专利名称：含硅藻的液体、硅藻及硅藻的培养方法
技术领域：
本发明涉及作为微型藻类的硅藻，所述微型藻类用于牡蛎、珍珠贝等贝类，日本对虾、基围虾等甲壳类，海参、海胆等棘皮类等水产种苗的饵料，更具体而言，涉及含有硅藻的液体及硅藻的培养方法。
背景技术：
作为养殖贝类、甲壳类、棘皮类等水产种苗时的饵料，近年来，分类为角毛藻(Chaetoceros)属、褐指藻(Phaeodactylum)属等微型藻类的硅藻(例如角毛藻属的钙质角毛藻(calcitrans)、角刺藻(gracilis)等)已开始为人们所关注。
例如，钙质角毛藻在4个角上分别具有1根长鞭毛。由于钙质角毛藻的直径(全长)约为3～6μm左右，因此特别适合用作水产种苗幼苗时的饵料。
作为微型藻类之一的硅藻，与其他植物浮游生物相比，在矿物质平衡及维生素平衡方面优良。另外，硅藻含有EPA(二十碳五烯酸，多元不饱和脂肪酸)、DHA(二十二碳六烯酸，多元不饱和脂肪酸)等有用脂肪酸。基于上述理由，微型藻类中的硅藻在作为饵料方面获得非常高的评价。
但是，微型藻类中的硅藻极难稳定地培养。在[1鱼类增殖技术试验，(1)盐水种苗生产研究，生物饵料培养](以下简称为文献1)及[平成4年特定研究开发促进事业微型藻类的大量培养技术开发研究报告书](以下简称为文献2)中，报道了按现有培养方法获得的硅藻角毛藻(以下简称角毛藻)的细胞浓度上限约为3.0×1013cell/m3。此处细胞浓度表示每1m3培养液中的细胞数。
按现有的培养方法，由于角毛藻的细胞浓度上限约为3.0×1013cell/m3，因此无法获得充分的培养量。因此正在寻找能够高浓度且稳定地培养角毛藻的液体(培养液、培养基)及培养方法。
发明内容
本发明是鉴于上述问题而完成的，其目的在于提供一种能够高浓度且稳定地培养作为微型藻类之一的硅藻的含有硅藻的液体及硅藻培养方法，且提供一种按上述方法培养的硅藻。
为了实现上述目的，本发明提供一种含有硅藻的液体，是用于培养硅藻的液体，其特征在于，所述液体含有硅藻、硅及氮，硅/氮(所述硅与所述氮的质量浓度比)设定为超过0.18的值。
为了实现上述目的，本发明提供一种硅藻，其特征在于，所述硅藻在下述液体中培养而成，所述液体含有硅及氮，硅/氮(所述硅与所述氮的质量浓度比)设定为超过0.18的值。
根据本发明，由于将用于培养硅藻的液体中的硅/氮(所述硅与所述氮的质量浓度比)设定为超过0.18的值，因此能够高浓度且稳定地培养硅藻。
为了实现上述目的，本发明提供一种含有硅藻的液体，是用于培养硅藻的液体，其特征在于，所述液体含有硅藻、磷、硅及氮，磷/氮(所述磷与所述氮的质量浓度比)、及硅/氮(所述硅与所述氮的质量浓度比)分别设定为0.1或0.1以上的值。
为了实现上述目的，本发明提供一种硅藻，其特征在于，所述硅藻是在下述液体中培养而成的，所述液体含有磷、氮及硅，且磷/氮(所述磷及所述氮的质量浓度比)、及硅/氮(所述硅及所述氮的质量浓度比)分别设定为0.1或0.1以上。
根据本发明，由于将用于培养硅藻的液体中所含磷/氮(磷及氮的质量浓度比)、及硅/氮(硅及氮的质量浓度比)分别设定为0.1或0.1以上的值，因此能够高浓度且稳定地培养硅藻。
为了实现本发明的目的，本发明提供一种含有硅藻的液体，是用于培养硅藻的液体，其特征在于，所述液体含有硅藻、磷、硅及氮，pH为6.4或6.4以上、8.4或8.4以下。
为了实现本发明的目的，本发明提供一种硅藻，其特征在于，所述硅藻是在下述液体中培养而成的，所述液体含有磷、氮及硅，且pH设定在6.4或6.4以上、8.4或8.4以下的范围内。
根据本发明，由于将用于培养硅藻的液体的pH设定在6.4或6.4以上、8.4或8.4以下的范围内，因此能够高浓度且稳定地培养硅藻。
为了实现上述目的，本发明提供一种硅藻的培养方法，是使用含有氮及硅的硅藻培养液培养硅藻的硅藻培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤分别测定所述液体中所含氮的初期浓度及硅的初期浓度的事前测定步骤；在所述液体中接种所述硅藻的接种步骤；分别测定所述氮的补给前浓度及所述硅的补给前浓度的补给前测定步骤；分别求出氮浓度差(所述氮的初期浓度与补给前浓度的差)和硅浓度差(所述硅的初期浓度与补给前浓度的差)的浓度差测定步骤；基于所述氮浓度差和所述硅浓度差，分别决定在所述液体中补给的氮量及硅量，并将其补给入所述液体，以便与所述氮初期浓度和所述硅初期浓度的比例一致的补给步骤。
根据本发明，在接种硅藻前测定氮的初期浓度及硅的初期浓度，在补给氮及硅前，测定氮的补给前浓度及硅的补给前浓度。然后，基于氮浓度差(氮的初期浓度与补给前浓度的差)和硅浓度差(硅的初期浓度与补给前浓度的差)，决定液体中补给的氮量和硅量。从而，由于将氮质量浓度与硅质量浓度的比例保持一致，因此能够高浓度且稳定地培养硅藻。
为了实现上述目的，本发明提供一种硅藻的培养方法，是使用含有氮及硅的硅藻培养液培养硅藻的硅藻培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤分别测定所述氮的补给前浓度及所述硅的补给前浓度的补给前测定步骤；分别求出氮浓度差(所述氮的规定浓度与补给前浓度的差)和硅浓度差(所述硅的规定浓度与补给前浓度的差)的浓度差测定步骤；基于所述氮浓度差和所述硅浓度差，分别决定在所述液体中补给的氮量及硅量，并将其补给入所述液体，以便与所述氮的规定浓度和所述硅的规定浓度的比例一致的补给步骤。
根据本发明，在补给氮及硅前，测定氮的补给前浓度及硅的补给前浓度之后，基于氮浓度差(氮的规定浓度与补给前浓度的差)和硅浓度差(硅的规定浓度与补给前浓度的差)，决定在液体中补给的氮量和硅量。从而，由于将氮的质量浓度与硅的质量浓度的比例保持一致，因此能够高浓度且稳定地培养硅藻。
为了实现上述目的，本发明提供一种硅藻的培养方法，是使用含有氮及硅的硅藻培养液培养硅藻的硅藻培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤测定所述接种了硅藻的液体中所含氮的初期浓度及硅的初期浓度的事前测定步骤；分别测定所述氮的补给前浓度及所述硅的补给前浓度的补给前测定步骤；分别求出氮浓度差(所述氮的初期浓度与补给前浓度的差)和硅浓度差(所述硅的初期浓度与补给前浓度的差)的浓度差测定步骤；基于所述氮浓度差和所述硅浓度差，分别决定在所述液体中补给的氮量及硅量，并将其补给入所述液体中，以便与所述氮的初期浓度和所述硅的初期浓度的比例一致的补给步骤。
根据本发明，在接种硅藻后，测定氮的初期浓度及硅的初期浓度，在补给氮及硅前，测定氮的补给前浓度及硅的补给前浓度。然后，基于氮浓度差(所述氮的初期浓度与补给前浓度的差)和硅浓度差(所述硅的初期浓度与补给前浓度的差)，决定液体中补给的氮量和硅量。从而，由于将氮的质量浓度与硅的质量浓度的比例保持一致，因此能够高浓度且稳定地培养硅藻。
为了实现上述目的，本发明提供一种硅藻的培养方法，是使用含有氮及硅的培养液培养硅藻的硅藻培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤在接种了所述硅藻的消费量测定用液体中，分别测定所述硅藻消费的氮消费量及硅消费量的事前测定步骤；在所述培养液中接种所述硅藻的接种步骤；测定所述硅藻的细胞浓度的测定步骤；所述细胞浓度超过规定量的情况下，调制追肥用液体，使氮及硅的比例与所述氮消费量和所述硅消费量的比例大致保持一致的调制步骤；将调制的所述追肥用液体补给入所述培养液中的补给步骤。
根据本发明，对于消费量测定用液体而言，在分别测定由硅藻消费的氮消费量及硅消费量后，用培养液培养硅藻时，如果硅藻的细胞浓度超过规定量，则将氮及硅的比例决定为与氮消费量和硅消费量的比例大致保持一致。从而，由于将氮的质量浓度与硅的质量浓度的比例保持为一定，因此能够高浓度且稳定地培养硅藻。
图1示出本实施方案中使用的培养液成分。
图2示出试样1至11的各培养液中繁殖的角毛藻的细胞浓度变化、氮消费量、磷消费量及硅消费量。
图3A示出氮消费量与细胞浓度变化的关系。
图3B示出磷消费量与细胞浓度变化的关系。
图3C示出硅消费量与细胞浓度变化的关系。
图4分别示出本实施方案中使用的培养液1至6的成分组成及现有现有培养液7至8的成分组成。
图5示出图4所示的各培养液中所含氮的质量浓度、磷的质量浓度及硅的质量浓度。
图6示出培养液4的pH值与水解量的关系。
图7为本实施方案中使用的扁平培养瓶的侧面图。
图8分别示出在培养液1中添加碳酸氢钠时及未在培养液1中添加碳酸氢钠时培养液1的pH值与细胞浓度变化的关系。
图9分别示出在碳酸氢钠的质量浓度调整为0.02×103ppm、0.14×103ppm、1.0×103ppm的培养液1中细胞浓度随时间的变化。
图10分别示出在碳酸氢钠的质量浓度调整为0.02×103ppm、0.14×103ppm、1.0×103ppm的培养液1中pH值随时间的变化。
图11分别示出在碳酸氢钠的质量浓度调整为0.07×103ppm、0.14×103ppm、0.28×103ppm、1.0×103ppm的培养液1中细胞浓度随时间的变化。
图12分别示出在碳酸氢钠的质量浓度调整为0.07×103ppm、0.14×103ppm、0.28×103ppm、1.0×103ppm的培养液1中pH值随时间的变化。
图13分别示出在碳酸氢钠的质量浓度调整为0.28×103ppm、0.56×103ppm、1.0×103ppm、2.0×103ppm的培养液1中细胞浓度随时间的变化。
图14分别示出在碳酸氢钠的质量浓度调整为0.28×103ppm、0.56×103ppm、1.0×103ppm、2.0×103ppm的培养液1中pH值随时间的变化。
图15分别示出在碳酸氢钠的质量浓度调整为1.0×103ppm、7.0×103ppm的培养液1中细胞浓度随时间的变化。
图16分别示出在碳酸氢钠的质量浓度调整为1.0×103ppm、7.0×103ppm的培养液1中pH值随时间的变化。
图17分别示出实施例1至4的培养液1至4的细胞浓度随时间的变化。
图18分别示出实施例1至4的培养液1至4的pH值随时间的变化。
图19分别示出重现试验中培养液1至4的细胞浓度随时间的变化。
图20分别示出重现试验中培养液1至4的pH值随时间的变化。
图21分别示出实施例5至7的培养液2、4、5的细胞浓度随时间的变化。
图22分别示出实施例5至7的培养液2、4、5的pH值随时间的变化。
图23分别示出再培养试验中培养液2、4、5的细胞浓度随时间的变化。
图24分别示出再培养试验中培养液2、4、5的pH值随时间的变化。
图25为实施例8中使用的半分批连续培养的流程图。
图26分别示出实施例8至9中培养液4、6的细胞浓度随时间的变化。
图27分别示出实施例8至9中培养液4、6的pH值随时间的变化。
图28示出实施例8至9中每1.4×104个角毛藻细胞对应的磷总消费量与氮总消费量的比、及硅总消费量与氮总消费量的比。
图29示出实施例10中培养液4的细胞浓度随时间的变化。
图30示出实施例10中培养液4的pH值随时间的变化。
图31示出实施例10中每1.4×104个角毛藻细胞对应的磷总消费量与氮总消费量的比、及硅总消费量与氮总消费量的比。
图32为半分批连续培养的变形例的流程图。
图33为半分批连续培养的其他变形例的流程图。
图34分别示出本实施方案中使用的培养液10、11的成分组成。
图35分别示出实施例11及比较例的培养液10、11的细胞浓度随时间的变化。
图36分别示出实施例11及比较例的培养液10、11的pH值随时间的变化。
具体实施例方式
在本实施方案中，最初进行了5个试验及解析作为事前调查，以寻找用于稳定且高浓度地培养硅藻的条件。然后，基于这些条件，寻找稳定且高浓度地培养硅藻的方法。
(事前调查)1)记载接种在液体(培养液)中的角毛藻培养量的变化(增殖量)与构成此培养液成分消费量的关系。
准备具有图1所示的培养液成分、且成分组成比互不相同的11个试样。将各试样放入具有规定容量(例如约65×10-3m3)的室外用(自然光用)密闭型反应器中。各试样的培养液容量一定。然后，将规定细胞数的角毛藻接种在各反应器中。接下来，在经过规定时间后，测定各试样的细胞浓度变化(培养细胞浓度-初期细胞浓度，单位cell/m3)、氮消费量、磷消费量及硅消费量。氮(N)、磷(P)及硅(Si)是角毛藻培养中的重要构成元素。
将图1所示的海洋生物(株式会社Marine·Tech制)溶于水成为人工海水。需要说明的是溶解在水中成为人工海水的成分，也可以使用海洋生物以外的成分。而且不限定为人工海水，也可以为使用高压灭菌器、过滤灭菌或药品等实施了灭菌处理的天然海水，或未杀菌的天然海水。
由于各培养液的容量一定，因此氮消费量用消费的质量浓度(初期培养液的氮质量浓度-残留的氮质量浓度)表示。氮的质量浓度单位为(ppm)。
由于各培养液的容量一定，因此磷消费量用消费的质量浓度(初期培养液的磷质量浓度-残留的磷质量浓度)表示。磷的质量浓度单位为(ppm)。
由于各培养液的容量一定，因此硅消费量用消费的质量浓度(初期培养液的硅质量浓度-残留的硅质量浓度)表示。硅的质量浓度单位为(ppm)。
图2示出11个试样中各培养液细胞浓度变化(cell/m3)、氮消费量、磷消费量及硅消费量。
基于此测定结果，氮消费量与角毛藻细胞浓度变化的关系、磷消费量与角毛藻细胞浓度变化的关系及硅消费量与角毛藻细胞浓度变化的关系分别如图3A、图3B及图3C所示。
氮、磷及硅的各消费量与细胞浓度变化量(增殖量)的关系如图3A、图3B及图3C的二点划线所示，构成比例关系。
2)记载培养液成分中P/N(磷与氮的质量浓度比)的值及Si/N(硅与氮的质量浓度比)的值。
在公开了现有培养方法的文献1及2中，记载了角毛藻培养液中氮、磷及硅的各质量浓度。文献1的培养液中氮的质量浓度、磷量的质量浓度、硅量的质量浓度分别为13.8(ppm)、1.4(ppm)、0.15(ppm)。文献2的培养液中氮的质量浓度、磷量的质量浓度、硅量的质量浓度分别为102(ppm)、1.4(ppm)、8.0(ppm)。
文献1的培养液中P/N、Si/N分别为0.10、0.011。文献2的培养液中P/N、Si/N分别为0.014、0.078。
如图3A、3B、3C所示，由于氮、磷及硅的各消费量与细胞浓度变化量成比例，因此推测如果将P/N及Si/N分别设定为大于由文献1及文献2算出的值，即至少为0.1或0.1以上，则与现有的培养方法相比，可以增大角毛藻的增殖量。
另外，如图3A、3B、3C的点线所示，可以推测为了使角毛藻的细胞浓度约为6.0×1013cell/m3或6.0×1013cell/m3以上，优选使用如下调制的培养液，即，使氮的质量浓度约为160ppm或160ppm以上、磷的质量浓度约为20ppm或20ppm以上及硅的质量浓度约为60ppm或60ppm以上。
为了验证上述2个推测，调制具有图4所示成分组成的培养液1～培养液6。需要说明的是培养液7的成分组成为文献1所述培养液的成分组成，培养液8的成分组成为文献2所述培养液的成分组成。各培养液的氮质量浓度、磷质量浓度、硅质量浓度、P/N及Si/N分别如图5所示。
培养液1的磷质量浓度及硅质量浓度小于上述推测值。在培养液1中，氮质量浓度、磷质量浓度、硅质量浓度分别为166(ppm)、10(ppm)、30(ppm)。P/N、Si/N分别为0.06、0.18。
培养液2调制为磷质量浓度2倍于培养液1的成分组成(磷质量浓度＝20(ppm)，P/N＝0.12)。
培养液3调制为硅质量浓度2倍于培养液1的成分组成(硅质量浓度＝60(ppm)，P/N＝0.36)。
培养液4调制为磷质量浓度及硅质量浓度分别2倍于培养液1的成分组成(磷量的质量浓度＝20(ppm)，P/N＝0.12，硅量的质量浓度＝60(ppm)，P/N＝0.36)。
培养液5调制为硅质量浓度3倍于培养液2的成分组成(硅量的质量浓度＝90(ppm)，P/N＝0.54)。
培养液6调制为硅质量浓度4倍于培养液2的成分组成(硅量的质量浓度＝120(ppm)，P/N＝0.72)。
培养液2～6中的磷质量浓度、硅质量浓度、P/N、Si/N均高于具有现有组成成分的培养液7、8中的磷质量浓度、硅质量浓度、P/N、Si/N。
3)记载磷质量浓度及硅质量浓度高的培养液中pH值与水解量的关系。
调整作为培养液成分之一的碳酸氢钠(NaHCO3)的质量浓度，使培养液4的pH在7.0～9.0之间变化。此时，测定培养液4中的水解量(相对于1m3溶液，沉淀的水解物质量(kg))。需要说明的是边将作为培养液内维持生命的必要成分的、混合了3％二氧化碳的空气作为培养液搅拌用空气供给至培养液4，边对培养液4进行通气搅拌。
图6示出此测定结果的曲线图。图6的实线与点线分别示出不同试验日获得的水解量变化，得到大致相同的结果。
由此测定结果可知，如果培养液4的pH超过8.5，则水解量变化剧烈，水解量(沉淀量)增加。如果培养液4的pH超过8.5，则由于沉淀物中含有角毛藻，因此角毛藻无法增殖。
4)确定培养液的pH上限值。使用作为培养液成分之一的碳酸氢钠和混合了3％二氧化碳的空气调整培养液的pH。通常，如果碳酸氢钠的量增加，则溶液的pH值增加，另外，如果二氧化碳的浓度增加，则溶液的pH减少。需要说明的是碳酸氢钠及二氧化碳是角毛藻光合成的碳源，且具有培养液pH调节剂的作用。
将培养液1(110×10-3m3)放入置于室外的密闭型反应器，边将温度维持在约25℃左右，边用自然的太阳光(光量子量约为1200μmol/m2/s的光强度)照射培养液1。在此状态下进行如下2个测定，即i)用混合了3％二氧化碳的空气通气搅拌培养液1，分别测定培养液1中角毛藻细胞浓度随时间的变化及pH随时间的变化；ii)添加碳酸氢钠(7.0×103ppm)，且用空气对培养液1进行通气搅拌，分别测定培养液1中角毛藻细胞浓度随时间的变化及pH随时间的变化。
图8是示出此测定结果的曲线图。图8的实线表示第1个测定结果，即不添加碳酸氢钠，用混合了3％二氧化碳的空气进行通气搅拌的情况下，培养液1的pH时间变化；图8的点线表示第2个测定结果，即添加碳酸氢钠，仅用空气进行通气搅拌的情况下，培养液1的pH时间变化。
由测定结果可知，用空气对培养液1进行通气搅拌，且添加碳酸氢钠的情况下，培养液1的pH如果超过8.5，则出现沉淀。此时，角毛藻与沉淀物一同沉淀。另外，用混合了3％二氧化碳的空气进行通气搅拌，且不添加碳酸氢钠的情况下，培养液1的pH不发生逐渐降低。
由3)及4)的测定结果可知，与用混合了3％二氧化碳的空气对培养液进行通气搅拌的情况相比，在培养液中添加碳酸氢钠能够将pH设定为8.4或8.4以下。其结果为能够分别防止沉淀的出现和角毛藻的共沉淀。
需要说明的是培养液1的成分与培养液2～6的成分相比，除了P/N及Si/N之外，其他成分完全相同。所以，由于培养液1的溶解度与其他培养液的溶解度大致相同，因此推测对于其他培养液而言，在培养液中添加碳酸氢钠的状态下，通过用混合了二氧化碳的空气对培养液进行通气搅拌，也能够分别防止沉淀的出现和角毛藻的共沉淀。
5)记载培养液pH的下限值及碳酸氢钠的适当添加量范围。
调整作为培养液成分之一的碳酸氢钠的质量浓度，准备下述8种培养液1，用混合了3％二氧化碳的空气对各培养液1进行通气搅拌[1]0.02×103ppm，[2]0.07×103ppm，[3]0.14×103ppm，[4]0.28×103ppm，[5]0.56×103ppm，[6]1.0×103ppm，[7]2.0×103ppm，[8]7.0×103ppm。对如上调制成的各培养液1进行角毛藻培养试验，测定细胞浓度的时间变化和pH的时间变化。需要说明的是为了确保重现性，改变日期，进行4次上述试验。
图9及10为第1次测定结果。在第1次培养试验中，使用具有下述3种碳酸氢钠质量浓度的培养液1[1]0.02×103ppm，[3]0.14×103ppm，[6]1.0×103ppm。图9所示的X1、X2、X3分别表示在[1]0.02×103ppm，[3]0.14×103ppm，[6]1.0×103ppm的培养液1中培养的角毛藻细胞浓度的时间变化。图10所示的XA1、XA2、XA3分别表示[1]0.02×103ppm，[3]0.14×103ppm，[6]1.0×103ppm的培养液1的pH随时间的变化。
图11及图12为第2次测定结果。在第2次培养试验中，使用具有下述4种碳酸氢钠质量浓度的培养液1[2]0.07×103ppm，[3]0.14×103ppm，[4]0.28×103ppm，[6]1.0×103ppm。图11所示的Y1、Y2、Y3、Y4分别表示在[2]0.07×103ppm，[3]0.14×103ppm，[4]0.28×103ppm，[6]1.0×103ppm的培养液1中培养的角毛藻细胞浓度的时间变化。图12所示的YA1、YA2、YA3、YA4分别表示[2]0.07×103ppm，[3]0.14×103ppm，[4]0.28×103ppm，[6]1.0×103ppm的培养液1的pH随时间的变化。
图13及图14为第3次测定结果。在第3次培养试验中，使用具有下述4种碳酸氢钠质量浓度的培养液1[4]0.28×103ppm，[5]0.56×103ppm，[6]1.0×103ppm，[7]2.0×103ppm。图13所示的Z1、Z2、Z3、Z4分别表示在[4]0.28×103ppm，[5]0.56×103ppm，[6]1.0×103ppm，[7]2.0×103ppm的培养液1中培养的角毛藻细胞浓度随时间的变化。图14所示的ZA1、ZA2、ZA3、ZA4分别表示[4]0.28×103ppm，[5]0.56×103ppm，[6]1.0×103ppm，[7]2.0×103ppm的培养液1的pH随时间的变化。
图15及图16为第4次测定结果。在第4次培养试验中，使用具有下述2种碳酸氢钠质量浓度的培养液1[6]1.0×103ppm，[8]7.0×103ppm。图15所示的W1、W2分别表示在[6]1.0×103ppm，[8]7.0×103ppm的培养液1中培养的角毛藻细胞浓度随时间的变化。图16所示的WA1、WA2分别表示[6]1.0×103ppm，[8]7.0×103ppm的培养液1的pH随时间的变化。
由此测定结果可知(1)在0.02×103ppm的培养液1中，pH值在试验后立刻降低，约25小时后降至6.4，且细胞浓度未达到3×1013cell/m3。
(2)在0.07×103ppm的培养液1中，pH值维持在约6.4或6.4以上、约7.0或7.0以下的范围内，且细胞浓度达到3×1013cell/m3。
(3)在0.14×103ppm的培养液1中，pH值维持在约6.4或6.4以上、约7.4或7.4以下的范围内，且细胞浓度超过4×1013cell/m3。
(4)在0.28×103ppm的培养液1中，pH值维持在约6.4或6.4以上、约7.6或7.6以下的范围内，且细胞浓度超过4×1013cell/m3。
(5)在0.56×103ppm的培养液1中，pH值维持在约7.0或7.0以上、约7.6或7.6以下的范围内，且细胞浓度超过4×1013cell/m3。
(6)在1.0×103ppm的培养液1中，pH值维持在约6.4或6.4以上、约7.9或7.9以下的范围内，且细胞浓度超过6×1013cell/m3。
(7)在2.0×103ppm的培养液1中，pH值维持在约7.0或7.0以上、约8.1或8.1以下的范围内，且细胞浓度超过5×1013cell/m3。
(8)在7.0×103ppm的培养液1中，pH值维持在约6.7或6.7以上、约8.1或8.1以下的范围内，且细胞浓度超过3×1013cell/m3。
因此，在调整成具有大于0.02×103ppm的碳酸氢钠质量浓度的培养液1后，用混合了3％二氧化碳的空气对培养液1进行通气搅拌，将培养液的pH设定为6.4或6.4以上，由此使角毛藻的细胞浓度超过现有培养方法的角毛藻细胞浓度的上限值(3×1013cell/m3)。
需要说明的是培养液1的成分与培养液2～6的成分相比，除了P/N及/或Si/N以外，其他成分相同。因此，对于其他培养液而言，同样地调整为具有0.02×103ppm或0.02×103ppm以上的碳酸氢钠质量浓度的培养液1后，用混合了3％二氧化碳的空气对培养液1进行通气搅拌，将培养液1的pH设定为6.4或6.4以上，由此使角毛藻的细胞浓度超过现有培养方法的角毛藻细胞浓度的上限值(3×1013cell/m3)。
由上述4项测定结果可知，使用培养液1～6培养角毛藻时，通过将培养液的pH设定在6.4或6.4以上、8.4或8.4以下的范围内，能够稳定地培养角毛藻。为了满足此条件，例如调制具有高于0.02×103ppm的碳酸氢钠质量浓度的培养液，用混合了3％二氧化碳的空气对培养液进行通气搅拌。
通过将培养液1～6的pH设定为6.4或6.4以上，能够超过现有培养方法的角毛藻细胞浓度的上限值。另外，通过将培养液1～6的pH设定为8.4或8.4以下，能够抑制起因于pH增加而生成的水解物的角毛藻共沉淀的发生，防止角毛藻的增殖降低。
接下来，基于此条件，由实施例1～11寻找稳定且高浓度地培养硅藻的方法。
(实施例1)将培养液1(1.5×10-3m3)加入到图7所示的实验室用扁平培养瓶11(容量1.5×10-3m3)中，在培养液1中添加碳酸氢钠至碳酸氢钠的质量浓度为1.0×103ppm。然后，在培养液1中接种规定量的角毛藻。然后，将培养液的温度维持在约25℃～约35℃，并利用荧光灯等，使具有光量子量约200μmol/m2/s强度的光照射培养液1，在此状态下，经由将瓶11的栓12连通的玻璃管13，将混合了3％二氧化碳的空气送入培养液1中，边对培养液1进行通气搅拌，边进行角毛藻的培养试验。分别测定培养液1中角毛藻细胞浓度的时间变化及pH的时间变化。
(实施例2)将培养液2(1.5×10-3m3)加入到实验室用扁平培养瓶11中，添加碳酸氢钠至碳酸氢钠的质量浓度为1.0×103ppm。然后，在培养液2中接种规定量(与实施例1同量)的角毛藻，在与实施例1大致相同的条件(培养液的温度约25℃～约35℃，光量子量约200μmol/m2/s，由混合了3％二氧化碳的空气进行通气搅拌)下，进行角毛藻的培养试验。分别测定培养液2中角毛藻细胞浓度的时间变化及pH的时间变化。
(实施例3)将培养液3(1.5×10-3m3)加入到实验室用扁平培养瓶11，添加碳酸氢钠至碳酸氢钠的质量浓度为1.0×103ppm。然后，在培养液3中接种规定量(与实施例1同量)的角毛藻，在与实施例1大致相同的条件(培养液温度约25℃～约3 5℃，光量子量约200μmol/m2/s，由混合了3％二氧化碳的空气进行通气搅拌)下，进行角毛藻的培养试验。分别测定培养液3中角毛藻细胞浓度的时间变化及pH的时间变化。
(实施例4)将培养液4(1.5×10-3m3)加入到实验室用扁平培养瓶11中，添加碳酸氢钠至碳酸氢钠的质量浓度为1.0×103ppm。然后，在培养液4中接种规定量(与实施例1同量)的角毛藻，在与实施例1大致相同的条件(培养液温度约25℃～约3 5℃，光量子量约200μmol/m2/s，由混合了3％二氧化碳的空气进行通气搅拌)下，进行角毛藻的培养试验。分别测定培养液4中角毛藻细胞浓度的时间变化及pH的时间变化。
图17为示出实施例1～4中角毛藻细胞浓度时间变化的曲线图。图17所示的C1、C2、C3、C4分别表示培养液1、2、3、4中培养的角毛藻细胞浓度的时间变化。另外，图17所示的A表示在各培养液中补给追肥成分(培养液中含有的氮、磷、硅、维生素类、矿物质类)的时间。
图18为示出实施例1～4中pH时间变化的曲线图。图18所示的D1、D2、D3、D4分别表示培养液1、2、3、4中pH的时间变化。
由此试验结果可知相对于培养液1(P/N＝0.06，Si/N＝0.18)，将硅量设定为2倍的培养液3(P/N＝0.06，Si/N＝0.36)获得比培养液1中角毛藻细胞浓度(约6.0×1013cell/m3)高的细胞浓度(约8.0×1013cell/m3)。
相对于培养液1(P/N＝0.06，Si/N＝0.18)，将磷量及硅量分别设定为2倍的培养液4(P/N＝0.12，Si/N＝0.36)获得比培养液1中角毛藻细胞浓度(约6.0×1013cell/m3)高的细胞浓度(约7.0×1013cell/m3)。
培养液1～4的各pH维持在6.4或6.4以上、8.5或8.5以下的范围，更具体而言，维持在约7.5或7.5以上、约8.5或8.5以下的范围内。
需要说明的是对于实施例4中培养液4的细胞浓度测定而言，培养试验中混合了二氧化碳的空气的供给可能不够充分，与实际情况可能由许多不同之处。
为了研究实施例1～4测定结果的重现性，在与实施例1～4同样的条件下，不补给追肥成分，再分别测定培养液1～4中角毛藻细胞浓度的时间变化及pH的时间变化。
图19为示出重现试验中使用的培养液1～4中角毛藻细胞浓度时间变化的曲线图。图19所示的E1、E2、E3、E4分别表示培养液1、2、3、4中培养的角毛藻细胞浓度的时间变化。
图20为示出重现试验中使用的培养液1～4中pH时间变化的曲线图。图20所示的F1、F2、F3、F4分别表示培养液1、2、3、4中pH的时间变化。
由此试验结果可知相对于培养液1(P/N＝0.06，Si/N＝0.18)，将磷量设定为2倍的培养液3(P/N＝0.12，Si/N＝0.18)获得比培养液1中角毛藻细胞浓度高的细胞浓度。
相对于培养液1(P/N＝0.06，Si/N＝0.18)，将硅量设定为2倍的培养液3(P/N＝0.06，Si/N＝0.36)获得比培养液1中角毛藻细胞浓度高的细胞浓度。
相对于培养液1(P/N＝0.06，Si/N＝0.18)，将磷量及硅量分别设定为2倍的培养液4(P/N＝0.12，Si/N＝0.36)获得比培养液1中角毛藻细胞浓度高的细胞浓度。
培养液4获得比培养液2、3中角毛藻细胞浓度高的细胞浓度。
培养液1～4的各pH维持在6.4或6.4以上、8.5或8.5以下的范围，更具体而言，维持在约7.4或7.4以上、约8.0或8.0以下的范围内。
由上述实施例1～4的结果可以推测如果追肥相对于培养液1含有2倍或2倍以上磷量及/或2倍或2倍以上硅量的培养液，培养角毛藻，则角毛藻的细胞浓度约为6.0×1013cell/m3或6.0×1013cell/m3以上。
为了证实上述推测，追肥相对于培养液1含有2倍磷量的培养液2、相对于培养液1含有2倍磷量及2倍硅量的培养液4、相对于培养液1含有2倍磷量及3倍硅量的培养液5，分别进行角毛藻的培养。
(实施例5)与实施例2同样，将培养液2(1.5×10-3m3)加入到扁平培养瓶11中，添加碳酸氢钠至碳酸氢钠的质量浓度为1.0×103ppm。然后，在培养液2中接种规定量(与实施例2同量)的角毛藻，在与实施例2大致相同的条件(培养液温度约25℃～约35℃，光量子量约200μmol/m2/s，由混合了3％二氧化碳的空气进行通气搅拌)下，进行角毛藻的培养试验。分别测定培养液2中角毛藻细胞浓度的时间变化及pH的时间变化。
(实施例6)与实施例4同样，将培养液4(1.5×10-3m3)加入到扁平培养瓶11中，添加碳酸氢钠至碳酸氢钠的质量浓度为1.0×103ppm。然后，在培养液4中接种规定量(与实施例5同量)的角毛藻，在与实施例5大致相同的条件(培养液温度约25℃～约35℃，光量子量约200μmol/m2/s，由混合了3％二氧化碳的空气进行通气搅拌)下，进行角毛藻的培养试验。分别测定培养液4中角毛藻细胞浓度的时间变化及pH的时间变化。
(实施例7)将培养液5(1.5×10-3m3)加入到扁平培养瓶11，添加碳酸氢钠至碳酸氢钠的质量浓度为1.0×103ppm。然后，在培养液5中接种规定量(与实施例5同量)的角毛藻，在与实施例5大致相同的条件(培养液温度约25℃～约35℃，光量子量约200μmol/m2/s，由混合了3％二氧化碳的空气进行通气搅拌)下，进行角毛藻的培养试验。分别测定培养液5中角毛藻细胞浓度的时间变化及pH的时间变化。
图21为示出实施例5～7中角毛藻细胞浓度时间变化的曲线图。图21所示的G1、G2、G3、G4分别表示培养液2、4、5中培养的角毛藻细胞浓度的时间变化。另外，图21所示的A表示在各培养液中补给追肥成分(培养液中含有的氮、磷、硅、维生素类、矿物质类)的时间。
图22为示出实施例5～7中pH时间变化的曲线图。图22所示的H1、H2、H3分别表示培养液2、4、5中pH的时间变化。另外，图22所示的H4表示实验室内室温的时间变化，H5表示培养液温度的时间变化。
由此测定结果可知相对于培养液2(P/N＝0.12，Si/N＝0.18)，将硅量设定为2倍的培养液4(P/N＝0.12，Si/N＝0.36)获得比培养液2中角毛藻细胞浓度高的细胞浓度(约9.0×1013cell/m3)。
相对于培养液2(P/N＝0.12，Si/N＝0.18)，将硅量设定为3倍的培养液5(P/N＝0.12，Si/N＝0.54)获得比培养液2中角毛藻细胞浓度高的细胞浓度(约9.0×1013cell/m3)。
培养液4中角毛藻的细胞浓度与培养液5中角毛藻的细胞浓度无较大差异。
培养液2、4、5的各pH维持在6.4或6.4以上、8.5或8.5以下的范围，更具体而言，维持在约7.4或7.4以上、约8.2或8.2以下的范围内。
由上述试验结果可以推测如果用相对于培养液2含有2倍或2倍以上的硅量的培养液培养角毛藻，则角毛藻的细胞浓度约为8.0×1013cell/m3或8.0×1013cell/m3以上。
为了证实上述推测，除了培养液2、4、5之外，使用培养液6，在与实施例5相同的条件下，再次进行培养试验，分别测定培养液2、4、5、6中角毛藻细胞浓度的时间变化及pH的时间变化。
图23为示出再培养试验中角毛藻细胞浓度时间变化的曲线图。图23所示的I1、I2、I3、I4分别表示培养液2、4、5、6中培养的角毛藻细胞浓度的时间变化。
图24为示出再培养试验中pH时间变化的曲线图。图24所示的J1、J2、J3、J4分别表示培养液2、4、5、6的pH。另外，图24所示的J5表示实验室内室温的时间变化，J6表示培养液温度的时间变化。
由此试验结果可知相对于培养液2(P/N＝0.12，Si/N＝0.18)，将硅量设定为2倍的培养液4(Si/N＝0.36)获得比培养液2中角毛藻细胞浓度高的细胞浓度(约1.0×1014cell/m3)。
相对于培养液2(P/N＝0.12，Si/N＝0.18)，将硅量设定为3倍的培养液5(Si/N＝0.54)获得比培养液2中角毛藻细胞浓度高的细胞浓度(约9.0×1013cell/m3)。
相对于培养液2(P/N＝0.12，Si/N＝0.18)，将硅量设定为4倍的培养液6(Si/N＝0.72)获得比培养液2中角毛藻细胞浓度高的细胞浓度(约1.0×1014cell/m3)。
培养液4中角毛藻细胞浓度与培养液5、6中角毛藻细胞浓度无较大差异。
培养液2、4、5、6的各pH维持在6.4或6.4以上、8.5或8.5以下的范围，更具体而言，维持在约7.3或7.3以上、约8.1或8.1以下的范围内。
由上述实施例5～7的试验结果可知，通过使用培养液4～6中的1种培养液培养角毛藻，角毛藻的细胞浓度增至约为8.0×1013cell/m3或8.0×1013cell/m3以上。换言之，通过使用P/N为0.12或0.12以上、及Si/N为0.36或0.36以上值的培养液培养角毛藻，角毛藻的细胞浓度增至约为8.0×1013cell/m3或8.0×1013cell/m3以上。
接下来，为了研究在连续培养时，培养条件(P/N≥0.12，及Si/N≥0.36)是否在室内及室外均成立，使用培养液4及培养液6，实施基于实施例8～10的试验。
(实施例8)将具有氮(166ppm)、磷(20ppm)、硅(60ppm)的培养液4(1.5×10-3m3)加入到实验室用扁平培养瓶11，添加碳酸氢钠至碳酸氢钠的质量浓度为1.0×103ppm。然后，在培养液4中接种规定量的角毛藻，在与实施例1大致相同的条件(培养液温度约25℃～约35℃，光量子量约200μmol/m2/s，由混合了3％二氧化碳的空气进行通气搅拌)下，进行角毛藻的培养试验。分别测定培养液4中角毛藻细胞浓度的时间变化及pH的时间变化。
在测定过程中，如果角毛藻的细胞浓度达到6.0×1013cell/m3或6.0×1013cell/m3以上，则从培养液4中取出约占总量2/3的溶液。然后，准备从培养液4中取出量的溶解了海洋生物的人工海水。通过在此人工海水中溶解含有氮、磷、硅、维生素类等的追肥成分，制成追肥用培养液。将此追肥用培养液补给入扁平培养瓶11内的培养液4中。将此称为半分批连续培养。
在半分批连续培养中，分别测定从培养液4中取出约占总量2/3的溶液后，在培养液4中补给追肥用培养液的前培养液4(以下简称为追肥前培养液4a)的氮量、磷量及硅量。然后，分别求出追肥前培养液4a中所含氮量、磷量及硅量与接种角毛藻前培养液(初期培养液)4中所含氮量、磷量及硅量的差。需要说明的是初期培养液4中氮量、磷量、磷量分别为166ppm、20ppm、60ppm。
基于氮量、磷量及硅量的差，在追肥前培养液4a中补给调整了追肥成分的氮量、磷量及硅量的追肥用培养液，以使追肥前培养液4a中的P/N及Si/N分别与初期培养液4中的P/N(＝0.12)及Si/N(＝0.36)一致。通过这一操作，使培养液4中的P/N及Si/N分别在补给前后保持为一定(参照图25)。
边重复半分批连续培养，边分别测定培养液4中角毛藻细胞浓度的时间变化、pH的时间变化，求出每1×104个角毛藻细胞的氮消费量、磷消费量及硅消费量。
(实施例9)将含有氮(166ppm)、磷(20ppm)、硅(120ppm)的培养液6(1.5×10-3m3)加入到实验室用扁平培养瓶11，添加碳酸氢钠至碳酸氢钠的质量浓度为1.0×103ppm。然后，在培养液6中接种规定量(与实施例8同量)的角毛藻，在与实施例8大致相同的条件(培养液温度约25℃～约35℃，光量子量约200μmol/m2/s，由混合了3％二氧化碳的空气进行通气搅拌)下，进行角毛藻的培养试验(半分批培养连续培养试验)。分别测定培养液6中角毛藻细胞浓度的时间变化及pH的时间变化，求出每1×104个角毛藻细胞的氮消费量、磷消费量及硅消费量。
图26为示出实施例8及9中角毛藻细胞浓度时间变化的曲线图。图26所示的K1、K2分别表示培养液4、6中培养的角毛藻的细胞浓度。图26所示的A1表示在各培养液中最初补给追肥成分(氮、磷、硅、维生素类、矿物质类)的时间。此时，由于角毛藻的细胞浓度未达到6.0×1013cell/m3，因此不从各培养液中取出约占总量2/3的溶液。图26所示的A2～7分别表示角毛藻的细胞浓度超过6.0×1013cell/m3时从各培养液中取出约占总量2/3的溶液，在各培养液中补给追肥用培养液的时间。
图27为示出实施例8及9中pH时间变化的曲线图。图27所示的L1、L2分别表示培养液4、6中的pH。
按下式分别求出培养液4、6中各补给时间的角毛藻的氮消费量、角毛藻的氮总消费量及每单位细胞的角毛藻氮总消费量。
NCOMA1＝NFIR-NREMA1NCOMA2＝NFIR+NADDA1-NREMA2NCOMA3＝NREMA2+NADDA2-NREMA3NCOMA4＝NREMA3+NADDA3-NREMA4NCOMA5＝NREMA4+NADDA4-NREMA5NCOMA6＝NREMA5+NADDA5-NREMA6NCOMA7＝NREMA6+NADDA6-NREMA7
NALL＝∑1≤i≤7(NCOMAi/CELLAi)此处，NCOMAi，NFIR，NREMAi，NADDAi，NCOMUNIT，CELLAi，NALL分别表示下述量。NCOMAi表示在补给时间A(i～1)～Ai之间由角毛藻消费的氮量(ppm)。NFIR表示初期培养液中的氮量(ppm)。NREMAi表示补给时间Ai时培养液中残留的氮量(ppm)。NADDAi表示补给时间Ai时补给的追肥用培养液中所含氮量(ppm)。NALL表示由每单位细胞的角毛藻消费的总氮量(ppm)。CELLAi表示补给时间Ai内角毛藻的单位细胞数，单位细胞数由补给时间Ai内角毛藻的细胞浓度求出。
由同样的计算式求出培养液4、6中由每单元细胞的角毛藻消费的磷总消费量PALL及硅总消费量SiALL。
图28表示实施例8及9中初期培养液中所含氮的质量浓度、磷的质量浓度、硅的质量浓度、P/N、Si/N。而且，图28表示由实施例8中每1.0×104个角毛藻细胞消费的氮总消费量(ppm)、磷总消费量(ppm)及硅总消费量(ppm)求出的磷总消费量与氮总消费量的比(PALL/NALL)及硅总消费量与氮总消费量的比(SiALL/NALL)。需要说明的是实施例9也示出同样的结果。
由此测定结果可知在约6.0×1013cell/m3附近能够稳定地连续培养角毛藻。
培养液4、6的pH维持在6.4或6.4以上、8.5或8.5以下的范围内，更具体而言，维持在7.5或7.5以上、8.5或8.5以下的范围内。
PALL/NALL及SiALL/NALL为与初期培养液4的P/N及Si/N近似的值。另外，PALL/NALL为与初期培养液6的P/N近似的值，SiALL/NALL为小于初期培养液6的Si/N的值。从而，如果将培养液4或6放入实验室用培养瓶11中培养角毛藻，则能够高浓度地连续稳定地培养角毛藻。而且，培养液4的情况下，可以不添加过剩的硅而按最适的成分比进行培养。
(实施例10)将具有氮(166ppm)、磷(20ppm)、硅(60ppm)的培养液4(65×10-3m3)放入设置在室外的密闭反应器中，添加碳酸氢钠至碳酸氢钠的质量浓度为1.0×103ppm。然后，在培养液4中接种规定量的角毛藻。接下来，在将培养液温度维持在约15℃～约35℃的范围，优选维持在25℃，且用自然的太阳光(光量子量约0μmol/m2/s～1200μmol/m2/s)照射培养液4的条件下，将混合了3％二氧化碳的空气送入反应器中，边对培养液4进行通气搅拌，边进行角毛藻的培养试验。分别测定室外的培养液4中角毛藻细胞浓度的时间变化及pH的时间变化。
在测定过程中，如果角毛藻的细胞浓度达到约5.0×1013cell/m3或5.0×1013cell/m3以上，则从培养液4中取出约占总量一半(33×10-3m3)的溶液。然后，准备从培养液4中取出量的溶解了海洋生物的人工海水。通过在此人工海水中溶解含有氮、磷、硅、维生素类等追肥成分，制成追肥用培养液。将此追肥用培养液补给入反应器内的培养液4中，进行半分批连续培养。
在半分批连续培养中，分别测定从培养液4中取出约占总量一半的溶液后，追肥前培养液4a的氮量、磷量及硅量。然后，分别求出追肥前培养液4a中所含氮量、磷量及硅量与初期培养液4中所含氮量、磷量及硅量的差。需要说明的是初期培养液4中氮量、磷量、硅量分别为166ppm、20ppm、60ppm。
基于氮量、磷量及硅量的差，在追肥前培养液4a中补给调整了追肥成分的氮量、磷量及硅量的追肥用培养液，以使追肥前培养液4a中的P/N及Si/N分别与初期培养液4中的P/N(＝0.12)及Si/N(＝0.36)一致。通过这一操作，使培养液4中的P/N及Si/N分别在补给前后保持为一定。
边重复半分批连续培养，边分别测定培养液4中角毛藻细胞浓度的时间变化、pH的时间变化，求出每1×104个角毛藻细胞的氮消费量、磷消费量及硅消费量。
图29为示出实施例10中角毛藻细胞浓度时间变化的曲线图。图29所示的A11表示在各培养液中最初补给追肥成分的时间。此时，由于角毛藻的细胞浓度未达到5.0×1013cell/m3，因此不从培养液4中取出约占总量一半的溶液。图29所示的A12～A17分别表示角毛藻的细胞浓度超过5.0×1013cell/m3时从培养液4中取出约占总量一半的溶液，在培养液4中补给追肥用培养液的时间。图30为示出实施例10中pH的时间变化的曲线图。
实施例10中，由与实施例8同样的计算式求出培养液4中每单位细胞(例如1.0×104cell)的角毛藻消费的氮总消费量(NALL)、磷总消费量(PALL)及硅总消费量(SiALL)。
图31表示实施例10中初期培养液中所含氮的质量浓度、磷的质量浓度、硅的质量浓度、P/N、Si/N。而且，图31表示由实施例10中每1.0×104细胞个角毛藻消费的氮总消费量(ppm)、磷总消费量(ppm)及硅总消费量(ppm)求出的磷总消费量与氮总消费量的比(PALL/NALL)及硅总消费量与氮总消费量的比(SiALL/NALL)。
由此测定结果可知在约5.0×1013cell/m3附近能够稳定地连续培养角毛藻。
培养液4的pH维持在6.4或6.4以上、8.5或8.5以下的范围内，更具体而言，维持在7.4或7.4以上、8.2或8.2以下的范围内。
PALL/NALL及SiALL/NALL为与初期培养液4的P/N及Si/N近似的值。从而，如果将培养液4放入室外用的密闭反应器中培养角毛藻，则能够高细胞浓度地连续稳定地培养角毛藻。
由上述实施例8～10的试验结果可知，在连续培养时，培养条件(P/N≥0.12，Si/N≥0.36)在室内及室外均成立。从而，与现有的培养方法相比，即使连续培养时，也能够高细胞浓度(室内约为6.0×1013cell/m3，室外约为5.0×1013cell/m3)地连续稳定地培养角毛藻。另外，无论室内或室外，培养液4的pH均维持在6.4或6.4以上、8.5或8.5以下的范围内。
需要说明的是由于角毛藻对氮及硅的摄入速度慢，因此在实施例8～10中，培养液4、6的初期浓度测定不限定为角毛藻接种前，例如也可以在刚进行过角毛藻接种后(参照图32)或接种半日后进行。
另外，实施例8～10中，以实际用于培养角毛藻的试验用培养液为对象，按实际时间测定氮消费量、磷消费量、硅消费量，但是也可以以具有与试验用培养液相同成分组成的消费量测定用培养液为对象，接种角毛藻，预先测定氮消费量、磷消费量、硅消费量。
其原因如下。就每单位细胞的角毛藻在每单位时间消费的氮量(NCOM)、磷量(PCOM)、硅量(SiCOM)而言，由此次试验及解析可知实际培养试验中PCOM/NCOM及SiCO/NCOM的值经常保持为一定。从而通过由消费量测定用培养液预先测定氮消费量、磷消费量、硅消费量，求出所培养硅藻的PALL/NALL及SiALL/NALL，即使在培养试验的补给时间不测定试验用培养液的氮消费量、磷消费量、硅消费量，只要补给分别调整了P/N及Si/N的追肥用培养液，以使其与预先求出的PALL/NALL及SiALL/NALL一致，就可以简化培养步骤，按最适量的培养液组成进行追肥。
例如，由于在培养液中接种的角毛藻量等于实施例10中培养液4中接种量的情况下，PALL/NALL、SiALL/NALL的值分别等于0.143、0.402(参照图27)，因此追肥用培养液的P/N及Si/N值分别等于0.143、0.402。
另外，在实施例8～10中，角毛藻的细胞浓度超过约6.0×1013cell/m3时，将追肥用培养液补给入培养液4，但不限定于此，可以任意设定角毛藻的细胞浓度。
本发明培养方法的优点如下所述由于每单位容积角毛藻的培养量增加，因此与现有的培养方法相比，作业量、培养间隔、保管间隔及运输成本减少。例如，对于作业量的减少而言，在具有以角毛藻为饵料的水产种苗的水槽中投入角毛藻培养液的量减少。
培养开始时，由于通过改变角毛藻的接种量，能够调整培养开始时的细胞浓度，因此能够预测到达规定量的细胞浓度所需的时间。
上述本实施方案中，接种在培养液中的硅藻为角毛藻，但并不限定于此，也可以是分类为其他属的硅藻。
例如，培养分类为褐指藻(Phaeodactylum)属的硅藻(以下称为褐指藻)时，准备具有图34所示成分组成的培养液10。需要说明的是培养液10的成分与培养液4相同，P/N＝0.12，Si/N＝0.36。另外，培养液11的成分组成为褐指藻培养中使用的公知培养液的成分组成，P/N＝1.29，Si/N＝0(即不添加硅)。
(实施例11)将培养液10(1.5×10-3m3)放入实验室用扁平培养瓶11(容量1.5×10-3m3)，添加碳酸氢钠至碳酸氢钠的质量浓度为1.0×103ppm。然后，在培养液10中接种规定量的褐指藻，在与实施例1大致相同的条件(培养液温度约25℃～约35℃，光量子量约200μmol/m2/s，由混合了3％二氧化碳的空气进行通气搅拌)下，培养褐指藻。分别测定培养液10中褐指藻细胞浓度的时间变化及pH的时间变化。
(比较例)将培养液11(1.5×10-3m3)加入到扁平培养瓶11中，添加碳酸氢钠至碳酸氢钠的质量浓度为1.0×103ppm。然后，在培养液11中接种与实施例11同量的褐指藻。接下来，在与实施例1大致相同的条件(培养液温度约25℃～约35℃，光量子量约200μmol/m2/s，由混合了3％二氧化碳的空气进行通气搅拌)下，培养褐指藻。分别测定培养液11中褐指藻细胞浓度的时间变化及pH的时间变化。
图35为示出实施例11及比较例中褐指藻细胞浓度时间变化的曲线图。图35所示的M1、M2分别表示培养液10、11中培养的褐指藻细胞浓度。
图36为示出实施例11及比较例中pH时间变化的曲线图。图36所示的N1、N2分别表示培养液10、11中的pH。
由此试验结果可知培养液10中褐指藻的细胞浓度超过约1.2×1014cell/m3。比较例中褐指藻的细胞浓度未达到约4.0×1013cell/m3。
培养液10中的pH维持在6.4或6.4以上、8.5或8.5以下的范围，比较例中的pH维持在约6.4或6.4以上、约8.5或8.5以下的范围内。
由上述实施例11的试验结果可知，通过使用培养液10培养褐指藻，与现有的培养液11相比，能够高细胞浓度且稳定地培养褐指藻。
从而，与角毛藻的情况相同，与现有的培养方法相比，可以降低作业量、培养空间、保管空间及运输成本。
需要说明的是在实施例1～11中，作为培养液的pH调节剂，添加碳酸氢钠。但是，除了碳酸氢钠之外，也可以添加含有钠以外的1价碱金属[Li(锂)，K(钾)，Rb(铷)，Cs(铯)等]的碳酸氢盐，以使培养液中含有碳酸氢盐。另外，作为pH调节剂，也可以添加2价碱金属，以使培养液中含有碱金属的碳酸氢盐。
另外，在实施例1～11中，作为通气搅拌培养液的气体，使用混合了3％二氧化碳的空气，但是只要是培养液内生命维持所必需的成分，也可以为添加了规定量的氧、二氧化碳等成分的气体。
而且，在本实施方案中，分别调制培养硅藻的培养液中的P/N及Si/N，但是本发明并不限定于此构成，只要至少调节Si/N就可以。
本发明并不限定于上述实施方案及实施例，在不脱离本发明主旨的范围内，可以进行适当修改后实施。
权利要求
1.一种含有硅藻的液体，是用于培养硅藻的液体，其特征在于，所述液体含有硅藻、硅及氮，硅/氮(所述硅和所述氮的质量浓度比)设定为大于0.18的值。
2.如权利要求1所述的含有硅藻的液体，其特征在于，所述液体的pH为6.4或6.4以上。
3.如权利要求1所述的含有硅藻的液体，其特征在于，所述液体含有碳酸氢盐。
4.如权利要求1所述的含有硅藻的液体，其特征在于，将接种所述硅藻前的溶液中的硅/氮决定为与预先测定的所述硅藻的硅消费量及氮消费量的比例大致为一致。
5.如权利要求1所述的含有硅藻的液体，其特征在于，所培养的硅藻细胞浓度为4.0×1013cell/m3或4.0×1013cell/m3以上。
6.如权利要求1所述的含有硅藻的液体，其特征在于，所述硅藻分类为角毛藻属。
7.如权利要求1所述的含有硅藻的液体，其特征在于，所述硅藻分类为褐指藻(Phaeodactylum)属。
8.一种含有硅藻的液体，是用于培养硅藻的液体，其特征在于，所述液体含有硅藻、磷、硅及氮，磷/氮(所述磷和所述氮的质量浓度比)、及硅/氮(所述硅和所述氮的质量浓度比)设定为0.1或0.1以上的值。
9.如权利要求8所述的含有硅藻的液体，其特征在于，所述液体的pH为6.4或6.4以上。
10.如权利要求8所述的含有硅藻的液体，其特征在于，所述液体含有碳酸氢盐。
11.如权利要求8所述的含有硅藻的液体，其特征在于，将接种所述硅藻前的溶液中的硅/氮决定为与预先测定的所述硅藻的硅消费量及氮消费量的比例大致为一致。
12.如权利要求8所述的含有硅藻的液体，其特征在于，将接种所述硅藻前的溶液中的磷/氮决定为与预先测定的所述硅藻的磷消费量及氮消费量的比例大致为一致。
13.如权利要求8所述的含有硅藻的液体，其特征在于，所培养的硅藻细胞浓度为4.0×1013cell/m3或4.0×1013cell/m3以上。
14.如权利要求8所述的含有硅藻的液体，其特征在于，所述硅藻分类为角毛藻属。
15.如权利要求8所述的含有硅藻的液体，其特征在于，所述硅藻分类为褐指藻(Phaeodactylum)属。
16.一种含有硅藻的液体，是用于培养硅藻的液体，其特征在于，所述液体含有硅藻、磷、硅及氮，pH为6.4或6.4以上、8.4或8.4以下。
17.如权利要求16所述的含有硅藻的液体，其特征在于，磷/氮(所述磷与所述氮的质量浓度比)设定为0.06或0.06以上，硅/氮(所述硅与所述氮的质量浓度比)设定为0.18或0.18以上。
18.如权利要求16所述的含有硅藻的液体，其特征在于，所述液体含有碳酸氢盐。
19.如权利要求16所述的含有硅藻的液体，其特征在于，将接种所述硅藻前的溶液中的硅/氮决定为与预先测定的所述硅藻的硅消费量及氮消费量的比例大致为一致。
20.如权利要求16所述的含有硅藻的液体，其特征在于，将接种所述硅藻前的溶液中的磷/氮决定为与预先测定的所述硅藻的磷消费量及氮消费量的比例大致为一致。
21.如权利要求16所述的含有硅藻的液体，其特征在于，所述硅藻分类为角毛藻属。
22.如权利要求16所述的含有硅藻的液体，其特征在于，所述硅藻分类为褐指藻(Phaeodactylum)属。
23.一种硅藻，其特征在于，所述硅藻在下述液体中培养而成，所述液体含有硅及氮，且硅/氮(所述硅与所述氮的质量浓度比)设定为超过0.18的值。
24.一种硅藻，其特征在于，所述硅藻在下述液体中培养而成，所述液体含有磷、氮及硅，且磷/氮(所述磷与所述氮的质量浓度比)及硅/氮(所述硅与所述氮的质量浓度比)分别设定为0.1或0.1以上的值。
25.一种硅藻，其特征在于，所述硅藻在下述液体中培养而成，所述液体含有磷、氮及硅，且pH设定在6.4或6.4以上、8.4或8.4以下的范围内。
26.一种硅藻的培养方法，是使用含有氮及硅的硅藻培养液培养硅藻的硅藻培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤分别测定所述液体中所含氮的初期浓度及硅的初期浓度的事前测定步骤；在所述液体中接种所述硅藻的接种步骤；分别测定所述氮的补给前浓度及所述硅的补给前浓度的补给前测定步骤；分别求出氮浓度差(所述氮的初期浓度与补给前浓度的差)和硅浓度差(所述硅的初期浓度与补给前浓度的差)的浓度差测定步骤；基于所述氮浓度差和所述硅浓度差，分别决定在所述液体中补给的氮量及硅量，并将其补给入所述液体中，以使其与所述氮的初期浓度和所述硅的初期浓度的比例一致的补给步骤。
27.一种硅藻的培养方法，是使用含有氮及硅的硅藻培养液培养硅藻的硅藻培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤分别测定所述氮的补给前浓度及所述硅的补给前浓度的补给前测定步骤；分别求出氮浓度差(所述氮的规定浓度与补给前浓度的差)和硅浓度差(所述硅的规定浓度与补给前浓度的差)的浓度差测定步骤；基于所述氮浓度差和所述硅浓度差，分别决定在所述液体中补给的氮量及硅量，并将其补给入所述液体中，以使其与所述氮的规定浓度和所述硅的规定浓度的比例一致的补给步骤。
28.如权利要求27所述的硅藻培养方法，其特征在于，所述液体还含有磷；在补给前测定步骤中，测定所述磷的补给前浓度；在浓度差测定步骤中，求出磷浓度差(所述磷的规定浓度与补给前浓度的差)；在补给步骤，基于所述磷浓度差，决定在所述液体中补给的磷量，并将其补给入所述液体中，以使其与所述氮的规定浓度和所述磷的规定浓度的比例一致，。
29.如权利要求27所述的硅藻培养方法，其特征在于，所述硅藻的培养边向所述液体内通入气体边进行。
30.如权利要求27所述的硅藻培养方法，其特征在于，将接种所述硅藻前的溶液中的硅/氮决定为与预先测定的所述硅藻的硅消费量及氮消费量的比例大致为一致。
31.如权利要求28所述的硅藻培养方法，其特征在于，将接种所述硅藻前的溶液中的磷/氮决定为与预先测定的所述硅藻的磷消费量及氮消费量的比例大致为一致。
32.一种硅藻的培养方法，是使用含有氮及硅的硅藻培养液培养硅藻的硅藻培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤测定在接种了所述硅藻的液体中所含氮的初期浓度及硅的初期浓度的事前测定步骤；分别测定所述氮的补给前浓度及所述硅的补给前浓度的补给前测定步骤；分别求出氮浓度差(所述氮的初期浓度与补给前浓度的差)和硅浓度差(所述硅的初期浓度与补给前浓度的差)的浓度差测定步骤；基于所述氮浓度差和所述硅浓度差，分别决定在所述液体中补给的氮量及硅量，并将其补给入所述液体中，以使其与所述氮的初期浓度和所述硅的初期浓度的比例一致的补给步骤。
33.如权利要求32所述的硅藻培养方法，其特征在于，所述液体还含有磷；在事前测定步骤中，测定所述磷的初期浓度；在补给前测定步骤中，测定所述磷的补给前浓度；在浓度差测定步骤中，求出磷浓度差(所述磷的初期浓度与补给前浓度的差)；在补给步骤中，基于所述磷浓度差，决定在所述液体中补给的磷量，并将其补给入所述液体中，以使其与所述氮的规定浓度和所述磷的规定浓度的比例一致。
34.如权利要求32所述的硅藻培养方法，其特征在于，所述硅藻的培养边向所述液体内通入气体边进行。
35.如权利要求32所述的硅藻培养方法，其特征在于，将接种所述硅藻前的溶液中的硅/氮决定为与预先测定的所述硅藻的硅消费量及氮消费量的比例大致为一致。
36.如权利要求33所述的硅藻培养方法，其特征在于，将接种所述硅藻前的溶液中的磷/氮决定为与预先测定的所述硅藻的磷消费量及氮消费量的比例大致为一致。
37.一种硅藻的培养方法，是使用含有氮及硅的硅藻培养液培养硅藻的硅藻培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤在接种了所述硅藻的消费量测定用液体中，分别测定所述硅藻消费的氮消费量及硅消费量的事前测定步骤；在所述液体中接种所述硅藻的接种步骤；测定所述硅藻的细胞浓度的测定步骤；所述细胞浓度超过规定量的情况下，调制追肥用液体以使氮及硅的比例与所述氮的消费量和所述硅的消费量的比例一致的调制步骤；将调制的所述追肥用液体补给入所述培养液中的补给步骤。
38.如权利要求37所述的硅藻培养方法，其特征在于，所述培养液还含有磷；在事前测定步骤中，测定所述消费量测定用液体中由所述硅藻消费的磷消费量；在调制步骤中，调制追肥用液体，以使氮及硅的比例与所述氮的消费量和所述磷的消费量的比例一致。
39.如权利要求37所述的硅藻培养方法，其特征在于，所述硅藻的培养边向所述液体内通入气体边进行。
40.如权利要求37所述的硅藻培养方法，其特征在于，将接种所述硅藻前的溶液中的硅/氮决定为与预先测定的所述硅藻的硅消费量及氮消费量的比例大致为一致。
41.如权利要求38所述的硅藻培养方法，其特征在于，将接种所述硅藻前的溶液中的磷/氮决定为与预先测定的所述硅藻的磷消费量及氮消费量的比例大致为一致。
全文摘要
在含有氮、硅及磷的培养液中，将硅/氮(硅及氮的质量浓度比)设定为0.06或0.06以上的值，磷/氮(磷与氮的质量浓度比)设定为0.18或0.18以上的值，培养液的pH设定在6.4或6.4以上、8.4或8.4以下的范围内。由此，使角毛藻的细胞浓度超过现有培养方法的细胞浓度上限值(3×10
文档编号C12N1/12GK1504109SQ200310120738
公开日2004年6月16日 申请日期2003年11月28日 优先权日2002年11月28日
发明者近藤裕, 山内一郎, 富田富士彦, 柏仓真, 山下卓, 铃木顺子, 士彦, 子, 郎 申请人:雅马哈发动机株式会社, 日清奥利友株式会社