射性活性物质或者酶标物。
本发明还涵盖了上述抗体的各种不同组成、等价物或者多肽片段(如，Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv，Fc等)、单链、二体，由抗体片段形成的多特异性抗体，及其突变体、含有抗体片段的融合蛋白，以及任何经过改造修饰后仍保持SM5-1抗原特异性识别位点的抗体。
人来源SM5-1抗体(huSM5-1)的可变区序列如表1所示。人源化SM5-1抗体(ReSM5-1)可变区序列如表3所示。因而，本发明提供了抗体、抗体片段以及由此而来的多肽，而抗体可以由宿主细胞产生。
本发明还提供了下列分子或者由下列分子组成的组合物。(a)抗体huSM5-1(可变区见表1)；(b)抗体huSM5-1的片段或者一个区域；(c)抗体huSM5-1的一条重链；(d)抗体huSM5-1的一条轻链；(e)来自抗体huSM5-1的重链或者轻链或者二者同时来源的一个或多个可变区；(f)来自抗体huSM5-1的一个或者多个CDR(s)(一、二、三、四、五、六个)；(g)来自抗体huSM5-1轻链三个CDR；(h)来自抗体huSM5-1重链的三个CDR；(i)来自抗体huSM5-1的重链的三个CDR和来自其轻链的三个CDR；(j)带有b到i的任何成分的抗体。
本发明还提供了下列分子或者由下列分子组成的组合物。(a)抗体mSM5-1(可变区见表2，由ATCC Designation No.HB-12588宿主细胞或者其来源细胞产生)；(b)抗体mSM5-1的片段或者一个区域；(c)来自抗体mSM5-1的重链或者轻链或者二者同时来源的一个或多个可变区；(d)来自抗体mSM5-1的一个或者多个CDR(s)(一、二、三、四、五、六个)；(e)来自抗体mSM5-1轻链三个CDR；(f)来自抗体mSM5-1重链的三个CDR；(g)来自抗体mSM5-1的重链的三个CDR和来自其轻链的三个CDR；(h)带有b到g的任何成分的抗体。
本发明还提供了下列分子或者由下列分子组成的复合物。(a)抗体ReSM5-1(可变区见表3)；(b)抗体ReSM5-1的片段或者一个区域；(c)来自抗体ReSM5-1的重链或者轻链或者二者同时来源的一个或多个可变区；(d)来自抗体ReSM5-1的一个或者多个CDR(s)(一、二、三、四、五、六个)；(e)来自抗体ReSM5-1轻链三个CDR；(f)来自抗体ReSM5-1重链的三个CDR；(g)来自抗体ReSM5-1的重链的三个CDR和来自其轻链的三个CDR；(h)带有b到g的任何成分的抗体。
在某些情况下，CDR可以是Kabat CDR，也可以是Chothia CDR或者是二者兼而有之；如何确定CDR区为本领域研究人员所熟知。
根据具体情况，本发明提供了至少存在一个和至少一个、两个、三个、四个、五个与huSM5-1，mSM5-1，or ReSM5-1基本同源CDR的抗体(某些情况下6个CDRs同源)；某些情况下为至少2个CDRs与huSM5-1，mSM5-1，or ReSM5-1至少两个、三个、四个、五个、六个CDRs基本同源，或者来源于这些抗体。可以理解的是，此类发明的特异性结合能力和/或整体活性(如治疗黑色素瘤、乳腺癌、肝癌等肿瘤的效果)均得以保留，虽然它们的活性水平可能多多少少有所差异。
本发明还提供了包含下列任何氨基酸序列的多肽(可以是抗体也可以不是抗体)本发明所描述抗体(huSM5-1，mSM5-1，和ReSM5-1)的可变区中相邻的至少5、10、20、25、30个氨基酸序列。
该发明还提供了制备这些抗体或者多肽的方法。该发明提到的抗体可以通过本领域的常规技术制备，某些具体技术在举例中已有说明。在某些具体情况下，制备方法包括如何培养携带编码这些抗体或片段核酸序列(如表1所示huSM5-1序列；表3示ReSM5-1序列)的宿主细胞，以及如何对这些表达的抗体或者片段进行复性。某些情况下还描述了如何分离和/或纯化这些抗体或者片段。
多肽可以通过蛋白水解或其他抗体降解方法获得，也可以通过上述重组技术或者化学合成的方法获得。抗体多肽，特别是50个氨基酸左右的短肽可以通过化学方法方便的合成。化学合成的方法为本领域人员所熟知，而且可通过商业途径获取。
单克隆抗体可以通过制备杂交瘤的方法获得，如Kohler and Milstein在1975，Nature 256495中所描述的方法。制备杂交瘤时，采用抗原免疫小鼠、仓鼠或者其他宿主动物使其产生能够分泌和抗原特异性结合的抗体的淋巴细胞。另外，淋巴细胞也可以通过体外方法加以免疫。
抗体或者抗体片段也可以通过重组技术获得，如美国专利No.4,816,567描述的那样。采用常规方法分离编码抗体或者抗体片段的DNA，采用能够特异性结合抗体重链和轻链的寡核苷酸探针予以测序。分离后的DNA(如SEQ ID NO5和SEQID NO6)装入表达载体，后者再转染本不表达免疫球蛋白的宿主细胞(如E.coli cells，simian COS cells，Chinese hamster ovary(CHO)cells，or myeloma cells)。对载体(包括表达载体)和宿主细胞，本文将进一步予以阐释。
该发明还描述了对于抗体进行改造修饰的方法，包括制备对其功能无明显影响的等价物和可能增强或者降低了其活性的变异体。修饰多肽技术为本领域的常规技术，无须详细描述。经过修饰改造的多肽包括对其保守序列进行氨基酸替代、在不显著影响活性情况下删除或者增加氨基酸，采用化学类似物等等。可以被取代的氨基酸包括但并不局限于甘氨酸/丙氨酸；缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；丝氨酸/苏氨酸；赖氨酸/精氨酸；和苯丙氨酸/酪氨酸.这些多肽包括糖基化、非糖基化、以及其他翻译后修饰形式，如不同形式的糖基化、乙酰化、和磷酸化。这些替代的氨基酸最好是保守性很强的氨基酸，换句话说，替代氨基酸应该具有原来氨基酸相似的化学性质。这些保守性氨基酸的取代为该研究领域人员所熟知，并且在上面已有举例说明。加以修饰的氨基酸可以是一个或者几个氨基酸，甚至可以是对于某个区(如可变区)的整个重新改建。可变区的变化有可能导致结合能力和/或特异性的改变。其他修饰方法还包括采用本领域常规的耦链技术，包括但不局限于酶手段、氧基取代和螯合作用。修饰可达到多种目的，如用来制备免疫检测用的标记试剂。
该发明还包括含有本发明中的抗体一个或几个片段或区域的融合蛋白。在某些情况下，融合的多肽包含一个轻链可变区和/或一个重链可变区(序列如SEQ IDNO2和/或SEQ ID NO1)。在另外一些情况下，融合的多肽包含来自SEQ ID NO10和/或SEQ ID NO9的一个轻链可变区和/或一个重链可变区。具体在本发明中，融合蛋白包含一个或者多个抗体及一个本来不具有的氨基酸序列，如来自其他分子或者其他区的序列。来自其他分子的此类例子如FLAG tag或6His tag中的″标志(tag)″，这些都是本领域人员所熟知。
融合多肽可以通过本领域人员所熟知的技术制备，如合成或重组技术。在本发明中，一般采用重组技术制备表达融合多肽的多聚核苷酸，当然也可以采用本领域其他的常规技术如化学合成的方法制备。
在一种具体情况下，该发明中的嵌合性抗体其重链和/或轻链为融合蛋白。在某些情况下，其恒定区来自一种种属和/或亚型，而可变区来自另外一种种属和/或亚型。举例说明，某一嵌合抗体其恒定区为人源，而可变区却与小鼠抗体同源或者来自小鼠抗体(如SEQ ID NO3和SEQ ID NO4)。本发明中还涉及一种抗体，其可变区经过人源化改造，其CDR区含有小鼠的氨基酸序列，而框架区来自人的序列。还有领域人员所熟知的其他形式的人源化抗体，本发明中也都有阐述。本发明中还包括嵌合抗体的功能片段，如人源化的Fab片段，其含有一个人源的铰链区，人源的第一个恒定区，一个人源的kappa轻链或重链恒定区，以及来自小鼠轻链和/或重链的可变区(如SEQ ID NO3和SEQ ID NO4)。人源化的Fab片段又可以制备成二聚体。一般说来，该发明中的融合蛋白和嵌合体通过重组技术制备，虽然其也可以通过本领域中其他常规技术如化学合成的方法制备(举例见U.S.Pat.Nos.5,807,715；4,816,567；and 6,331,415.)。
该发明中还包括人源化抗体。通过基因技术对于抗体(如SEQ ID NO7 andSEQ ID NO8)或其他抗体类似物的多聚核苷酸进行操作，以制备人源化抗体，或者提高其亲和力及其他特点。人源化过程的原则是保留抗体结合抗原的基本序列，同时用人源抗体序列更换其其余非人抗体序列。人源化过程基本分为四个步骤(1)确定原来抗体轻链和重链可变区的核酸序列并预测其氨基酸序列；(2)设计人源化抗体，也就是说，确定在人源化过程中采用哪一个框架区；(3)具体的人源化方法和技术；(4)人源化抗体的转染和表达。如恒定区被改造成更加类似人恒定区，从而避免临床试验或用于人体试验时产生免疫反应(如美国专利Nos.5,997,867 and5,866,692.)。
已有多种来源于非人免疫球蛋白携带抗原结合位点的“人源化”抗体被加以描述，包括携带啮齿类V区(改造或不加改造)的抗体，它们的CDRs与人的恒定区融合。具体例子可参考Winter et al.Nature 349293-299(1991)，Lobuglio et al.Proc.Nat.Acad.Sci.USA 864220-4224(1989)，Shaw et al.J Immunol.1384534-4538(1987)，and Brown et al.Cancer Res.473577-3583(1987).。其他亦有文献描述在与人恒定区融合之前，啮齿类CDRs被移植到人的框架区(FR)。可参考Riechmann et al.Nature 332323-327(1 988)，Verhoeyen et al.Science 2391534-1536(1988)，and Joneset al.Nature 321522-525(1986).也有文献描述了采用改造的啮齿类FR为啮齿类CDRs提供支架，如European Patent Publication No.519,596.通过上述处理，这些人源化分子最大限度的降低了用于人体时可能引起的免疫反应，延长了作用时间，提高了治疗效果。其他如Daugherty等在Nucl.Acids Res.，192471-2476(1991)中，以及美国专利Nos.6,180,377；6,054,297；5,997,867；5,866,692；6,210,671；6,350,861和PCT WO 01/27160等描述的方法也可以制备人源化抗体。
另一可供选择的方法是通过噬菌体展示技术制备重组抗体。参见美国专利5,565,332；5,580,717；5,733,743和6,265,150；及Winter et al.，Annu.Rev.Immunol.12433-455(1994)，和实施例2。另外，噬菌体展示技术(McCafferty et al.，Nature 348552-553(1990))还可用于从非免疫的供者免疫球蛋白可变区基因库体外生产人源抗体或抗体片段根据该技术，将可变区基因按表达框克隆至丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白，如M13或fd，并且功能性抗体片段表达于噬菌体颗粒表面。因为丝状噬菌体包含一个单链的基因组DNA拷贝，因此抗体功能的筛选与编码抗体的基因的筛选联系到一起。这样，噬菌体有些类似于B细胞。.噬菌体展示技术可以多种形式应用，参见Johnson，Kevin S.and Chiswell，David J.，Current Opnion如Structural Biology3，564-571(1993)。几种来源的可变区基因片段可用于噬菌体展示。Clacksonet al.，Nature 352624-628(1991)从免疫小鼠的脾脏构建的可变区基因的小的随机组合文库分离到了多种抗唑酮的抗体。可以构建非免疫的人的抗体可变区基因库，并可以分离到抗多种抗原(包括自身抗原)的抗体，使用的技术参见Mark et al.，J.Mol.Biol.222581-597(1991)，or Griffith et al.，EMBO J.12725-734(1993)。在天然的免疫反应中，抗体基因积累高频突变(体细胞突变)。其中的某些变化使抗体具有更高的亲和力，具有高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞再次接触抗原时选择性的复制分化。这一天然过程可通过链替换技术模拟，参见Marks，et al.，Bio/Technol.10779-783(1992))。在该方法中通过噬菌体展示获得的原始的人源抗体的亲和力可以通过自未免疫的供者获得的天然可变区基因库中的重链及轻链可变区基因的序列替换得到提高。利用这种技术可以生产亲和力为pM-nM抗体及抗体片段。1993年，Waterhouse等在Nucl.Acids Res.212265-2266中描述了大规模噬菌体抗体库(也称为“诸库之母”)的制备策略。基因拖曳技术也被用于从啮齿类抗体制备人源抗体，制备的人源抗体与原来的啮齿类抗体具有相似的亲和力和特异性。根据这种也被称作“表位印记”的技术，通过噬菌体文库技术获得的啮齿类抗体的重链或轻链V区基因被人V区所取代，得到啮齿类-人嵌合体。采用抗原选择可分离出能够重建功能性抗原结合位点的人可变区，也就是说，表位决定(印记)了伙伴的选择。通过重复该过程替代残存的啮齿类V区获得人源抗体(具体例子参考PCT patent application PCT WO 9306213，published April 1，1993)。与传统的移植CDR制备人源化抗体不同，该项技术可制备出不含啮齿类框架区或者CDR残基的完全人源抗体。显然，尽管上述讨论的是人源化抗体的制备过程，该技术原则也适用于制备狗、猫、灵长类等动物适用的抗体。
本发明还提供了上述抗体或多肽偶联(如连接)于治疗性的制剂，如放射性同位素，毒素(如calicheamicin)，化疗分子，可以将药物前体转化为活性抗肿瘤药物的药物前体转化酶或含有化疗复合物(或包含这些抗体或多肽的组合物)的脂质体或其他载体。这些组成应用于个体，可以通过抗体或多肽识别肿瘤细胞表达的SM5-1抗原而将制剂导向肿瘤细胞从而可以消除肿瘤细胞(或减少数量)和/或抑制肿瘤细胞的生长和增殖。这些结合物通常指如上所述连接这些成分于抗体。连接(通常指至少为应用的目的，固定这些成分，使之与抗体为最近的相关关系)可以通过下述的方法达到。
本发明的放射性同位素包括能够有效杀伤肿瘤细胞的放射性同位素。例如但并不限于钴-60，131I及X-射线。另外，天然生成的放射性同位素如铀、镭和钍常为多种放射性的混合形式，同样也是合适的放射性分子的例证。
本发明的毒素包括但并不限于紫杉酚，细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴化乙啶，吐根碱，丝裂霉素，依托泊甙，tenoposide，长春新碱，长春碱，秋水仙素，阿霉素，红比霉素，dihydroxy anthracin dione，米托蒽醌，光神霉素，放线菌素D，1-去氢睾酮，糖皮质激素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，心得安，嘌呤霉素及其同源或类似物。
本发明的抗体或多肽可以结合(连接)放射性同位素或分子，毒素，或其他治疗制剂，可以将药物前体转化为活性抗肿瘤药物的前体药物转化酶，脂质体或包含直接或间接、共价或非共价连接的其他载体。抗体可以连接放射性分子，毒素，治疗性分子或前体药物转化酶于其任何位点，只要其保留结合靶抗原的能力。
毒素与治疗制剂可以直接或间接(如通过连接基团或通过具有连接位点的连接分子(如美国专利5,552,391描述的分子))偶联(如共价结合)。本发明中的毒素和治疗性制剂可直接通过本领域熟知的方法直接连接于靶蛋白。例如当抗体与制剂之一具有可以与对方反应的取代基时，二者可直接反应。例如一方的亲核基团如氨基，巯基可与含羰基的基团如酸酐或卤酸或具有容易脱离基团(如卤素)的烃基的另一方反应。
本发明中抗体或多肽连接物还包括了双功能连接分子，其既包含可与毒素制剂或治疗制剂偶联的基团，又有能与抗体偶联的基团。连接分子可以使抗体及所连接的制剂适当分离从而避免影响抗体的结合能力。连接分子可以是可分或不可分的。连接分子的作用还可以是提高制剂或抗体取代基的化学反应性，从而增加偶联的效率。化学反应性的提高可以使得制剂的使用更加容易，或使制剂中的基团具有功能，否则不可能达此目的。双功能连接分子可通过本领域熟知的方法与抗体偶联。例如，含有活性酯基团如N-羟磺胺吡啶酯的连接分子，可通过氨基与抗体中的赖氨酸相连。另一个实例为含有亲核基团胺或肼残基的连接分子可以与抗体糖基中糖的氧化分解过程产生的的醛基相偶联。除了这些直接的偶联方法外；连接分子还可通过中间载体如氨基右旋糖苷与抗体间接偶联。在这些具体情况中，修饰的连接是通过赖氨酸、糖类或中间载体形成。在另一具体的情况下，连接分子与抗体分子中的自由硫醇残基位点选择性相偶联。在本领域中，选择性与蛋白中硫醇残基相偶联的合适的连接分子为大家熟知。包括二硫化合物，α-卤代羧基及α-卤代羧基化合物，马来酰亚胺。亲核的胺与出现于同一分子内部的α-卤代羧基或羧基，可能通过分子内部的胺的烃化而有环化存在的可能。避免这一问题的方法为本领域中熟知的常规方法，例如制备胺与α-卤代基团被不可折叠的基团(如芳基，反式烯烃基)分隔的连接分子，使得不期望的环化反应在空间化学上变得不可能。对于通过二硫键连接的maytansinoids与抗体的偶联物的制法，可参见美国专利6,441,163。
本发明的抗体(或多肽)可通过本领域熟知的方法连接上放射性同位素或分子。有关放射性标记抗体的讨论参见″Cancer Therapy with MonoclonalAntibodiesT″，D.M.Goldenberg ed.(CRC Press，Boca Raton，1995).
本发明的抗体(或多肽)可以连接上述制剂(包括可以将前体药物转化为活性抗肿瘤药物的前体药物转化酶)。例如本发明的抗体或多肽可以通过连接转化前体药物的前体药物转化酶从而用于抗体依赖的酶介导的前体药物治疗AntibodyDependent Enzyme Mediated Prodrug Therapy(ADEPT)(如a peptidylchemotherapeutic agent，see WO81/01145)参见WO 88/07378及美国专利.4,975,278.
本发明的抗体(或多肽)可连接(或标记)标记试剂，如荧光分子，放射性分子或其他本领域熟知的标记物。标记物通常可以提供(直接或间接)信号。
本发明还涵盖了组合，包括药学上的组合，其中包括有效剂量的可与SM5-1抗原结合的抗体(包括抗体连接物)和多肽，以及包括编码上述抗体、多肽序列的多聚核苷酸。如上所述，组合包括结合SM5-1抗原的一种或多种抗体，和/或一种或多种含有编码一种或多种结合SM5-1抗体序列的多聚核苷酸。这种组合还包括合适的赋形剂，如本领域所熟知的包括缓冲液在内的药学上可接受的赋形剂。
本发明还涵盖了包括有效剂量的上述抗体和有效剂量的抗肿瘤制剂的组合。抗肿瘤制剂可以是治疗黑色素瘤、乳腺癌或肝细胞癌的制剂。
本发明还提供了分离的SM5-1的靶抗原，其包含与上述抗体特异结合的蛋白。在某些具体的情况下，分离的SM5-1是一种人的抗原。在某些具体的情况下，分离的SM5-1抗原是糖基化的蛋白。在另一些具体的情况下，分离的SM5-1抗原是一种非糖基化的蛋白。在某些具体的情况下，分离的SM5-1抗原是上述的A230或A180片段。在某些具体的情况下，分离的SM5-1抗原可自黑色素瘤、乳腺癌和/或肝细胞癌细胞中分离获得。
D、多聚核苷酸、载体和宿主细胞本发明还提供了编码该发明中的抗体(如轻链可变区和重链可变区包含SEQID NO2和SEQ ID NO1的多肽序列，轻链可变区和重链可变区包含SEQ ID NO10和SEQ ID NO9的多肽序列)的分离的核酸分子，以及包含该多聚核苷酸分子的载体和宿主细胞。
另一方面，本发明提供了编码上述多肽(包括抗体片段)的多聚核苷酸分子。
另一方面，本发明提供了组合(如药学上的组合)，组合中包括本发明的多聚核苷酸分子。在某些具体的情况下，多聚核苷酸包含SEQ ID NO11或SEQ ID NO12中的核苷酸序列。另一具体的情况是多聚核苷酸包含SEQ ID NO5或SEQ ID NO6中的核苷酸序列。另一具体的情况是组合中包括含有编码上述抗体的多聚核苷酸的表达载体。另一具体的情况是组合包括上述一种或两种多聚核苷酸。表达载体及多聚核苷酸的应用下文有详细说明。
另一方面，本发明提供了制备上述多聚核苷酸的方法。
与本发明所述序列互补的多聚核苷酸也包括其中。多聚核苷酸可以为单链(编码链或反意义链)或双链，也可以是DNA(基因组，cDNA或合成)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子，其包含有内含子，并与DNA分子呈一一对应方式以及不包含内含子的mRNA分子。另外编码或非编码序列可以但非必须出现于本发明的多聚核苷酸中，多聚核苷酸可以但非必须与支持物相连。
多聚核苷酸可以包括一个天然序列(如编码抗体或其片段的内源性序列)或包含这样序列的一个可变区。多聚核苷酸包含一个或多个可替代区域，而且删除这些区域或插入片段，其编码多肽的免疫反应性与天然分子的免疫反应性相比并不会减弱。对编码多肽免疫反应性的影响可以通过如下描述的方法评定。多聚核苷酸的变化形式较佳的至少含有70％，更佳的至少含有80％以及最佳的含有90％的与编码天然抗体或其片段的多聚核苷酸序列等同的序列。
如果两个序列的核苷酸或氨基酸序列如下所述排列比较时相同，则两个多聚核苷酸或多肽序列视为等同。两个序列的比较通常通过比较窗进行，鉴定及比较区域序列的相似性。上述的比较窗指至少约20个临近的位点，通常将两个序列最佳的排列好之后，与参考序列比较30到约75，40到约50的相应的临近位点。
比较序列的最佳排列可以使用生物信息软件-Lasergene套装软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)中的Megalign，应用缺省参数。这一程序具体为下述文献中描述的几种排列技术Dayhoff，M.O.(1978)A model of evolutionary change inproteins-Matrices for detecting distant relationships.In Dayhoff，M.O.(ed.)Atlas of Protein Sequence and Structure，National Biomedical ResearchFoundation，Washington DC Vol.5，Suppl.3，pp.345-358；Hein J.，1990，Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp.626-645 Methods inEnzymology vol.183，Academic Press，Inc.，San Diego，CA；Higgins，D.G.andSharp，P.M.，1989，CABIOS 5151-153；Myers，E.W.and Muller W.，1988，CABIOS411-17；Robinson，E.D.，1971，Comb.Theor.11105；Santou，N.，Nes，M.，1987，Mol.Biol.Evol.4406-425；Sneath，P.H.A.and Sokal，R.R.，1973，Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy，Freeman Press，San Francisco，CA；Wilbur，W.J.and Lipman，D.J.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80726-730。
序列一致性百分比通过如下的方法确定比较两个最佳排列序列的比较窗中至少20个位点，比较窗中的多聚核苷酸或多肽序列与参考序列(不含插入或缺失)相比可能含有20％或更少如5-15％或10-12％的插入或缺失。确定两个序列中相一致的核苷酸或氨基酸相同的位点获得相匹配的位点数，相匹配的位点数除以参考序列的总的为位点数(如窗口的大小)，乘以100而获得序列一致性百分比。
变化形式还包括其部分序列选择性的被天然基因的同源序列取代的情况。这种多聚核苷酸的变化形式在中等强度的条件下可与编码天然抗体的序列(或其互补序列)发生杂交反应。
适合的中等强度的条件包括在5X SSC，0.5％SDS，1.0mM EDTA(pH8.0)中预杂交；50℃-65℃，5X SSC杂交过夜；以及含0.1％SDS的2X，0.5X及0.2XSSC于65℃洗涤20分钟，各两次。
如上所述，高强度的条件为(1)使用低离子强度及高的温度洗涤，如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)杂交过程使用变性剂，如福尔马林，含0.1％牛血清白蛋白的50％(v/v)的福尔马林/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH6.5含750mM氯化钠及75mM柠檬酸钠，42℃；(3)或使用50％的福尔马林，5x SSC(0.75M NaCl，0.075M sodium citrate)，50mM磷酸钠缓冲液(pH6.8)，0.1％的焦磷酸钠，5x Denhardt’s溶液，超声降解的鲑精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS，及10％的硫酸右旋糖苷，42℃，0.2 x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)42℃及50％的福尔马林55℃洗涤，以及随后的高强度的含EDTA的0.1 x SSC于55℃洗涤。熟练的技术工作人员知道如何根据提供的条件如检测长度等调整温度，离子强度等条件。
通过本领域的常规技术，依据基因密码子的简并性，可得到编码上述抗体的许多核酸序列。某些这样的多聚核苷酸与天然基因的核苷酸序列具有最低的同源性。本发明已预期了由于使用不同密码子而产生的多聚核苷酸的变化形式。而且包含这里提供多聚核苷酸序列的等位基因也在本发明的范围。等位基因是发生了一个或多个突变的内源性基因，如核苷酸的删除、添加或取代。其相应的mRNA及蛋白质可以但是并非必须发生结构或功能的改变。等位基因可以通过标准化的技术(如杂交，扩增和/或序列数据库的比较)进行鉴定。
本发明的多聚核苷酸可以通过化学合成的方法、重组方法或PCR获得。化学合成多聚核苷酸的方法已为本领域所熟知，这里没有详细描述。可使用本领域中的技术根据上述的序列通过商业化的DNA合成仪合成预期的DNA序列。
利用重组的方法制备多聚核苷酸，可将包含预期序列的多聚核苷酸可以插入合适的载体，而后载体转入合适的宿主细胞进行复制和扩增。多聚核苷酸可以通过本领域熟知的方法插入宿主细胞。细胞通过直接摄取，胞吞，转染，F-杂交或电转的方式转化外源的多聚核苷酸分子。外源多聚核苷酸一旦转入细胞，就可以以非整合的载体(如质粒)或整合入宿主细胞基因组而在细胞内维持。因此多聚核苷酸可以通过本领域熟知的方法在宿主细胞中扩增，分离。参见Sambrook et al.(1989)。
PCR也可以完成DNA序列的复制。PCR技术已为本领域所熟知，可参见美国专利4,683,195，4,800,159，4,754,065及PCRThe Polymerase Chain Reaction，Mullis et al.eds.，Birkauswer Press，Boston(1994)。
RNA可以通过分离位于合适载体中的DNA并插入到合适的宿主细胞获得。细胞复制时，DNA转录为RNA，RNA可通过本领域熟知的技术分离得到，参见Sambrook etal.，(1989)。
可以通过标准化的技术构建或从本领域可获得的大量的克隆载体中选择获得合适的克隆载体。克隆载体要根据打算应用的宿主细胞进行选择，有用的克隆载体通常具有自主复制的能力，具有特定限制性内切酶的单一酶切位点，和/或具有筛选含有载体的阳性克隆的标志基因。适当的实例包括质粒、细菌病毒，如pUC18，，pUC19，，pUC57，，pMG18-3K，Bluescript(e.g.，pBS SK+，pBS SK-)及其派生物，mp18，mp19，pBR322，pMB9，ColE1，pCR1，RP4，噬菌体DNA，以及穿梭载体如pSA3及pAT28。这些以及许多其他的克隆载体已商业化，可自BioRad，Strategene，及Invitrogen.等厂商购得。
表达载体通常可以复制包含本发明多聚核苷酸序列的的多聚核苷酸结构。因此表达载体在宿主细胞内必须以附加体或整合成为染色体DNA的一部分的方式进行复制。合适的表达载体包括但不限于质粒、病毒载体，包括腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒及噬粒。载体的元件通常包括但并不限于一个或多个下列成分信号序列；复制起始位点；一个或多个标志基因；适当的转录控制元件(如启动子，增强子，终止子)。为了表达(即翻译)，通常还需要一个或多个翻译控制元件，如核糖体结合位点，翻译起始位点以及终止密码子。
含有插入的多聚核苷酸序列的载体可以通过多种适当的方法导入宿主细胞，包括电转化，应用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-右旋糖苷或其他物质转染；微注射；脂质体；感染(载体具有感染性如牛痘病毒)。导入载体或多聚核苷酸的方法的选择通常取决于宿主细胞的特征。
本发明还提供了包含上述多聚核苷酸的宿主细胞。任何可以高表达异源DNA的宿主细胞都可用于编码感兴趣的抗体、多肽或蛋白基因的分离。非限制性的哺乳动物宿主细胞的实例包括但不限于COS，HeLa，及CHO细胞。合适的非哺乳动物宿主细胞包括原核细胞(如大肠杆菌或B.subtillis)及酵母(如S.cerevisae，S.pombe或K.lactis)。宿主细胞cDNA的表达量较佳的要超过宿主细胞内源性抗体或目的蛋白(如果存在的话)表达量的5倍以上，更佳的要超过10倍以上，最佳的要超过20倍以上。筛选表达与SM5-1靶抗原结合的特异抗体的宿主细胞可以通过免疫分析或流式细胞术完成。可以鉴定出高表达目的抗体或蛋白的细胞。
E、利用特异结合于SM5-1抗原的抗体进行肿瘤诊断的方法一方面，本发明提供了样本中人SM5-1靶抗原的方法，该方法包括a)自受试者获得样本；b)上述样本与SM5-1靶抗原特异结合的抗体的结合。c)通过分析样本中人SM5-1靶抗原与抗体的结合来判断样本中是否含有和/或SM5-1靶抗原的量。
上述的SM5-1靶抗原特异性的抗体可以用于鉴定肿瘤细胞的存在与否，包括但不限于黑色素瘤，乳腺癌，肝细胞癌的诊断。检测通常包括了上述SM5-1靶抗原特异性抗体与细胞抗原的结合以及抗原抗体复合物的形成。这种复合物的形成可以在体外或是体内。
另一方面，本发明提供了一种利用上述抗体或多肽帮助肿瘤诊断的方法。所述的帮助诊断的方法是指这些方法有助于判断肿瘤的分类或特征，其可以或不可以作出最后的明确的诊断。帮助肿瘤诊断的方法可以包括检测来自个体的生物样本的SM5-1靶抗原的水平以及样本中SM5-1靶抗原的表达水平。
一种将抗体用于肿瘤的体内影象学诊断是连接标记试剂(如荧光试剂，放射性或放射非穿透性制剂)于抗体，该抗体应用于个体后通过X-射线或其他影响学设备观测标记抗体在表面表达靶抗原的肿瘤细胞的分布位置。所用抗体的浓度在生理条件下可以促进与靶抗原的结合。标记物为本领域所熟知。
另一方面，去除肿瘤细胞并利用本领域熟知的方法制备免疫组织化学检测的组织(包埋入冰冻复合物，冰冻，切片，固定或不固定；固定或石蜡包埋，使用或不使用各种抗原修复及染色方法)。抗体还可以用于鉴定不同进展期的肿瘤细胞。抗体还可以用于确定哪些患者肿瘤细胞表面表达可确定水平的相应抗原从而作为应用针对所述抗原的抗体进行免疫治疗的候选者。
识别抗原的抗体(或多肽)可用于发明检测肿瘤活细胞或死细胞释放或分泌于体液，包括但不限于血液，唾液，尿液，肺部的积液或腹水中的抗原的免疫分析方法。利用本发明的抗体进行诊断的方法在任何形式的抗肿瘤治疗之前或之后都是十分有用的，如化疗或放疗，确定何种肿瘤对给予的治疗反应性更佳，肿瘤患者的预后，肿瘤的亚型分析，转移性肿瘤的原发灶以及肿瘤的进展及其对治疗的反应。
F、治疗中应用SM5-1抗原特异性抗体的方法。
本发明还提供了治疗哺乳动物肿瘤的方法，该方法包括应用有效剂量的SM5-1抗原特异性的抗体(如huSM5-1及ReSM5-1)于需要该种处理的哺乳动物。本发明所述的抗体可以用于患有各种肿瘤个体的治疗，包括但不限于黑色素瘤、乳腺癌及肝细胞癌。在某些具体的情况下，抗体用于肿瘤患者的被动免疫。在某些具体情况下，应用的抗体通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用和/或补体依赖的细胞毒作用发挥抗肿瘤效应。在某些具体情况下，抗体用于治疗人类肿瘤患者。
本发明还提供了治疗哺乳动物肿瘤的方法，该方法包括应用有效剂量的药物组合，组合包括有效剂量的上述SM5-1抗原特异性的抗体以及有效剂量的抗肿瘤制剂于需要该种处理的哺乳动物。在某些具体的情况下，抗肿瘤制剂为治疗黑色素瘤、乳腺癌或肝细胞癌的制剂。
本发明还提供了一种诱导caspase-10介导的细胞凋亡的方法，该方法包括包括应用有效剂量的上述SM5-1抗原特异性的抗体于需要该种诱导的细胞。在某些具体的情况下，细胞为黑色素瘤细胞。在某些具体情况下，细胞位于哺乳动物体内。
可以应用多种形式的上述抗SM5-1抗体以及抗体或抗体片段(如Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv，Fc等)的等价物，如嵌合抗体单链抗体(ScFv)，以及它们的突变体，包含抗体片段的融合蛋白，人源化抗体，连接毒素或放射性同位素的抗体及其他包含所需特异性的改形抗体。在另外一些具体的情况下，抗体或其多种形式(包括上述的具体组成)以及药学上可以接受的赋形剂可以多种形式应用。药学上可接受的赋形剂在本领域是众所周知的，其为相对惰性的物质，可以使药学上有效的物质应用更加容易。例如赋形剂可赋予药物坚固的外形，或作为溶剂。适当的赋形剂包括但不限于稳定剂，湿化及乳化剂，提供不同渗透压的盐类，胶囊剂，缓冲液及透皮剂。用于肠胃外和非肠胃外的给药的赋形剂以及剂型，在Remington，The Scienceand Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing(2000)中有描述。
通常这些制剂构成供注射使用的形式(如腹腔注射，静脉注射，皮下注射，肌肉注射)，但其他应用的形式(如口服，粘摸等)也可使用。抗体及其等价物最好与药学上可接受的载体如盐水，林格氏液，右旋糖苷等联合应用。确切的投药方法如剂量，时间，重复给药取决于具体的个体以及该个体的就医史。通常，应用剂量至少为100ug/kg体重，250ug/kg体重，750ug/kg体重，3mg/kg体重，5mg/kg体重及10mg/kg体重。如每天应用1-200mg的剂量。抗体可以注入肿瘤局部(Irieet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 838694-8698(1986))或全身应用(特别是转移性肿瘤)。
根据经验，药物的半衰期通常会决定使用的剂量。与人体免疫系统相容的抗体如人源化抗体及全人源抗体，可以延长抗体的半衰期并防止宿主免疫系统的攻击。给药频率可在治疗期间确定和调整，基于减少肿瘤细胞的数量，维持肿瘤细胞的减少，降低肿瘤细胞的增殖或是延迟肿瘤转移的发生。肿瘤细胞的存在可由本领域技术人员熟知的多种方法或这里讨论的方法(如免疫组化，活检或生物样品的流式细胞检测)鉴定。也可选择持续释放抗体的长效形式。获得长效释放的形式及工具为本领域所熟知。
在一种具体的情况下，抗体剂量可以根据给药一次或多次的个体依经验确定。一些个体给予逐渐增加剂量的抗体。为评价抗体的疗效，可以随访肿瘤状态特异性的标志分子。这包括观察或用卡尺直接测量肿瘤的大小，通过X射线或其他成像技术间接测量肿瘤大小；通过直接的肿瘤活检及肿瘤样本的显微镜检判断其有否改善；肿瘤间接标志的检测，疼痛或麻痹的减轻，语言、视力、呼吸以及其他肿瘤相关的能力降低的改善；食欲改善；或通过可接受的测定方法检测的生活质量的提高及生存期的延长。对本领域的技术人员而言，投药剂量要依据不同的个体、肿瘤的不同类型、肿瘤的分期、肿瘤有否转移、个体的其他状态以及过去及当前应用的处理而有所不同。
其他的形式包括本领域熟知的转运形式包括但不限于载体，如脂质体。参见Mahato et al.(1997)Pharm.Res.14853-859。脂质体包括但不限于cytofectins，多层载体及单层载体。
在某些具体的情况下，可以出现一种以上的抗体或其他制剂。抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体。这种组合包括至少一种，至少两种，至少三种，至少四种，至少五种不同的抗癌、腺癌、肉瘤或腺肉瘤的抗体。如本领域时常指出的那样，抗体混合物可用于治疗很宽范围的个体。
G、包含本发明抗体的试剂盒本发明还提供了用于检测和/或治疗的包含抗体的试剂盒。在某些具体的情况下，试剂盒包含上述抗体。本发明的试剂盒有合适的包装，并且有选择的提供附加试剂，如缓冲液及上述方法中抗体的使用说明。
一个方面，试剂盒可以用于上述的任何方法，包括治疗患肿瘤的个体。在某些具体的情况下，试剂盒包括有效剂量的上述抗体以及所述抗体的使用说明。
另一方面，本发明提供了分析样本中人源SM5-1靶抗原的试剂盒，试剂盒中包含上述的抗体以及通过分析抗体与SM5-1靶抗原的结合，从而判断样本中是否含有和/或SM5-1靶抗原的量的方法。在某些具体情况下，试剂盒包括分析方法的说明。
本发明的主要优点在于(1)本发明的人源化单克隆抗体/嵌合抗体不仅保留了鼠源SM5-1单克隆抗体的高敏感性、特异性等生物活性，而且在哺乳动物宿主细胞内能够实现高表达，更适合应用于人用药物和临床治疗。
(2)本发明的单克隆抗体可作用于多种肿瘤细胞系，包括但不限于黑色素瘤、肝细胞瘤、乳腺癌等的细胞系。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1huSM5-1抗原的筛选和鉴定一.构建肝细胞癌细胞株QYC的cDNA文库人肝细胞癌细胞QYC(购自上海国际合作肿瘤研究所)用Trizol试剂提取总RNA。按照文献报道的方法分离mRNA并合成cDNA(Marken JS.PNAS，1992，893503-3507)，补平后与BstXI酶切位点的接头相连，经BstXI酶切后克隆到哺乳动物瞬时表达载体pCDM8(购自Invitrogen公司)中，电转化大肠杆菌MC1061/P3(购自Invitrogen公司)，构成cDNA文库。
二.文库的表达和筛选用以上构建的cDNA文库按lipofectin法转染COS-7细胞(Invitrogen)。12小时后胰酶消化细胞后铺于新的培养皿中，转染后72小时，收集细胞，重悬于含鼠源单抗SM5-1(ATCC HB-12588)的PBS/10mM EDTA/5％FBS液中，冰浴1小时，细胞经洗涤后重悬于PBS/EDTA/0.5％FBS液中，将细胞分别铺到10个用羊抗鼠IgG抗体包被的分筛皿中，室温静置2小时后用PBS/EDTA/5％FBS液轻轻洗涤，去掉未与抗体结合的细胞，然后收集吸附在分筛皿上的细胞，采用Hirt法(萨姆布鲁克J，弗里齐E，曼尼阿提斯T.分子克隆实验指南，第2版)回收细胞中的质粒DNA，转化大肠杆菌MC1061/p3进行扩增，构成一个新的cDNA文库。
如上所述，经过4轮转染、表达、分筛和质粒回收，将最后一次用Hirt法回收的质粒转化大肠杆菌MC1061/P3后铺板，随机挑取多个单克隆扩增、抽提质粒，并分别用Lipofectin法转染COS-7细胞。转染12小时后，胰酶消化细胞并铺于新的培养皿中。转染72小时后加入单抗SM5-1，并用FITC标记的羊抗鼠IgG二抗染色，最后在荧光显微镜下观察，鉴定出阳性克隆。
自筛选到的阳性克隆分离质粒，并对编码SM5-1的cDNA克隆进行测序分析。SM5-1的胞外区克隆入哺乳动物细胞表达载体转染CHO细胞进行表达。SM5-1抗原的胞外区自无血清培养上清经亲和层析(交联鼠SM5-1单抗的Sepharose-4B)纯化获得。
实施例2从人抗体库中筛选huSM5-1可变区基因按照Marks等人J.Mol.Biol.，222，581-597；Hoogenboom和Winte，J.Mol.Biol.，227，381-388；Haidaris CG等，J Immunol Methods.2001 Nov1；257(1-2)185-202；Griffiths，A.D.等EMBO J.，13，3245-3260(1994)；Nissim，A.等EMBO J.，13，692-698(1994)中描述的方法构建人源抗体库。
将复苏的抗体库菌株1毫升加入新鲜LB培养基14毫升，于50毫升三角瓶中37℃培养16小时。
菌液12000rpm高速离心10分钟，转移上清至一个无菌的50毫升离心管中，保存备用。其滴度应在2×1011以上。以实施例1纯化的抗原A230(SM5-1)包被25毫升细胞培养瓶。在包被后的细胞瓶中加入不少于3×1010噬菌体颗粒，37℃温育1小时。然后，倒掉瓶中的液体，用10毫升含1％Tween-20的PBS洗涤培养瓶10次。洗脱缓冲液洗下粘附的噬菌体颗粒并加入1毫升对数期的TG1细胞，37℃温育震荡培养16小时。
重复上段所述步骤共4次。
将上述获得的细胞稀释至105/毫升，然后在含0.1％氨苄青霉素的1.5％琼脂平板上进行培养以获得单克隆。取上述平板上的克隆在96孔深孔板上培养，每孔一个克隆，共作960个克隆(10块96孔板)。将上述深孔板在96孔板离心机上5000RPM离心20分钟，将上清转移到新的无菌深孔板，封口后保藏于4℃备用。
取10块96孔板，每孔中加入A230抗原(10微克/毫升)10微升常规包被后，分别加入上述保存的上清10微升，37℃温育1小时后用含有1％Tween-20的PBS洗涤20次。加入1微升HRP标记的羊抗M13单抗，37℃温育30分钟后用含1％Tween-20的PBS洗涤10次。
加入100微升TMB显色底物溶液，96孔板室温避光显色5-20分钟，加入50微升终止缓冲液后，酶标仪读取450纳米处的光吸收值。
通过上述过程共筛选出415个阳性克隆。显色反应强的孔，其相对应的克隆即为包含较强亲和力的抗体可变区的克隆。依据光吸收值，筛选得到5个亲和力强的克隆。取亲和力最强克隆，即含有本发明单抗huSM5-1可变区的克隆，用于后续的研究。HuSM5-1重链氨基酸及核苷序列(SEQ ID NOs9和11)及轻链氨基酸及核苷酸序列(SEQ ID NOs10及12)列于下表1中。
表1. huSM5-1重链及轻链可变区氨基酸及核苷酸序列

实施例3huSM5-1单克隆抗体的制备一.huSM5-1表达载体的构建利用PCR将XbaI酶切位点及单抗OKT3的信号肽加至huSM5-1重链可变区基因的5’端，NheI酶切位点加至3’端。单抗OKT3的信号肽氨基酸序列为MDFQVQIFSFLLISASVIISRG(SEQ ID NO13)，其核苷酸序列为ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGAG(SEQ ID NO14)。将上述PCR产物克隆至pGEM-T载体进行测序确证。重链可变区经XbaI和NheI酶切后插入图1所示的pMG18-3K表达载体(from Development oftools for environmental monitoring based on incp-9 plasmid sequences.A.Greated，R.Krasowiak，M.Titok，C.M.Thomas school of biologicalsciences，university of Bermingham，Edgbaston，Birmingham B15 2TT，UKand Faculty of Biology，Dept of Microbiology，Belarus State UniversityScorina Av.4，Minsk 220080 Belarus)的相应酶切位点。
利用PCR将HindIII酶切位点及单抗OKT3的信号肽加至huSM5-1轻链可变区基因的5’端，BsiWI酶切位点加至3’端。将上述PCR产物克隆至pGEM-T载体进行测序确证。轻链可变区经HindIII和BsiWI酶切后插入pMG18-3K表达载体的相应酶切位点。
二、人源SM5-1的表达及纯化转染之前，CHOdhfr-细胞培养于含有甘氨酸、次黄嘌呤及胸腺嘧啶(GHT)的完全DMEM培养基。上述表达载体用Lipofectamine2000试剂(Invitrogen，Garlsbad，CA)按厂商说明操作，转入CHOdhfr-细胞。转染的细胞在无GHT的DMEM中选择培养，逐渐提高MTX的浓度至1.0mM。挑出抗性克隆扩增后进行后续的分析。挑出的克隆培养上清用夹心ELISA法分析抗体的表达量，羊抗人IgG(Fc)(KPL)为包被抗体，羊抗人κ-HRP(KPL)为检测抗体，纯化的人IgG1/Kappa(Sigma)作为标准品。挑选出抗体表达量最高的克隆进行无血清培养的适应。重组抗体的无血清培养上清通过ProteinA亲和层析纯化。
实施例4SM5-1嵌合(chSM5-1)及人源化(reSM5-1)单克隆抗体的构建1.鼠源SM5-1单抗重链及轻链克变区基因的克隆。用Trizol试剂(GibcoBRL，Grand Island，NY)提取SM5-1杂交瘤细胞(ATCC Designation No.HB-12588)的RNA。按照厂商的说明操作，用5’RACE系统克隆杂交瘤细胞的mSM5-1重链及轻链克变区基因。最终的PCR产物克隆至pGEM-T载体(Promega，Madison，WI)测序确正。重链克变区(mSM5-1VH)及轻链可变区(mSM5-1VL)的核苷酸序列及推定的氨基酸序列如下表2。
表2.mSM5-1可变区的核苷酸及氨基酸序列


2.嵌合抗体表达载体的构建上述mSM5-1重链及轻链可变区用于构建人鼠嵌合抗体。嵌合抗体表达载体的构建采取与实施例3中huSM5-1相同的方法。
转染之前，CHOdhfr-细胞培养于含有甘氨酸、次黄嘌呤及胸腺嘧啶(GHT)的完全DMEM培养基。含有chSM5-1重链及轻链的表达载体pMG18-3K用Lipofectamine2000试剂(Invitrogen，Garlsbad，CA)按厂商说明操作，转入CHOdhfr-细胞。转染的细胞在无GHT的DMEM中选择培养，逐渐提高MTX的浓度至1.0mM。挑出抗性克隆扩增后进行后续的分析。挑出的克隆培养上清用夹心ELISA法分析抗体的表达量，羊抗人IgG(Fc)(KPL)为包被抗体，羊抗人κ-HRP(KPL)为检测抗体，纯化的人IgG1/Kappa(Sigma)作为标准品。挑选出抗体表达量最高的克隆进行无血清培养的适应。重组抗体的无血清培养上清通过ProteinA亲和层析纯化。
3.人源化SM5-1(reSM5-1)表达载体的构建人抗体KOL重链可变区用作人源化抗体重链的框架区，人Bence-Jones蛋白REI用作轻链的框架区。轻链及重链的三个CDR区移植入人抗体轻链及重链的框架区产生人源化抗体的基因。人源化抗体的轻链及重链可变区基因用overlapping PCR的方法合成。人源化抗体表达载体的构建与上述嵌合抗体的方法相同。
如图2所示，轻链或重链的三个CDR区直接移植入人抗体轻链或重链的框架区产生人源化抗体的基因。人源化抗体的轻链可变区及重链可变区基因克隆至表达载体pMG18-3K并在COS细胞中瞬时表达，产生人源化的SM5-1。COS细胞培养上清的reSM5-1表达量通过ELISA鉴定，其与肝细胞癌细胞QYC的结合能力通过流式细胞仪检测确定。抗原结合活性分析表明该抗体与人黑色素瘤细胞的结合能力很差。这提示某些框架区的氨基酸必须改变以回复抗体的结合活性。通过分析确定可能影响抗体结合活性的重要的框架区氨基酸并进行回复突变。最终我们获得了与chSM5-1具有相同抗原结合活性的人源化抗体。人源化SM5-1命名为ReSM5-1，其轻链及重链可变区的氨基酸及核苷酸序列如下表3。在竞争结合实验中，ReSM5-1显示了与mSM5-1及chSM5-1具有相同的亲和力。
表3.ReSM5-1可变区的氨基酸及核苷酸序列

4.人源化抗体的纯化转染之前，CHOdhfr-细胞培养于含有甘氨酸、次黄嘌呤及胸腺嘧啶(GHT)的完全DMEM培养基。合适的表达载体pMG18-3K用Lipofectamine2000试剂(Invitrogen，Garlsbad，CA)按厂商说明操作，转入CHOdhfr-细胞。转染的细胞在无GHT的DMEM中选择培养，逐渐提高MTX的浓度至1.0mM。挑出抗性克隆扩增后进行后续的分析。挑出的克隆培养上清用夹心ELISA法分析抗体的表达量，羊抗人IgG(Fc)(KPL)为包被抗体，羊抗人κ-HRP(KPL)为检测抗体，纯化的人IgG1/Kappa(Sigma)作为标准品。挑选出抗体表达量最高的克隆进行无血清培养的适应。重组抗体的无血清培养上清通过ProteinA亲和层析纯化。
实施例5huSM5-1的生物学活性1.huSM5-1对黑色素瘤细胞的作用在RPMI1640培养基中培养黑色素瘤A2058细胞株至106/毫升。96孔板每孔加入20ul上述细胞悬浮液和不同量的单抗huSM5-1(0，1，5，10，20，50，100ul；单抗溶于含10％FCS的RPMI1640培养基，浓度为1μg/ul)，每孔加入含10％FCS的RPMI1640培养基至500ul。每个浓度设3个复孔。37℃5％CO2培养箱中培养24小时后显微镜检或MTT染色后确定活细胞数。
(1)细胞计数。从上述样品中取出0.2毫升进行细胞计数，结果以检测孔存活细胞占对照孔(不加huSM5-1)存活细胞的百分数表示，具体数据如下huSM5-1加入量(ul) 01 5 102050100细胞存活数(％) 100.087.8 68.8 53.2 42.6 32.6 22.6上述结果说明，huSM5-1单抗具有明显的杀伤人黑色素瘤细胞的作用。
(2)MTT检测取经过huSM5-1单抗处理的细胞0.2毫升，加入1/10体积浓度为5mg/ml的MTT溶液，37℃培养30分钟后在酶标仪上读取570nm处的光吸收值。结果如下表，经过huSM5-1单抗处理的细胞比未经处理的对照光吸收明显降低。
huSM5-1加入量(ul)0 1 5 102050100光吸收(％) 100.0 96.384.9 66.2 47.7 33.6 20.1从上述两个检测结果可以看出，huSM5-1单抗在体外可以明显抑制人黑色素瘤细胞的增殖，因此可能在临床上用于黑色素瘤的治疗。
2.流式细胞分析SM5-1特异性抗原的表达利用huSM5-1对肿瘤细胞表面特异性抗原的表达通过流式细胞术进行了分析，使用的细胞系有乳腺癌细胞系SK-BR-3，MDA-MB-231，BT-20-T，MDA-MB-468和MCF-7；黑色素瘤细胞系CRL-1872，U10；肝细胞癌细胞系QYC，LYX，XJC。
研究发现，SM5-1特异性抗原不仅表达于黑色素瘤细胞，还表达于乳腺癌及肝细胞癌细胞。
取上述细胞系细胞，与适当稀释的huSM5-1温育1小时，然后用PBS洗涤细胞5次，再与FITC标记的羊抗人IgG(2mg/ml，Jackson ImmuinoresearchLaboratories，West Grove，PA)温育40分钟，含1％福尔马林的PBS固定后进行流式细胞仪分析。
结果见图3。乳腺癌细胞系SK-BR-3，MDA-MB-231，MCF-7；黑色素瘤细胞系CRL-1872；肝细胞癌细胞系QYC，LYX，表达高水平或中等水平的SM5-1特异性抗原；SM5-1特异性抗原在乳腺癌细胞系SK-BR-3，BT-20-T，肝细胞癌细胞XJC以及黑色素瘤细胞系U10中表达较低。
这些结果证实SM5-1特异性抗原表达于黑色素瘤细胞，乳腺癌及肝细胞癌细胞。
为了确定huSM5-1识别的抗原决定簇，抽提的肝细胞癌细胞QYC的膜蛋白用huSM5-1抗体进行免疫沉淀，鼠抗人CD4作为阴性对照，然后进行Western印迹测定。
结果发现分子量为230kD和180kD的两种蛋白具有huSM5-1特异性的抗原决定簇(图4)。
3.huSM5-1诱导caspase-10相关的细胞凋亡为了测定caspase是否在huSM5-1诱导的凋亡中发挥作用，检测了多种不同的caspase抑制剂对凋亡抑制率的影响。Caspase抑制剂包括普通caspase抑制剂(Z-VAD-FMK)，caspase-1抑制剂(Z-WEHD-FMK)，caspase-2抑制剂(Z-VDVAD-FMK)，caspase-3抑制剂(Z-DEVD-FMK)，caspase-4抑制剂(Z-YVAD-FMK)，caspase-6抑制剂(Z-VE ID-FMK)，caspase-8抑制剂(Z-IETD-FMK)，caspase-9抑制剂(Z-LEHD-FMK)，caspase-10抑制剂(Z-AVED-FMK)，caspase-13抑制剂(Z-LEED-FMK)。在50uM/L浓度下，caspase抑制剂与QYC细胞共同温育2小时，之后细胞用50ng/ml huSM5-1抗体处理。这些caspase抑制剂的抑制率分别为pan-caspase(72％)，caspase-10抑制剂(52％)，caspase-6抑制剂(28％)，caspase-1抑制剂(27％)，caspase-8抑制剂(17％)，caspase-13抑制剂(15％)，caspase-4抑制剂(14％)，caspase-9抑制剂(5％)，caspase-2抑制剂(1％)，caspase-3抑制剂(1％)。依据上述结果，pan-caspase能够最大抑制huSM5-1诱导的凋亡，caspase-10也可有效的抑制这种凋亡，比其他的caspase抑制剂具有高的抑制效率，这表明huSM5-1诱导的凋亡是caspase依赖性的，caspase-10是对huSM5-1诱导凋亡影响最大的一种caspase。
为了进一步证明huSM5-1诱导的凋亡是caspase-10相关的，使用caspase-10比色分析试剂盒测定了QYC和JXC中caspase-10酶活性的升高。Caspase-10的活性通过caspase-10分析试剂盒(美国R&D公司)来测定，按照厂家的说明书操作。将细胞与50ng/ml huSM5-1抗体孵育一定时间，离心收集细胞，转移弃去上清，加入溶解缓冲液(25ul/1×106细胞)溶解，在冰上放置10分钟，离心，转移上清至新的管中，置于冰上保存。Caspase活性的酶反应在96孔微量滴定板上进行。每一反应需要50ul细胞溶解液上清，50ul 2X反应缓冲液，10ul新鲜DTT贮存液。加入5ul caspase-10比色底物(AEVD-pNA)，在37℃温育1-2小时。酶标仪测定吸光值，检测波长为405nm。Caspase-10相关的活性的增加通过下式计算Caspase-10活性(％)＝(B-C)/(A-C)×100％其中，A表示未用huSM5-1抗体处理的细胞的OD值；B表示用huSM5-1抗体处理的细胞的OD值；C表示阴性对照的OD值。每种处理设置3复孔。
结果如图5。用huSM5-1处理的QYC细胞，caspase-10活性增加从13％(48h)至51％(96h)，huSM5-1处理的XJC细胞，caspase-10活性增加从17％(48h)至38％(72h)，后又降至28％(96h)。与上述试验相结合，可以得出结论，huSM5-1抗体诱导的细胞凋亡是caspase-10相关的。
4.huSM5-1对细胞分化和生长的作用huSM5-1对细胞生长抑制的测定使用MTT进行分析。该反应的原理为活细胞能够将淡黄色的四甲基偶氮唑盐(MTT)还原成蓝紫色的结晶。1×103待测细胞与不同浓度的抗体共孵育，一定时间后，加入20ul MTT(0.5mg/ml，2h)，温育后用DMSO(150ul)溶解蓝紫色结晶。MTT还原产物用Benchmark吸光值读取机(Bio-RadLaboratories)在490nm处测定吸收值，进行定量。细胞生长抑制率如下式计算抑制率(％)＝(A-B)/(A-C)×100其中，A表示huSM5-1未作用的细胞的OD值；B表示huSM5-1作用的细胞的OD值；C表示阴性对照的OD值。每种处理设置3复孔。
发明人用MTT法测定了huSM5-1对4种肿瘤细胞系的生长抑制作用，使用的细胞分别是肝细胞瘤细胞QYC，XJC；乳腺癌细胞系MDA-MB-231；黑色素瘤细胞系CRL-1872。将细胞分别用不同浓度(50ng/ml，10ng/ml，1ng/ml)的huSM5-1抗体处理一定时间(24h，48h，72h，96h)。最大抑制出现在细胞用50ng/ml的huSM5-1处理后72小时。如50ng/ml、10ng/ml和1ng/ml的huSM5-1处理肝细胞癌细胞QYC 24小时后，增长抑制率为29％、11％和7％；48小时后，增长抑制率为28％、17％和5％；72小时后，增长抑制率为43％、19％和10％；96小时后，增长抑制率为36％、11％和2.5％。其他的3种细胞处理后出现类似的结果。对照使用无关人IgG1抗体，对细胞的增殖没有影响。
上述结果证明，huSM5-1抗体能够显著的抑制肿瘤细胞的生长，并且这种抑制作用在一定剂量范围内与剂量及时间相关。这种抑制肿瘤生长的作用是由于huSM5-1单抗具有诱导肿瘤细胞发生Caspase-10相关的凋亡，其凋亡的机制可能与DNA的断裂有关。
实施例6chSM5-1和ReSM5-1的对肿瘤细胞的体外作用本例中使用人肝癌细胞系QYC，购自上海国际合作肿瘤研究所。细胞均传代培养于25cm2培养瓶中，使用含10％胎牛血清(GIBCO公司)的RPMI-1640/DMEM(VV＝1)培养基(GIBCO公司)。
将对数生长期细胞用0.05％胰蛋白酶，0.02％EDTA消化，计数，调整细胞密度为6×104/ml，重悬于10％FCS 1640/DMEM培养液中备用。
用含10％胎牛血清的RPMI-1640/DMEM培养基稀释chSM5-1及huSM5-1。
chSM5-1与huSM5-1的浓度为20mg/ml，用10％FCS 1640/DMEM逐级稀释，直至浓度为8ug/ml，每步稀释不得超过10倍。然后以8ug/ml为起始浓度，在96孔板中2倍比序列稀释，共14个浓度梯度，100ul/孔，只加10％FCS 1640/DMEM的孔为空白对照。
将准备好的细胞悬液分别加入含两种抗体的96孔板中，100ul/孔。为防止多孔板的边缘效应，不使用96孔细胞培养板边缘的孔，但须加入200ul/孔的PBS。37℃，7％CO2细胞培养箱培养7天后显色读数。
显色96孔板加入PMS∶MTS＝1∶20的显色剂，20ul/孔。96孔板盖打开后细胞培养箱继续培养3小时。
酶标仪检测96孔板OD490nm，将吸光度值对标准品或样品浓度作四参数回归。
Y＝(A-B)/[1+(X/C)D]+B根据该方程，X＝+∞时，Y＝B，即最高限；当X＝0时，Y＝A，即最低限；而当X＝C时，Y＝(A+B)/2，即达到最大效应的一半。因此C值为半数有效浓度(ED50)。chSM5-1及reSM5-1对细胞QYC的体外增殖抑制结果参见图6。
试验结果表明，在离体条件下，chSM5-1及reSM5-1均可明显抑制受试细胞系的增殖。
实施例7chSM5-1及reSM5-1对肿瘤细胞的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用1.外周血淋巴细胞(PBL)的分离无菌采集静脉血，注入含有肝素20U/ml的无菌15ml离心管中，轻轻混匀。加入等体积PBS溶液，稀释血液以提高分离效果。
取15ml离心管，每管加入6ml室温浴温后的淋巴细胞分离液(购自中国科学院细胞生物所，上海，中国)。倾斜离心管，沿管壁缓慢加入稀释后的抗凝外周血，6ml/管。动作轻柔，以防破坏界面。
20℃，800g离心30min，刹车关闭，自然降速。管内液体分为三层，从上至下依次为血浆层、细胞分离液、红细胞及粒细胞层。血浆层与细胞分层液交界处毛玻璃样的白色层即为淋巴及单核细胞层。
用吸管轻轻插入毛玻璃样层，缓慢吸出外周血单个核细胞，放入另一15ml离心管中。加入PBS稀释后离心，200g，5min，洗涤2遍。
用无酚红1640/DMEM混合液(GIBCO公司)调整细胞密度为6×106/ml，悬于15ml离心管，置于37℃，7％CO2细胞培养箱备用。
2.靶细胞QYC的制备对数生长期的QYC细胞，用吸管将培养上清吸除，用PBS洗涤2遍。加入0.5ml含0.05％胰蛋白酶及0.02％EDTA的消化液，显微镜下观察细胞形态。待细胞形态开始变圆，吸管吸除消化液。用无酚红的1640/DMEM重悬QYC细胞。计数，调整细胞密度为3×105/ml备用。
3.细胞与chSM5-1及reSM5-1的作用将chSM5-1及reSM5-1用无酚红1640/DMEM混合液稀释至浓度为40ug/ml，而后在1.5ml离心管中将抗体浓度2倍比序列稀释，共14个浓度，300ul/管。加入调整好细胞密度的QYC细胞，300ul/管。4℃作用30min后，200g离心5min，用PBS洗涤2遍。悬于300ul无酚红1640/DMEM混合液中。将与chSM5-1及reSM5-1作用后的细胞悬液加入96孔板中，100ul/孔。以20∶1效、靶比加入效应细胞，100ul/孔，37℃，7％CO2细胞培养箱7h后显色。
4.显色和读数使用罗氏公司非同位素细胞杀伤检测试剂盒检测。催化剂用1ml ddH2O溶解。以1∶45比例将催化剂与染料溶液混合。96孔板以200g离心5min后，每孔吸取50ul上清至另一96孔板中，加入混合好的显色液50ul/孔，室温，避光作用30min。酶标仪读数OD490。
结果见图7。结果证明，chSM5-1及reSM5-1诱发细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖的机理与ADCC有关。
实施例8补体依赖的细胞毒作用人肝癌细胞系QYC细胞表面高表达A230抗原分子，SM5-1单克隆抗体可与其结合。如果培养液中同时存在人的补体成分，则能使结合了抗体的靶细胞溶解，即补体依赖的细胞毒作用(CDC)。在存在过量补体的前提下(由新鲜的正常人血清提供)，在一定范围内抗体的浓度与细胞溶解的程度呈量效关系。细胞溶解的程度可通过检测细胞溶解后释放的乳酸脱氢酶来检测。
补体依赖的细胞毒作用检测使用QYC细胞，经检测无支原体污染。用含10％新生小牛血清(NBS)的RPMI-1640/DMEM(1∶1)培养液传代培养于25-75cm2方瓶中。下述培养液过滤除菌后4℃保存A为含10％新生小牛血清(NBS)的RPMI-1640/DMEM(1∶1)培养液；B为不含血清的无酚红RPMI-1640培养液；C.为含有5％正常人血清的培养液B。人血清为新鲜分离的正常人血清。培养条件为37℃，5％CO2，饱和湿度。
对数生长期的QYC细胞，计数，每次测定(1块96孔板)需约2×106细胞，离心弃上清，加入培养液B调整细胞密度至2×105/ml，加入96孔培养板中，0.1ml/孔。注意不使用96孔板边缘的孔，但在这些孔中加入无菌水(防止多孔板的边缘效应)用培养液C将待测样品逐步稀释至浓度为4ug/mL。每次稀释倍数不超过10倍。在1.5mL无菌离心管中用培养液C连续2倍比稀释样品。
以培养液C为阴性对照，在已接种过QYC细胞的培养板中，加入上述梯度稀的样品或阴性对照的培养液，0.1mL/孔。每个稀释度设2个复孔。置于37℃5％二氧化碳培养箱中培养3-4小时。
从每个测量孔中吸出50μL上清至另一96孔板的对应孔中，加入混合好的LDH检测试剂盒试剂50uL，室温避光孵育0.5h，用终止液1mol/L醋酸50uL/孔终止显色。以490nm为检测波长，630为参比波长于酶标仪测量A450-A630值。结果参见图8。
注该软件给出的回归方程为四参数方程Y＝(A-B)/[1+(X/C)D]+B根据该方程，X＝+∞时，Y＝B，即最高限；当X＝0时，Y＝A，即最低限；而当X＝C时，Y＝(A+B)/2，即半数有效。因此C值为半数有效浓度(ED50)。
上述结果表明，chSM5-1及reSM5-1诱发肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖的机理与CDC有关(图8)。
实施例9SM5-1抗体对QYC荷瘤裸鼠的治疗作用检测chSM5-1、reSM5-1、chCD3、reCD3对QYC荷瘤裸鼠的治疗作用。
40只雌性裸鼠皮下接种QYC细胞，接种后7周瘤体直径平均达0.5cm。荷瘤裸鼠随机分为5组一组为PBS；一组为无关抗体chCD3 4mg/kg；一组为reCD34mg/kg；一组为chSM5-14mg/kg；一组为reSM5-14mg/kg；每组八只裸鼠。
结果参见图9。结果显示，chSM5-1、reSM5-1对QYC荷瘤裸鼠有明显的治疗作用。其作用的机理可能与ADCC或/和CDC有关。
实施例10125I标记的chSM5-1及reSM5-1尾静脉注射荷瘤裸鼠后的组织分布取8只荷瘤裸鼠(QYC)，肿瘤大小约0.7cm，随机分为2组，根据文献报导及临床应用剂量显示4mg/kg浓度即可抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长。故采用此单一剂量进行体内分布实验。
chSM5-1标记效率为682823cpm/ul(0.52ug/ul)，reSM5-1标记效率为681012cpm/u(0.52ug/ul)。
荷瘤裸鼠称重，尾静脉分别注射125I标记的chSM5-1及reSM5-1，平均每只裸鼠尾静注射约180ul左右。根据文献报道，用药后24-72小时测量组织分布较为合适，因此选择48小时作为测量时间。
准备好γ-计数仪专用管并编号，用天平称管重。
先用眼科镊眼球取血，后依次取如下21种组织置于管中。操作过程应最后取肿瘤组织并防止组织间交叉污染。

称取含组织的管重，并得出净重。用γ-计数仪读出cpm值，并根据净重计算出单位重量cpm值。
结果参见图10，注射后chSM5-1及reSM5-1选择性集中于肿瘤部位，可见采用chSM5-1及reSM5-1可用于肿瘤的放射性治疗。
实施例11氯甘脲(Iodogen)法131I标记单克隆抗体SM5-1及其治疗性动物实验氯甘脲(Iodogen)的化学名称为1，3，4，6-四氯-3α，6α-二苯基乙二醇脲，和氯胺T同属于氯酰胺碘化反应类型，是一种不溶于水的固相氧化剂，能将131I氧化成131I2，从而与蛋白质或多肽分子中酪氨酸残基上羟基邻位的氢发生置换反应。此法反应温和，操作简便，对抗体损伤小，标记率高。
1.涂布试管将含0.02％氯甘脲的二氯甲烷或氯仿溶液50ul，加至玻璃或塑料反应管底部，用氮气吹干或减压抽干，低温干燥保存。用前以少量0.05mol/L，pH7.4 PBS洗涤数次，去除未粘附管壁的试剂。
2.标记抗体在反应试管中加入以下物质氯甘脲(0.02％)50ul(涂布于反应管)0.05mol/L，pH7.4PBS 50ulNa131I溶液11mCi/10ul抗体5-10ug/10ul混匀，室温反应5-15min加入0.05mol/L，pH7.4 PBS 200ul终止反应。
3.标记抗体的纯化反应混合物通过Sephades G-50凝胶过滤层析分离纯化。
结果表明，所得标记抗体的比放射活性为126MBq/mg，足以用于放射免疫治疗。
4.131I标记的chSM5-1及ReSM5-1对荷瘤裸鼠的疗效用上述方法标记5mg纯化的chSM5-1及ReSM5-1。将32只荷瘤裸鼠(肿瘤细胞为QYC，肿瘤大小约为0.7cm)随机分成4组，每组8只，尾静脉注射标记的抗体药物。治疗组剂量为5GBq/kg体重。8周后检查肿瘤大小情况(此前死亡的，在死亡时检查)和存活情况，结果如下表。
131I标记的chSM5-1及ReSM5-1对荷瘤裸鼠(QYC)的疗效

上述结果证明，I131标记的chSM5-1及ReSM5-1对荷瘤小鼠有明显的治疗作用，可显著降低肿瘤大小，提高生存率。
实施例12chSM5-1及ReSM5-1亲和力比较用Pharmacia公司的BIAcore，参照Karlsson等(Karlsson，R.，Michaelsson，A.，and Mattsson，L.(1991)Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigeninteractions with a new biosensor based analytical system.J.Immunol.Methods 145，229-240)提供的方法测定chSM5-1及ReSM5-1的亲和常数Kd(Kon/Koff)，发现chSM5-1与ReSM5-1亲和力接近，分别为9.31×10-9M和3.78×10-9M。
上述结果说明，本次对SM5-1的人源化设计改造是成功的，基本没有降低亲和力，达到了治疗用单抗亲和力的要求。
上述的实施实例只是为了说明本发明，并非将本发明限定于上述范围。上述实例可能作很多变动，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>马，菁<120>肿瘤相关抗原SM5-1的特异性抗体及其应用<130>035759<150>CN 03129123.6<151>2003-06-06<160>14<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>119<212>PRT<213>人工序列<220>
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<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(113)<223>huSM5-1轻链可变区<400>10Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Gly Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Asp Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser20 25 30Ser Lys Asp Asp Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Gly Pro Gly Lys35 40 45Ala Pro Ser Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asp Arg Glu Ser Asp Val50 55 60Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asp Asp Tyr Thr Leu Thr65 70 75 80Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln85 90 95Trp Phe Ser Ser Tyr Thr Phe Asp Gln Gly Thr Lys Leu Asn Ile Thr100 105 110Arg<210>11<211>357<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(357)<223>huSM5-1重链可变区<400>11caggtgcagc tggtggagtc tggcggtgga gtggtccagc ccggctgcag cctgaggctg60tcctgcagta gctctggcta caccttcacc agctacacca tgacatgggt gcgccaagcc120cccggaaagg gcctcgaatg gattggctac attaatcctt ataatgacgg tgggaagtac180aatgaaaagt tcaagtggag attttcaata tcaagtgaca agagcaagaa caccctgttc240ctccaaagcg acagcttgac cccagaggac accggcgtat actattgtgt gcgcggcagc300cgttacgact ggtacgggga ctactggggc caaggcactc cagtcaccgt ctcctct 357<210>12<211>339<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(339)<223>huSM5-1轻链可变区<400>12gacatccaga tgactcagag cccatccagc ttgagcggct cagtaggcga ccgcgtaacg60atcacttgcg actcctctca gtcagtattg tactccagca aagacgacaa ctacctggcc120ggatatcagc aggggcccgg caaagcccca agcttgctga tttattatgc ctccgaccgc180gagtctgacg tgccatcacg ctttagcggc agcgggtccg gtgatgatta cacgctgacc240attagcagtc tgcagcctga ggacgccgcc acctactact gtcaccagtg gtttagttcc300tacacttttg accagggaac taaactgaac attactcga 339
<210>13<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(22)<223>单抗OKT3的信号肽<400>13Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Ile Ser Arg Gly20<210>14<211>67<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(67)<223>单抗OKT3的信号肽编码序列<400>14atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatatcc60agaggag 6权利要求
1.一种可竞争抑制人源SM5-1单克隆抗体与SM5-1靶抗原特异结合的抗体，其中，所述的人源SM5-1单克隆抗体重链可变区包含SEQ ID NO9的氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO10的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的抗体，可选自多克隆抗体、单克隆抗体、Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、双体片段、单链抗体以及多特异性抗体等抗体片段。
3.如权利要求1所述的抗体，其重链可变区包含SEQ ID NO9中31-35，50-66及99-108的氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO10中24-40，56-62及95-102的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的抗体，其重链可变区包含SEQ ID NO9的氨基酸序列。
5.如权利要求3所述的抗体，其轻链可变区包含SEQ ID NO10的氨基酸序列。
6.一种人源SM5-1特异性单克隆抗体，其特征在于，重链可变区包含SEQ IDNO9的氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO10的氨基酸序列。
7.一种可竞争抑制SM5-1单克隆抗体与SM5-1靶抗原特异结合的抗体，其中，所述的SM5-1单克隆抗体重链可变区包含SEQ ID NO1的氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
8.如权利要求7所述的抗体，可选自多克隆抗体、单克隆抗体、Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、双体片段、单链抗体以及多特异性抗体等抗体片段。
9.如权利要求7所述的抗体，其重链可变区包含SEQ ID NO1中31-35，50-66及99-108的氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO2中24-40，56-62及95-102的氨基酸序列。
10.如权利要求9所述的抗体，其为人源化抗体。
11.如权利要求7所述的抗体，其重链可变区包含SEQ ID NO3的氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO4的氨基酸序列。
12.一种人源化SM5-1特异性单克隆抗体，其重链可变区包含SEQ ID NO1的氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
13.一种分离的核酸分子，它编码权利要求3所述抗体的重链和/或轻链或其片段。
14.一种分离的核酸分子，它编码权利要求6所述人源SM5-1单克隆抗体的重链和/或轻链或其片段。
15.如权利要求14所述的分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO11和/或SEQID NO12的核苷酸序列。
16.一种分离的核酸分子，它包含与权利要求13的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
17.一种载体，它含有权利要求13所述的核酸分子。
18.如权利要17求所述的载体，它含有与编码抗体轻链和/或重链或其片段的核苷酸序列操作性相连的表达调控序列。
19.一种重组细胞，它含有权利要求13所述的核酸分子。
20.如权利要求19所述的重组细胞，其特征在于，它是真核细胞。
21.如权利要求19所述的重组细胞，其特征在于，它是CHO细胞。
22.一种分离的核酸分子，它包含权利要求9中所述编码重链和/或轻链或其片段的核苷酸序列。
23.一种分离的核酸分子，它包含权利要求12中所述编码人源化抗体重链和/或轻链或其片段的核苷酸序列。
24.如权利要求23所述的核酸分子，它包含SEQ ID NO5和/或SEQ ID NO6的核苷酸序列。
25.一种分离的核酸分子，它包含与权利要求22核苷酸序列互补的核苷酸序列。
26.一种载体，它含有权利要求22所述的核酸分子。
27.如权利要26求所述的载体，它含有与编码抗体轻链和/或重链或其片段的核苷酸序列操作性相连的表达调控序列。
28.一种重组细胞，它含有权利要求22所述的核酸分子。
29.如权利要求28所述的重组细胞，其特征在于，它是真核细胞。
30.如权利要求28所述的重组细胞，其特征在于，它是CHO细胞。
31.一种制备抗体或抗体片段的方法，该方法包括含有权利要求13所述核酸分子的重组细胞的培养，核酸分子编码抗体或抗体片段的表达，以及表达抗体或抗体片段的复性，所述抗体为人源抗体。
32.如权利要求31中所述的方法，还包括复性抗体和/或抗体片段的分离纯化。
33.一种制备抗体或抗体片段的方法，该方法包括含有权利要求22所述核酸分子的重组细胞的培养，核酸分子编码抗体或抗体片段的表达，以及表达抗体或抗体片段的复性，所述抗体为人源化抗体。
34.如权利要求33中所述的方法，还包括复性抗体和/或抗体片段的分离纯化。
35.一种药物组合物，包含有效量的权利要求3所述的单克隆抗体以及药学上可接受的载体或赋形剂，其中，所述抗体为人源抗体。
36.一种药物组合物，包含有效量的人源化SM5-1特异性单克隆抗体以及药学上可接受的载体或赋形剂，其中，所述人源化SM5-1特异性单克隆抗体的重链可变区包含SEQ ID NO1中31-35，50-66和99-108的氨基酸序列，轻链可变区包含SEQID NO2中24-40，56-62和95-102的氨基酸序列。
37.一种试剂盒，包含有效量的权利要求3中所述抗体以及抗体的应用方法说明，其中，所述的抗体为人源抗体。
38.一种试剂盒，包含有效量的人源化SM5-1特异性单克隆抗体以及抗体的应用方法说明，其中，所述人源化SM5-1特异性单克隆抗体重链可变区包含SEQ ID NO1中31-35，50-66和99-108的氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ IDNO2中24-40，56-62和95-102的氨基酸序列。
39.权利要求1中所述的抗体在制备治疗哺乳动物肿瘤的药物中的应用。
40.如权利要求39所述的应用，其特征在于，所述的哺乳动物为人。
41.如权利要求39所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为黑色素瘤、乳腺癌或肝细胞癌。
42.如权利要求39所述的应用，其特征在于，所述的抗体为人源SM5-1特异性单克隆抗体。
43.如权利要求39所述的应用，其特征在于，抗体通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用或补体依赖的细胞毒作用发挥抗肿瘤效应。
44.权利要求7中所述的抗体在制备治疗哺乳动物肿瘤的药物中的应用。
45.如权利要求44所述的应用，其特征在于，所述的抗体为人源化抗体，人源化抗体重链可变区包含SEQ ID NO1中31-35，50-66和99-108的氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO2中24-40，56-62和95-102的氨基酸序列。
46.如权利要求45的应用，其特征在于，哺乳动物为人。
47.如权利要求45的应用，其特征在于，肿瘤为黑色素瘤、乳腺癌或肝细胞癌。
48.如权利要求45的应用，其特征在于，人源化抗体通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用或补体依赖的细胞毒作用发挥抗肿瘤效应。
49.一种组合物，这种组合物包括a)有效量的权利要求1所述的抗体；b)有效量的抗肿瘤制剂。
50.如权利要求49的组合物，其特征在于，抗肿瘤制剂为治疗黑色素瘤、乳腺癌或肝细胞癌的制剂。
51.权利要求49中所述的组合物在制备治疗哺乳动物肿瘤的药物中的应用。
52.一种组合物，这种组合物包括a)有效量的权利要求7所述的抗体；b)有效量的抗肿瘤制剂。
53.如权利要求52的组合物，其特征在于，抗体为人源化抗体，人源化抗体重链可变区包含SEQ ID NO1中31-35，50-66和99-108的氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO2中24-40，56-62和95-102的氨基酸序列。
54.如权利要求52的组合物，其特征在于，抗肿瘤制剂为对黑色素瘤、乳腺癌或肝细胞癌的治疗有效的制剂。
55.权利要求52中所述的组合物在制备治疗哺乳动物肿瘤的药物中的应用。
56.权利要求1所述的抗体在制备诱导caspase-10介导细胞凋亡的药物中的应用。
57.如权利要求56的应用，其特征在于，细胞为哺乳动物细胞。
58.如权利要求56的应用，其特征在于，细胞为哺乳动物体内细胞。
59.权利要求7所述的抗体在制备诱导caspase-10介导细胞凋亡的药物中的应用。
60.如权利要求56的应用，其特征在于，抗体为人源化抗体，人源化抗体重链可变区包含SEQ ID NO1中31-35，50-66和99-108的氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO2中24-40，56-62和95-102的氨基酸序列。
61.如权利要求59的应用，其特征在于，细胞为哺乳动物细胞。
62.如权利要求59的应用，其特征在于，细胞为哺乳动物体内细胞。
63.一种偶联物，该偶联物包括连接毒素和/或放射性同位素于权利要求1中所述的抗体。
64.如权利要求63的偶联物，该偶联物中的抗体为人源抗体，人源抗体重链可变区包含SEQ ID NO9中31-35，50-66及99-108的氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO10中24-40，56-62及95-102的氨基酸序列。
65.一种偶联物，该偶联物包括连接毒素和/或放射性同位素于权利要求7中的抗体。
66.如权利要求65的偶联物，该偶联物中的抗体为人源化抗体，人源化抗体重链可变区包含SEQ ID NO1中31-35，50-66和99-108的氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO2中24-40，56-62和95-102的氨基酸序列。
67.一种分析样本中人源SM5-1靶抗原的方法，该方法包括a)从受试者中获取样本；b)用权利要求1中的抗体在适当的条件下与样本结合，如样本中存在人源SM5-1的靶抗原，就会与所述抗体结合；c)通过分析样本中人源SM5-1靶抗原与抗体的结合来判断样本中是否含有和/或SM5-1靶抗原的量。
68.如权利要求67的方法，其特征在于，该方法用于肿瘤的鉴定及预后判断。
69.如权利要求68的方法，其特征在于，所述的肿瘤为黑色素瘤、乳腺癌或肝细胞癌。
70.一种分析样本中人源SM5-1靶抗原的方法，该方法包括a)从受试者中获取样本；b)用权利要求7中的抗体在适当的条件下与样本结合，如样本中存在人源SM5-1的靶抗原，就会与所述抗体结合；c)通过分析样本中人源SM5-1靶抗原与抗体的结合来判断样本中是否含有和/或SM5-1靶抗原的量。
71.如权利要求70的方法，其特征在于，该方法用于肿瘤的鉴定及预后判断。
72.如权利要求71的方法，其特征在于，肿瘤为黑色素瘤、乳腺癌或肝细胞癌。
73.一种分析样本中人源SM5-1靶抗原的试剂盒，其中包含a)权利要求1中所述抗体；b)通过分析样本中人源SM5-1靶抗原与抗体的结合来判断样本中是否含有和/或SM5-1靶抗原的量的方法。
74.一种分析样本中人源SM5-1靶抗原的试剂盒，其中包含a)权利要求7中所述抗体；b)通过分析样本中人源SM5-1靶抗原与抗体的结合来判断样本中是否含有和/或SM5-1靶抗原的量的方法。
全文摘要
本发明公开了一种新的黑色素瘤、乳腺癌和肝细胞癌特异性的抗体(人源化单克隆抗体huSM5－1和人鼠嵌合的抗体SM5－1)，其相关的抗原，编码该抗体的分离的核酸分子，以及所述抗体的制备方法。本发明还涉及所述的抗体和/或分离的核酸分子在制备诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
文档编号C12N5/06GK1572800SQ20031011992
公开日2005年2月2日 申请日期2003年11月25日 优先权日2003年6月6日
发明者马菁 申请人:马菁