专利名称：人类胚干细胞的培养系统及其培养方法
技术领域：
本发明涉及一种培养人类胚干细胞的培养系统，尤其是一种无滋养层的人类胚干细胞培养系统，以及利用该系统培养人类胚干细胞的方法，使人类胚干细胞增殖及维持未分化状态。
背景技术：
人类胚干细胞(human embryonic stem cells；HES)是指囊胚期胚胎(blastocyst)中内细胞团(inner cell mass)的细胞，其在生物学的特征如下(1)正常核型(Normal karyotype)；(2)较高的细胞核/细胞质比例；(3)碱性磷酸酯酶(Alkaline phosphatase)呈阳性反应；(4)mRNA-OCT4阳性，此物质为多发性(pluripotent)细胞拥有的特征；以及(5)将此细胞注入免疫不全老鼠身体，可形成具三个胚层细胞的畸瘤(teratoma)。
人类胚干细胞因具有无限分裂增殖与分化成各种组织细胞的能力，近一、二年来，被认为是组织工程的最佳细胞组件，且可广泛应用于临床药物研发与细胞医疗上。人类胚干细胞的培养与一般体细胞不同，相比较而言，胚干细胞对体外生长要求严格，一方面要促进细胞分裂增殖，另一方面又要抑制细胞分化。
人类胚胎干细胞为一种贴壁细胞(锚地依赖细胞，anchorage-dependent cells)，即体外培养细胞需附着在适宜的底物(substratum)上才能生长。目前人类胚干细胞的培养方式是将胚干细胞培养在一层去活化滋养层细胞上，藉由滋养层细胞来提供胚干细胞生长所需的重要因子，以提供人类胚胎干细胞生长、增殖与维持其未分化状态。
上述滋养层细胞可选自初代小鼠胚胎纤维母细胞(primary mouseembryonic fibroblast；PMEF)、小鼠胚胎纤维母细胞株(mouse embryonicfibroblast；STO)、小鼠胎儿的纤维母细胞(murine fetal fibroblast；MFF)、人类胚胎纤维母细胞(human embryonic fibroblast；HEF)、人类胎儿肌肉细胞(human fetal muscle；HFM)、人类胎儿皮肤细胞(human fetalskin cell；HFS)、人类成人皮肤细胞(human adult skin cell)、人类包皮纤维母细胞(human foreskin fibroblast；HFF)、人类成人输卵管上皮细胞(human adult fallopian tubal epithelial cell；HAFT)、人类骨髓基质细胞(human marrow stromal cells；hMSCs)(WO 03/02944、WO 03/014313、J.H.Park等，Biol Reprod.，692007-2017，2003、M.Amit等，Biol Reprod.，68(6)2150-2156，2003、Outi Hovattal等，Hum.Reprod.，18(7)1404-1409，2003、Richards，M.等，Nat Biotechnol.，20(9)933-936，2002、James A.等，Science，282(6)1145-1147，1998及Linzhao Cheng等，Stem Cells，21131-142，2003)。
然而上述的培养方式使得人类胚干细胞的产量及临床应用上会面临下列有关生物安全性及细胞品质稳定性的问题(1)异种(异源)生物细胞共培养模式，会有异种/异源生物间病毒或其它致病原感染的安全性疑虑；(2)由于滋养层细胞多来自初代培养的细胞(primary cells)，不同批次的初代培养细胞，会有不同的滋养层功效，所以培养的胚干细胞品质较难控制；(3)供应的细胞来源与数量有限，限制胚干细胞的产量及应用；以及(4)滋养层的存在，会影响到胚干细胞研发时所使用的技术，例如基因转染(transfection)等。由于滋养层细胞的培养系统具有上述难以掌控的缺点，因此无滋养层细胞的培养系统，是目前人类胚干细胞研发的关键技术。
相关无滋养层培养系统是以下列物质取代滋养层细胞培养人类胚干细胞层粘连蛋白(laminin)、纤维粘连蛋白(fibronectin)、胶原蛋白IV(collagen IV)以及一种自老鼠肿瘤细胞(Engelbreth-Hom-Swarm tumorcell)萃取的基底膜基质(Matrigel)(WO 03/020920、US 2003/0017589及Xu，C.等，Nat Biotechnol.，19(10)971-974，2001)。由于该物质是选自胞外基质(extracellular matrix；ECM)的成分之一进行培养，而实际上天然的胞外基质除有支撑细胞的作用，而且也作为一种物质交换和讯息的区域，允许营养物质、代谢产物和生长因子在细胞之间扩散，这并不是单一成分物质便可取代的。再者，胞外基质除上述成分物质外，还有弹性蛋白(elastin)、蛋白聚糖及其它糖基蛋白等物质。目前有学者指出前述培养系统仅适用于培养某些特定的人类胚干细胞株(如H1，H9)，对于其它人类胚干细胞株则效果不佳(Outi Hovattal等，Hum.Reprod.，18(7)1404-1409，2003)。由此可知，目前仍亟需开发更安全、适用性更广泛的无滋养层细胞的培养系统。
发明内容
有鉴于上述传统胚干细胞培养系统的缺失，本发明的主要目的是提供一种新的培养人类胚干细胞的培养系统，用以达到维持人类胚胎干细胞的未分化生长及增殖的目的。
本发明提供的培养系统包括培养基质，萃取自滋养层细胞的胞外基质；及条件培养基，收集自培养滋养层细胞的培养液。
其中，所述培养基质的制备方法，是将滋养层细胞以氢氧化钠(NaOH)或三硝基甲苯(triton)处理后，去除细胞内的物质，即可获得该细胞的胞外基质以作为培养基质。在该培养基质的制备方法中，去除细胞内物质的方法可用水或缓冲液清洗。
所述条件培养基的制备方法，包括(a)将滋养层细胞去活化处理；(b)将步骤(a)所述的细胞置于一培养液进行培养；(c)收取其细胞培养液作为条件培养基。
本发明的另一目的是提供一种培养人类胚干细胞的方法，利用前述的培养系统，使人类胚干细胞增殖及维持未分化状态。
该培养方法的步骤包括取得人类胚干细胞；将人类胚干细胞培养于前述的培养人类胚干细胞的培养系统；以及持续培养，使人类胚干细胞增殖及维持未分化状态。所述的人类胚干细胞在本发明的无滋养层的人类胚干细胞培养系统中可维持至少五代的未分化与增殖状态。
先前的研究结果发现滋养层维持胚干细胞生长增殖的重要因子，包括滋养层细胞分泌于培养液中的生长因子以及滋养层分泌建构的细胞外基质。因此本发明便是藉由移除滋养层细胞，而保留具有功效的重要因子，包括胞外基质结构以及滋养层细胞所分泌的养分，从而发展出一套不需滋养层细胞存在的人类胚干细胞培养系统，突破人类胚干细胞产量及临床应用的难题。
为了达到本发明的目的，本发明所提供的培养人类胚干细胞的培养系统，是用以维持人类胚胎干细胞的未分化生长及增殖，该系统包括培养基质，萃取自滋养层细胞的胞外基质；及条件培养基，收集自培养滋养层细胞的培养液。
本发明中所述人类胚干细胞(human embryonic stem cells；HES)是指人类囊胚期胚胎(Blastocyst)中内细胞团(Inner cell mass)的多发性(pluripotent)细胞。
在本发明的优选实施例中，所述人类胚干细胞株种系优选为hES-3或hES-4的人类胚干细胞株。
本发明中所述的培养基质(culture matrix)是指提供作为细胞培养时的附着底物(substratum)。除少数悬浮型细胞外，绝大多数体外培养细胞需附着在适宜的底物上才能生长。细胞贴附在底物上生长的性质称锚地依赖性。原则上，凡对细胞无毒性的物质都可用作底物，但不同的细胞，对底物要求各异，底物不适，细胞生长不良。目前人类胚干细胞的培养方式是将胚干细胞培养在一层去活化滋养层细胞上，藉由滋养层细胞来提供胚干细胞生长所需的重要因子，以提供人类胚胎干细胞生长、增殖与维持其未分化状态。
本发明中所述滋养层细胞(Feeder Cells)也称饲养细胞，可采用纤维细胞或其它细胞，以大剂量辐射线照射，如珈玛射线(γ-ray)辐射；或采用药剂处理，如丝裂霉素C(mitomycin C)进行去活化(inactivation)处理，使生存的细胞失去增殖能力但仍保有代谢等生理功能，如合成重要生长因子。令其作为底物，将其它细胞接种于其上；滋养层细胞的代谢产物利于其它细胞生长，从而被称为滋养层细胞。常见用于人类胚干细胞的滋养层细胞有初代小鼠胚胎纤维母细胞(primary mouseembryonic fibroblast；PMEF)、小鼠胚胎纤维母细胞株(mouse embryonicfibroblast；STO)、小鼠胎儿的纤维母细胞(murine fetal fibroblast；MFF)、人类胚胎纤维母细胞(human embryonic fibroblast；HEF)、人类胎儿肌肉细胞(human fetal muscle；HFM)、人类胎儿皮肤细胞(human fetalskin cell；HFS)、人类成人皮肤细胞(human adult skin cell)、人类包皮纤维母细胞(human foreskin fibroblast；HFF)、人类成人输卵管上皮细胞(human adult fallopian tubal epithelial cell；HAFT)、人类骨髓基质细胞(human marrow stromal cells；hMSCs)等。
在本发明的最优选实施例中，所述滋养层细胞优选选自小鼠胚胎纤维母细胞或人类包皮纤维母细胞。
本发明中所述胞外基质(Extracellular Matrix；ECM)是指细胞分泌出来的大分子物质，其主要由三类生物分子所组成(1)结构蛋白(Structural proteins)胶原蛋白(collagen)及弹性蛋白(elastin)；(2)特化蛋白(Specialized proteins)如纤维粘连蛋白(fibronectin)、层粘连蛋白(laminin)、肌丝蛋白质(fibrillin)；以及(3)蛋白聚糖(Proteoglycans；PG)其是以蛋白质为核心，连接葡萄胺聚糖(glycosaminoglycans；GAGs)重复单元的长链以形成一复杂的高分子量生物分子。胞外基质除有支撑细胞的作用，而且也作为一种物质交换和讯息的区域，允许营养物质、代谢产物和生长因子在细胞之间扩散。有关胞外基质的制备都可由熟悉本领域的技术人员所完成，并可参见美国专利第5993844号。
本发明中所述条件培养基(Conditional Medium；CM)是指经培养过特定细胞的培养液。该条件培养基可用于提供另一细胞的生长培养。有关条件培养基的制备都可由熟悉本领域的技术人员所完成，并可参见美国专利公开第2003/0017589、2002/0137204、2002/0072117、2002/0022268号以及Richards，M.等，Nat Biotechnol.，20(9)933-936，2002。
本发明中用以培养人类胚干细胞的培养液的制备也可由熟悉本领域的技术人员所完成，并另可参见美国专利第5690926号、美国专利公开第2003/0008392、2003/0073234、2002/0160509号以及Reubinoff BE.等，NatBiotechnol.，18(4)399-404，2002。一般而言，培养液的主要成分是胺基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和一些其它辅助物质。另外，除上述基础培养液外，还可添加一些促细胞生长增殖或抑制分化的生长因子，如白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor；ILF)、纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor；FGF)、干细胞因子(Stem cell factor；SCF)、胰岛素-转铁蛋白-硒G补充物(insulin-transferrin-selenium Gsupplement；ITS G supplement)(WO03/020920、US2003/0017589、US5690926、US5453357及Xu，C.等，Nat Biotechnol.，19(10)971-974，2001、Richards，M.等，Nat Biotechnol.，20(9)933-936，2002)。
本发明中所述培养基质的制备方法，包括将滋养层细胞以氢氧化钠(NaOH)或三硝基甲苯(triton)处理后，去除细胞内的物质，如细胞核或胞器等，即可获得该细胞的胞外基质以作为培养基质。
在该培养基质的制备方法中，所述去除细胞内物质的方法可以为用清洗液清洗，如用缓冲液或水清洗。
本发明中所述条件培养基的制备方法，包括(a)将滋养层细胞去活化处理；(b)将步骤(a)所述的细胞置于一培养液进行培养；以及(c)收取其细胞培养液作为条件培养基。
图1为显示本发明利用无滋养层的人类胚干细胞培养系统培养人类胚干细胞的方法流程图。
图2A显示小鼠的胚胎纤维母细胞(MEF)型态(300X)。
图2B显示由小鼠的胚胎纤维母细胞的胞外基质结构(300X)。
图2C显示在扫描式电子显微镜下观察小鼠的胚胎纤维母细胞的胞外基质的纤维束及网架结构(2000X)。
图3A显示人类包皮纤维母细胞(HSF)型态(300X)。
图3B显示由人类包皮纤维母细胞的胞外基质结构(300X)。
图4A显示以小鼠的胚胎纤维母细胞制备的培养基质所培养的人类胚干细胞(hES3)型态(10X)。
图4B显示以人类包皮纤维母细制备的培养基质所培养的人类胚干细胞(hES3)型态(10X)。
图5A显示以小鼠的胚胎纤维母细胞制备的培养基质所培养的人类胚干细胞(hES3)具有高活性的碱性磷酸酯酶(10X)。
图5B显示以人类包皮纤维母细制备的培养基质所培养的人类胚干细胞(hES3)具有高活性的碱性磷酸酯酶(10X)。
图6显示本发明的无滋养层培养系统所培养的人类胚干细胞(hES3)的OCT-4表现。其中，1代表小鼠胚胎纤维母细胞为滋养层，2代表人类包皮纤维母细胞为滋养层，3代表利用本发明系统胚干细胞，4为无细胞样品的对照组。
具体实施例方式
以下藉由实施例并配合附图进一步详细说明本发明的技术特征，但下述的实施例并非用以限定本发明的保护范围。
请参阅图1，其显示本发明的利用无滋养层的人类胚干细胞培养系统培养人类胚干细胞的方法，其步骤包括取得人类胚干细胞，例如hES3和/或hES4；将人类胚干细胞培养于前述本发明所述的无滋养层的人类胚干细胞培养系统；以及使人类胚干细胞维持增殖及未分化状态，其中，前述人类胚干细胞在无滋养层的胚干细胞培养系统中可维持至少五代的未分化与增殖状态。
实施例一、本发明培养系统的组成物制备1.条件培养基的制备小鼠的胚胎纤维母细胞或人类包皮纤维母细胞(购自台湾动物科技研究所)于纤维母细胞培养液(90％DMEM+10％FBS)。该细胞培养约3天后以丝裂霉素C(购自Sigam)进行去活化作用，以抑制细胞增生，但仍保有代谢等生理功能。每日收取该细胞培养液备用。上述培养液配方如下80％Dulbecco的改良的Eagle’s培养基(Dulbecco’s modified eagle medium；DMEM)(购自Gibco)与20％牛血清(Fetal Serum Bovine；FBS)(购自Hyclone)，并添加1mMβ-乙基硫醇(β-mercaptoethanol)(购自Gibco)、1％非必需胺基酸(non-essential amino acids)(购自Gibco)、1％谷胺酸(glutamine)(购自Gibco)、1％胰岛素-转铁蛋白-硒G补充物(insulin-transferrin-selenium G supplement；ITS G supplement)(购自Gibco)(请参考Richards，M.等，Nat Biotechnol.，20(9)933-936，2002)。其中牛血清也可以用血清替代物(serum replacement)取代，制备成无血清培养液。当然，视培养细胞的需要，本发明的无滋养层胚干细胞培养系统同样也可使用其它培养基成分，并不局限于本实施例所使用的条件培养基。
2.培养基质的制备培养小鼠的胚胎纤维母细胞或人类包皮纤维母细胞于纤维母细胞培养液(90％DMEM+10％FBS)，细胞培养约3天后以丝裂霉素C进行去活化作用。去活化的纤维母细胞再经培养3至28天后，以0.05N氢氧化钠(NaOH)或0.1％三硝基甲苯(Triton，购自Sigma)打破其细胞膜，并以pH7.4的Dulbecco’s磷酸盐缓冲液(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline；DPBS，1X)(购自Gibco)清洗以去除细胞内的胞器及细胞核，即可获得胞外基质。
实施例二、利用本发明的培养系统培养人类胚干细胞将人类胚干细胞(细胞株种系HES-3或HES-4)以切割方式切成100至5,000个细胞不等的细胞团，再逐一将这些细胞团移至上述的培养系统内，接着将培养皿放在37℃，5％CO2培养箱内培养。每1-2天更换培养液一次，待细胞数目增加约5至15倍时，则可再以切割方式进行细胞的继代培养(Subculture)。
实施例三、本发明培养系统的培养基质观察图2A显示小鼠的胚胎纤维母细胞型态，将小鼠的胚胎纤维母细胞藉由实施例一的步骤制成培养基质，其结构如图2B所示。将前述基质结构藉由扫描式电子显微镜观察，可观察到该培养基质的纤维束及网架结构，如图2C所示。
图3A与图3B分别显示用来制备培养基质的人类包皮纤维母细胞型态，以及将人类包皮纤维母细胞利用前述步骤所制成的培养基质结构。
实施例四、人类胚干细胞未分化性质的分析为进一步确认利用本发明培养系统的培养效果，可藉由观测特定表现于未分化的人类胚干细胞的分子记号，例如碱性磷酸酯酶、OCT-4、SSEA-3、SEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81等(请参考Thomson JA等，Science，282(6)1145-1147，1998或Reubinoff BE等，Nat Biotechnol.18(4)399-404，2000)，以便判断胚干细胞的未分化状态。
本实施例采用检测碱性磷酸酵素以及转录因子OCT-4的表现来观察本发明无滋养层胚干细胞培养系统的培养功效。关于检测碱性磷酸酵素的方法参照Reubinoff BE等，Nat Biotechnol.，18(4)399-404，2000所叙述的方式，而OCT-4的检测方法则依照Richards，M.等，Nat Biotechnol.，20(9)933-936.2002所叙述的方式来操作。其检测结果分述如下1.细胞型态观察图4A与图4B分别显示本发明利用小鼠的胚胎纤维母细胞或人类包皮纤维母细胞做为培养基质的培养系统所培养的人类胚干细胞型态。
2.碱性磷酸酶检测人类胚干细胞具有高活性的碱性磷酸酵素，所以藉由鉴定培养的人类胚干细胞的碱性磷酸酵素活性，可以得知人类胚干细胞未分化的程度。实验结果发现不论小鼠的胚胎纤维母细胞或人类包皮纤维母细胞为培养基质的培养系统，其所培养的人类胚干细胞均具有高活性的碱性磷酸酵素(染色结果呈现鲜艳的红色)，显示其保持于未分化的全能状态(图5A与图5B)。且根据实验结果显示，胚干细胞在本发明的无滋养层人类胚干细胞培养系统中至少可持续继代培养五代仍维持胚干细胞增殖及未分化的特性。
3.OCT-4检测比较利用各种培养系统所培养的胚干细胞OCT-4的表现，结果如图6所示，分别为小鼠胚胎纤维母细胞为滋养层(lane1)、人类包皮纤维母细胞为滋养层(lane2)以及利用本发明系统(lane3)所培养的胚干细胞OCT-4的表现情形，其中lane4为无细胞样品的对照组。本发明的无滋养层人类胚干细胞培养系统所培养的人类胚干细胞可观察到转录因子OCT-4的表现(lane3)，此OCT-4为未分化的人类胚干细胞所特有的转录因子，由此可知，本发明的无滋养层人类胚干细胞培养系统确实可保持人类胚干细胞维持于未分化的阶段，且OCT-4的表现量与在传统滋养层培养的人类胚干细胞(lane1与lane2)相当。
本发明的无滋养层的人类胚干细胞培养系统具有下列优势(1)由于本发明的培养系统中不需要滋养层细胞与人类胚干细胞共同培养，所以可以避免不同细胞培养造成的病源性(pathologic)感染，增加人类胚干细胞的安全性及临床的可应用性；(2)藉由控管无细胞的培养基质及含有生长因子的培养液，可以进一步管制人类胚干细胞的培养条件及细胞品质；(3)本发明的培养方法可以应用于开发人类胚干细胞的产量系统；(4)了解人类胚干细胞与微环境的互动，促进胚干细胞的研发及应用；(5)建立人类胚干细胞株；(6)胚干细胞株的基因改造工程(如基因转染技术)。
上述实施例仅是用来详细叙述本发明的内容，并非用以限制本发明于所揭示的特定形式。本发明的保护范围以权利要求书的范围所定义为基准，并且包括不脱离本发明的精神与范围的所有修饰与类似的变更。
权利要求
1.一种培养人类胚干细胞的培养系统，用以维持人类胚胎干细胞的未分化生长及增殖，该培养系统包括培养基质，萃取自滋养层细胞的胞外基质；及条件培养基，收集自培养滋养层细胞的培养液；其中，所述滋养层细胞选自初级小鼠胚胎纤维母细胞、小鼠胚胎纤维母细胞株、小鼠胎儿的纤维母细胞、人类胚胎纤维母细胞、人类胎儿肌肉细胞、人类胎儿皮肤细胞、人类成人皮肤细胞、人类包皮纤维母细胞、人类成人输卵管上皮细胞或人类骨髓基质细胞。
2.如权利要求1所述的培养人类胚干细胞的培养系统，其中所述滋养层细胞为小鼠胚胎纤维母细胞或人类包皮纤维母细胞。
3.如权利要求1所述的培养人类胚干细胞的培养系统，其中所述培养基质的制备方法，包括将滋养层细胞以氢氧化钠或三硝基甲苯处理后，去除细胞内的物质，即可获得该细胞的胞外基质以作为培养基质。
4.如权利要求3所述的培养人类胚干细胞的培养系统，其中所述去除细胞内物质的方法为用水或缓冲液清洗。
5.如权利要求4所述的培养人类胚干细胞的培养系统，其中所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
6.如权利要求1所述的培养人类胚干细胞的培养系统，其中所述条件培养基的制备方法，包括(a)将滋养层细胞去活化处理；(b)将步骤(a)所述的细胞置于一培养液进行培养；以及(c)收取其细胞培养液作为条件培养基。
7.如权利要求6所述的培养人类胚干细胞的培养系统，其中所述滋养层细胞去活化处理为以γ射线照射或丝裂霉素C处理。
8.如权利要求7所述的培养人类胚干细胞的培养系统，其中所述滋养层细胞去活化处理为以丝裂霉素C处理。
9.一种人类胚干细胞的培养方法，其步骤包括取得人类胚干细胞；将人类胚干细胞培养于如权利要求1-8任一项所述的培养人类胚干细胞的培养系统；以及持续培养，使人类胚干细胞维持增殖及未分化状态。
10.如权利要求9所述的人类胚干细胞的培养方法，其中所述的人类胚干细胞在无滋养层的人类胚干细胞培养系统中可维持至少五代的未分化与增殖状态。
全文摘要
本发明涉及一种人类胚干细胞的培养系统及其培养方法，本发明的培养系统是用以维持人类胚胎干细胞的未分化生长及增殖，该培养系统包括培养基质，萃取自滋养层细胞的胞外基质；以及条件培养基，收集自培养滋养层细胞的培养液。本发明同时还提供一种利用本发明的系统培养人类胚干细胞的方法。
文档编号C12N13/00GK1626651SQ20031011943
公开日2005年6月15日 申请日期2003年12月10日 优先权日2003年12月10日
发明者杨梅如, 张光宁, 徐丽道, 黄俊杰, 陈婉昕, 郭兆茔 申请人:财团法人工业技术研究院