芽孢杆菌)(K-4菌剂稀释至有效成分含量 1.0 X IO6-L OX 10scfu/mL后使用，用于抑制油菜菌核病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌、 西瓜枯萎病菌。
[0039] 下面将结合实施例对本发明提供的一种甲基营养型芽孢杆菌及其应用予以进一 步说明。
[0040] 实施例1
[0041] 本实施例所述油菜菌核病菌、水稻纹枯病菌、西瓜枯萎病菌、核桃根腐病菌由长江 大学农学院植物病理学研究室提供，其它方式获得的油菜菌核病菌、水稻纹枯病菌、西瓜枯 萎病菌、核桃根腐病菌也适用于本发明。
[0042] 一、甲基营养型芽孢杆菌XK-4的分离、筛选与鉴定
[0043] 分离：从湖北荆州市周边油菜田块中采集长势旺盛的油菜植株，取粘附在根部的 根际土壤，置于250mL三角瓶中。将上一生长季节收集的油菜菌核病菌核装入5cm2大小， 网孔为I. 5mm2的尼龙小袋中，每袋10粒，再将尼龙袋埋入上述盛有根际土壤的三角瓶中。 三周后，取出尼龙袋中的菌核，置于灭菌的培养皿中，用75%酒精浸泡lmin，再用0. 1%升 汞浸泡30s，然后无菌水漂洗4次，置于LB液体培养基中28-30°C、160r/min振荡培养2d， 取培养所得的菌液lmL，加到盛有9mL无菌水的试管中，振荡混匀，制成样品悬浮液。取ImL 样品悬浮液加入盛有9mL无菌水的试管中依次进行10倍系列稀释，分别取10 5、10 6、10 7的 稀释液50 μ L涂布于LB平板，置于28°C培养24h。根据形态、大小、色泽等特点，共挑取单 菌落135株，转接于LB平板上培养，保存备用。
[0044] 筛选：将油菜菌核病菌置于PDA培养基平板中央，用灭菌的签将上述分离纯化的 菌株呈三角状对称接入PDA平板，距离中心约2cm，26°C培养观察对峙培养抑菌情况。将抑 菌作用明显的菌株XK-4转入LB平板上培养，保存备用。甲基营养型芽孢杆菌XK-4在LB 固体培养基上生长的菌落形态见附图1，甲基营养型芽孢杆菌XK-4在LB平板上形成的菌落 成圆形，乳白色，表面粗糙，边缘呈锯齿状，隆起，湿润，有光泽。所述PDA培养基的配制方法 为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，补足蒸馏水至1000mL，121°C湿热灭菌20min。
[0045] 鉴定：对筛选的菌株XK-4进行常规生理生化鉴定，确定为芽孢杆菌属， 然后提取菌株的总基因组DNA为模板扩增其16S rDNA序列。所用正向和反向引 物分别为 27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，即序列表 SEQ ID No.l;1429R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，即序列表SEQIDNo.2。PCR反应体系为15μL反应体系：DNA 模板 〇· 6 μ L ;H20 8. 57 μ L !buffer 1. 65 μ L ;Mg2+ 2. 75 μ L ;dNTP 0· 66 μ L ;27F :0· 33 μ L ; 14291?0.33 4 1^汀88 0.114 1^。？〇?反应程序为：941€3111丨11;941€308,50 1€458,721€ 100s，35个循环；72°C 7min。回收并纯化PCR产物，测序，根据测序结果将菌株XK-4鉴定 为甲基营养型芽孢杆菌。
[0046] 二、甲基营养型芽孢杆菌)(K-4对油菜菌核病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌、西 瓜枯萎病菌的拮抗作用
[0047] 将筛选出的抑菌作用最明显的菌株ΧΚ-4接入LB液体培养基中，于28°C下140r/ min振荡培养36h，制成菌悬液。在不同PDA培养基平板中心分别接入油菜菌核病菌、水稻 纹枯病菌、西瓜枯萎病菌、核桃根腐病菌等病原真菌，用移液器将Hi-4菌悬液呈三角状对 称接入PDA平板，每点接入10 μ L，距离中心约2cm，以无菌水为对照，26°C培养观察对峙培 养抑菌情况，4d后测量菌落半径，甲基营养型芽孢杆菌XK-4对油菜菌核病菌的抑菌情况见 附图2、对水稻纹枯病菌的抑菌情况见附图3、对西瓜枯萎病菌的抑菌情况见附图4、对核桃 根腐病菌的抑菌情况见附图5。
[0048] 采用以下公式计算菌株XK-4对病原真菌生长的相对抑菌率，每处理重复三次。
[0049] 相对抑制率=(对照菌落半径-处理菌落半径）/对照菌落半径X 100%
[0050] 甲基营养型芽孢杆菌)(K-4对油菜菌核病菌、水稻纹枯病菌、西瓜枯萎病菌、核桃 根腐病菌等几种重要土传病原真菌均具有明显的拮抗作用，结果见表1，其相对抑制率分别 为83. 8 %、78. 6 %、79. 2 %、73. 9 %。通过镜检观察甲基营养型芽孢杆菌ΧΚ-4对油菜菌核病 菌菌丝生长的抑制作用，结果见附图6,发现菌株)(Κ-4处理的菌丝出现溶解，断裂，生长点 膨大等畸形，而对照菌丝生长正常，形态均匀。
[0051] 表1 :甲基营养型芽孢杆菌ΧΚ-4对几种不同病原真菌的拮抗作用
[0052]
[0053] 三、解淀粉芽孢杆菌XK-2菌剂的制备
[0054] 本实施例按照以下主要步骤完成甲基营养型芽孢杆菌ΧΚ-4菌剂的制备：
[0055] (1)将所述的甲基营养型芽孢杆菌ΧΚ-4接种于LB固体培养基，于28°C下培养 20h，活化菌株；LB固体培养基配制：酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂粉 20g，NaOH 调 pH 至 7. 0,121°C、20min 高压灭菌。
[0056] (2)将步骤（1)活化的菌株接入LB液体培养基中，于28°C下160r/min振荡培养 20h，制成种子液；LB液体培养基配制：酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，NaOH调 pH 至 7. 0,121°C、20min 高压灭菌。
[0057] (3)将步骤（2)所获的种子发酵液按体积比5%接种于LB液体发酵培养基中，于 28°C下 140r/min 振荡培养 40h。
[0058] 按以上步骤即制得甲基营养型芽孢杆菌ΧΚ-4菌剂。
[0059] 四、甲基营养型芽孢杆菌ΧΚ-4在防治油菜菌核病中的应用
[0060] (1)将所制备的甲基营养型芽孢杆菌ΧΚ-4菌剂用0. 25 % Tween20稀释至 1.0 X 10scfu/mL，0D6。。= 0. 82-0. 84,用于油菜菌核病的离体防治实验。
[0061] 采集油菜4-5叶期大小相近、叶位一致的叶片，用灭菌水清洗，晾干。设置3个处 理：①叶片浸泡于上述配制的)《-4菌剂稀释液中30s，晾干，将PDA平板活化的菌核病菌菌 丝块接种于油菜叶片正面，每叶片接2个菌饼；②叶片浸泡于无菌水中30s，晾干，在正面接 入油菜菌核病菌菌饼；③叶片浸泡于上述配制的XK-4菌剂稀释液中30s，晾干。每处理重 复3次，叶片置于25°C保鲜盒中，叶片基部用湿润的棉球包裹，以防失水。4d后，测量各处 理病斑的直径。根据公式计算相对防治效果。
[0062] 相对防治效果=[(对照病斑直径一处理病斑直径）/对照病斑直径]X 100%
[0063] 甲基营养型芽孢杆菌)(K-4对油菜菌核病的离体防治试验结果见表2,只接种油菜 菌核病菌的叶片病斑为2. 93cm ;只接种)(Κ-4菌剂的叶片无病斑，表明其对油菜植株是安全 的；同时接种菌核菌和菌剂ΧΚ-4的叶片病斑直径为0. 57cm，相对防治效果为80. 5%。
[0064] 表2 :甲基营养型芽孢杆菌XK-4对油菜菌核病的离体防治效果
[0065]
[0066] (2)甲基营养型芽孢杆菌XK-4防治油菜菌核病的盆栽试验
[0067] 将所制备的ΧΚ-4菌剂用保藏液，即0. 25% Tween20,配成稀释液I. 0 X 10scfu/mL， 0D_= 0. 82-0. 84,用于油菜菌核病的盆栽防治试验。将PDA平板活化的核盘菌菌丝块接 种于装有IOOmL PDB培养液的250mL三角瓶中，每瓶接种3-4块，25°C，140r/min培养72h， 然后将发酵液倒入组织捣碎机制成菌丝悬浮液，备用。
[0068] 经温水浸泡的油菜种子，中双10号，播种于育苗盘，待生长至4-5叶期，备用。选 取健康的油菜植株移栽，每盆5株。设置以下三个处理：①喷雾接种)(K-4菌剂稀释液，每株 约5mL ;②喷雾接种核盘菌菌丝悬浮液，每株约5mL ;③先喷雾接种)(Κ-4菌剂稀释液，每株 约5mL，48h后喷雾接种核盘菌菌丝悬浮液，每株约5mL ;④喷雾清水为空白对照。所有处理 完毕后套塑料袋保湿48h，5d后统计发病率，参照病情分级标准计算病情指数和防治效果。
[0069] 油菜菌核病分级标准：
[0070] 0级：无病；
[0071] 1级：轻微发病，发病面积占叶片表面积的10%以下；
[0072] 2级：轻度发病，发病面积占叶片表面积的11% -30% ;
[0073] 3级：中等发病，