D-氨基酸抑制香蕉细菌性软腐病菌生物膜及其培养基的制作方法
【专利摘要】本发明属于农作物病害防治领域，公开了一种D-氨基酸在抑制香蕉细菌性软腐病菌细菌生物膜中的应用及其培养基。本发明筛选的D-氨基酸可显著有效抑制香蕉细菌性软腐病菌的细菌生物膜的生长。本发明筛选获得4种可显著抑制细菌性软腐病菌的细菌生物膜生长的D-氨基酸，D-酪氨酸、D-缬氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸；并获得其最低抑制浓度。本发明还提供了上述4种D-氨基酸的混配配方，大大降低了各种D-氨基酸的使用浓度。本发明还提供了一种用于上述应用的D-氨基酸培养基。基于本发明的内容可为开发细菌性软腐病菌的防治新技术提供新的方法及思路；结合D-氨基酸使用，提高化学农药、生物农药等防治方法的使用效果。
【专利说明】D-氨基酸抑制香蕉细菌性软腐病菌生物膜及其培养基
【技术领域】
[0001] 本发明属于农作物病害防治领域，特别涉及一种D-氨基酸在抑制香蕉细菌性软 腐病菌细菌生物膜中的应用及其培养基。
【背景技术】
[0002] 香蕉主要生长在热带、亚热带地区，已至少有107个国家生产香蕉；2013年，香 蕉是产值全球第四大的食用植物，仅次于米、麦及玉米，近10年全世界香蕉种植面积呈增 长的趋势。然而，该作物现已受到香蕉细菌性软腐病的严重危害；从本研宄组首次报道的 Dickeya sp.引起的香蕉细菌性软腐病在中国大陆的发生（Lin et al，2010)起，细菌性软 腐病的扩展蔓延速度迅速，在广东香蕉主要产区及海南、广西、福建等香蕉产区均发现该病 害的发生。该病害田间发病率20%?30%，严重可达100%以上，并造成整株死亡，已严重 危害香蕉产业。综合生化特征、保守基因序列等，该病原菌被鉴定为Dickeya zeae (Zhang et al，2010)〇
[0003] 细菌为适应生存环境而吸附着于生物或非生物材料表面会形成膜样多细菌复合 体，即细菌生物膜（Bacterial biofilm，BBF) (Stoodley et al，2002)。生物膜状态的细 菌比浮游状态下的细菌具有更强的耐药性、毒力和对抗宿主免疫防御的能力，能在宿主抑 菌成分中生存，细菌生物膜已成为病原细菌的重要致病因子（Morris and Monier，2003)， 并在植物与病原物互作的动态过程中发挥作用（Danhom and Fuqua, 2007)。细菌生物 膜是铜绿假单胞菌侵染多种寄主的关键因子，扫描电镜观察发现它在寄主植物组织中 形成了细菌生物膜（Tan et al, 1999);引起葡萄皮尔氏病的苛养木杆菌在木质部可形 成细菌生物膜并阻塞导管，使植物失水和养分运输受阻而表现出症状（Guilhabert and Kirkpatrick，2005);同时，植物保护同样面临细菌生物膜的抗药性增加的难题。由于细菌 生物膜胞外物质的屏障作用、细菌密度以及通过降低细胞膜的通透性等，减少抑菌药物进 入细胞内及增强细胞内的药物外排，使得细菌在生物膜状态有着比浮游态高出千百倍的抗 药性。因此，针对植物病原细菌，与细菌生物膜的抑制因子筛选相关的研宄可为植物保护技 术的开发提供新思路，对于防控细菌性植物病害也具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供D-氨基酸在 抑制香蕉细菌性软腐病菌细菌生物膜中的应用。本发明提供的D-氨基酸对香蕉细菌性软 腐病菌的细菌生物膜具有显著的抑制作用。
[0005] 本发明另一目的在于提供一种用于上述应用的D-氨基酸培养基。
[0006] 本发明的目的通过下述方案实现：
[0007] D-氨基酸在抑制香蕉细菌性软腐病菌（Dickeya zeae)细菌生物膜中的应用，所 述的D-氨基酸为D-酪氨酸、D-色氨酸、D-缬氨酸和D-蛋氨酸中的至少一种。
[0008] 为了进一步更好地实现本发明，单独使用所述D-酪氨酸时，其有效抑制浓度为 420 μΜοΙ/L ；
[0009] 为了进一步更好地实现本发明，单独使用所述D-色氨酸时，其有效抑制浓度为 5mMol/L ；
[0010] 为了进一步更好地实现本发明，单独使用所述D-缬氨酸时，其有效抑制浓度为 llmMol/L ；
[0011] 为了进一步更好地实现本发明，单独使用所述D-蛋氨酸时，其有效抑制浓度为 15mMol/L〇
[0012] 本发明优选混合使用两种、三种或四种上述D-氨基酸，混合搭配使用上述D-氨基 酸，相互间具有协效作用，可有效减少各种D-氨基酸的用量。
[0013] 更优选地，所述应用中四种D-氨基酸搭配使用时的用量可为120 μ Mol/L的D-酪 氨酸、5mMol/L的D-缬氨酸、7mMol/L的D-蛋氨酸、0. 5mMol/L的色氨酸；
[0014] 或所述应用中四种D-氨基酸搭配使用时的用量可为160 μΜοΙ/L的D-酪氨酸、 3mMol/L的D-缴氨酸、5mMol/L的D-蛋氨酸、0. 5mMol/L的色氨酸；
[0015] 或所述应用中四种D-氨基酸搭配使用时的用量可为120 μΜοΙ/L的D-酪氨酸、 3mMol/L的D-缬氨酸、5mMol/L的D-蛋氨酸、3mMol/L的色氨酸；
[0016] 或所述应用中四种D-氨基酸搭配使用时的用量可为320 μΜοΙ/L的D-酪氨酸、 3mMol/L的D-缬氨酸、3mMol/L的D-蛋氨酸、3mMol/L的色氨酸。
[0017] 上述将D-氨基酸应用于抑制香蕉细菌性软腐病菌细菌生物膜中，可显著抑制细 菌生物膜生长，为开发细菌性软腐病菌的防治新技术提供新的方法及思路
[0018] 本发明还提供了一种用于上述D-氨基酸培养基在抑制香蕉细菌性软腐病菌细菌 生物膜中是应用的D-氨基酸培养基，为在本领域常用的液体培养基中添加有D-氨基酸得 到的培养基，如NA液体培养基等。所述的D-氨基酸为D-酪氨酸、D-色氨酸、D-缬氨酸和 D-蛋氨酸中的至少一种。
[0019] 为了进一步更好地实现本发明，所述的D-氨基酸培养基中优选添加上述四种 D-氨基酸。
[0020] 更优选地，所述的D-氨基酸培养基中四种D-氨基酸的含量为120 μ Mol/L的D-酪 氨酸、5mMol/L的D-缬氨酸、7mMol/L的D-蛋氨酸、0. 5mMol/L的色氨酸；
[0021] 或所述的D-氨基酸培养基中四种D-氨基酸的含量为160 μ Mol/L的D-酪氨酸、 3mMol/L的D-缴氨酸、5mMol/L的D-蛋氨酸、0. 5mMol/L的色氨酸；
[0022] 或所述的D-氨基酸培养基中四种D-氨基酸的含量为120 μ Mol/L的D-酪氨酸、 3mMol/L的D-缬氨酸、5mMol/L的D-蛋氨酸、3mMol/L的色氨酸；
[0023] 或所述的D-氨基酸培养基中四种D-氨基酸的含量为320 μ Mol/L的D-酪氨酸、 3mMol/L的D-缬氨酸、3mMol/L的D-蛋氨酸、3mMol/L的色氨酸。
[0024] 本发明提供的D-氨基酸培养基可显著抑制香蕉细菌性软腐病菌细菌生物膜的生 长，为开发香蕉细菌性软腐病菌的防治新技术提供新的方法及思路；结合D-氨基酸使用， 提高化学农药、生物农药等防治方法的使用效果，开发新型的高效、低毒、环保农药。
[0025] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
[0026] 本发明筛选的D-氨基酸可显著有效抑制香蕉细菌性软腐病菌的细菌生物膜的生 长。本发明通过筛选获得4种可显著抑制细菌性软腐病菌的细菌生物膜生长的D-氨基酸， D-酪氨酸、D-缬氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸；并筛选获得它们各自的最低抑制浓度。同时， 本发明也通过结晶紫染色及激光共聚焦显微镜明确D-氨基酸抑制香蕉细菌性软腐病菌的 显著效果及细胞学特征。本发明还提供了上述4种D-氨基酸的混配配方，大大降低了各种 D-氨基酸的使用浓度，并可同样显著抑制细菌生物膜的生长。本发明还提供了一种用于上 述应用的D-氨基酸培养基。基于本发明的内容可为开发细菌性软腐病菌的防治新技术提 供新的方法及思路；结合D-氨基酸使用，提高化学农药、生物农药等防治方法的使用效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1为Dickeya zeae MSl的细菌生物膜生物量相对定量，其中，D. zeae biofilms、 D. zeae planktonic分别表示细菌生物膜及浮游细菌的相对定量。
[0028] 图2为Dickeya zeae MSl细菌生物膜的形态特征激光共聚焦显微图。
[0029] 图3为D-氨基酸处理后Dickeya zeae MSl细菌生物膜结晶紫染色分析图。
[0030] 图4为D-缬氨酸抑制Dickeya zeae MSl细菌生物膜生长的激光共聚焦分析图。
[0031] 图5为4种D-氨基酸混配配方抑制Dickeya zeae MSl的细菌生物膜形成的分析 图。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0033] 香蕉细菌性软腐病菌（Dickeya zeae MSI)在文献"Identification of Dickeya zeae as a Causal Agent of Bacterial Soft Rot in Banana in China. Plant Disease, 2014, 98 (4) :436-442. "中公开，由广东省农业科学院植物保护研宄所实验室提 供；
[0034] D-氨基酸均在Sigma-Aldrich公司购买。
[0035] 实施例1 :细菌的培养及细菌生物膜的培养
[0036] 取甘油冻存（-80 °C )的细菌菌株 Dickeya zeae MSI (Identif ication of Dickeya zeae as a Causal Agent of Bacterial Soft Rot in Banana in China. Plant Disease, 2014, 98 (4) :436-442.)分别接种到NA固体培养基（牛肉膏3g、酵母膏lg、蛋白胨 5g、葡萄糖10g、琼脂18g，水定容至lOOOmL，pH为7. 2?7. 4)平板上，划线培养；挑取单菌 落于液体NA培养基（牛肉膏3g、酵母膏lg、蛋白胨5g、葡萄糖10g，水定容至1000mL，pH为 7. 2 ?7. 4)中培养，180rpm，32°C培养。
[0037] 培养Dickeya zeae MSl至108CFU/mL ;NA液体培养基稀释菌液至1:1000。取2mL 稀释的菌液加入聚苯乙烯24微孔板中，每样品3个重复，32°C静置培养，培养不同时间后 作下一步检测。培养6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、96h、144h、216h后，先抽取浮游细菌 于96孔板中，在酶标仪测取600nm(0D 6QQ)的吸光度值（Multiskan Spectrum，Thermo Lab Systems);下一步将余下浮游细菌和细菌生物膜混勾，再次测取600nm(0D6CICI)的吸光度值。 计算混匀后的细菌OD值减去浮游细菌OD值，即为细菌生物膜生物量的相对定量。
[0038] 培养Dickeya zeae MSl至108CFU/mL ;NA培养基稀释菌液至1:1000。加入5mL稀 释的菌液于聚苯乙烯6孔板中，使用聚苯乙烯的光学玻片浸泡入细菌培养基中，与细菌共 同培养6h、24h。使用PBS缓冲液清洗去除浮游细菌，粘附基质玻片的细菌细胞使用5%的 戊二醛进行固定lh，再用PBS缓冲液清洗；PI用于DNA染色，Alexa-Fluor Concanavalin A(ConA)用于结合胞外多糖，染料的分别结合用于分析Dickeya zeae MSl细菌生物膜在 不同时间段形成的特征。使用以下的氩激光激发、接收波长参数：PI 630-633nm激发和 650-800nm接收，ConA 346nm激发和442nm接收，激光共聚焦显微镜观察。
[0039] 结果见图1及图2。由图可见，0?12h，浮游菌生长量大于细菌生物膜；至24h达到 动态平衡，生长速度一致；48h后，浮游菌衰亡而细菌生物膜不变；表明Dickeya zeae MSl 离体培养后24h即可形成稳定的细菌生物膜。激光共聚焦显微镜观察结果类似，在6h时形 成的细菌生物膜较稀薄，到24h时，细菌已形成完整、密集的细菌生物膜。
[0040] 实施例2 :不同D-氨基酸抑制香蕉细菌性软腐病菌的效果分析
[0041 ] 配制D-缬氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸、D-苏氨酸、D-精氨酸、D-脯氨酸、D-亮氨 酸、D-丝氨酸、D-组氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-谷氨酰胺、D-苯丙氨酸、D-丙氨酸 等的IOOmMoVL的储存液；配制D-酪氨酸的IOmMoVL的储存液，其中D-酪氨酸储存液含 0. IMol/L的HCl。按照不同浓度配比，配制系列D-氨基酸浓度的NA液体培养基；分别配置 200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480 及 500 μΜοΙ/L(简写 μΜ)浓度的D-酪氨酸的NA液体培养基（牛肉膏3g、酵母膏lg、蛋白胨5g、葡萄糖10g，水 定容至 lOOOmL，pH 为 7. 2 ?7. 4);分别配置 1、3、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17· 5 及 20mMol/L(简写mM)的其他D-氨基酸的NA培养基（牛肉膏3g、酵母膏lg、蛋白胨5g、葡萄 糖l〇g，水定容至lOOOmL，pH为7. 2?7. 4)。
[0042] 取甘油冻存（_80°C )的细菌菌株Dickeya zeae MSl接种到NA固体培养基（牛肉 膏3g、酵母膏lg、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂18g，水定容至lOOOmL，pH为7. 2?7. 4)平 板上，划线培养；挑取单菌落于NA液体培养基中培养，180rpm，32°C培养。
[0043] 培养Dickeya zeae MSl至108CFU/mL ;利用不同浓度D-氨基酸的NA培养基稀释 菌液至1:1000,设置无 D-氨基酸菌液对照（CK)，及无菌NA液体培养基对照（NA)。取2mL 稀释的菌液加入聚苯乙烯24微孔板中，32°C静置培养。培养24h后，先抽取浮游细菌于96 孔板中，每样品3个重复，在酶标仪测取600nm(0D_)的吸光度值（Multiskan Spectrum， Thermo Lab Systems);下一步将余下浮游细菌和细菌生物膜混勾，再次测取600nm(0D_) 的吸光度值。计算混匀后的细菌OD值减去浮游细菌OD值，即为细菌生物膜生物量的相对 定量，结果见表1?2。
[0044]
【权利要求】
1. D-氨基酸在抑制香蕉细菌性软腐病菌（Dickeya zeae)细菌生物膜中的应用。
2. 根据权利要求1所述的D-氨基酸在抑制香蕉细菌性软腐病菌（Dickeya zeae)细菌 生物膜中的应用，其特征在于：所述的D-氨基酸为D-酪氨酸、D-色氨酸、D-缬氨酸和D-蛋 氨酸中的至少一种。
3. 根据权利要求2所述的D-氨基酸在抑制香蕉细菌性软腐病菌（Dickeya zeae)细菌 生物膜中的应用，其特征在于：所述D-酪氨酸的有效抑制浓度为420 y Mol/L ;所述D-色氨 酸的有效抑制浓度为5mMol/L ;所述D-缬氨酸的有效抑制浓度为llmMol/L ;所述D-蛋氨酸 的有效抑制浓度为15mMol/L。
4. 根据权利要求2所述的D-氨基酸在抑制香蕉细菌性软腐病菌（Dickeya zeae)细菌 生物膜中的应用，其特征在于：所述D-氨基酸搭配使用时的用量为120 y Mol/L的D-酪氨 酸、5mMol/L的D-缬氨酸、7mMol/L的D-蛋氨酸、0. 5mMol/L的色氨酸； 或为160 y Mol/L的D-酪氨酸、3mMol/L的D-缬氨酸、5mMol/L的D-蛋氨酸、0. 5mMol/ L的色氨酸； 或为120 yMol/L的D-酪氨酸、3mMol/L的D-缬氨酸、5mMol/L的D-蛋氨酸、3mMol/L 的色氨酸； 或为320 yMol/L的D-酪氨酸、3mMol/L的D-缬氨酸、3mMol/L的D-蛋氨酸、3mMol/L 的色氨酸。
5. -种用于权利要求1?4任一项所述的D-氨基酸在抑制香蕉细菌性软腐病菌 (Dickeya zeae)细菌生物膜中的应用中的D-氨基酸培养基，其特征在于：通过在液体培养 基中添加有D-氨基酸得到。
6. 根据权利要求5所述的D-氨基酸培养基，其特征在于：其中添加有D-酪氨酸、D-色 氨酸、D-缬氨酸和D-蛋氨酸中的至少一种。
7. 根据权利要求6所述的D-氨基酸培养基，其特征在于：所述的D-氨基酸培养基中 四种D-氨基酸的含量为120 y Mol/L的D-酪氨酸、5mMol/L的D-缬氨酸、7mMol/L的D-蛋 氨酸、0. 5mMol/L的色氨酸。
8. 根据权利要求6所述的D-氨基酸培养基，其特征在于：所述的D-氨基酸培养基中 四种D-氨基酸的含量为160 y Mol/L的D-酪氨酸、3mMol/L的D-缬氨酸、5mMol/L的D-蛋 氨酸、0. 5mMol/L的色氨酸。
9. 根据权利要求6所述的D-氨基酸培养基，其特征在于：所述的D-氨基酸培养基中 四种D-氨基酸的含量为120 y Mol/L的D-酪氨酸、3mMol/L的D-缬氨酸、5mMol/L的D-蛋 氨酸、3mMol/L的色氨酸。
10. 根据权利要求6所述的D-氨基酸培养基，其特征在于：所述的D-氨基酸培养基中 四种D-氨基酸的含量为320 y Mol/L的D-酪氨酸、3mMol/L的D-缬氨酸、3mMol/L的D-蛋 氨酸、3mMol/L的色氨酸。
【文档编号】C12R1/01GK104498395SQ201410715110
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月28日 优先权日:2014年11月28日
【发明者】张景欣, 林壁润, 黄宁, 沈会芳, 蒲小明, 潘群英 申请人:广东省农业科学院植物保护研究所