专利名称：花鲈胚胎干细胞及培养方法
技术领域：
本发明属于细胞生物技术中的细胞培养技术，是在体外人工培养条件下，以花鲈囊胚期细胞为材料获得具有发育多能性和无限增殖能力的细胞--胚胎干细胞的一种技术方法。
背景技术：
鱼类胚胎干细胞是从鱼类早期囊胚中分离培养出的具有发育全能性的未分化细胞系。本发明做出之前，国际上对鱼类胚胎干细胞培养的研究主要集中在小型模式鱼类斑马鱼和青鳉上1992年美国的Collodi等尝试培养斑马鱼胚胎干细胞，但未获成功；1995年美国的Sun等借鉴小鼠胚胎干细胞的培养方法获得了斑马鱼胚胎干细胞系，培养方法如下以斑马鱼的成纤维细胞系(ZEF)作为滋养层细胞，将斑马鱼囊胚期细胞与其共培养，培养基为LDF基础培养基，添加0.18mg/ml碳酸氢钠、15mmol/lHepes(pH7.4)、400μg/ml青霉素、400μg/ml链霉素、50μg/ml氨苄青霉素、10μg牛胰岛素、0.4％鳟鱼血清和5％小牛血清等物质，所培养的细胞具有鼠类胚胎干细胞的形态，并且具有高的碱性磷酸酶活性。1994年日本的Wakamatsu等采用滋养层细胞培养系统建立了青鳉胚胎干细胞系，该细胞系在形态、碱性磷酸酶活性及分化能力等具有胚胎干细胞的特征。德国Hong和Schartl(1996)以DMEM培养基为基础培养基，添加4.5g/ml葡萄糖、20mmol/l Hepes(pH7.4)、50μg/ml青霉素、50μg/ml链霉素、50μg/ml氨苄青霉素、2mmol/l谷氨酸、15％胎牛血清和1％鱼血清等物质培养青鳉囊胚细胞，获得了稳定传代的青鳉胚胎干细胞系，细胞具有哺乳动物胚胎干细胞的许多特征。而有关花鲈胚胎干细胞系的建立国内外均未见报道。
发明内容
本发明的目的是建立花鲈胚胎干细胞及培养方法，使细胞保持良好的生长状态及其典型的胚胎干细胞特征，为开展鱼类基因打靶和基因功能研究提供细胞基础，为海水鱼类基因工程育种提供技术手段。
本发明是按如下技术内容实现的花鲈胚胎干细胞其特征为细胞小且呈圆形、多角形或多边形，细胞直径15-25um，具有大的细胞核和较少的细胞质，细胞增殖速度快，在24℃下，细胞倍增时间为20小时左右；在人工诱导条件下，可以分化成神经细胞、肌肉细胞和神经胶质细胞等不同细胞类型。
花鲈胚胎干细胞的培养方法本发明是按以下操作程序完成的花鲈胚胎囊胚期细胞的收集；胚胎干细胞的培养和传代，包括对囊胚期细胞进行原代培养和早期传代培养、温度对花鲈胚胎干细胞生长的影响、稳定胚胎干细胞的培养。对培养的花鲈胚胎干细胞进行特征鉴定，包括形态学鉴定、碱性磷酸酶检测、倍性检测，细胞发育多能性的鉴定。
花鲈胚胎囊胚期细胞的收集采集花鲈胚胎，镜检合格后在常温下培养至中囊胚期时使用，此时囊胚期细胞数目为1000个左右。将花鲈囊胚分组，每组为50-70个胚胎，从中分离出囊胚期细胞，用于原代培养。
胚胎干细胞的培养和传代对囊胚期细胞进行原代培养和早期传代培养将收集的囊胚期细胞接种到24孔细胞培养板中单层培养，加入完全培养基1.0ml，24℃培养。待培养2-3天后，更换培养基，细胞长满培养孔，按1∶2的比例进行细胞传代，每2-3天更换1次培养基，1周传代2-3次。完全培养基配方为DMEM培养基为基础培养基，添加4.5g/ml葡萄糖、20mmol/l Hepes(pH7.5)，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，2mmol/l谷氨酸、1mmol/l丙酮酸钠，1mmol/l非必需氨基酸，5ng/ml重组人白血病抑制因子，15％胎牛血清和1％花鲈鱼血清，0.1％胚胎抽提物，8nM的亚硒酸钠，5ng/ml的成纤维生长因子，27.5μM巯基乙醇。
温度对花鲈胚胎干细胞生长的影响研究发现，LJESl在4-32℃下都能存活，适宜生长温度为20-28℃；在4℃下，细胞可存活40天，再转到24℃下依然生长良好，能正常传代；在32℃下，LJES1细胞可以生长、增殖，但生长速度开始下降，细胞最适宜温度为24-28℃，28℃细胞生长速度达到最大。适宜LJES1生长的最适pH值为7.2-7.4。
稳定胚胎干细胞的培养形成稳定的胚胎干细胞系后，细胞保持较快的生长速度，基本上不再自发分化，得到第13、35和60代胚胎干细胞倍增时间分别为19.76、20.67和21.31小时，在60小时细胞增殖速率达到最大。
花鲈胚胎干细胞特征鉴定形态学鉴定在100×和400×的相差显微镜下观察细胞的外形和细胞大小，显微照相记录细胞形态，比较本细胞与典型的胚胎干细胞的异同，其细胞具有典型的胚胎干细胞特征多边形或多角形，具有大的细胞核，一个或两个核仁，细胞的直径约为15-25um。
碱性磷酸酶检测细胞经1％多聚甲醛固定，BCIP/NBT作为反应底物，在黑暗环境下对细胞进行染色，囊胚中期细胞为对照，相差显微镜观察结果为其细胞被染色显现紫红色。
倍性检测对胚胎干细胞进行常规的染色体制备，显微镜下观察染色体形态，统计二倍体细胞的比率，即染色体数目为48条的细胞所占比率为60％以上。
细胞发育多能性的鉴定通过花鲈胚胎干细胞的分化能力验证。体外诱导分化主要是在培养基中添加视黄酸(RA)，可以形成多种不同类型的细胞如神经样细胞、肌肉样细胞、纤维样细胞和拟胚体等；体内诱导分化主要是通过细胞移植构建嵌合体进行多能性的鉴定。
本发明与已有技术对比，具有以下特点目前除本发明外，国内外尚无花鲈胚胎干细胞培养的报道，国际上成功的胚胎干细胞培养也主要局限在小型模式鱼青鳉和斑马鱼上。本发明首次建立了花鲈胚胎干细胞系及其培养方法。建立的花鲈胚胎干细胞培养方法适用于大型的、经济价值较高的海水鱼类，本发明拓宽了鱼类胚胎干细胞培养的研究范畴，突破了以往鱼类胚胎干细胞培养仅具有理论意义的局限，为进一步将鱼类胚胎干细胞应用于生产实践提供了技术手段。
本发明所采用的是无滋养层细胞培养方法。与斑马鱼胚胎干细胞和小鼠胚胎干细胞培养常用的滋养层培养法相比，本方法无需培养用于控制胚胎干细胞分化的滋养层成纤维细胞，而是在培养基中添加LIF因子来控制细胞分化，为保证细胞能有效贴壁，则采用0.1％明胶处理培养板的方法；因此，本发明具有操作简单、培养方便的优点。另外，本方法可保证细胞处于快速、稳定的生长状态。
具体实施例方式下面通过实施例详细叙述本发明的内容花鲈胚胎干细胞培养采用较为简单的无滋养层培养法，更为重要的是，花鲈是我国重要的海水养殖品种，经济价值较高。花鲈胚胎干细胞不仅可以作为海水鱼类模式细胞，为开展基因打靶研究奠定细胞学基础，并且在鱼类功能基因研究、定点突变的转基因研究等方面也有重要作用。建立简便、有效的花鲈胚胎干细胞培养方法在开展海水鱼类基因工程育种研究和实际生产应用方面意义重大。
花鲈胚胎干细胞是从花鲈囊胚期胚胎中分离出的、具有发育全能性的细胞，其特征是细胞小、呈圆形、多角形或多边形，细胞直径15-25um，具有大的细胞核和较少的细胞质，具有高的碱性磷酸酶活性、细胞增殖速度快，在24℃下，细胞倍增时间为20小时左右；在人工诱导条件下，可以分化成不同细胞类型，通过细胞移植，可以在受体囊胚内分化发育形成不同的组织和器官，从而形成嵌合体。
花鲈胚胎干细胞的培养方法本发明是按以下操作程序完成的花鲈胚胎囊胚期细胞的收集；胚胎干细胞的原代培养和传代培养，包括对囊胚期细胞进行原代培养和早期传代培养；温度对花鲈胚胎干细胞生长的影响；稳定胚胎干细胞的培养；对培养的花鲈胚胎干细胞特征进行鉴定，包括形态学鉴定、碱性磷酸酶检测、倍性检测，细胞发育多能性的鉴定。
囊胚期细胞的收集采集花鲈胚胎，显微镜下挑选胚胎发育正常的浮性卵，在常温下培养至中囊胚期(约1000个细胞的胚胎)备用，每组胚胎数量为50-70枚，在1×PBS溶液中反复浸洗，然后转移到70％酒精中对胚胎进行快速消毒，并用灭菌的1×PBS(pH为7.4)溶液冲洗3次。在显微镜下用镊子剥除卵膜，分离出胚胎细胞，用枪头反复轻轻吹打形成单个细胞，吸出溶液以800转/分钟离心5分钟，去上清，加入培养基形成细胞悬液，同样转速离心，重复此步骤3次，彻底去除卵黄和油球，加入完全培养基重悬细胞，轻轻吹打形成细胞悬液待用。
胚胎干细胞的原代培养和传代培养对囊胚期细胞进行原代培养和早期传代培养将囊胚期细胞悬液接种到24孔细胞培养板的1孔中，加入1ml完全培养基在细胞培养箱中进行原代培养，培养温度为24℃。完全培养基配方为DMEM培养基为基础培养基，添加4.5g/ml葡萄糖、20mmol/l Hepes(pH7.5)，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，2mmol/l谷氨酸、1mmol/l丙酮酸钠，1mmol/l非必需氨基酸，5ng/ml重组人白血病限制因子，15％胎牛血清和1％花鲈血清，0.1％花鲈胚胎抽提物，8nM的亚硒酸钠，5ng/ml的成纤维生长因子，27.5μM巯基乙醇。镜检观察细胞长满培养孔的95％时，按1∶2的比例进行细胞传代，每2-3天更换1次培养基，1周传代2-3次。获得的8个囊胚细胞原代培养物，在传代过程中，有6个出现分化，逐渐死亡，2个囊胚细胞原代培养物形成细胞系，保持较稳定的生长状况，细胞呈现胚胎干细胞形态细胞为圆形或多边形，核大，细胞质稀薄，细胞大小为15-25μm。待细胞经过150天的培养传代到40代时，即形成稳定的胚胎干细胞系。
温度对花鲈胚胎干细胞生长的影响研究发现，LJES1在4-32℃下都能存活，适宜生长温度为20-28℃；在4℃下，细胞可存活40天，再转到24℃下依然生长良好，能正常传代；在32℃下，LJES1细胞可以生长、增殖，但生长速度开始下降，细胞最适宜温度为24-28℃，28℃细胞生长速度达到最大(如表1所示)。适宜LJES1生长的最适pH值为7.2-7.4。
表1不同温度对LJES1细胞生长的影响
稳定胚胎干细胞的培养形成稳定的干细胞系后，细胞保持较快的生长速度，基本上不再自发分化，得到第13、35和60代胚胎干细胞倍增时间分别为19.76、20.67和21.31小时，在60小时细胞增殖速率达到最大。
胚胎干细胞特征鉴定主要是形态学鉴定、碱性磷酸酶检测、倍性检测以及细胞发育多能性的鉴定。
形态学鉴定在100×或400×的相差显微镜下可观察到花鲈胚胎干细胞具有典型的干细胞特征，一般为多边形或多角形，具有大的细胞核，一个或两个核仁，细胞的直径约为15-25um，在含有LIF抑制分化因子的条件培养基中成单层生长。花鲈胚胎干细胞(LJES1)生长迅速，在极低密度下(103cells/ml)接种于培养瓶中，10-15天即可由一个细胞形成单克隆集落。
碱性磷酸酶检测花鲈胚胎干细胞用1×PBS洗涤后，以1％的多聚甲醛固定10分钟，再用1×PBS洗涤2次，以BCIP/NBT为底物在黑暗环境染色15-20分钟。囊胚中期细胞为对照，花鲈胚胎干细胞与囊胚中期细胞一样，显现强烈的紫红色，为碱性磷酸酶阳性。
倍性检测花鲈胚胎干细胞生长至对数期，在培养基中添加秋水仙素使终浓度为10μg/ml，4小时后收获细胞，75mmol/L KCl溶液低渗处理30分钟，3∶1甲醇、冰醋酸固定细胞3次，每次15分钟，冷滴片，空气干燥，5％Giemsa染色20分钟。显微镜下观察染色体形态，计数染色体数目，做出核型。花鲈胚胎干细胞的染色体数目48条占60％以上，核型公式为2n＝48t，与花鲈体细胞染色体相同。
细胞发育多能性的检测包括胚胎干细胞的体外分化能力、花鲈胚胎干细胞可形成拟胚体并发生分化、花鲈胚胎干细胞的体内分化能力。
胚胎干细胞的体外分化能力胚胎干细胞在诱导剂视黄酸的作用下，可以在体外诱导分化为多种类型的细胞，如神经细胞、神经胶质细胞、肌肉细胞、成纤维细胞等。细胞的诱导过程是胚胎干细胞在完全培养基中培养2-3天，细胞经胰酶消化后，以高和低两种细胞密度分别接种到12孔培养板，以含有不同浓度RA(0.1uM、0.2uM、0.5uM、luM)的ES细胞培养液(撤除了LIF因子)培养LJES1单层细胞，诱导3-4周，在诱导期间，为保持细胞处于合适的密度大小，要适时传代。结果如表2和表3所示表2高密度下诱导分化结果
表3低密度下诱导分化结果
花鲈胚胎干细胞可形成拟胚体并发生分化花鲈胚胎干细胞经胰酶消化后，制成约20×104cells/ml密度的单细胞悬液，再将其接种于9cm培养皿上盖的内表面上，接种培养基为诱导分化培养基1(在基础培养基DMEM的基础上添加5％的小牛血清和50mM 2-巯基乙醇)，制成许多悬浮细胞小滴。置培养箱中培养4-10天后，ES细胞形成拟胚体，可以看见一部分拟胚体中出现黑色素细胞。将拟胚体移至诱导分化培养基2(在基础培养基DMEM的基础上添加5％的小牛血清FBS、50mM2-巯基乙醇和0.5uM的视黄酸)中继续培养，在显微镜下观察其分化情况，结果为LJES1细胞在诱导分化培养基1中悬滴培养3天后，形成拟胚体结构，拟胚体不断的向外生长，变大，大部分的拟胚体都出现典型的黑色素细胞。随后，将拟胚体转移到诱导分化培养基2中培养6-8小时后，拟胚体贴壁，并开始分化为树状肌肉细胞，最外层是成纤维细胞，有些拟胚体内部还能看到分化为几个胚层的现象；在完全培养基(撤除LI F因子，添加RA)中，拟胚体分化为神经细胞，可以看见神经细胞向外辐射的细长的轴丝。
花鲈胚胎干细胞的体内分化能力体内分化能力是证明胚胎干细胞发育全能性的重要证据。采用脂质体介导法将pCMVEGFP质粒转染花鲈胚胎干细胞，使其表达绿色荧光蛋白并作为细胞供体。方法如下花鲈胚胎干细胞用完全培养基以20×104/ml细胞接种到12孔细胞培养板中，使细胞长满培养孔的60％-80％，24℃过夜培养。培养12-16小时后，进行脂质体转染。将DNA和脂质体genejuice分别溶于不含血清和抗体的DMEM中，然后进行混合，形成DNA-脂质体混合物，将其逐滴加到培养基表面并均匀的分布在培养基中，6-8h后，添加1ml培养基继续培养24-72小时后，在激发波长为488nm的荧光显微镜下观察荧光的表达，表达效率为10％-20％。以此细胞作为供体，采用显微注射方法进行细胞移植制备花鲈嵌合体胚胎。注射时，将发育至囊胚中期的花鲈胚胎小心吸入到特制的琼脂凹槽内，使其在凹槽内呈单排直线排列，加入少量灭菌海水浸没胚胎。用拨卵针小心将胚胎的动物极转至上方，将注射针注射入囊胚内，每个囊胚注入20～50个供体细胞。将注射后发育形成的嵌合体于18℃无菌海水中培养，胚胎孵化后用新鲜过滤海水培养；注射后的胚胎和孵化出的鱼苗进行荧光显微观察。在细胞移植24h后可观察到绿色荧光蛋白在受体胚胎中的表达，共有7.7％的胚胎发育形成了表达绿色荧光蛋白的嵌合体，嵌合部位发生在胚胎的三个胚层内，有的分布在眼、听囊等部位，有的在胚体中部，有的在卵黄囊，充分证明了花鲈胚胎干细胞的体内分化能力和发育全能性。
因此，形态学和倍性检测、生理生化检测、细胞体外分化检测及细胞移植实验充分证明本发明建立的花鲈胚胎干细胞系具有典型的胚胎干细胞特征。
权利要求
1.一种花鲈胚胎干细胞，其特征在于它的胚胎干细胞小且呈圆形、多角形或多边形，细胞直径15-25um，具有大的细胞核和较少的细胞质，具有高的碱性磷酸酶活性，细胞增殖速度快，在24℃下，细胞倍增时间为20小时左右；在人工诱导条件下，可以分化成神经细胞、肌肉细胞和神经胶质细胞等不同类型细胞.
2.一种花鲈胚胎干细胞培养方法，其特征在于它的操作程序是花鲈胚胎囊胚期细胞的收集；胚胎干细胞的培养和传代包括对囊胚期细胞进行原代培养和早期传代培养、温度对花鲈胚胎干细胞生长的影响、稳定胚胎干细胞的培养；对培养的花鲈胚胎干细胞进行特征鉴定包括形态学鉴定、碱性磷酸酶检测、倍性检测、细胞发育多能性的鉴定，花鲈胚胎囊胚期细胞的收集采集花鲈胚胎，镜检合格后在常温下培养至囊胚中期时使用，每个胚胎含有大约1000个细胞，胚胎干细胞的培养和传代对囊胚期细胞进行原代培养和早期传代培养将收集的囊胚期细胞接种到24孔细胞培养板中单层培养，加入完全培养基1.0ml，24℃培养，待培养2-3天后，更换培养基，细胞长满培养孔，按1∶2的比例进行细胞传代，每2-3天更换1次培养基，1周传代2-3次。完全培养基的配方为DMEM培养基为基本培养基，添加4.5g/ml葡萄糖、20mmol/lHepes(pH7.5)、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、2mmol/l谷氨酸、1mmol/l丙酮酸钠、1mmol/l非必需氨基酸、5ng/ml重组人白血病抑制因子、15％胎牛血清、1％花鲈鱼血清、0.1％胚胎抽提物、8nM的亚硒酸钠、5ng/ml的成纤维生长因子、27.5μM巯基乙醇，温度对花鲈胚胎干细胞生长的影响研究发现，LJES1在4-32℃下都能存活；在4℃下，细胞可存活40天，再转到24℃下依然生长良好，能正常传代；在32℃下，LJES1细胞可以生长、增殖，但生长速度开始下降，细胞最适宜温度为24-28℃，28℃细胞生长速度达到最大。适宜LJES1生长的最适pH值为7.2-7.4，稳定胚胎干细胞的培养形成稳定的胚胎干细胞系后，细胞保持较快的生长速度，基本上不再自发分化，得到第13、35和60代胚胎干细胞倍增时间分别为19.76、20.67和21.31小时，在60小时细胞增殖速率达到最大，胚胎干细胞特征鉴定形态学鉴定在100×和400×的相差显微镜下观察细胞的外形和细胞大小，比较本细胞与典型的胚胎干细胞的异同，其细胞具有典型的胚胎干细胞特征多边形或多角形，具有大的细胞核，一个或两个核仁，细胞直径约为15-25um，碱性磷酸酶检测细胞经1％多聚甲醛固定，BCIP/NBT作为反应底物，在黑暗环境下对细胞进行染色，囊胚中期细胞为对照，相差显微镜观察，花鲈胚胎干细胞与囊胚中期细胞一样，被染色显现强烈的紫红色，为碱性磷酸酶阳性，倍性检测对胚胎干细胞进行常规的染色体制备，显微镜下观察染色体形态，统计二倍体细胞的比率，即染色体数目为48条的细胞所占比率为60％以上，细胞发育多能性的鉴定通过花鲈胚胎干细胞的体外分化能力验证。体外诱导分化主要是在培养基中添加视黄酸(RA)及控制培养条件，可以诱导细胞分化成多种不同类型的细胞，如神经样细胞、肌肉样细胞、纤维样细胞及拟胚体等；体内诱导分化主要是通过细胞移植构建嵌合体进行多能性鉴定。
全文摘要
一种花鲈胚胎干细胞及培养方法，它的细胞小且呈圆形、多角形或多边形，细胞直径15－25um，具有大的细胞核和较少的细胞质，细胞增殖速度快，具有发育多能性和分化潜力；其操作程序是花鲈囊胚期细胞收集；胚胎干细胞的原代和传代培养、温度对花鲈胚胎干细胞生长的影响、稳定期胚胎干细胞培养；花鲈胚胎干细胞特征鉴定，包括形态学、碱性磷酸酶、倍性，发育多能性的鉴定和检测。胚胎干细胞采用完全培养基培养，每周传代2－3次。细胞采用无滋养层技术，于0.1％明胶处理的培养板上单层培养，培养温度为24℃。以此方法培养的花鲈胚胎干细胞具有典型的胚胎干细胞特征。本发明技术操作简单，细胞增殖快速，可用于其他鱼类胚胎干细胞培养。
文档编号C12Q1/02GK1737130SQ20051004403
公开日2006年2月22日 申请日期2005年7月12日 优先权日2005年7月12日
发明者陈松林, 沙珍霞, 叶寒青 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所