抗感染脂肽类的制作方法

专利名称：抗感染脂肽类的制作方法
相关申请的交叉引用
本申请请求2005年8月23日提交的美国临时申请60/710,705和2004年11月12日提交的美国临时申请60/627,056的利益，将这些文献全部引入本文作为参考。
政府的支持
本文所述的工作部分在Small Business Innovation Research(SBIR)GrantNo.5R44GM068173-03和Grant No.1R43A156858-1的政府支持下进行的。政府可以对这项工作拥有一定权利。
发明领域 本发明涉及新型酯肽(depsipeptide)类化合物。本发明还涉及这些化合物的药物组合物和这些化合物作为抗菌剂的使用方法。

背景技术：
革兰氏阳性菌感染-包括那些因耐药细菌导致的感染-的发生率的快速增加已经重新引起了对研发新类型抗生素的关注。已经显示出作为有用的抗生素活性剂的一类化合物为环状酯肽类。值得注意的大量环状酯肽类为下列文献中所述的A21978C脂肽类例如美国专利RE 32,333；RE 32,455；RE 32,311；RE 32,310；4,482,487；4,537,717；5,912,226；6,911,525；和6,794,490；以及国际专利申请WO01/44272；WO01/44274；和WO01/44271。
另外，美国专利US4,994,270；US5,039,789；和US5,028,590中所述的A54145类化合物还显示具有抗生素活性。
达托霉素，也称作LY146032由与连接环10-氨基酸肽的三-氨基酸链的N-末端色氨酸连接的正-癸酰基侧链组成。达托霉素在体外和体内对临床相关的导致严重和威胁生命的疾病的革兰氏阳性菌具有有效的杀菌活性。这些细菌包括；耐药病原体，诸如万古霉素-抗性肠球菌(enterococci)(VRE)、甲氧西林-抗性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)、糖肽中间体敏感性金黄色葡萄球菌(GISA)、万古霉素-抗性金黄色葡萄球菌(VRSA)、凝固酶-阴性葡萄球菌(staphylococci)(CNS)和青霉素抗性肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(PRSP)，对它们而言几乎没有治疗的选择。例如，参见Tally等，1999，Exp.Opin.Invest.Drugs 81223-1238。
尽管现存抗菌剂已经显示了希望，但是对新抗生素仍然存在不断需求。许多病原体反复接触常用的抗生素。这种接触已经导致变种抗菌菌株对广谱抗生素的选择。因耐药机制导致的抗生素功效和有效性的丧失使得抗生素无效并且最终可以产生一些实际上无法治疗的威胁生命的感染。对于即将进入市场的新抗生素，病原体可能对这些新药发生耐药性或中度耐药性，实际上产生了对于对抗这些新出现的菌株的新抗菌剂持续的需求。此外，表现出杀菌活性的化合物提供了超过目前抑菌化合物的优点。因此，可以预计新的抗菌剂不仅可用于治疗“天然”病原体，而且可以治疗中度耐药病原体和耐药病原体，因为该病原体从未接触该新抗菌剂。新抗菌剂可以表现出对不同类型病原体的差别有效性。
发明概述 本发明提供了对广谱细菌，包括耐药菌，具有抗菌活性的新化合物和制备这些化合物的方法。
本发明在一个方面中提供了式I的化合物
及其盐；其中 a)R2为氨基酸侧链，

或
b)R2*为H或可选地R2与R2*形成5或6元杂环； c)R3为

或非蛋白质原的氨基酸侧链； d)R5为H或甲基； e)R5*为H或来源于N-甲基氨基酸的氨基酸侧链。或者，R5与R5*形成5或6元杂环； f)R6为甲基或
g)R8为氨基酸侧链、甲基、

或
h)R8*为H或可选地R8与R8*形成5或6元杂环； i)R9为

或被至少一种羧酸取代的氨基酸侧链； j)R11为氨基酸侧链、甲基、

或
k)R11*为H或可选地R11与R11*形成5或6元杂环； l)R12为H或CH3 m)R13为CH(CH3)2、CH(CH2CH3)CH3，

或

且 n)R1、R6*和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
本发明在另一个方面中提供了式F1的化合物
及其盐；其中 a)R8为氢，

或
b)R11为甲基，

或
c)R12为H或CH3； d)R13为CH(CH3)2，CH(CH2CH3)CH3，

或

且 e)R1和R6*各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基； 本发明在另一个方面中提供了式F2的化合物
及其盐；其中 a)R8为氢、甲基、

或
b)R12为H或CH3； c)R13为CH(CH3)2、CH(CH2CH3)CH3

或

且 d)R1、R6*和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基； 本发明在另一个方面中提供了式F3的化合物
及其盐；其中 a)R8为氢、

或
b)R11为甲基、

或
c)R12为H或CH3；且 d)R1、R6*和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
本发明在另一个方面中提供了式F4的化合物
及其盐；其中 a)R8为氢、甲基、

或
b)R11为甲基或
c)R12为H或CH3；且 d)R1、R6*和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
本发明在另一个方面中提供了式F5的化合物
及其盐；其中 a)R8为氢、甲基、

或
b)R11为甲基、

或

且 c)R1、R6*和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
本发明在另一个方面中提供了式F6的化合物
及其盐；其中 a)R8为

或
b)R9为

或
c)R11为甲基、

或
d)R12为H或CH3；且 e)R1为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
本发明在另一个方面中提供了式F7的化合物
及其盐；其中 a)R8为甲基，

或
b)R9为

或
c)R12为H或CH3；且 d)R1和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
本发明在另一个方面中提供了式F8的化合物
及其盐；其中 a)R3**为羟基或氢 b)R8为甲基，、

或
c)R11为氨基酸侧链、甲基、

或
d)R12为H或CH3；且 e)R1和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
本发明在另一个方面中提供了式F9的化合物
及其盐；其中 a)R12为H或CH3；且 b)R1和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
本发明在另一个方面中提供了式F10的化合物
及其盐；其中 a)R13*为H或CH3；且 b)R1和R6*各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
本发明在另一个方面中提供了式F11的化合物
及其盐；其中 a)R13*为H或CH3；且 b)R1和R6*各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
本发明在另一个方面中提供了式F12的化合物
及其盐；其中 a)R13为CH(CH2CH3)CH3或

且 b)R1和R6*各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
本发明在另一个方面中提供了式F13的化合物
及其盐；其中R1、R6*和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
本发明在另一个方面中提供了式F14的化合物
及其盐；其中 a)R12为H或CH3；且 b)R1和R6*各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
本发明在另一个方面中提供了式F15的化合物
及其盐；其中 a)R12为H或CH3；且 b)R1和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
本发明在另一个方面中提供了式F16的化合物
及其盐；其中 a)R12为H或CH3，且 b)R1和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
本发明在另一个方面中提供了式F17的化合物
及其盐；其中 a)R12为H或CH3；和 b)R1为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
本发明在另一个方面中提供了式F18的化合物
及其盐；其中R1和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
本发明在另一个方面中提供了式F19的化合物
及其盐；其中 a)R2为

或
b)R6为甲基或
c)R8为甲基或

且 d)R1、R6*和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
本发明在另一个方面中提供了式F20的化合物
及其盐；其中 a)R12为H或CH3；且 b)R1和R8**各自为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
本发明在另一个方面中提供了式F21的化合物
及其盐；其中 a)R1为


或
b)R12为H或CH3，且 c)R8**为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
本发明在另一个方面中提供了式F22的化合物
及其盐；其中 R6*为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
本发明在另一个方面中还提供了包括式I的化合物和式F1-F22的化合物的药物组合物及其使用方法。
本发明在另一个方面还提供了包括式I的化合物和式F1-F22的化合物的抗菌组合物及其使用方法。
本发明在另一个方面中提供了制备式I的化合物和式F1-F22的化合物的方法。
附图简述

图1显示了达托霉素、A54145和CDA的生物合成基因簇的描述。圆括号内的数字表示氨基酸编号。使用下列缩写Trp色氨酸；Asn天冬酰胺；Asp天冬氨酸；Thr苏氨酸；Gly甘氨酸；Orn鸟氨酸；Ala丙氨酸；Ser丝氨酸；MeGlu3-甲基谷氨酸；Kyn犬尿氨酸；Glu谷氨酸；hAsn3-羟基天冬酰胺；Sar肌氨酸；Lys赖氨酸；OMeAsp3-甲氧基天冬氨酸；Ile异亮氨酸；Val缬氨酸；D-HPGD-羟基苯基甘氨酸。
图2描绘了玫瑰孢链霉菌(S.roseosporus)中dptA-H的缺失，由此通过用tsr(硫链丝菌肽抗性)和cat(氯霉素)交换dptA-H基因座以构建玫瑰孢链霉菌的染色体中的缺失而在玫瑰孢链霉菌中构建dptA-H的缺失。
图3描绘了达托霉素NRPS途径中“红色-介导的”基因取代的一般方法。将噬菌体λ-诱导的“超-重组”状态(“Red”系统或Red-介导的重组)用于构建dptBC内的缺失和通过所谓的“缺口修复”的技术克隆取代组件。缩写“C”，凝聚结构域；“Aser”，丝氨酸的腺苷酰化结构域；“T”，硫醇化结构域；“E”，表异构酶结构域。
图4描绘了来自玫瑰孢链霉菌组合库的构建体。
图5描绘了dptBC中的组件构成(dptBC中D-氨基酸的内部组件)和与硫酯酶相关的dptD中末端氨基酸组件(犬尿氨酸)。C为凝聚结构域。含有3字母代码的氨基酸的环为对该氨基酸具有特异性的腺苷酰化结构域Asn天冬酰胺；Ala丙氨酸；Asp天冬氨酸；3MGlu3-甲基谷氨酸；和Kyn犬尿氨酸。T为硫醇化结构域。E为表异构化结构域。TE为硫酯酶结构域。
发明详述 定义 术语″酰基″表示与烷基、链烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基连接的羰基，实例包括，但不限于诸如8-甲基癸酰基、10-甲基十一烷酰基、10-甲基十二烷酰基、正-癸酰基、8-甲基壬酰基、十二烷酰基、十一烷酰基、乙酰基和苯甲酰基这类基团。在本发明的一个实施方案中，酰基为“烷酰基”，将其定义为与烷基连接的羰基。在本发明的另一个实施方案中，烷酰基为“C1-C20-烷酰基”，将其定义为总计含有包括羰基碳在内的1-20个碳原子的烷酰基。碳原子可以以直链或支链方式排列。烷酰基为“C1-C15-烷酰基”，将其定义为总计含有包括羰基碳在内的1-15个碳原子的烷酰基。
碳原子可以以直链或支链方式排列。在本发明的另一个实施方案中，烷酰基为a“C1-C13-烷酰基”，将其定义为总计含有包括羰基碳在内的1-13个碳原子的烷酰基。碳原子可以以直链或支链方式排列。在本发明的另一个实施方案中，烷酰基为“C5-C20-烷酰基”，将其定义为总计含有包括羰基碳在内的5-20个碳原子的烷酰基。碳原子可以以直链或支链方式排列。在本发明的另一个实施方案中，烷酰基为“C10-C20-烷酰基”，将其定义为总计含有包括羰基碳在内的10-20个碳原子的烷酰基。碳原子可以以直链或支链方式排列。在本发明的另一个实施方案中，烷酰基为“C10-C13-烷酰基”，将其定义为总计含有包括羰基碳在内的1-13个碳原子的烷酰基。碳原子可以以直链或支链方式排列。在本发明的另一个实施方案中，烷酰基为


或
在本发明的另一个实施方案中，术语酰基的亚组为(1)“未被取代的烷酰基”，将其定义为与未被取代的烷基连接的羰基；和(2)“未被取代的烯酰基”，将其定义为与未被取代的链烯基连接的羰基。
将术语″酰氨基″定义为酰基相邻的氮基团。在本发明的一个实施方案中，在本发明的一个实施方案中，酰氨基为“烷酰氨基”，将其定义为与烷酰基连接的氮基团。在本发明的另一个实施方案中，烷酰氨基为“C1-C20-烷酰氨基”，将其定义为总计含有包括羰基碳在内的1-20个碳原子的烷酰氨基。碳原子可以以直链或支链方式排列。在本发明的另一个实施方案中，烷酰氨基为“C1-C15-烷酰氨基”，将其定义为总计含有包括羰基碳在内的1-15个碳原子的烷酰氨基。碳原子可以以直链或支链方式排列。在本发明的另一个实施方案中，烷酰氨基为“C1-C13-烷酰氨基”，将其定义为总计含有包括羰基碳在内的1-13个碳原子的烷酰氨基。碳原子可以以直链或支链方式排列。在本发明的另一个实施方案中，烷酰氨基为“C5-C20-烷酰氨基”，将其定义为总计含有包括羰基碳在内的5-20个碳原子的烷酰氨基。碳原子可以以直链或支链方式排列。在本发明的另一个实施方案中，烷酰氨基为“C10-C20-烷酰氨基”，将其定义为总计含有包括羰基碳在内的10-20个碳原子的烷酰氨基。碳原子可以以直链或支链方式排列。在本发明的另一个实施方案中，烷酰氨基为“C10-C13-烷酰氨基”，将其定义为总计含有包括羰基碳在内的1-13个碳原子的烷酰氨基。碳原子可以以直链或支链方式排列。
在本发明的另一个实施方案中，烷酰氨基为


或
术语″酰氧基″表示与酰基相邻的氧基团。
将术语″链烯基″定义为带有2-约20个碳原子，优选3-约10个碳原子并且含有至少一个碳-碳双键的直链或支链基团。还可以用取代基取代一个或多个氢原子，所述的取代基选自酰基、酰氨基、酰氧基、链烯基、烷氧基、烷基、炔基、氨基、芳基、芳氧基、氨基甲酰基、烷氧羰基、羧基、羧基酰氨基、羧基氨基、氰基、二取代的氨基、甲酰基、胍基、卤素、杂芳基、杂环基、羟基、亚氨基氨基、单取代的氨基、硝基、氧代、膦氨基、亚磺酰基、磺氨基、磺酰基、硫代、硫代酰氨基、硫脲基或脲基。不饱和烃链的双键部分可以为顺或反式构型。链烯基的实例包括，但不限于乙烯基或苯基乙烯基。术语链烯基的亚组为“未被取代的链烯基”，将其定义为不带有取代基的链烯基。
术语″烷氧基″表示被烷基、环烷基或杂环基取代的氧基。实例包括，但不限于甲氧基、叔丁氧基、苄氧基和环己氧基。
将术语″烷基″定义为带有1-约20个碳原子的直链或支链的饱和基团，除非另有说明。将术语“低级烷基”定义为含有1-4个碳原子的烷基。一个或多个氢原子也可以被取代基取代，所述的取代基选择酰基、酰氨基、酰氧基、链烯基、烷氧基、烷基、炔基、氨基、芳基、芳氧基、氨基甲酰基、烷氧羰基、羧基、羧基酰氨基、羧基氨基、氰基、二取代的氨基、甲酰基、胍基、卤素、杂芳基、杂环基、羟基、亚氨基氨基、单取代的氨基、硝基、氧代、膦氨基、亚磺酰基、磺氨基、磺酰基、硫代、硫代酰氨基、硫脲基或脲基。烷基的实例包括，但不限于甲基、丁基、叔丁基、异丙基、三氟甲基、壬基、十一烷基、辛基、十二烷基、甲氧基甲基、2-(2’-氨基苯甲酰甲基)、3-吲哚基甲基、苄基和羧甲基。术语烷基的亚组为(1)“未被取代的烷基”，将其定义为不带取代基的烷基；和(2)“取代的烷基”，其表示一个或多个氢原子被取代基取代的烷基，所述的取代基选自酰基、酰氨基、酰氧基、链烯基、烷氧基、烷基、炔基、氨基、芳基、芳氧基、氨基甲酰基、烷氧羰基、羧基、羧基酰氨基、羧基氨基、氰基、二取代的氨基、甲酰基、胍基、卤素、杂芳基、杂环基、羟基、亚氨基氨基、单取代的氨基、硝基、氧代、膦氨基、亚磺酰基、磺氨基、磺酰基、硫代、硫代酰氨基、硫脲基或脲基。在本发明的另一个实施方案中，烷基为“C1-C20-烷基”，将其定义为总计含有1-20个碳原子的烷基。碳原子可以以直链或支链方式排列。在本发明的另一个实施方案中，烷基为“C1-C15-烷基”，将其定义为总计含有1-15个碳原子的烷基。碳原子可以以直链或支链方式排列。在本发明的另一个实施方案中，烷基为“C1-C13-烷基”，将其定义为总计含有1-13个碳原子的烷基。碳原子可以以直链或支链方式排列。在本发明的另一个实施方案中，烷基为“C5-C20-烷酰基”，将其定义为总计含有5-20个碳原子的烷基。
碳原子可以以直链或支链方式排列。在本发明的另一个实施方案中，烷基为“C10-C20-烷基”，将其定义为总计含有10-20个碳原子的烷基。碳原子可以以直链或支链方式排列。在本发明的另一个实施方案中，烷基为“C10-C13-烷基”，将其定义为总计含有10-13个碳原子的烷基。在本发明的另一个实施方案中，烷基为“C9-C12-烷基”，将其定义为总计含有9-12个碳原子的烷基。碳原子可以以直链或支链方式排列。在本发明的另一个实施方案中，烷基为壬基、7-甲基辛基、7-甲基壬基、正-癸基、9-甲基十一烷基、9-甲基癸基、正-十一烷基。
将术语“亚烷基”定义为下式的碳基团
其中Rx和Rx1独立地选自氢或C7-C17未被取代的烷基，其中Rx和Rx1的碳总数不超过17个。
术语″炔基″表示带有2-约10个碳原子并且含有至少一个碳-碳三键的直链或支链基团。一个或多个氢原子也可以被取代基取代，所述的取代基选自酰基、酰氨基、酰氧基、链烯基、烷氧基、烷基、炔基、氨基、芳基、芳氧基、氨基甲酰基、烷氧羰基、羧基、羧基酰氨基、羧基氨基、氰基、二取代的氨基、甲酰基、胍基、卤素、杂芳基、杂环基、羟基、亚氨基氨基、单取代的氨基、硝基、氧代、膦氨基、亚磺酰基、磺氨基、磺酰基、硫代、硫代酰氨基、硫脲基或脲基。炔基的实例包括，但不限于丙炔基。
将术语″氨基″定义为NH2基团。
术语“氨基酸”表示下式的化合物
其中Raa为氨基酸侧链。“天然存在的氨基酸”为天然发现的氨基酸。“基本氨基酸”为20种常见的氨基酸之一丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。“非-蛋白质原氨基酸(non-proteinogenic amino acid)”为除基本氨基酸之外的任意氨基酸。在本说明书中，将下列缩写用于描述具体的氨基酸 在本发明的一个方面中，氨基酸为3-甲氧基-天冬氨酸、3-羟基-天冬酰胺、3-羟基-天冬氨酸、3-甲基谷氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、犬尿氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。
本领域技术人员可以理解通过上述3字母代码的连接来描述肽类。例如，Asp-Asn-Trp指如下化合物
或者，还可以将上述化合物描述为Asp-Asn-Trp-NH2。本领域技术人员还可以理解本发明的肽类可以含有保护基(参见下文)。当氨基酸含有保护基时，三字母代码适合于表示保护基。例如，Thr-Asp(OtBu)-Asn(NHTrt)-Trp-NH2指如下化合物
用于本发明氨基酸的常用保护基包括叔丁氧基(tBu)、三苯甲基(Trt)和叔丁氧羰基(BOC)保护基。
本领域技术人员还可以理解也可以用三字母代码描述环肽类。例如，三字母结构

与如下结构相同
本领域技术人员还可以理解氨基酸可以以L或D构型存在。当需要表示氨基酸的构型时，将D或L命名置于三字母代码前。
术语“氨基酸残基”表示下式的化合物
其中Raa为氨基酸侧链。在本发明的一个方面中，氨基酸残基来源于天然氨基酸。在本发明的另一个方面中，氨基酸残基来源于氨基酸3-甲氧基-天冬氨酸、3-羟基-天冬酰胺、3-羟基-天冬氨酸、3-甲基谷氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、犬尿氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。
术语″氨基酸侧链″表示来自天然形成或合成的氨基酸的任意侧链(R基团)。例如，3-吲哚基甲基也可以称作色氨酸侧链。氨基酸侧链的实例包括，但不限于


氢和甲基，其中Raa1和Raa2各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。“非蛋白质原氨基酸侧链”为来源于非蛋白质原氨基酸的氨基酸侧链(参见上文)。非蛋白质原的氨基酸侧链的实例包括，但不限于
在本发明的一个方面中，氨基酸侧链来源于天然氨基酸。在本发明的另一个方面中，氨基酸侧链来源于氨基酸3-甲氧基-天冬氨酸、3-羟基-天冬酰胺、3-羟基-天冬氨酸、3-甲基谷氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、犬尿氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。
术语“2-(2’-氨基苯甲酰甲基)”指下式的基团
将术语″芳基″或″芳基环″定义为带有5-14个环成员的单或稠合碳环系中的芳族基团。在一个优选的实施方案中，所述的环系带有6-10个环成员。一个或多个氢原子也可以被取代基取代，所述的取代基选自酰基、酰氨基、酰氧基、链烯基、烷氧基、烷基、炔基、氨基、芳基、芳氧基、叠氮基、氨基甲酰基、烷氧羰基、羧基、羧基酰氨基、羧基氨基、氰基、二取代的氨基、甲酰基、胍基、卤素、杂芳基、杂环基、羟基、亚氨基氨基、单取代的氨基、硝基、氧代、膦氨基、亚磺酰基、磺氨基、磺酰基、硫代、硫代酰氨基、硫脲基或脲基。芳基的实例包括，但不限于苯基、萘基、联苯基、三联苯。
术语″芳氧基″表示被芳基或杂芳基取代的含氧基团。实例包括，但不限于苯氧基。
术语“氨基甲酰基”表示下式的氮基团
其中Rx2选自氢、烷基、芳基、环烷基、杂芳基或杂环基且Rx3选自烷基、芳基、环烷基、杂芳基或杂环基。
将术语″烷氧羰基″定义为与烷氧基或芳氧基相邻的羰基。
术语″羧基″表示COOH基团。
术语“羧基氨基”表示CONH2基团。
将术语″羧基酰氨基″定义为与单取代的氨基或二取代的氨基相邻的羰基。
将术语“α-羧基氨基酸侧链”定义为下式的碳基团
其中将Rx4定义为氨基酸侧链。
术语“羧甲基”表示CH2CO2H基团。
术语″环烷基″或″环烷基环″表示在带有3-12个环成员的单或稠合碳环系中的饱和或部分不饱和的碳环。在一个优选的实施方案中，环烷基为带有3-7个环成员的环系。一个或多个氢原子也可以被取代基取代，所述的取代基选自酰基、酰氨基、酰氧基、链烯基、烷氧基、烷基、炔基、氨基、芳基、芳氧基、氨基甲酰基、烷氧羰基、羧基、羧基酰氨基、羧基氨基、氰基、二取代的氨基、甲酰基、胍基、卤素、杂芳基、杂环基、羟基、亚氨基氨基、单取代的氨基、硝基、氧代、膦氨基、亚磺酰基、磺氨基、磺酰基、硫代、硫代酰氨基、硫脲基或脲基。环烷基的实例包括，但不限于环丙基、环丁基、环己基和环庚基。
将术语“二取代的氨基”定义为含有两个取代基的氮基团，所述的取代基独立地选自烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基。优选的二取代的氨基为“低级二取代的氨基”，其中取代基为低级烷基。另外优选的二取代的氨基为一个取代基为低级烷基，而另一个取代基为α-羧基氨基酸侧链的氨基。
基团“Fmoc”为9-芴基甲氧羰基。
将术语“胍基”定义为下式的氮基团
其中Rx5、Rx7和Rx8各自独立选自氢、烷基、芳基、环烷基、杂芳基或杂环基；且Rx6选自烷基、芳基、环烷基、杂芳基或杂环基。
术语″卤素″表示溴、氯、氟或氟基团。
将″杂芳基″或″杂芳基环″定义为具有5-15个环成员的在单环或稠合环系中含有1-4个选自O、N、S或SO的杂原子或杂基团的芳族基团。在一个优选的实施方案中，杂芳基环系具有6-10个环成员。一个或多个氢原子也可以被取代基取代，所述的取代基选自酰基、酰氨基、酰氧基、链烯基、烷氧基、烷基、炔基、氨基、芳基、芳氧基、氨基甲酰基、烷氧羰基、羧基、羧基酰氨基、羧基氨基、氰基、二取代的氨基、甲酰基、胍基、卤素、杂芳基、杂环基、羟基、亚氨基氨基、单取代的氨基、硝基、氧代、膦氨基、亚磺酰基、磺氨基、磺酰基、硫代、硫代酰氨基、硫脲基或脲基。杂芳基的实例包括，但不限于吡啶基、噻唑基、噻二唑基、异喹啉基、吡唑基、噁唑基、噁二唑基、三唑基和吡咯基。
术语″杂环基″、″杂环″或″杂环基环″表示在具有3-12个环成员的单环或稠合杂环系中含有1-4个选自O、N、NH、N(低级烷基)、S、SO或SO2的杂原子或杂基团的饱和或部分不饱和环。在一个优选的实施方案中，杂环基为具有3-7个环成员的环系。一个或多个氢原子也可以被取代基取代，所述的取代基选自酰基、酰氨基、酰氧基、链烯基、烷氧基、烷基、炔基、氨基、芳基、芳氧基、氨基甲酰基、烷氧羰基、羧基、羧基酰氨基、羧基氨基、氰基、二取代的氨基、甲酰基、胍基、卤素、杂芳基、杂环基、羟基、亚氨基氨基、单取代的氨基、硝基、氧代、膦氨基、亚磺酰基、磺氨基、磺酰基、硫代、硫代酰氨基、硫脲基或脲基。杂环基的实例包括，但不限于吗啉基、哌啶基和吡咯烷基。
将术语″氢″定义为单个氢原子(H)。
术语“亚氨基氨基”表示下式的氮基团
其中Rx9和Rx11各自独立选自氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环基；并且Rx10选自烷基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环基。
术语“N-甲基氨基酸”表示下式的化合物
其中Raa为氨基酸侧链。N-甲基氨基酸的氨基酸侧链的实例包括


和
术语“单取代的氨基”表示含有氢基团和选自烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基的取代基的氮基团。优选的单取代的氨基为“低级单取代的氨基”，其中取代基为低级烷基。更优选的单取代的氨基为含有α-羧基氨基酸侧链的氨基。
将术语“膦氨基”定义为下式的氮基团
其中Rx12选自氢、烷基、芳基、环烷基、杂芳基或杂环基；其中Rx13和Rx14各自独立选自烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、环烷基、杂芳基和杂环基。
术语“保护基”指可以用于防止分子上的基团发生化学反应，同时在分子的另外部分发生化学改变的任意化学化合物。可能需要保护的基团包括羟基、氨基、羧酸和羧基氨基。大量保护基为本领域技术人员已知的并且实例可以在″Protective Groups in Organic Synthesis″by Theodora W.Greene和Peter G.M.Wuts，John Wiley和Sons，New York，3rd Edition 1999，下文的Greene中找到。
术语“氨基保护基”指可以用于防止分子上的氨基发生化学反应，同时在分子的另外部分发生化学改变的任意化学化合物。大量氨基保护基为本领域技术人员已知的并且实例可以在Greene中找到。“氨基保护基”的实例包括苯二酰亚氨基、三氯乙酰基、STA-碱、苄氧羰基、叔丁氧羰基、叔戊氧羰基、异冰片基氧基羰基、金刚烷基氧基羰基、氯苄氧羰基、硝基苄氧羰基等。优选的氨基保护基为“氨基甲酸氨基酯保护基”或叠氮基，将该氨基甲酸氨基酯保护基定义为在结合氨基时形成氨基甲酸酯的氨基保护基。优选的氨基甲酸氨基酯保护基为烯丙氧羰基(alloc)、苄氧羰基(CBZ)、9-芴基甲氧羰基(Fmoc)和叔丁氧羰基保护基。
术语“羟基保护基”指可以用于防止分子上的羟基发生化学反应，同时在分子的另外部分发生化学改变的任意化学化合物。大量羟基保护基为本领域技术人员已知的并且实例可以在Greene中找到(参见上文)。羟基保护基的实例包括酯类，诸如，但不限于甲酸酯、乙酸酯、取代的乙酸酯、巴豆酸酯、苯甲酸酯、取代的苯甲酸酯、碳酸甲酯、碳酸乙酯、碳酸烷基酯和碳酸芳基酯、硼酸酯和磺酸酯。羟基保护基的实例还包括醚类，诸如，但不限于甲基、苄氧基甲基、甲硅烷氧基甲基、四氢吡喃基、取代的四氢吡喃基、乙基、取代的乙基、烯丙基、叔丁基、炔丙基、苯基、取代的苯基、苄基、取代的苄基、烷基甲硅烷基和甲硅烷基的醚类等。优选的羟基保护基为“酸不稳定的醚类”，将其定义为可以通过用酸处理除去的醚保护基。优选的羟基醚保护基为三苯甲基(Trt)、叔丁基(tBu)、苄基(Bzl)和叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)保护基。
术语“羧酸保护基”指可以用于防止分子上的羧酸发生化学反应，同时在分子的另外部分发生化学改变的任意化学化合物。大量羧酸保护基为本领域技术人员已知的并且实例可以在Greene中找到(参见上文)。羧酸保护基的实例包括，但不限于酰胺类、酰肼类和酯类，诸如甲酯类；取代的甲基、苯甲酰甲基、四氢吡喃基、四氢呋喃基、氰基甲基、三异丙基甲硅烷基甲基、二苯乙酮基、乙基2-取代的乙基、苯基、2，6二烷基苯基、苄基、取代的苄基、甲硅烷基和锡烷基等。优选的羧酸酯保护基为烯丙基(All)、叔丁基(tBu)、苄基(Bzl)、4-{N-[1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环亚己基(cyclohexylidinene))-3-甲基丁基]-氨基}苄基(ODmab)、1-金刚烷基(1Ada)和2-苯基异丙基(2-PhiPr)保护基。
术语″亚磺酰基″表示被氧代取代基和第二个取代基取代的四价硫代团，所述第二个取代基选自烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基。
将术语磺氨基定义为下式的氨基
其中Rx15选自氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环基；且Rx16选自烷基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环基。
术语″磺酰基″表示被两个氧代取代基和第三个取代基取代的六价硫代团，所述的取代基选自烷基、环烷基、杂环基、芳基、或杂芳基。
将术语″硫代″定义为含有取代基的、与二价硫原子连接的基团，诸如硫代甲基和硫代苯基，所述的取代基独立地选自氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基。
术语“硫代酰氨基”表示下式的氨基
其中Rx17选自氢、烷基、芳基、环烷基、杂芳基或杂环基；且其中Rx18选自烷基、芳基、环烷基、杂芳基或杂环基。
将术语“硫脲基”定义为下式的硫代团
其中Rx19和Rx20各自独立选自氢、烷基、芳基、环烷基、杂芳基或杂环基；且Rx21选自烷基、芳基、环烷基、杂芳基或杂环基。
基团三苯甲基为三苯基甲基。
将术语“脲基”定义为下式的氮基团
其中Rx21和Rx22各自独立地选自氢、烷基、芳基、环烷基、杂芳基或杂环基；且Rx23选自烷基、芳基、环烷基、杂芳基或杂环基。
术语“lptA”、″lptB″、“lptC”和“lptD”指编码A54145 NRPS亚基的核酸分子。在一个优选的实施方案中，核酸分子来源于链霉菌属(Streptomyces)，更优选核酸的分子来源于弗氏链霉菌(S.fradiae)。LptA核酸编码氨基酸1-5。lptB核酸编码氨基酸6和7。lpC核酸编码氨基酸8-11。lptD核酸编码氨基酸12和13(图1)。术语“lptA”、“lptB、″lptC”和“lptD”还指这些基因的等位变体，其可以获自链霉菌属的其它种类或其它弗氏链霉菌菌株。
术语“dptA”、“dptBC”和“dptD”指编码达托霉素NRPS亚基的核酸分子。
在一个优选的实施方案中，核酸分子来源于链霉菌属，更优选核酸分子来源于玫瑰孢链霉菌。dptA核酸编码氨基酸1-5。dptBC核酸编码氨基酸6-11。dptD核酸编码氨基酸12-13(图1)。术语“dptA”、“dptBC”和“dptD”还指这些基因的等位变体，其可以获自链霉菌属的其它种类或其它玫瑰孢链霉菌菌株。
本发明化合物的盐包括酸加成的盐和碱加成的盐。在一个优选的实施方案中，所述的盐为式I的化合物或式F1-F22的任意化合物的药学上可接受的盐。术语″药学上可接受的盐″包括常用于形成碱金属盐和形成游离酸或游离碱的加成盐的盐。盐的性质并不关键，只要它为药学上可接受的。本发明化合物合适的药学上可接受的酸加成的盐可以由无机酸或有机酸制备。这类无机酸的实例包括，但不限于盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、硫酸和磷酸。合适的有机酸可以选自脂族、环脂族、芳族、芳基脂族、杂环、羧酸和磺酸类的有机酸，其实例包括，但不限于甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、葡糖酸、马来酸、扑酸(embonic)(双羟萘酸(pamoic))、甲磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、泛酸、苯磺酸、甲苯磺酸、对氨基苯磺酸、甲磺酸、环己氨基磺酸、硬脂酸、algenic、β-羟基丁酸、丙二酸、半乳糖二酸(galactic)和半乳糖醛酸。本发明化合物的合适的药学上可接受的碱加成的盐包括，但不限于由铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌制成的金属盐或由N，N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡萄胺、赖氨酸和普鲁卡因制备的有机盐。例如，可以通过用合适的酸或碱处理本发明的化合物由本发明相应的化合物通过常规方法制备所有这些盐。
本发明的化合物可以具有一个或多个不对称碳原子且由此能以旋光异构体的形式及其外消旋或非外消旋混合物的形式存在。在本发明中可以将本发明的化合物作为单一异构体或作为立体化学异构体形式的混合物使用。可以通过常规方式，诸如色谱、蒸馏、结晶或升华分离非对映异构体，即不能重叠的异构体形式。可以通过按照常规方法拆分外消旋混合物，例如通过用旋光酸或碱处理形成非对映异构体盐而获得旋光异构体。合适的酸的实例包括，但不限于酒石酸、二乙酰基酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、二甲苯酰基酒石酸和樟脑磺酸。可以通过结晶，随后从旋光盐中释放旋光碱来分离非对映体混合物。用于分离旋光异构体的可选方法包括使用最优选使对映体分离最大化的手性色谱柱。另一种方法包括通过使本发明化合物与光学纯的活化形式的酸或光学纯的异氰酸酯反应合成共价非对映异构体分子。可以通过常规方式，诸如色谱、蒸馏、结晶或升华分离合成的非对映异构体，然后使其水解而得到对映体纯的化合物。同样可以通过使用旋光原料获得本发明的旋光化合物。这些异构体可以为游离酸、游离碱、酯或盐的形式。
本发明还包括分离的化合物，优选式I的化合物或式F1-F22的任意的化合物。分离的化合物指化合物，优选式I的化合物或式F1-F22的任意化合物，其在混合物中的存在量占至少约1％，优选至少约10％，更优选至少约20％，甚至更优选至少约50％，更优选至少约80％，甚至更优选至少约90％且最优选至少约99％。在本发明的一个实施方案中，化合物，优选式I的化合物或式F1-F22的任意化合物在组合物中的存在量至少约80％-约90％。在另一个实施方案中，化合物，优选式I的化合物或式F1-F22的任意化合物在组合物中的存在量至少90％。在另一个实施方案中，化合物，优选式I的化合物或式F1-F22的任意化合物在组合物中的存在量大于90％。
可以通过任意方式测定化合物，优选式I的化合物或式F1-F22的任意化合物的百分比，所述的任意方式包括核磁共振(NMR)、气相色谱法/质谱法(GC/MS)、液相色谱法/质谱法(LC/MS)或微生物化验。用于测定化合物纯度的优选方式通过分析型高效液相色谱法(HPLC)或LC/MS进行。
在本发明的一个实施方案中，化合物，其药学上可接受的盐或包含该化合物的药物组合物在例如本文所述的那些常规生物学化验中表现出可检测到的(即统计学上显著性的)抗微生物活性。
酯肽化合物 本发明在一个方面中提供了式I化合物
及其盐。
式I的基团R2为氨基酸侧链、

或

在本发明的一个实施方案中，氨基酸侧链为

或

在本发明的另一个实施方案中，氨基酸侧链来源于D-氨基酸。在本发明的另一个实施方案中，氨基酸侧链为


或
其中Raa1和Raa2各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
取代基R2*为H。或者，R2和R2*与它们所连接的原子一起形成5或6-元杂环。在式I的一个实施方案中，R2和R2*与它们所连接的原子一起形成吡咯烷环。
式I的基团R3为

或非蛋白质原的氨基酸侧链。在本发明的一个实施方案中，式I的基团R3为

或

在本发明的另一个实施方案中，非蛋白质原氨基酸为


或
式I的取代基R5为H或甲基且式I的取代基R5*为H或来源于N-甲基氨基酸的氨基酸侧链。在本发明的一个实施方案中，R5*为甲基，


或
或者，R5和R5*与它们所连接的原子一起形成5或6-元杂环。在式I的一个实施方案中，R5和R5*与它们所连接的原子一起形成哌啶或吡咯烷环。
式I的基团R6为甲基或
式I的取代基R8为氨基酸侧链、氢、甲基、

或

在本发明的一个实施方案中，式I的取代基R8为氢、甲基、

或

在本发明的另一个实施方案中，氨基酸侧链来源于D-氨基酸。在本发明的另一个实施方案中，取代基R8为来源于甘氨酸、D-丙氨酸、D-天冬酰胺、D-丝氨酸或D-赖氨酸的氨基酸侧链。本发明的另一个实施方案中，氨基酸侧链为


或
其中Raa1和Raa2各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
式I的取代基R8*为H。或者，R8和R8*与它们所连接的原子一起形成5或6-元杂环。在式I的一个实施方案中，R8和R8*与它们所连接的原子一起形成吡咯烷环。
式I的基团R9为

或被至少一种羧酸取代的氨基酸侧链。在本发明的一个实施方案中，式I的基团R9为


或

在本发明的另一个实施方案中，氨基酸侧链为
或 式I的取代基R11为氨基酸侧链、甲基、

或

在本发明的一个实施方案中，式I的取代基R11为甲基、

或

在本发明的一个实施方案中，氨基酸侧链来源于D-氨基酸。在本发明的另一个实施方案中，式I的R11为来源于D-丙氨酸、D-丝氨酸或D-天冬酰胺的氨基酸侧链。本发明的另一个实施方案中，氨基酸侧链为


或
其中Raa1和Raa2各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
取代基R11*为H。或者，R11和R11*与它们所连接的原子一起形成5或6-元杂环。在式I的一个实施方案中，R11和R11*与它们所连接的原子一起形成吡咯烷环。
式I的基团R12为H或CH3。
式I的取代基R13为CH(CH3)2，CH(CH2CH3)CH3，

或
在本发明的一个实施方案中，R13为CH(CH2CH3)CH3或
R1、R6*和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。在本发明的一个实施方案中，R1为氨基、NH-氨基保护基或酰氨基。在本发明的另一个实施方案中，R1为氨基。在本发明的另一个实施方案中，R1为NH-氨基保护基。在本发明的另一个实施方案中，R1为酰氨基。在本发明的另一个实施方案中，R1为烷酰氨基。在本发明的另一个实施方案中，R1为C10-C13烷酰氨基。在本发明的另一个实施方案中，R1为


或
在本发明的另一个实施方案中，R6*和R8**各自独立为氨基或NH-氨基保护基。在本发明的另一个实施方案中，R6*和R8**各自独立为氨基。在本发明的另一个实施方案中，R6*和R8**各自独立为NH-氨基保护基。
表I提供了式I的示范性化合物。
表I 式I的化合物































































































在本发明的一个实施方案中，R2*、R5*、R8*、R11*和R12为H，R9为

或
且R13为CH(CH2CH3)CH3。该实施方案提供了式II的化合物。

其中R9*为H或OMe且R1、R2、R3、R5、R6、R8和R11如上述所定义。
表II提供了式II的示范性化合物。
表II 式II的化合物











在本发明的另一个实施方案中， R2为
R3为
R9为
R2*、R5、R5*、R8*和R11*各自为H；且 R6为
该实施方案得到了式III的化合物。

其中R1、R6*、R8、R11、R12和R13如上述所定义。
表III提供了式III的示范性化合物。
表III 式III的化合物













在本发明的另一个实施方案中，R2*、R8*和R11*各自为H。该实施方案得到了式IV的化合物。

表IV提供了式IV的示范性化合物。
表IV 式IV的化合物













本发明在另一个实施方案中提供了式F1的化合物
及其盐；其中 a)R8为氢、

或
b)R11为甲基、

或
c)R12为H或CH3； d)R13为CH(CH3)2、CH(CH2CH3)CH3、

或

且 e)R1和R6*各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
在本发明的一个实施方案中，式F1的取代基R13为CH(CH2CH3)CH3、

或
在本发明的另一个实施方案中，式F1的化合物选自
在本发明的一个实施方案中，当取代基R8**为氢或

时，式F1的取代基R1不为C10-烷酰基。
式F1的示范性化合物包括，但不限于化合物C22、C189、C201、C210、C37和C39(参见上文)。
本发明在另一个实施方案中提供了式F2的化合物
及其盐；其中 a)R8为氢、甲基、

或
b)R12为H或CH3； c)R13为CH(CH3)2、CH(CH2CH3)CH3、

或

且 d)R1、R6*和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
在本发明的另一个实施方案中，F2的化合物选自
式F2的示范性化合物包括，但不限于化合物C46、C49和C61(参见上文)。
本发明在另一个实施方案中提供了式F3的化合物
及其盐；其中 a)R8为氢、

或
b)R11为甲基、

或
c)R12为H或CH3；且 d)R1、R6*和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
本发明在另一个方面中提供了式F4的化合物
及其盐；其中 a)R8为氢、甲基、

或
b)R11为甲基或
c)R12为H或CH3；且 d)R1、R6*和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
本发明在另一个实施方案中提供了式F5的化合物
及其盐；其中 a)R8为氢、甲基、

或
b)R11为甲基、

或

且 c)R1、R6*和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
本发明在另一个实施方案中提供了式F6的化合物
及其盐；其中 a)R8为

或
b)R9为

或
c)R11为甲基、

或
d)R12为H或CH3；且 e)R1为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
在本发明的另一个实施方案中，式F6的化合物选自
和
式F6的示范性化合物包括，但不限于化合物C292、C289、C307和C304(参见上文)。
本发明在另一个实施方案中提供了式F7的化合物
及其盐；其中 a)R8为甲基、

或
b)R9为

或
c)R12为H或CH3；且 d)R1和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH--氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
在本发明的另一个实施方案中，式F7的化合物选自

和
式F7的示范性化合物包括，但不限于化合物C337和C328(参见上文)。
本发明在另一个实施方案中提供了式F8的化合物
及其盐；其中 a)R3**为羟基或氢； b)R8为甲基、

或
c)R11为氨基酸侧链、甲基、

或
d)R12为H或CH3；且 e)R1和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
在本发明的一个实施方案中，式F8的基团R3**羟基。该实施方案得到了式F8A的化合物
其中R1、R8、R8**、R11和R12如对式F8所述。
在本发明的另一个实施方案中，式F8A的化合物选自

和
式F8A的示范性化合物包括，但不限于化合物C87和C111(参见上文)。
在本发明的另一个实施方案中，式F8的基团R3**为氢。该实施方案得到了式F8B的化合物
其中R1、R8、R8**、R11和R12如对式F8所述。
在本发明的另一个实施方案中，式F8B的化合物选自

和
式F8B的示范性化合物包括，但不限于化合物C102和C99(参见上文)。
本发明在另一个实施方案中提供了式F9的化合物
及其盐；其中 a)R12为H或CH3；且 b)R1和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲 基、亚氨基氨基或膦氨基。
在本发明的一个实施方案中，式F9的取代基R12为甲基。
在本发明的另一个实施方案中，式F9的化合物选自

和
式F2的示范性化合物包括，但不限于化合物C105和C108(参见上文)。
本发明在另一个实施方案中提供了式F10的化合物
及其盐；其中 a)R13*为H或CH3；且 b)R1和R6*各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
在本发明的另一个实施方案中，式F10的化合物选自

和
式F10的示范性化合物包括，但不限于化合物C259和C262(参见上文)。
本发明在另一个实施方案中提供了式F11的化合物
及其盐；其中 a)R13*为H或CH3；且 b)R1和R6*各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
在本发明的另一个实施方案中，式F11的化合物选自

和
式F11的示范性化合物包括，但不限于化合物C4和C8(参见上文)。
本发明在另一个实施方案中提供了式F12的化合物
及其盐；其中 a)R13为CH(CH2CH3)CH3或

且 b)R1和R6*各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
在本发明的另一个实施方案中，式F12的化合物选自

和
式F12的示范性化合物包括，但不限于化合物C233和C221(参见上文)。
本发明在另一个实施方案中提供了式F13的化合物
及其盐，其中R1、R6*和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
在本发明的另一个实施方案中，式F13的化合物选自
和
式F13的示范性化合物包括，但不限于化合物C236、237和C238(参见上文)。
本发明在另一个实施方案中提供了式F14的化合物
及其盐；其中 a)R12为H或CH3；且 b)R1和R6*各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
在本发明的另一个实施方案中，式F14的化合物选自

和
式14的示范性化合物包括，但不限于化合物C283和C277(参见上文)。
本发明在另一个实施方案中提供了式F15的化合物
及其盐；其中 a)R12为H或CH3；且 b)R1和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
在本发明的一个实施方案中，式F15的取代基R12为甲基。
在本发明的另一个实施方案中，式F15的化合物选自

和
式F15的示范性化合物包括，但不限于化合物C325和C153(参见上文)。
本发明在另一个实施方案中提供了式F16的化合物
及其盐；其中 a)R12为H或CH3，且 b)R1和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
在本发明的一个实施方案中，式F16的取代基R12为甲基。
在本发明的另一个实施方案中，式F16的化合物选自

和
式F16的示范性化合物包括，但不限于化合物C90和C114(参见上文)。
本发明在另一个实施方案中提供了式F17的化合物
及其盐；其中 a)R12为H或CH3；且 b)R1为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
在本发明的另一个实施方案中，式F17的化合物选自

和
式F17的示范性化合物包括，但不限于化合物C316和C319(参见上文)。
本发明在另一个实施方案中提供了式F18的化合物
及其盐； 其中R1和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
在本发明的另一个实施方案中，式F18的化合物为
式F18的示范性化合物为，但不限于化合物C180(参见上文)。
本发明在另一个实施方案中提供了式F19的化合物
及其盐；其中 a)R2为

或
b)R6为甲基或
c)R8为甲基或

且 d)R1、R6*和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
在本发明的另一个实施方案中，式F19的化合物选自

和
式F19的示范性化合物包括，但不限于化合物C86、C359和C356(参见上文)。
本发明在另一个实施方案中提供了式F20的化合物
及其盐；其中 a)R12为H或CH3；且 b)R1和R8**各自为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
在本发明的另一个实施方案中，式F20的化合物选自

和
式F20的示范性化合物包括，但不限于化合物C343和C340(参见上文)。
本发明在另一个实施方案中提供了式F21的化合物
及其盐；其中 a)R1为


或
b)R12为H或CH3，且 c)R8**为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH--氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
在本发明的另一个实施方案中， 式F21的化合物选自

和
式F21的示范性化合物包括，但不限于化合物C265和C271(参见上文)。
本发明在另一个实施方案中提供了式F22的化合物
及其盐；其中 R6*为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
在本发明的另一个实施方案中，式F22的化合物为
式F22的示范性化合物包括，但不限于化合物C3(参见上文)。
在本发明的一个实施方案中，式F1-F20的任意化合物的取代基R1为氨基、酰氨基、NH-氨基保护基或氨基甲酰基。在本发明的另一个实施方案中，式F1-F20的任意化合物的取代基R1为C10-C13烷酰氨基。在本发明的另一个实施方案中，式F1-F20的任意化合物的取代基R1为


或
在本发明的另一个实施方案中，式F1-F20的任意化合物的取代基R1为
在本发明的一个实施方案中，式F1-F5、F10-F14、F19和F22的任意化合物的取代基R6*为氨基、NH-氨基保护基或氨基甲酰基。在本发明的另一个实施方案中，式F1-F5、F10-F14、F19和F22的任意化合物的取代基R6*为氨基。
在本发明的一个实施方案中，式F2-F5、F7-F9、F13、F15、F16、F18和F20-F21的任意化合物的取代基R8**为氨基、NH-氨基保护基或氨基甲酰基。在本发明的另一个实施方案中，式F2-F5、F7-F9、F13、F15、F16、F18和F20-F21的任意化合物的取代基R8**为氨基。
本领域技术人员可以理解本发明的化合物，特别是式I和式F1-F22的化合物用作制备式I和式F1-F22的其它化合物的中间体。特别有用的也为中间体的化合物为式I、F2-F5、F13和F19的化合物，其中R1、R6*或R8**中的至少一个是氨基、NH-氨基保护基或氨基甲酰基；式F1或F10-F14的化合物，其中R1或R6*中至少一个为氨基、NH-氨基保护基或氨基甲酰基；式F7-9、F15-16、F18和F20的化合物，其中R1或R8**中至少一个为氨基、NH-氨基保护基或氨基甲酰基；式F22的化合物，其中R6*为氨基、NH-氨基保护基或氨基甲酰基；式F21的化合物，其中R8**为氨基、NH-氨基保护基或氨基甲酰基；和式F6和F17的化合物，其中R1为氨基、NH-氨基保护基或氨基甲酰基。
药物组合物及其使用方法 本发明在一个实施方案中提供了包含式I的化合物或式F1-F22的任意化合物或其盐的药物组合物或制剂。
可以为治疗或预防性治疗疾病，特别是细菌感染配制口服、静脉内、肌内、皮下或非肠道给药用的本发明化合物，优选式I的化合物或式F1-F22的任意化合物或其药学上可接受的盐。就口服或非肠道给药而言，可以将本发明的化合物与常规药用载体和赋形剂混合并且以片剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆剂、糯米纸囊剂(wafer)等的形式使用。包含本发明化合物的组合物含有约0.1-约99％重量的活性化合物，且一般约10-约30％。
按照标准程序制备本文披露的药物制剂并且以选择的剂量给药以便减轻、预防或消除感染(例如，参见“Remington′s Pharmaceutical Sciences”，MackPublishing Company，Easton，PA；和“Goodman和Gilman′s The PharmaceuticalBasis of Therapeutics”，Pergamon Press，New York，NY，将这些文献的内容引入本文作为参考，用于一般性描述用于人体治疗的各种抗微生物剂的给药方法)。可以使用控释(例如胶囊)或缓释递药系统(例如生物易蚀基质)递送本发明的组合物，优选式I的组合物或任意式F1-F22的组合物。适合于给药本发明组合物，优选式I或任意式F1-F22的组合物的药物递送的示范性延迟释放递送系统描述在美国专利4,452,775(授权给Kent)、5,239,660(授权给Leonard)和3,854,480(授权给Zaffaroni)中。
本发明药学上可接受的组合物包含本发明的一种或多种化合物，优选式I的化合物或式F1-F22的任意化合物，和一种或多种在本文中统称为″载体″物质的无毒性的药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或佐剂和/或赋形剂，并且如果需要，还可以包含其它活性组分。这些组合物可以含有常用载体和赋形剂，诸如玉米淀粉或明胶、乳糖、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露糖醇、磷酸二钙、氯化钠和藻酸。这些组合物可以含有交联羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、玉米淀粉、羟基乙酸淀粉钠和藻酸。
可以包括的片剂粘合剂为阿拉伯胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)、羟丙基甲基纤维素、蔗糖、淀粉和乙基纤维素。
可以使用的润滑剂包括硬脂酸镁或其它金属硬脂酸盐、硬脂酸、硅氧烷液、滑石、蜡、油和胶态二氧化硅。
还可以使用调味剂，诸如薄荷、冬青油、樱桃香精(cherry flavoring)等。另外需要加入着色剂以便使剂型在外观上更具有美感或有助于鉴别产品。
就口服应用而言，固体制剂，诸如片剂和胶囊特别有用。还设计了缓释制剂或肠溶包衣制剂。就儿科和老年医学应用而言，悬浮液、糖浆剂和咀嚼片尤其合适。对于口服给药，药物组合物为例如片剂、胶囊、悬浮液或液体的形式。优选制成含有治疗有效量的活性组分的剂量单位(dosage unit)形式的药物组合物。这类剂量单位的实例为片剂和胶囊。为了治疗目的，片剂和胶囊除含有活性组分外，还可以含有常用载体，诸如粘合剂，例如阿拉伯树胶、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇或西黄蓍胶；填充剂，例如磷酸钙、甘氨酸、乳糖、玉米淀粉、山梨醇或蔗糖；润滑剂，例如硬脂酸镁、聚乙二醇、二氧化硅或滑石；崩解剂，例如马铃薯淀粉、调味剂或着色剂；或可接受的湿润剂。口服液体制剂为水溶液或油溶液、悬浮液、乳剂、糖浆剂或酏剂的形式，它们可以含有常用添加剂，诸如悬浮剂、乳化剂、非水试剂、防腐剂、着色剂和调味剂。用于液体制剂的添加剂的实例包括阿拉伯胶、杏仁油、乙醇、分级分离的椰子油、明胶、葡萄糖糖浆、甘油、氢化可食用脂肪、卵磷脂、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、丙二醇、山梨醇或山梨酸。
就静脉内(IV)应用而言，可以将本发明的化合物溶于或悬浮于任意常用的静脉用液中并且通过输注给药。静脉用液包括，但不限于生理盐水或林格液。静脉内给药可以通过使用，但不限于注射器、微泵或静脉用管进行。
非肠道给药用制剂可以为含水或非水等渗无菌注射溶液或悬浮液的形式。可以由无菌粉末或颗粒制备这些溶液或悬浮液，该无菌粉末或颗粒具有一种或多种所述用于口服给药用制剂的载体。可以将化合物溶于聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、苄醇、氯化钠和/或各种缓冲液。
就肌内制剂而言，可以将本发明化合物或该化合物的适当可溶性盐，例如盐酸盐的无菌制剂溶于药用稀释剂，诸如注射用水(WFI)、生理盐水或5％葡萄糖并且以在药用稀释剂中的形式给药。可以制备化合物的适当不溶性形式并且作为在水基或药学上可接受的油基例如长链脂肪酸酯如油酸乙酯中的悬浮液给药。
可以将本发明化合物的静脉内、肌内或非肠道制剂的剂量以推注(bolus)或通过缓慢输注给药。推注为在小于30分钟内给予的剂量。在一个优选的实施方案中，在小于15分钟或小于10分钟内给予推注。在一个更优选的实施方案中，在小于5分钟内给予推注。在甚至更优选的实施方案中，在1分钟或小于1分钟内给予推注。输注为以30分钟或30分钟以上的速率给药的剂量。在一个优选的实施方案中，输注为1小时或1小时以上。在另一个实施方案中，输注基本上为恒定的。
就局部应用而言，还可以制备施用于皮肤或鼻和咽喉粘膜的合适形式的本发明化合物，优选式I的化合物或式F1-F22的任意的化合物，并且可以采用霜剂、软膏剂、液体喷雾剂或吸入剂、锭剂或咽喉涂剂的形式。这类局部用制剂可以进一步包括诸如二甲亚砜(DMSO)这类化合物以便有利于活性组分d表面渗透。
就施用于眼或耳而言，可以将本发明的化合物，优选式I的化合物或式F1-F22的任意的化合物在疏水性或亲水性基质中制成液体或半液体形式，如软膏剂、霜剂、洗剂、涂剂或粉末。
就直肠给药而言，可以以混合有常用载体，诸如可可脂、拉或其它甘油酯的栓剂形式给药本发明的化合物，优选式I的化合物或式F1-F22的任意的化合物。
或者，在一个实施方案中，本发明的化合物，优选式I的化合物或式F1-F22的任意的化合物可以为粉末形式，该粉末在递送时用适当的药学上可接受的载体重构(reconstitution)。在另一个实施方案中，化合物的剂量单位可以为在无菌密封安瓿或无菌注射器中化合物或优选其盐在合适的稀释剂中的溶液。例如，化合物在单位剂量中的浓度可以在约1％-约50％之间改变，这取决于所用的化合物及其溶解度和医师所希望的剂量。如果组合物含有剂量单位，那么各剂量单位优选含有1-500mg活性物质。就成年人治疗而言，所用的剂量优选在5mg-10g/天，这取决于给药途径和给药频率。
本发明在另一个方面中提供了抑制微生物，优选细菌生长的方法，包含使所述的生物体在允许化合物接触所述生物体和所述微生物的条件下接触本发明的化合物。这类条件为本领域技术人员公知的并且示例于实施例中。该方法包括使微生物细胞在体内或体外接触治疗有效量的本发明化合物，优选式I的化合物或式F1-F22的任意化合物。
按照本发明的该方面，将本文披露的新型组合物置于药学上可接受的载体中并且按照已知递药方法递送给接受的受治疗者(优选人)。一般而言，本发明用于体内递送本发明化合物的方法使用了递送试剂的公认方案，其中对在公认的方案中的药物而言，单一的实际操作步骤改变为替换本发明化合物，式I的化合物或式F1-F22的任意化合物。同样，例如，使用用于处理培养物中的细胞的请求保护的组合物消除或降低细胞培养物细菌污染水平的方法使用了公认的用抗菌剂处理细胞培养物的方案，其中对在公认方案中使用的试剂而言，单一的实际操作步骤改变为替换本发明化合物，式I的化合物或式F1-F22的任意化合物。
本发明在一个实施方案中提供了使用治疗有效量的本发明化合物治疗受治疗者感染，尤其是那些因革兰氏阳性菌导致的感染的方法。用于递送抗菌剂的示例性操作步骤描述在美国专利5,041,567和PCT专利申请EP94/02552(公开号WO 95/05384)中，将这些文件的全部内容完整地引入本文作为参考。本文所用的术语″治疗有效量″指预防细菌感染发作、缓解其症状或终止其发展的本发明化合物的用量。将术语″治疗″定义为对受治疗者给予治疗有效量的本发明化合物以便预防感染发生和控制或消除感染。将本文所用的术语″受治疗者″定义为哺乳动物、植物或细胞培养物。在一个优选的实施方案中，受治疗者为需要抗菌治疗的人或其它动物患者。
该方法包含对受治疗者给予有效剂量的本发明化合物。有效剂量一般在约0.1-约100mg/kg的本发明化合物或其药学上可接受的盐。优选剂量在约0.1-约50mg/kg本发明化合物或其药学上可接受的盐。更优选的剂量在约1-25mg/kg的本发明化合物或其药学上可接受的盐。用于细胞培养物的有效剂量通常为0.1-1000μg/mL，更优选0.1-200μg/mL。
可以将含有本发明化合物的组合物以每天一次剂量或以每天多次剂量的方式给药。治疗方案可要求在延长的时间阶段给药，例如几天或2-4周。 每次给药剂量的用量或总给药量取决于诸如感染的性质和严重程度、患者的年龄和综合健康情况、患者对化合物的耐受力以及感染中涉及的微生物或多种微生物这类因素。对患者给予达托霉素，即酯肽化合物类中的另一个成员的方法披露在美国专利6,468,967和6,852,689中，将这些文献的内容引入本文作为参考。
还可以将本发明的化合物给药在患者或动物的膳食或饲料中。如果作为总膳食摄取的组成部分给药，所用的化合物的量以膳食重量计可低于1％重量且优选不大于0.5％重量。用于动物的膳食可以为加入所述化合物的正常膳食或者将所述化合物加入预混物(premix)的正常膳食。
本发明还提供了对有此需要的受治疗者给予本发明化合物，优选式I的化合物或使F1-F22的任意化合物或其药物组合物的方法，其用量可有效减轻、改善或消除细菌感染。可以通过口服，非肠道，通过吸入，局部，直肠、鼻部，口含，阴道或通过植入的贮器，体外泵或导管给予所述的化合物。可以制备用于眼部(opthalmic)或雾化应用的化合物。可以将本发明的化合物作为气溶胶给药。优选的气溶胶递送媒介物为无水或干粉吸入器。还可以将式I的化合物或式F1-F22的任意化合物或其药物组合物直接或给药入脓肿、心室或关节。非肠道给药包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、池(cisternal)、鞘内、肝内、损害内(intralesional)和颅内注射或输注。在一个优选的实施方案中，通过静脉内、皮下、或口服给予本发明的化合物。在对细胞培养物给予式I的化合物或式F1-F22的任意化合物的一个优选实施方案中，可以在营养培养基中给予所述化合物。
本发明的方法可以用于治疗患有细菌感染的受治疗者，其中所述的感染因任意类型的细菌，特别是革兰氏阳性菌导致或加剧。在一个实施方案中，按照本发明的方法对受治疗者给予本发明的化合物或其药物组合物。在一个优选的实施方案中，细菌感染可以因革兰氏阳性菌导致或加剧。这些革兰氏阳性菌包括，但不限于甲氧西林敏感性和甲氧西林-抗性葡萄球菌(包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)、人葡萄球菌(S.hominis)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)和凝固酶-阴性葡萄球菌)、糖肽中等敏感性金黄色葡萄球菌(GISA)、万古霉素抗性金黄色葡萄球(VRSA)、表霉素敏感性和青霉素抗性链球菌(包括肺炎链球菌、酿脓链球菌(S.pyogenes)、无乳链球菌(S.agalactiae)、鸟肠球菌(S.avium)、牛链球菌(S.bovis)、乳酸链球菌(S.lactis)、血链球菌(S.sangius)和C族链球菌、G族链球菌和易变链球菌(viridans streptococci))、肠球菌(包括万古霉素敏感性和万古霉素抗性菌株，诸如粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和屎肠球菌(E.faecium))、艰难梭菌(Clostridium difficile)、梭状梭菌(C.clostridiiforme)、无害梭菌(C.innocuum)、产气夹膜梭菌(C.perfringens)、多枝梭菌(C.ramosum)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、杰氏棒肝菌(Corynebacteriumjeikeium)、双岐杆菌属的种类(Bifidobacterium spp.)、产气假杆菌(Eubacterium aerofaciens)、迟缓真杆菌(E.lentum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(L.casei)、植物乳杆菌(L.plantarum)、乳球菌属的种类(Lactococcus spp.)、明串珠菌属的种类(Leuconostoc spp.)、片球菌属(Pediococcus)、厌氧消化链球菌(Peptostreptococcus anaerobius)、不解糖消化链球菌(P.asaccarolyticus)、达消化链球菌(P.magnus)、微小消化链球菌(P.micros)、普氏消化链球菌(P.prevotii)、产生瘤胃球菌(P.productus)、疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、放线菌属的种类(Actinomyces spp.)、莫拉氏菌属的种类(Moraxella spp.)(包括粘膜炎莫拉氏菌(M.catarrhalis))和埃希氏杆菌属的种类(Escherichia spp.)(包括大肠杆菌(E.coli))。
在一个优选的实施方案中，在体外实验中，式I的化合物或式F1-F22的任意化合物对传统″抗性″菌株的抗菌活性与对传统″敏感性″菌株的抗菌活性相差无几。在另一个优选的实施方案中，本发明化合物对敏感性菌株的最小抑制浓度(MIC)值一般相同或低于万古霉素或达托霉素的相应值。因此，在一个优选的实施方案中，按照本发明方法对表现出耐受其它化合物，包括万古霉素或达托霉素的细菌感染患者给予本发明的化合物或其药物组合物。此外，不同于糖肽抗生素，诸如本发明中披露的那些酯肽化合物表现出对革兰氏阳性生物体的快速浓度依赖性杀菌活性。因此，在一个优选的实施方案中，可以按照本发明方法对需要抗生素疗法快速起效的患者给予本发明的化合物或其药物组合物。
本发明的方法可以用于任意体内器官或组织的任意细菌感染。在一个优选的实施方案中，细菌感染因革兰氏阳性菌导致。这些器官或组织包括，但不限于骨骼肌、皮肤、血流、肾、心脏、肺和骨。本发明的方法可以用于治疗，但不限于皮肤和软组织感染、菌血症和尿道感染。本发明的方法还可以用于包含不同类型革兰氏阳性菌或包含革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的混合感染。这些类型的感染包括腹内感染和产科/妇科感染。本发明的方法还可以用于治疗感染，包括，但不限于心内膜炎、肾炎、脓毒性关节炎、腹内脓毒症、骨和关节感染以及骨髓炎。在一个优选的实施方案中，可以使用本发明的化合物或其药物组合物治疗任意上述疾病。
还可以在同时给予一种或多种其它抗微生物剂的同时实施本发明的方法，所述的其它抗微生物剂诸如抗菌剂(抗生素)或抗真菌剂。在一个方面中，可以通过给予一种以上本发明的化合物实施该方法。在另一个实施方案中，可以通过给予本发明的化合物与脂肽化合物实施该方法，所述的脂肽化合物诸如达托霉素或例如美国专利US6,911,525；和US6,794,490以及国际专利申请WO01/44272；WO01/44274；WO01/44271和WO03/014147中的脂肽化合物。
可以与本发明化合物共同给予的抗菌剂及其类型包括，但不限于青霉素类和相关药物；碳青霉烯类；头孢菌素类和相关药物；氨基糖甙类；杆菌肽；短杆菌肽；莫匹罗星(mupirocin)；氯霉素；甲砜霉素；夫西地酸钠；林可霉素；克林霉素；大环内酯类；新生霉素；多粘菌素类；利福霉素类；大观霉素；四环素类；万古霉素；替考拉宁；链霉杀阳菌素；抗叶酸剂，包括磺胺类药物；甲氧苄啶及其组合物和乙胺嘧啶；合成抗菌剂，包括呋喃类药物、扁桃酸乌洛托品(methenamine mandelate)和马尿酸乌洛托品(methenamine hippurate)；硝基咪唑类；喹诺酮类；氟喹诺酮类；异烟肼；乙胺丁醇；乙胺丁醇；对氨基水杨酸(PAS)；环丝氨酸；卷曲霉素；乙硫异烟胺；丙硫异烟胺；氨硫脲；氨硫脲；晚霉素(everninomycin)；糖肽；甘氨酰环素；酮内酯类；噁唑烷酮类；亚胺培南(imipenen)；阿米卡星；奈替米星；磷霉素；庆大霉素；头孢曲松；

LY 333328；CL 331002；HMR 3647；

氨曲南甲硝唑；依匹普林；OCA-983；GV-143253；山费培南钠；CS-834；比阿培南；A-99058.1；A-165600；A-179796；KA 159；蒽环类抗生素A；DX8739；U 6681；头孢瑞南；ER 35786；头孢噻利；山费培南西酯(sanfetrinem celexetil)；HGP-31；头孢匹罗；HMR-3647；RU-59863；mersacidin；KP 736；利福拉齐；AM 1732；MEN 10700；来那培南；BO 2502A；NE-1530；PR 39；K130；OPC 20000；OPC 2045；veneprim；PD 138312；PD 140248；CP 111905；来那培南；利替培南酯(ritipenam acoxyl)；RO-65-5788；cyclothialidine；Sch-40832；SEP-132613；micacocidinA；SB-275833；SR-15402；SUNA0026；TOC 39；卡芦莫南；头孢唑兰；头孢他美匹伏酯；和T 3811。
可以与本发明化合物共同给予的抗真菌剂包括，但不限于卡泊芬净(caspofungen)、伏立康唑、舍他康唑、B-367、K-463、LY-303366、Sch-56592、西他沙星；DB-289聚烯类，诸如两性霉素；制霉菌素；primaricin；吡咯类，诸如氟康唑、伊曲康唑和酮康唑；烯丙基胺类，诸如萘替芬和特比萘芬；和抗代谢物，诸如氟胞嘧啶。其它抗真菌剂包括，但不限于那些披露在Fostel等，2000，Drug Discovery Today 525-32中的抗真菌剂，将该文献引入本文作为参考。Fostel等披露了抗真菌化合物，包括corynecandin、Mer-WF3010、fusacandins、artrichitin/LL 15G256、粪壳菌素、cispentacin、azoxybacillin、金担子素和khafrefungin。
可以按照该方法给予本发明的化合物，直到细菌感染得到根除或减轻。在一个实施方案中，将式I的化合物或式F1-F22的任意化合物给予2天到6个月的时间期限。在一个优选的实施方案中，将式I的化合物或式F1-F22的任意化合物给予7-56天。在一个更优选的实施方案中，将式I的化合物或式F1-F22的任意化合物给予7-28天。在甚至更优选的实施方案中，将式I的化合物或式F1-F22的任意化合物给予7-14天。只要需要，就可以将式I的化合物或式F1-F22的任意化合物给予较长或较短的时间期限。
在一个实施方案中，本发明提供了包含式I的化合物或式F1-F22的任意化合物或其盐的抗菌组合物或制剂。在一个实施方案中，抗菌组合物可以包含在水溶液中。在另一个实施方案中，可以对水溶性进行缓冲。在另一个实施方案中，所述的缓冲液可以具有酸性、中性或碱性pH。
新酯肽类的制备 1.合成方法 在本发明的一个实施方案中，可以使用固相载体化学制备式I化合物或式F1-F22的化合物。三种优选的方法，即方法A-C生成了树脂结合的线性前体nn3、nn3a或nn3b。
正如方案I中概括的，方法A使用树脂结合的7氨基酸衍生的多肽片段nn1和6氨基酸衍生的多肽片段nn2。该方法称作“7+6片段合成”。
方案I 方法A“7+6”片段合成
或者，如方案II中所述，方法B使用了树脂结合的6氨基酸衍生的多肽片段nn1a和7氨基酸衍生的多肽片段nn2a。该方法称作“6+7片段合成”。
方案II 方法B.“6+7”片段合成
另一种方法，即方法C使用了6氨基酸衍生的多肽，即树脂结合的氨基酸，和第二种6氨基酸衍生的多肽。该方法称作“1+6+6片段合成”。
方案III 方法C.“1+6+6”片段合成
酯肽化合物的固相载体合成方法A7+6片段合成 可以在如下列方案IV、方案V和方案VI中概括的固相载体上合成式I的酯肽化合物。
方案IV
在第一步中，使被保护的谷氨酸-衍生物，诸如商购的N-α-Fmoc-L-谷氨酸α-烯丙酯或N-Fmoc-L-3-甲基谷氨酸α-烯丙酯(参见实施例1-68和1-69，参见下文)与树脂偶联而得到化合物nn5，其中R12如上述所定义。在该反应中可以使用树脂或固相载体，诸如，但不限于Wang、HMPA、Safety Catch、RinkAcid、2-氯三苯甲基-氯树脂、三苯甲基-氯树脂、4-甲基三苯甲基-氯树脂、4-甲氧基三苯甲基-氯树脂或PAM树脂。选择保护基P1和P2，以便可以彼此独立地除去它们并且不会从树脂上对肽进行裂解。保护基的实例可以在Theodora W.Greene的“Protecting Groups in Organic Synthesis”中找到(参见上文)，在下文中称作“Greene”，将该文献引入本文作为参考。保护基组合，诸如，但不限于P1为烯丙酯且P2为Fmoc的组合适合于该反应。
使化合物nn5的胺脱保护，随后使游离氨基与氨基酸或被保护的氨基酸偶联而得到化合物nn6，其中P3为可以与P1独立地被除去的保护基并且不会从树脂上对肽进行裂解；R11A为氨基酸侧链、被保护的氨基酸侧链、甲基、CH2-OP4或CH2-CONHP5；P4和P5各自独立为合适的保护基并且P1和R11*各自如上述所定义。重复这种肽偶联方法，即，使α-氨基脱保护，随后与被保护的氨基酸偶联，直到所需数量的氨基酸与树脂偶联。在方案IV中，使总计7个氨基酸偶联而得到化合物nn1，其中 R6A为甲基或

R6*A为被保护的氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基，只要R6*A与从肽上除去树脂所要求的条件相容；R8A为氨基酸侧链、被保护的氨基酸侧链、甲基、CH2-OP6、CH2-CONHP5*或

其中P5*和P6各自独立为合适的保护基；其中R8**A为被保护的氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基，只要R8*A与从肽上除去树脂所要求的条件相容； 其中R9A为

或被至少一种式

的羧酸基团取代的氨基酸侧链；P7为可以与P1独立地被除去并且不会从树脂上对肽进行裂解的保护基；P8和P9各自独立地为合适的保护基，使得P1和P7可以与P8和P9各自独立地被除去，并且在从树脂上裂解时可各自裂解P8和P9；并且P1、R8*、R9A、R11*、R11A和R12如上述所定义。
按照如方案V中概括的类似的方式使第二种肽与树脂偶联。
方案V
在步骤1中，使N-保护的-甘氨酸，诸如商购的Fmoc-N-甘氨酸与树脂偶联而得到化合物nn7，其中R5A和R5*A独立为氢且P10为选择的保护基，使得可以在不从树脂上对肽进行裂解的情况下除去它。步骤1中使用的树脂的选择依赖于步骤2-6中偶联的氨基酸的性质。如果氨基酸侧链含有保护基，那么必须选择树脂，以便在步骤7中从肽上除去树脂时，保护基仍保留完好。可以在保护肽类保护基的同时裂解的树脂包括，但不限于SafetyCatch、Rink Acid、2-氯三苯甲基-氯树脂、三苯甲基-氯树脂、4-甲基三苯甲基-氯树脂、4-甲氧基三苯甲基-氯树脂或PAM树脂。
使化合物nn7被保护的氨基脱保护，随后使游离氨基与n14偶联
得到化合物nn8，其中P11为选择的保护基，使得可以在不从树脂上对肽进行裂解的情况下除去它。重复这种肽偶联方法，即，使α-氨基脱保护，随后与被保护的氨基酸偶联，直到所需数量的氨基酸与树脂偶联。在方案V中，使5个氨基酸偶联而得到化合物nn11，其中R1A为被保护的氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基，只要R1A与从肽上除去树脂所要求的条件相容；R2A为氨基酸侧链、被保护的氨基酸侧链、CH2-CH2-CO2P14或CH2-CONHP15；R3A为CH2-CO2P16、CH(OP17)CONH2、CH2CONH2、非蛋白质原的氨基酸侧链或被保护的非蛋白质原的氨基酸侧链；P12和P13各自为选择的保护基，使得可以在不从树脂上对肽进行裂解的情况下除去它；P14、P15、P16和P17各自独立为合适的保护基；且R2*、R5A和R5*A如上述所定义。
化合物n11与
偶联而得到化合物n12，其中P18为合适的保护基并且R13A为CH(CH3)2、CH(CH2CH3)CH3

或
然后从树脂上除去肽n12而得到化合物nn2，其中P19为合适的保护基。
方案VI中概括了肽片段nn1和nn2的偶联。
方案VI
使肽片段nn1和nn2偶联而得到树脂结合的肽nn3，其中R1A、R2*、R2A、R3A、R5A、R5*A、R6A、R8*、R8A、R9A、R11A、R11*、R12、R13A、P1、P8，和P18如上述所定义。使P1和P18保护基脱保护，随后环化得到树脂-结合的酯肽nn4，其中R1A、R2*、R2A、R3A、R5A、R5*A、R6A、R8*、R5A、R9A、R11A、R11*、R12、R13A和P8如上述所定义。从树脂上裂解酯肽并且使任何余下的保护基脱保护而得到式I的化合物。
酯肽化合物固相载体合成的方法B 6+7片段合成 可以如方案VII、VIII和IX所述在固相载体上合成式I的酯肽化合物。
方案VII
如方法A中所述制备化合物nn6。重复这种肽偶联方法(参见上文)，即，使α-氨基脱保护，随后与被保护的氨基酸偶联，直到所需数量的氨基酸与树脂偶联。在方案VII中使总计6个氨基酸偶联而得到化合物nn1a，其中R8*、R8A、R9A、R11*、R11A、R12、P1和P8如上述所定义，并且P20为可以与P1独立地除去并且不从树脂上对肽进行裂解的保护基，诸如P1为烯丙基且P20为Fmoc。
如方案VIII中概括的类似方式使第二种肽与树脂偶联。
方案VIII
在步骤1中，使N-保护的-氨基酸与树脂偶联而得到化合物n16，其中P21为可以在不从树脂上对肽进行裂解的情况下除去的保护基并且R6A如上述所定义。步骤1中使用的树脂的选择依赖于步骤2-6中偶联的氨基酸的性质。如果氨基酸侧链含有保护基，那么必须选择树脂，以便在步骤8中从肽上除去树脂时，保护基仍保留完好。可以在保护肽类保护基的同时裂解的树脂包括，但不限于Safety Catch、RinkAcid、2-氯三苯甲基-氯树脂、三苯甲基-氯树脂、4-甲基三苯甲基-氯树脂、4-甲氧基三苯甲基-氯树脂或PAM树脂。
使化合物n16被保护的氨基脱保护，随后使游离氨基与第二种被保护的氨基偶联而得到化合物n17，其中P22为可以在不从树脂上对肽进行裂解的情况下除去的保护基；并且R5、R5*和R6如上述所定义。
使化合物n17被保护的氨基脱保护，随后使游离氨基与n14(参见上文)偶联而得到化合物n18，其中R5、R5*、R6A和P9如上述所定义。重复这种肽偶联方法，即，使α-氨基脱保护，随后与被保护的氨基酸偶联，直到所需数量的氨基酸与树脂偶联。在方案VIII中，使总计6个氨基酸偶联而得到化合物n21，其中P23和P24各自为可以在不从树脂上对肽进行裂解的情况下除去的保护基；R1A、R2A、R2*、R3A、R5、R5*和R6A如上述所定义。
使化合物n21与n15区偶联(参见上文)而得到化合物n22，其中R1A、R2A、R2*、R3A、R5、R5*、R6A、R13A和P18如上述所定义。
然后从树脂上除去肽n22而得到化合物nn2a，其中R1A、R2A、R2*、R3A、R5、R5*、R6A、R13A和P18如上述所定义。
在方案IX中概括了肽片段nn1a和nn2a的偶联。
方案IX
使肽片段nn1a和nn2a偶联而得到树脂结合的肽nn3a，其中R1A、R2A、R2*、R3A、R5、R5*、R6A、R8*、R8A、R9A、R11*、R11A、R12、R13A、P1、P8、P9和P18如上述所定义。
使P1和P18保护基脱保护，随后环化得到树脂-结合的酯肽nn4a，其中其中R1A、R2A、R2*、R3A、R5、R5*、R6A、R8*、R8A、R9A、R11*、R11A、R12、R13A和P8如上述所定义。
从树脂上裂解酯肽并且使任意剩余的保护基脱保护而得到式I的化合物。
酯肽化合物固相载体合成的方法C 1+6+6片段合成 在本发明可选的实施方案中，可以如方案X-XII中所述合成式I的酯钛化合物。
方案X
在步骤1中，使被保护的-β-甲基谷氨酸衍生物，诸如商购的N-α-Fmoc-L-谷氨酸α-烯丙酯或N-Fmoc-L-3-甲基谷氨酸α-烯丙酯(参见实施例1-68和1-69，参见下文)与树脂偶联而得到化合物n23，其中R12A为甲基。树脂或固相载体，诸如，但不限于Wang、HMPA、Safaty Catch、Rink Acid、2-氯三苯甲基-氯树脂、三苯甲基-氯树脂、4-甲基三苯甲基-氯树脂、4-甲氧基三苯甲基-氯树脂或PAM树脂可以用于该反应。选择保护基P25和P26，以便可以将它们彼此独立地除去并且不从树脂上对肽类进行裂解。诸如，但不限于P25为烯丙酯且P26为Fmoc的保护基组合适合于该反应。
按照如方案XI中概括的类似的方式使第二种肽与树脂偶联。
方案XI
在步骤1中，使被保护的氨基酸与树脂偶联而得到化合物n24，其中P27为可以在不从树脂上对肽进行裂解的情况下除去的保护基；R11*和R11A如上述所定义。在第一步中使用的树脂的选择依赖于在进行的步骤中偶联的氨基酸的性质。如果氨基酸侧链含有保护基，那么必须选择树脂，以便在从树脂上除去肽时，这些保护基仍然保留完好。可以在保护肽类保护基的同时裂解的树脂包括，但不限于Safety Catch、Rink Acid、2-氯三苯甲基-氯树脂、三苯甲基-氯树脂、4-甲基三苯甲基-氯树脂、4-甲氧基三苯甲基-氯树脂或PAM树脂。
重复这种肽偶联方法，即，使α-氨基脱保护，随后与被保护的氨基酸偶联，直到所需数量的氨基酸与树脂偶联。在方案XI中，使总计6个氨基酸偶联而得到化合物n25，其中P28为可以在不从树脂上对肽进行裂解的情况下除去的保护基；R6A、R8*、R8A、R9A、R11*、R11A和P8如上述所定义。
从树脂上裂解肽而得到化合物n26。在方案XII中概括了3肽片段的偶联。
方案XII
使R12A如上述所定义的树脂结合的3-甲基谷氨酸盐n23脱保护而得到游离胺，然后与片段n26偶联而得到树脂结合的片段nn1b，其中R11A、R11*、R9A、R8A、R8*、R6A、P8、P25和P28如上述所定义。然后使其如上所述与所述的片段nn2偶联而得到nn3b，其中R1A、R2A、R2*、R3A、R5*A、R5*A、R6A、R8*、R8A、R9A、R11*、R11A、R12A、R13A、P1、P8和P18如上述所定义。如方法A中所述脱保护和环化而得到树脂-结合的酯肽nn4b，其中R1A、R2A、R2*、R3A、R5*A、R5*A、R6A、R8*、R8A、R9A、R11*、R11A、R12A、R13A和P8如上述所定义。从树脂裂解酯肽，随后使任意剩余的保护基脱保护而得到式I的化合物。
按照上述合成方案(方案IV-XII)，可以理解，必须使氨基酸氨基与氨基酸侧链官能基成直角保护(ortogonally protected)，此后使它们与生长的肽链连接。合适的保护基可以为用于肽合成的任意保护基。这类保护基的配对是众所周知的。例如，参见″Synthesis Notes″in the Novabiochem Catalog andPeptide Synthesis Handbook，1999，S1-S93页和其中引用的参考文献。
本领域技术人员还可以理解对氨基酸侧链官能基上保护基的选择将导致或不会导致保护基与肽从树脂上进行最终裂解的同时被裂解，这将分别得到天然氨基酸官能度或其被保护的衍生物。当从树脂上裂解酯肽而不同时裂解保护基时，额外的脱保护可能是必不可少的。
对本领域技术人员显而易见的是，不仅可以通过如上所述的方法A-C，而且还可以通过合并任意两个片段对获得线性前体nn3 nn3a或nn3b和由此的中间体nn4 nn4a和nn4b及最终产物I。通过使序列中任意两种氨基酸之间的式I化合物碎片化可以预想到这些片段对，即1+12，2+11，3+10等。

或者，可以在通过美国专利6,911,525和6,794,490以及国际专利申请WO01/44272、WO01/44274、WO01/44271和WO03/014147中所述的方法形成酯之前通过线性装配形成所述的化合物。或者，可以通过装配多个片段形成所述的化合物。
尽管上述方法使用了树脂化学，但是这些方法还适合于溶液-相肽化学。
或者，可以通过国际专利申请WO2005/012541中所述的方法形成本发明的化合物。
2.生物合成方法 非核糖体肽合成酶途径 细菌，包括放线菌属(actinomycetes)，和真菌合成不同阵列的低分子量肽和聚酮化合物(约2-48个残基长度)。这些化合物的生物合成由非核糖体肽合成酶(NRPSs)和聚酮化合物合成酶(PKSs)催化。与由核糖体从RNA模板翻译的肽类相比，不包括按照遗传代码进行核糖体介导的RNA翻译的NRPS方法能够产生表现出巨大结构差异的肽类。它们包括D-和L-氨基酸和羟基酸的引入；形成线性、环状或支化环状结构的肽主链中的变化；和附加的结构修饰，包括氧化、酰化、糖基化、N-甲基化和杂环形成。已经发现许多非核糖体合成的肽类具有有用的药理学(例如抗生素、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫、铁载体、细胞生长抑制、免疫抑制、抗胆甾醇血和抗癌)、农用化学或物理化学(例如生物表面活性剂)特性。
非核糖体合成的肽类由包含一个或多个亚基的大的(例如约200-2000kDa)多功能NRPS酶复合物装配。实例包括达托霉素、A54145、万古霉素、棘球白素(echinocandin)和环孢霉素。同样，聚酮化合物由包含一个或多个种亚基的大的多功能PKS酶复合物装配。实例包括红霉素、泰乐菌素、莫能霉素和阿弗菌素。在某些情况中，可以通过混合的PKS/NRPS系统合成复合分子。实例包括雷帕霉素(rapamycin)、博来霉素(bleomycin)和埃坡霉素(epothilone)。
NRPS通常由构成NRPS复合物的一个或多个可读框组成。NRPS复合物作为包含一系列蛋白质生物合成单位的蛋白质模板起作用，装配所述的蛋白质生物合成单位是为了结合和活化特定结构单元底物和催化肽链形成和延伸(例如，参见Konz和Marahiel，1999，Chem.Biol.639-48和其中引述的参考文献；von

等，1999，Chem.Biol.6273-279和其中引述的参考文献；和Cane和Walsh，1999，Chem.Biol.6319-325和其中引述的参考文献-将这些文献各自完整地引入本文作为参考)。NRPS或NRPS亚基各自包含一个或多个组件。将“组件”定义为将单一结构单元(例如氨基酸)引入生长的肽链的催化单位。形成NRPS蛋白质模板的生物合成组件的顺序和特异性规定了最终肽产物的序列和结构。
NRPS的各组件起半自主性活性位点的作用，所述的活性位点含有导致肽链延伸所需催化特定反应的不连续的折叠蛋白质结构域。最小组件(在单一组件复合物中)由至少两个核心结构域组成1)导致氨基酸活化(或有时导致羟基酸活化)的腺苷酸化结构域；和2)导致活化的中间体转移至酶结合泛酰巯基乙胺辅因子的巯化或酰基载体结构域。大部分组件还含有3)导致催化活化中间体之间肽键形成的缩合结构域。补充这三个核心结构域的为可变数目的额外结构域，它们可以介导，例如结合的氨基酸中间体的N-甲基化(M或甲基化结构域)和L-至D-转化(E或表异构化结构域)和杂环形成(Cy或环化结构域)。这些结构域的特征通常在于特定的氨基酸基元或特征。就是对在附近组件内的束缚中间体局部起作用的这类辅助结构域的组合，提供了NRPS和混合的NRPS/PKS酶复合物装配的成熟肽产物巨大的结构和功能多样性。
各最小组件的腺苷酸化结构域催化对关连氨基酸的特异性识别和活化。在这一非核糖体肽生物合成的早期步骤中，各NRPS组件的关连氨基酸与腺苷酸化结构域结合并且被活化为不稳定的腺苷酸酰基酯(与ATP-水解同时进行)。例如，参见Stachelhaus等，1999，Chem.Biol.6493-505和Challis等，2000，Chem.Biol.7211-224，将它们各自完整地引入本文作为参考。在大部分NRPS组件中，腺苷酸酰基酯中间体随后被转移至组件的T(巯化)结构域(也称作肽基载体蛋白或PCP结构域)，其中它被转化成硫酯中间体并且通过转硫醇反应而被束缚在共价结合的酶辅因子上(4’-磷酸泛酰巯基乙胺基(4’-PP)中间体)。导致引入D-构型化或N-甲基化氨基酸的组件可以具有额外的修饰结构域，在研究的几种NRPS中，这些结构域位于A与T结构域之间。
在各组件中的酶结合的中间体随后通过逐步缩合反应被装配成肽产物，所述的逐步缩合反应包括将一个组件中一个残基的硫酯活化的羧基转移至例如下一个组件中的下一个氨基酸的相邻氨基上，同时中间体仍然保持与NRPS共价连接。每一缩合反应由通常位于两个最小组件之间的缩合结构域催化。NRPS中缩合结构域的数目一般相当于存在于最终(线性)肽中的肽键的数目。在几种NRPS(例如在环孢霉素合成酶的氨基末端和雷帕霉素的羧基末端；例如，参见Konz和Marahiel，文献同上)中发现了额外的C结构域，已经提出它涉及肽链终止和环化反应。然而，许多其它NRPS复合物在由C-末端硫酯酶(Te)结构域(具有约28K-35K的相对分子量)催化的反应中释放全长链。
大部分NRPS复合物的硫酯酶结构域使用催化三联体(与众所周知的胰凝乳蛋白酶结构的催化三联体类似)，它相对于组氨酸和酸性残基而言在保守的三维构造中包括保守的丝氨酸(较不常见的是半胱氨酸或天冬氨酸)。例如，参见V.De Crecy-Lagard在“Comprehensive Natural Products Chemistry”，Volume 4，ed.by J.W.Kelly，Elsevier，New York，1999，pp.221-238中所述，将 该文献完整地引入本文作为参考。硫酯裂解是两步过程。在第一(酰化)步中，全长肽链从巯化结构域中巯基束缚的酶中间体(参见上文)转移至Te结构域中的保守丝氨酸残基，从而形成酰基-O-Te酯中间体。在第二(脱酰化)步中，Te结构域丝氨酸酯中间体被水解(由此释放线性全长产物)或进行环化，这取决于酯中间体是受到水(水解)还是活化的分子内亲核体(活化)的攻击。
来自NRPS超家族不同成员的C-末端硫酯酶结构域的序列比较已经揭示出包含丝氨酸催化残基的保守基元(GXSXG基元)，通常随后是距保守丝氨酸残基约25个氨基酸下游的天冬氨酸残基。已知第二类硫酯酶，即游离硫酯酶参与某些肽和聚酮化合物二次代谢物的生物合成。例如，参见Schneider和Marahiel，1998，Arch.Microbiol.169404-410，和Butler等，1999，Chem.Biol.687-292，将这些文献各自完整地引入本文作为参考。通常需要这些硫酯酶来进行有效天然产物合成(参见美国专利申请号20020192773)。Butler等已经推定在聚酮化合物泰乐菌素基因簇中发现的游离硫酯酶-需要它有效进行泰乐菌素生产-可能涉及编辑和校正功能。
NRPS多酶复合物的组件构成反映在编码组件的基因组DNA水平上。已经研究了编码几种不同NRPS的基因的构成和DNA序列(例如，参见Marahiel，1997，Chem.Biol.4561-567，将该文献完整地引入本文作为参考)。已经通过比较来源于许多不同生物体的NRPS序列鉴定了表现特定NRPS功能结构域的保守序列并且已经将那些保守序列基元用于设计可用于鉴定和分离新NRPS基因和组件的探针。
可以利用PKS和NRPS酶复合物的组件结构以便通过遗传工程和体内重组在DNA水平上改变组件的数目和位置来改造具有新特异性的新酶。例如，已经基于全组件融合构建功能性杂种NRPS。例如，参见Gokhale等，1999，Science 284482-485；Mootz等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.975848-5853，将这些文献完整地引入本文作为参考。可以将重组技术用于成功地交换来自异源PKS或NRPS复合物的结构域。例如，参见Schneider等，1998，Mol.Gen.Genet.257308-318；McDaniel等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.961846-1851；美国专利号5,652,116和5,795,738；和国际专利号WO 00/56896；将这些文献完整地引入本文作为参考。
还描述了通过改变形成腺苷酸化结构域的底物结合袋的残基改造组件内的新底物特异性。例如，参见Cane和Walsh，1999，Chem.Biol.6319-325；Stachelhaus等，1999，Chem.Biol.6493-505；和国际专利申请号WO 00/52152；将这些各自文献完整地引入本文作为参考。例如，通过将枯草芽孢杆菌(B.subtilis)肽合成酶GrsA腺苷酸化结构域(PheA，其结构已知)的序列与来自原核和真核NRPS的160种其它腺苷酸化结构域的序列进行比较，Stachelhaus等(上文)和Challis等，2000，Chem.Biol.7211-224定义了用于各种氨基酸底物的腺苷酸化(A)结构域特征序列(与遗传密码的密码子类似)。由那些特征序列的集合整理了推定的NRPS赋予选择性密码(具有类似于遗传密码的简并性)。
通过添加、缺失或交换组件(或通过添加、缺失或交换一种或多种组件内的结构域)改造具有新组件模板结构和新底物特异性的NRPS的能力能够产生具有改变的或潜在有利的特性的新肽类。例如，通过取代来自雷帕霉素PKS(编码可变底物特异性)的对应序列系统性修饰合成红霉素前体(DEBS)的PKS，制备包含50种以上新的聚酮化合物的组合文库。例如，参见国际专利申请号WO 00/63361和McDaniel等，1999，上文，将该文献完整地引入本文作为参考。
达托霉素为通过NRPS制备的非核糖体合成的肽的实例(附图1)。编码达托霉素生物合成途径中涉及的蛋白质，包括达托霉素NRPS的基因的修饰提供了生产修饰的玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)(NRRL 11379)以及其它宿主菌株的第一步，所述的菌株可以产生改进的抗生素(例如具有更大的功效)；可以产生增加量的天然或新的抗生素；或可以产生具有有用的生物特性的其它肽产物。涉及玫瑰孢链霉菌达托霉素生物合成基因簇，包括分离的核酸和分离的蛋白质的组合物和方法描述在国际专利申请号WO03/014297中；将该文献引入本文作为参考。
A54145为通过NRPS制备的非核糖体合成的肽的另一个实例。A54145为通过弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)(NRRL 18158)发酵产生的环状脂肽抗生素。A54145包含通过3-氨基酸链与环状10-氨基酸肽的N-末端色氨酸连接的脂肪酸链(附图2)。该化合物具有与A21978C/达托霉素相似的对下列各种菌株的体外抗菌活性金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)和肠球菌。涉及弗氏链霉菌A54145生物合成基因簇，包括分离的核酸和分离的蛋白质的组合物和方法描述在国际专利申请号WO03/060127中；将该文献引入本文作为参考。
编码A54145生物合成途径中涉及的蛋白质，包括A54145 NRPS的基因提供了生产修饰的弗氏链霉菌以及其它宿主菌株的第一步，所述的菌株可以产生改进的抗生素(例如具有更大的功效)；可以产生增加量的天然或新的抗生素；或可以产生具有有用的生物特性的其它肽产物。
改变通过NRPS生产新化合物的基因簇的方法 NRPS多肽组件和结构域的改变 本发明在一个方面中提供了改变NRPS中组件的数目或位置以便获得式I的化合物或式F1-F22任一的化合物的方法。在一个实施方案中，可以从NRPS中缺失一个或多个结构域。在这种情况中，例如，如果缺失表异构化和/或甲基化结构域，那么通过NRPS产生的产物相对于没有缺失存在下产生的肽而言具有化学改变。
在另一个实施方案中，可以向NRPS中添加一个或多个结构域。在这种情况中，通过NRPS合成的肽具有额外的化学改变。例如，如果添加表异构化或甲基化结构域，那么所得肽分别含有额外的D-氨基酸或含有甲基化氨基酸。在另一个实施方案中，可以使一个或多个组件突变，例如，可以使腺苷酸化结构域突变，使得它具有不同于天然存在的腺苷酸化结构域的氨基酸特异性。凭借手中的氨基酸密码，本领域技术人员可以通过各种众所周知的技术实施诱变，以便将一个组件中的密码与另一种密码交换，由此改变通过改变的NRPS合成的所得肽的最终氨基酸组成和/或序列。在另一个实施方案中，可以向NRPS中添加或缺失一个或多个亚基。
在另一个实施方案中，一个或多个结构域、组件或亚基可以被另一个结构域、组件或亚基取代，以便通过补足产生新的肽类(参见国际专利申请号WO 01/30985，该文献中特别提供了取代组件的方法)。在这种情况中，例如，通过改变的NRPS产生的肽具有一个或多个与天然存在肽相比不同的氨基酸。此外，可以将结构域、组件或亚基的插入、缺失、取代和突变的不同组合用于产生感兴趣的肽。例如，可以用修饰的组件、结构域或亚基取代天然存在的组件、结构域或亚基，或可以用来自一种生物体的NRPS的天然存在的组件、结构域或亚基取代来自另一种生物体的NRPS的组件、结构域或亚基。可以通过定点诱变、结构域交换(用于组件或亚基修饰)、缺失、插入或取代组件或亚基中的结构域或缺失、插入或取代亚基中的组件对组件、结构域和亚基进行修饰。此外，可以使用本领域任意公知的方法破坏结构域、组件或亚基，使得它不起作用。这些破坏包括例如，诸如单交换破坏(single crossover disruptant)或通过用另一基因(例如允许选择或筛选的基因)同源重组取代这类技术。
通过修饰的NRPS复合物产生的产物具有不同的引入的氨基酸，不同的氨基酸化学改变(例如甲基化和表异构化)。结构域，组件或亚基可以来源于任意数目的所需NRPS，包括两种、三种或四种NRPS。此外，本发明关注这些具有和没有整合的硫酯酶结构域的这些改变的NRPS复合物。
组件、结构域和/或亚基的来源可以来源于达托霉素生物合成基因簇NRPS，A54145生物合成基因簇NRPS或可以来源于编码另一种脂肽的任意NRPS或其它肽来源。这些肽来源包括糖肽基因簇，混合途径基因簇和铁载体基因簇。人工NRPS和制备它们的方法描述在国际专利申请号WO01/30985中，将该文献引入作为参考。此外，组件、结构域和/或亚基的来源可以获自任意适当的来源，包括链霉菌和非-链霉菌来源。非-链霉菌来源包括放线菌属，例如拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)；原核非放线菌属，例如芽孢杆菌属(Bacillus)和蓝细菌(cyanobacteria)；和非-细菌来源，例如真菌。
NRPS或其部分对感兴趣的宿主细胞而言可能是异源的或对宿主细胞而言可以是内源的。在一个实施方案中，用本领域技术人员公知的任意载体，例如质粒、粘粒、噬菌体或BAC将NRPS或其部分(例如其结构域、组件或亚基)导入宿主细胞。导入了NRPS或其部分的宿主细胞可以含有内源性RPS或其部分(例如其结构域、组件或亚基)。或者，可以将异源NRPS或其部分导入含有异源性NRPS或其部分的宿主细胞。第一种NRPS或另一种NRPS或NRPS的结构域、组件或亚基可以具有天然存在的或修饰的序列。在另一个实施方案中，NRPS或其部分对宿主细胞而言为内源性的，例如，就A54145而言，宿主细胞为弗氏链霉菌，或就达托霉素而言，宿主细胞为玫瑰孢链霉菌。可以将天然存在或修饰的NRPS或其结构域、组件或亚基导入包含内源性NRPS或其部分的宿主细胞。异源结构域、组件、亚基或NRPS可以包含组成型或可调节启动子，它们对本领域技术人员而言是公知的。启动子对导入了细胞的核酸分子而言可以为同源或异源的。在某些实施方案中，启动子可以如上所述来自A54145生物合成基因簇或达托霉素生物合成基因簇。
可以以附加体方式维持包含NRPS或其部分(例如结构域、组件或亚基)的核酸分子或将其整合入基因组。例如，可以将核酸分子导入基因组的噬菌体整合位点上。此外，可以将核酸分子导入基因组的内源性或异源性NRPS或其部分上或基因组中的其它处。可以以这类方式导入核酸分子以便破坏已经存在于基因组中的NRPS的结构域、组件或亚基的所有或部分功能，或可以按照不破坏NRPS或其部分的功能的方式导入核酸分子。
可以将通过这些NRPS产生的肽类用作新化合物或可以用于生产新化合物。在一个优选的实施方案中，新化合物用作或可以用于生产抗生素化合物。在另一个实施方案中，新化合物用作或可以用于生产具有有用活性的其它肽类，包括，但不限于抗生素、抗真菌、抗病毒、抗寄生虫、抗有丝分裂、细胞生长抑制、抗肿瘤、免疫调节、抗胆甾醇血、铁载体、农用化学(例如杀虫)或物理化学(例如表面活性剂)特性。
还可以通过在异源宿主细胞，即在非NRPS和PKS基因或组件所来源的那些宿主细胞中表达一种或多种NRPS和PKS基因(编码天然、杂交，否则就是改变的组件或结构域)获得非核糖体合成的肽类和聚酮化合物的额外多样性。
3.后肽修饰 可以通过下列步骤获得本发明的化合物首先通过上述任意方法装配分子母核，随后如美国专利号6,911,525；和6,794,490和国际专利申请号WO01/44272；WO01/44274；和WO01/44271中所述对所有或某些剩余的伯氨基进行合成操作。
用试剂，诸如异氰酸酯类、异硫氰酸酯类、活化的酯类、酰基氯类、磺酰氯类或活化的磺酰胺类、带有易于取代的基团的杂环、亚氨酸酯类、内酯类处理伯氨基，或用醛类还原处理而得到化合物，其中取代基R1、Raa1、Raa2、R6*和R8**中的一个或多个独立为单取代的氨基、二取代的氨基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
为了进行这些修饰，必须保护分子上的某些官能基。根据本发明披露的内容，保护这些官能基应属于本领域技术人员的专业技能范围。例如，参见Greene，文献同上。
可以表达重组NRPS的细胞和制备它们的方法 本发明包括可以表达重组NRPS基因簇的细胞和制备它们的方法，所述的重组NRPS基因簇能够表达重组NRPS并且能够产生本发明的各种化合物。在某些具体的实施方案中，所述的细胞可以为革兰氏阳性细胞，包括浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)或玫瑰孢链霉菌。在本发明的其它具体的实施方案中，由来自达托霉素或A54145 NRPS基因簇的组件装配重组NRPS。可以使用本领域公知或本文中典型的重组技术“交换”这些基因。在其它实施方案中，使重组NRPS中的某些基因失活或“敲除”它们以便消除细胞中的表达产物及其活性。[JILL，SHOULD WE MENTION 3MG HERE AND lptl？] 在一个优选的实施方案中，将细菌宿主细胞用于表达本发明的核酸分子。用于细菌宿主的有用的表达载体包括细菌质粒，诸如那些来自大肠杆菌或链霉菌属的质粒，包括pBluescript；pGEX-2T；pUC载体；col E1；pCR1；pBR322；pMB9及其衍生物；较宽宿主范围的质粒，诸如RP4；噬菌体DNA，例如噬菌体λ的大量衍生物，例如NM989、λGT10和λGT11；和其它噬菌体，例如M13和丝状单链噬菌体DNA。优选的载体为细菌人工染色体(BAC)。更优选的载体为如国际专利申请号03/014297的实施例2中所述的pStreptoBAC。
在其它实施方案中，可以使用真核宿主细胞，诸如酵母、昆虫或哺乳动物细胞。酵母载体包括酵母整合质粒(例如YIp5)和酵母复制质粒(YRp和YEp系列质粒)、酵母着丝粒质粒(YCp系列质粒)，pGPD-2、2μ质粒及其衍生物和改进的穿梭载体，诸如那些描述在Gietz和Sugino，Gene，74，pp.527-34(1988)中的穿梭载体(YIplac、YEplac和YCplac)。可以使用各种质粒，包括pSV2、pBC12BI和p91023以及裂解病毒载体(例如牛痘病毒、腺病毒和杆状病毒)、附加型病毒载体(例如牛乳头瘤病毒)和逆转录病毒(例如鼠逆转录病毒)在哺乳动物细胞中进行表达。用于昆虫细胞的有用载体包括杆状病毒载体和pVL 941。
本发明的其它方面提供了化合物和由本文所述的重组细胞制备该化合物的方法。可以通过使用本领域公知或本文所述的技术和条件培养细胞来生产所述的化合物。用于培养细胞的条件可以包括使用促进本发明具体化合物生产的脂肽尾前体发酵细胞。这种前体可以在发酵过程中被细胞吸收并且增加细胞中具体化合物的产生。在发酵过程中提供给细胞的前体有时称作发酵进料且所得化合物为进料产物。可以进一步从发酵产物中分离通过培养或发酵本发明细胞产生的本发明化合物和/或将其纯化。
新酯肽类的制备 1.合成方法 为了可以更完全地理解本发明，列举了下列实施例。这些实施例仅用于解释目的，而并不以任何方式来限定本发明的范围。
实施例1-1肽树脂化合物1的合成 树脂-Gly-Thr-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-NH2(1) 反应1树脂-Gly-Thr-NHFmoc(2)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-苏氨酸(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)、1，3-二异丙基碳二亚胺(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)和1-羟基-苯并三唑(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)的溶液加入到商购的甘氨酸2-氯三苯甲基树脂(334mg)中。将该混合物振摇1小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用标准Kaiser试验测试少许珠粒中存在的游离胺(参见E.Kaiser等，1970，Anal.Biochem.34595；和“AdvancedChemtech Handbook of Combinatorial，Organic and Peptide Chemistry”2003-2004，208页)。Kaiser试验产生了蓝色，表明反应未完成，由此重复偶联条件。在通过玻璃烧结漏斗过滤后，用N-甲基吡咯烷(3×6mL)、甲醇(3×6mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×6mL)洗涤带有树脂的产物而得到化合物2。
反应2树脂-Gly-Thr-NH2(3)的制备 将化合物2在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(6mL)中搅拌30分钟。将树脂通过玻璃烧结漏斗过滤并且重新悬浮于在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(6mL)中并且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×6mL)，甲醇(3×6mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×6mL)洗涤固体而得到化合物3。
反应3树脂-Gly-Thr-Asp(OtBu)-NHFmoc(4)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-天冬氨酸β-叔丁基酯(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)、1，3-二异丙基碳二亚胺(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)和1-羟基-苯并三唑(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)加入到化合物3中。将该混合物振摇1小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且重复偶联。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×6mL)，甲醇(3×6mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×6mL)洗涤固体而得到化合物4。
反应4树脂-Gly-Thr-Asp(OtBu)-NH2(5)的制备 将化合物4在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(6mL)中搅拌30分钟。将树脂通过玻璃烧结漏斗过滤并且重新悬浮于在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(6mL)中并且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×6mL)，甲醇(3×6mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×6mL)洗涤固体而得到化合物5。
反应5树脂-Gly-Thr-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-NHFmoc(6)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-D-天冬酰胺δ-N-三苯甲基(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)、1，3-二异丙基碳二亚胺(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)和1-羟基-苯并三唑(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)的溶液加入到树脂5中。将该反应混合物振摇1小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且重复偶联。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×6mL)，甲醇(3×6mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×6mL)洗涤固体而得到化合物6。
反应6树脂-Gly-Thr-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-NH2(7)的制备 将化合物6在20％哌啶的N-甲基吡咯烷(6mL)中搅拌30分钟。将树脂通过玻璃烧结漏斗过滤并且重新悬浮于在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(6mL)中并且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×6mL)，甲醇(3×6mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×6mL)洗涤固体而得到化合物7。
反应7树脂-Gly-Thr-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-NHFmoc(8)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-色氨酸(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)、1，3-二异丙基碳二亚胺(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)和1-羟基-苯并三唑(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)加入到树脂7中。将该混合物振摇1小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤并且重复偶联。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×6mL)，甲醇(3×6mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×6mL)洗涤固体而得到化合物8。
反应8树脂-Gly-Thr-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-NH2(1)的制备 将化合物8在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(6mL)中搅拌30分钟。将树脂通过玻璃烧结漏斗过滤并且重新悬浮于在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(6mL)中并且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×6mL)，甲醇(3×6mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×6mL)洗涤固体而得到树脂肽化合物1. 实施例1-2肽树脂化合物9的合成 树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp-Orn(NHBoc)-NH2(9) 反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-NHFmoc(10)的制备 向商购的4-羟基甲基苯氧基树脂(Wang树脂，5g，0.4mmol/g)在二氯甲烷(60mL)中的悬浮液中加入1，3-二异丙基碳二亚胺(0.940mL)、4-二甲氨基吡啶(在N-甲基吡咯烷(1mL)中24mg)和商购Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-谷氨酸α-烯丙基酯(在N-甲基吡咯烷(9mL)中2.46g)。将该反应混合物搅拌16小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吡咯烷和二氯甲烷洗涤固体且在减压下干燥而得到化合物10。
反应2树脂-Glu(αO烯丙基)-NH2(11)的制备 将化合物10(526mg)在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(6mL)中搅拌30分钟。将树脂通过玻璃烧结漏斗过滤并且重新悬浮于在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(6mL)中并且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×6mL)，甲醇(3×6mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×6mL)洗涤固体而得到化合物11。
反应3树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-NHFmoc(12)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-D-丝氨酸-叔丁基醚(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)、1，3-二异丙基碳二亚胺(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)和1-羟基-苯并三唑(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)加入到树脂11中。将该反应混合物振摇1小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤并且重复偶联。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×6mL)，甲醇(3×6mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×6mL)洗涤固体而得到化合物12。
反应4树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-NH2(13)的制备 将化合物12在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(6mL)中搅拌30分钟。将树脂通过玻璃烧结漏斗过滤并且重新悬浮于在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(6mL)中并且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×6mL)，甲醇(3×6mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×6mL)洗涤固体而得到化合物13。
反应5树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-NHFmoc(14)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L甘氨酸(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)、1，3-二异丙基碳二亚胺(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)和1-羟基-苯并三唑(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)加入到树脂13中。将该反应混合物振摇1小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤并且重复偶联。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×6mL)，甲醇(3×6mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×6mL)洗涤固体而得到化合物14。
反应6树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-NH2(15)的制备 将化合物14在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(6mL)中搅拌30分钟。将树脂通过玻璃烧结漏斗过滤并且重新悬浮于在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(6mL)中并且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×6mL)，甲醇(3×6mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×6mL)洗涤固体而得到化合物15。
反应7树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-NHFmoc(16)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-天冬氨酸β-叔丁基酯(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)、1，3-二异丙基碳二亚胺(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)和1-羟基-苯并三唑(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)加入到树脂15中。将该反应混合物振摇1小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤并且重复偶联。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×6mL)，甲醇(3×6mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×6mL)洗涤固体而得到化合物16。
反应8树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-NH2(17)的制备 将化合物16在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(6mL)中搅拌30分钟。将树脂通过玻璃烧结漏斗过滤并且重新悬浮于在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(6mL)中并且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×6mL)，甲醇(3×6mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×6mL)洗涤固体而得到化合物17。
反应9树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-NHFmoc(18)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-D-丙氨酸((2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)、1，3-二异丙基碳二亚胺(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)和1-羟基-苯并三唑(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)的溶液加入到树脂17中。将该反应混合物振摇1小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤并且重复偶联。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×6mL)，甲醇(3×6mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×6mL)洗涤固体而得到化合物18。
反应10树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-NH2(19)的制备 将化合物18在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(6mL)中搅拌30分钟。将树脂通过玻璃烧结漏斗过滤并且重新悬浮于在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(6mL)中并且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×6mL)，甲醇(3×6mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×6mL)洗涤固体而得到化合物19。
反应11Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-NHFmoc(20)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-天冬氨酸β-叔丁基酯((2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)、1，3-二异丙基碳二亚胺(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)和1-羟基-苯并三唑(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)加入到树脂19中。将该反应混合物振摇1小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤并且重复偶联。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×6mL)，甲醇(3×6mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×6mL)洗涤固体而得到化合物20。
反应12树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-NH2(21)的制备 将化合物20在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(6mL)中搅拌30分钟。将树脂通过玻璃烧结漏斗过滤并且重新悬浮于在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(6mL)中并且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×6mL)，甲醇(3×6mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×6mL)洗涤固体而得到化合物21。
反应13树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-Orn-NHFmoc(22)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-Nδ-(叔丁氧羰基)-L-鸟氨酸(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)、1，3-二异丙基碳二亚胺(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)和1-羟基-苯并三唑(2mL的在N-甲基吡咯烷中的0.5摩尔溶液)加入到树脂21中。将该反应混合物振摇1小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤并且重复偶联。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×6mL)，甲醇(3×6mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×6mL)洗涤固体而得到化合物22。
反应14树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-Orn(NHBoc)-NH2(9)的制备 将化合物22在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(6mL)中搅拌30分钟。将树脂通过玻璃烧结漏斗过滤并且重新悬浮于在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(6mL)中并且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×6mL)，甲醇(3×6mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×6mL)洗涤固体而得到化合物9。
实施例1-3肽树脂化合物23的合成
反应1化合物24的制备
将五氟苯酚(3.68g)溶于二氯甲烷(40mL)并且在冰/NaCl浴中冷却至0℃。滴加癸酰基氯(4.15mL)，使温度保持在2℃以下。一旦添加完成，就将该反应体系在0℃下再搅拌2.5小时。然后除去冷却浴并且将该反应体系升温至环境温度并搅拌17小时。在减压下除去挥发性物质以便得到五氟苯基酯24粗产物，随后可以将其不经进一步纯化使用。
反应2化合物23的制备
将树脂肽化合物1(2g)加入到癸酸的五氟苯基酯24(440mg)在二氯甲烷中的溶液中。将该混合物振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用Kaiser试验(参见上文)判断反应未完成。将癸酸(517mg)、1-羟基-苯并三唑(446mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(438μL)溶于N-甲基吡咯烷(8mL)并且搅拌1小时。然后将树脂加入到癸酸混合物中，然后搅拌8小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吡咯烷(3×6mL)，甲醇(3×6mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×6mL)洗涤。使用Kaiser试验测定反应完成，得到树脂结合的脂肽23。
实施例1-4化合物C352的合成
反应1化合物(25)的制备
将商购的犬尿氨酸(3g)悬浮于乙腈(100mL)和水(30mL)中。向该溶液中滴加二异丙基乙胺(DIPEA，5.01mL)并且持续搅拌至溶液均匀。然后将该溶液在冰/氯化钠浴中冷却至0°并且加入烯丙氧基羰基氧基琥珀酰亚胺(allyloxycarbonyl oxysuccinimide)(AllocOSu，4.3g)的乙腈(30mL)溶液中。将该反应混合物搅拌3小时，然后浓缩以便除去乙腈，用5％K2CO3溶液(220mL)碱化并且用乙酸乙酯(5×90mL)和二氯甲烷(1×90mL)洗涤。然后将含水部分酸化至pH1并且用乙酸乙酯(4×90mL)萃取。用无水MgSO4干燥合并的酸性有机洗涤物并且蒸发而得到粗产物。(4.85g)。通过硅胶柱色谱法纯化，用二氯甲烷∶甲醇19∶1洗脱，在蒸发溶剂后得到所需中间体L-2-N-(烯丙氧羰基)-4-(2-氨基苯基)-4-氧代丁酸，为黄色固体2.92g。将该固体(2.9g)溶于4N HCl(100mL)并且在冰/氯化钠浴中冷却至0℃。滴加NaNO2(0.76g)在水(10mL)中的溶液，使温度保持在3℃以下，并且将所得溶液在0℃下搅拌2.5小时。滴加NaN3(1.95g)的水(10mL)溶液，使温度保持在3℃以下并且将所得溶液升温至环境温度并且搅拌19小时以上。将该反应混合物倾入水(250mL)中并且用二氯甲烷(4×100ml)萃取。用无水MgSO4干燥合并的有机洗涤物并且蒸发得到所需的产物化合物25(2.86g)。
反应2化合物(26)的制备
用氩气充分净化L-2-N-(烯丙氧羰基)-4-(2-叠氮基苯基)-4-氧代丁酸25(636mg)、4-二甲氨基吡啶(25mg)和N-甲基-2-氯吡啶鎓碘化物(511mg)，然后悬浮于二氯甲烷(10mL)中。加入三乙胺(560μL)并且将该反应混合物搅拌以得到均匀的溶液。向该溶液中加入树脂脂肽23(667mg)并且再次用氩气净化烧瓶并且振摇17小时。取出20mg树脂样品以便测试反应的完成(用2，2，2-三氟乙醇(0.2mL)和乙酸(0.2mL)处理20mg在二氯甲烷(0.6mL)中的树脂并且搅拌3小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤并且蒸发溶剂，得到残余物。对残余物进行的液相色谱/质谱分析显示反应未完成)。判断偶联未完成，由此在减压下将树脂干燥5天并且再次重复上述偶联17小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤并且用二氯甲烷充分洗涤固体。然后将固体悬浮于二氯甲烷(6mL)、2，2，2-三氟乙醇(2mL)和乙酸(2mL)中并且振摇5小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤并且蒸发滤液而得到所需肽26粗产品(44mg)。通过反相HPLC(C18 10μM Jupiter柱250×21.2mm)，以20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。将含有产物的级分冷冻干燥而得到纯的产物26(10.6mg)。
反应3化合物(27)的制备
将羟基-苯并三唑(5mg)、1，3-二异丙基碳二亚胺(6μL)和肽树脂化合物9(12.3mg)加入到化合物26(10.6mg)的N-甲基吡咯烷(0.7mL)溶液中，然后振摇22小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联完成，得到树脂结合的脂肽27。
反应4化合物(28)的制备
将干燥的树脂27置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(19mg)在二氯甲烷(1.47mL)、乙酸(74μL)和N-甲基吗啉(37μL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且将固体用N-甲基吗啉洗涤两次，用甲醇洗涤两次并且再用N-甲基吗啉洗涤两次。向树脂中加入1-羟基-苯并三唑(0.5mL的在N-甲基吗啉中的0.5摩尔溶液)和1，3-二异丙基碳二亚胺(0.5mL的在N-甲基吗啉中的0.5摩尔溶液)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到树脂结合的环化酯肽28。
反应5化合物(C352)的制备
将干燥的树脂28悬浮于二氯甲烷(4mL)、三氟乙酸(6mL)、乙二硫醇(250μl)和三异丙基硅烷(250μl)中，并且将该反应混合物在环境温度下搅拌3小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(6mL)与水(3mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C18 10μM Jupiter柱250×21.2mm)，以20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到纯的产物C352(1.0mg)。
实施例1-5.化合物C369的合成
反应1化合物(30)的制备
使用方法D或方法E(参见下文)获得化合物30。
方法D 向树脂结合的脂肽23(1g)中加入商购Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-异亮氨酸(618mg)、溴-三-吡咯烷磷鎓六氟膦酸盐(bromo-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate)(PyBrOP，815mg)和二-异丙基乙胺(914μL)在二氯甲烷(5mL)中的溶液。加入二甲氨基吡啶(5mg)并且将该混合物振摇2小时。2小时后，将该混合物通过烧结玻璃漏斗过滤并且用二氯甲烷(3×10mL)洗涤且重复偶联操作步骤。将所得树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×10mL)和甲醇(3×10mL)洗涤并且在减压下用氢氧化钾颗粒干燥。将这种干燥的树脂悬浮于二氯甲烷(3mL)、2，2，2-三氟乙醇(1mL)和乙酸(1mL)中，且振摇3小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤并且蒸发滤液而得到所需的肽30(400mg)，为白色固体。
方法E 用氩气充分净化商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-异亮氨酸(95mg)4-二甲氨基吡啶(6mg)和N-甲基-2-氯吡啶鎓碘化物(69mg)，然后悬浮于二氯甲烷(2.7mL)中。加入三乙胺(76μL)并且将该反应混合物搅拌以得到均匀的溶液。向该溶液中加入树脂脂肽23(200mg)，再次用氩气净化烧瓶并且振摇14小时。将所得树脂通过烧结玻璃漏斗过滤并且用二氯甲烷充分洗涤。将固体悬浮于二氯甲烷(6mL)、2，2，2-三氟乙醇(2mL)和乙酸(2mL)中并且振摇3小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤并且蒸发滤液而得到所需肽30(54mg)，为白色固体。
反应2化合物(31)的制备
将1-羟基-苯并三唑(26mg)、1，3-二异丙基碳二亚胺(30μL)和肽树脂化合物9(64mg)加入到酯肽30(54mg)在N-甲基吗啉(3.8mL)中的溶液中并且将所得混合物振摇22小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联完成，得到树脂结合的酯肽31。
反应3化合物(32)的制备
将干燥的树脂31置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(在二氯甲烷(7.63mL)中48mg)、乙酸(0.38mL)和N-甲基吗啉(0.19mL)的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且将固体用N-甲基吗啉洗涤两次，用甲醇洗涤两次并且再用N-甲基吗啉洗涤两次。将固体树脂悬浮于含20％哌啶的N-甲基吗啉(7mL)中105分钟，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤固体。向树脂中加入1-羟基-苯并三唑(0.3mL的在N-甲基吗啉中的0.5摩尔溶液)和1，3-二异丙基碳二亚胺(0.3mL的在N-甲基吗啉中的0.5摩尔溶液)。将该反应混合物振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤沉淀而得到树脂结合的环化酯肽32。
反应4化合物C369的制备
将干燥的树脂32悬浮于二氯甲烷(4mL)、三氟乙酸(6mL)、乙二硫醇(250μl)和三异丙基硅烷(250μl)中并且在环境温度下搅拌3小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤并且用二氯甲烷(2×2mL)洗涤且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(6mL)与水(3mL)之间分配。分离并冷冻干燥水层而得到粗产物33(21.5mg)。然后通过反相HPLC(C18 10μMJupiter柱250×21.2mm)，以20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到纯的产物C369(1.8mg)。
实施例1-6肽树脂化合物34的合成 树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp-(OtBu)NH2(34) 反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-NHFmoc(35)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-Nε-(叔丁氧羰基)-D-赖氨酸(1.48g)、1，3-二异丙基碳二亚胺(0.49mL)、1-羟基-苯并三唑(425mg)和4-二甲氨基吡啶(37mg)作为在N-甲基吡咯烷(20mL)中的溶液加入到树脂17中(参见上文)。将该反应混合物振摇3小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且重复偶联15小时。过滤该反应混合物，通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到化合物35。
反应2树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-NH2(36)的制备 将化合物35在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(25mL)中搅拌1小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到化合物36。
反应3树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-NHFmoc(37)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-天冬氨酸β-叔丁基酯(2.16g)、1，3-二异丙基碳二亚胺(822μL)和1-羟基-苯并三唑(710mg)作为在N-甲基吡咯烷(20mL)中的溶液加入到树脂36中。将该反应混合物振摇4小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到化合物37。
反应4树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-NH2(34)的制备 将化合物37在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(25mL)中搅拌1小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到化合物34。
实施例1-7肽树脂化合物38的合成 树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-Ala-NH2(38) 反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-Ala-NHFmoc(39)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-丙氨酸(1.62g)、1，3-二异丙基碳二亚胺(825μL)和1-羟基-苯并三唑(715mg)作为在N-甲基吡咯烷(20mL)中的溶液加入到树脂21中(参见上文)。将该反应混合物振摇17小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到化合物39。
反应2树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-Ala-NH2(38)的制备 将化合物39(227mg)在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(1mL)中搅拌0.5小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到38。
实施例1-8肽树脂化合物40的合成 树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-NH2(40) 反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-NHFmoc(41)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-D-天冬酰胺(NHTrt)OH(3.1g)、2-(1H-苯并三唑-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(2-(1H-benzotriazol-yl)-1，1，3，3-tetramethyluronium tetrafluroborate)(TBTU，1.67g)、羟基-苯并三唑(0.56g)和二异丙基乙胺(DIPEA，2.7mL)作为在N-甲基吡咯烷酮(NMP，40mL)中的溶液加入到树脂-Glu-NH2(11，参见上文，4g)中。将该混合物振摇30分钟，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用标准Kaiser试验(参见上文)测试少许珠粒中存在的游离胺。Kaiser试验产生了黄色，由此认为偶联完成。在通过烧结玻璃漏斗过滤后，用N-甲基吡咯烷(3×40mL)，甲醇(3×40mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×40mL)洗涤含有树脂的产物而得到化合物41。
反应2树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-NH2(42)的制备 将化合物41在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(30mL)中搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤并且重新悬浮于含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(30mL)中并且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×30mL)，甲醇(3×30mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×30mL)洗涤固体而得到化合物42。
反应3树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-NHFmoc(43)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-甘氨酸(1.55g)、2-(1H-苯并三唑-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU，1.67g)、羟基-苯并三唑(HOBt，0.56g)和二异丙基乙胺(DIPEA，2.7mL)作为在N-甲基吡咯烷酮(NMP，40mL)中的溶液加入到化合物42(4g)中。将该混合物振摇30分钟，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用标准Kaiser试验(参见上文)测试少许珠粒中存在的游离胺。Kaiser试验产生了黄色，由此认为偶联完成。在通过烧结玻璃漏斗过滤后，用N-甲基吡咯烷(3×40mL)，甲醇(3×40mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×40mL)洗涤含有树脂的产物而得到化合物43。
反应4树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-NH2(44)的制备 将化合物43在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(30mL)中搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤并且重新悬浮于含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(30mL)中并且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×30mL)，甲醇(3×30mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×30mL)洗涤固体而得到化合物44。
反应5树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-NHFmoc(45)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-天冬氨酸β-叔丁基酯(2.14g)、2-(1H-苯并三唑-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU，1.67g)、HOBt(0.56g)和二异丙基乙胺(DIPEA，2.7mL)作为在N-甲基吡咯烷酮(NMP，40mL)中的溶液加入到化合物44(4g)中。将该混合物振摇30分钟，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用标准Kaiser试验(参见上文)测试少许珠粒中存在的游离胺。Kaiser试验产生了黄色，由此认为偶联完成。在通过烧结玻璃漏斗过滤后，用N-甲基吡咯烷(3×40mL)，甲醇(3×40mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×40mL)洗涤含有树脂的产物而得到化合物45。
反应6树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-NH2(46)的制备 将化合物45在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(30mL)中搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤并且重新悬浮于含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(30mL)中并且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×30mL)，甲醇(3×30mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×30mL)洗涤固体而得到化合物46。
反应7树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-NHFmoc(47)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-D-丙氨酸(0.81g)、2-(1H-苯并三唑-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU，0.84g)、HOBt(0.28g)和二异丙基乙胺(DIPEA，1.4mL)作为在N-甲基吡咯烷酮(NMP，20mL)中的溶液加入到化合物46(2g)中。将该混合物振摇30分钟，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用标准Kaiser试验(参见上文)测试少许珠粒中存在的游离胺。Kaiser试验产生了黄色，由此认为偶联完成。在通过烧结玻璃漏斗过滤后，用N-甲基吡咯烷(3×40mL)，甲醇(3×40mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×40mL)洗涤含有树脂的产物而得到化合物47。
反应8Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-NH2(48)的制备 将化合物47在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(15mL)中搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤并且重新悬浮于含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(15mL)中并且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×10mL)，甲醇(3×10mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×10mL)洗涤固体而得到化合物48。
反应9树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-NHFmoc(49)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-天冬氨酸β-叔丁基酯(1.07g)、2-(1H-苯并三唑-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU，0.84g)、HOBt(0.28g)和二异丙基乙胺(DIPEA，1.4mL)作为在N-甲基吡咯烷酮(NMP，20mL)中的溶液加入到化合物48(2g)中。将该混合物振摇30分钟，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用标准Kaiser试验(参见上文)测试少许珠粒中存在的游离胺。Kaiser试验产生了黄色，由此认为偶联完成。在通过烧结玻璃漏斗过滤后，用N-甲基吡咯烷(3×20mL)，甲醇(3×20mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×20mL)洗涤含有树脂的产物而得到化合物49。
反应10Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-NH2(40)的制备 将化合物49在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(15mL)中搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤并且重新悬浮于含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(15mL)中并且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×10mL)，甲醇(3×10mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×10mL)洗涤固体而得到化合物40。
实施例1-9肽树脂化合物50的合成 树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-Orn(NHBoc)-NH250 反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-Orn(NHBoc)-NHFmoc(51)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-鸟氨酸(Boc)-OH(1.17g)、2-(1H-苯并三唑-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU，0.83g)、HOBt(0.31g)和二异丙基乙胺(DIPEA，1.4mL)作为在N-甲基吡咯烷酮(NMP，20mL)中的溶液加入到化合物40(2.8g)中。将该混合物振摇30分钟，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用标准Kaiser试验(参见上文)测试少许珠粒中存在的游离胺。Kaiser试验产生了黄色，由此认为偶联完成。在通过烧结玻璃漏斗过滤后，用N-甲基吡咯烷(3×20mL)，甲醇(3×20mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×20mL)洗涤含有树脂的产物而得到化合物51。
反应2树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-Orn(NHBoc)-NH2(50)的制备 将化合物51在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(15mL)中搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，重新悬浮于含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(15mL)中并且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×10mL)，甲醇(3×10mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×10mL)洗涤固体而得到化合物50。
实施例1-10肽树脂化合物52的合成 树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-Ala-NH2(52) 反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-Ala-NHFmoc(53)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-丙氨酸(63mg)、2-(1H-苯并三唑-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU，64mg)、HOBt(27mg)和二异丙基乙胺(DIPEA，70μL)作为在N-甲基吡咯烷酮(NNP，1mL)中的溶液加入到化合物40(340mg)中。将该混合物振摇30分钟，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用标准Kaiser试验(参见上文)测试少许珠粒中存在的游离胺。Kaiser试验产生了黄色，由此认为偶联完成。在通过烧结玻璃漏斗过滤后，用N-甲基吡咯烷(3×2mL)，甲醇(3×2mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×2mL)洗涤含有树脂的产物而得到化合物53。
反应2树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-Ala-NH2(52)的制备 将化合物53在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(1.5mL)中搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，重新悬浮于含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(1.5mL)中并且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×1mL)，甲醇(3×1mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×1mL)洗涤固体而得到化合物52。
实施例1-11肽树脂化合物54的合成 树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-Orn(NHBoc)-NH2(54) 反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-Orn(NHBoc)-NHFmoc(55)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-鸟氨酸(Boc)-OH(0.44g)、2-(1H-苯并三唑-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU，0.31g)、HOBt(0.13g)和二异丙基乙胺(DIPEA，0.3mL)作为在N-甲基吡咯烷酮(NMP，20mL)中的溶液加入到化合物34(参见上文，0.8g)中。将该混合物振摇30分钟，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用标准Kaiser试验(参见上文)测试少许珠粒中存在的游离胺。Kaiser试验产生了黄色，由此认为偶联完成。在通过烧结玻璃漏斗过滤后，用N-甲基吡咯烷(3×20mL)，甲醇(3×20mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×20mL)洗涤含有树脂的产物而得到化合物55。
反应2树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-Orn(NHBoc)-NH2(54)的制备 将化合物55在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(8mL)中搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，重新悬浮于含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(8mL)中并且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×8mL)，甲醇(3×8mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×8mL)洗涤固体而得到化合物54。
实施例1-12肽树脂化合物56的合成 树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-NH2(56) 反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-NHFmoc(57)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-D-Nα-(9-芴基甲氧羰基)-Nε-(叔丁氧羰基)L-赖氨酸(1.28g)、2-(1H-苯并三唑-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU，0.84g)、HOBt(0.28g)和二异丙基乙胺(DIPEA，1.4mL)作为在N-甲基吡咯烷酮(NMP，20mL)中的溶液加入到化合物46(2g)中。将该混合物振摇30分钟，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用标准Kaiser试验(参见上文)测试少许珠粒中存在的游离胺。Kaiser试验产生了黄色，由此认为偶联完成。在通过烧结玻璃漏斗过滤后，用N-甲基吡咯烷(3×20mL)，甲醇(3×20mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×20mL)洗涤含有树脂的产物而得到化合物57。
反应2树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-NH2(58)的制备 将化合物57在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(15mL)中搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，重新悬浮于含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(15mL)中并且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×10mL)，甲醇(3×10mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×10mL)洗涤固体而得到化合物58。
反应3树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-NHFmoc(59)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-天冬氨酸β-叔丁基酯(1.07g)、2-(1H-苯并三唑-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU，0.84g)、HOBt(0.28g)和二异丙基乙胺(DIPEA，1.4mL)作为在N-甲基吡咯烷酮(NMP，20mL)中的溶液加入到化合物58(2g)中。将该混合物振摇30分钟，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用标准Kaiser试验(参见上文)测试少许珠粒中存在的游离胺。Kaiser试验产生了黄色，由此认为偶联完成。在通过烧结玻璃漏斗过滤后，用N-甲基吡咯烷(3×20mL)，甲醇(3×20mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×20mL)洗涤含有树脂的产物而得到化合物59。
反应4树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-NH2(56)的制备 将化合物59在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(15mL)中搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，重新悬浮于含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(15mL)中并且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×10mL)，甲醇(3×10mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×10mL)洗涤固体而得到化合物56。
实施例1-13肽树脂化合物60的合成 树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-Orn(NHBoc)-NH(60) 反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-Orn(NHBoc)-NHFmoc(61)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-鸟氨酸(Boc)-OH(0.54g)、2-(1H-苯并三唑-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU，0.38g)、HOBt(0.12g)和二异丙基乙胺(DIPEA，0.63mL)作为在N-甲基吡咯烷酮(NMP，12mL)中的溶液加入到化合物56(1.2g)中。将该混合物振摇30分钟，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用标准Kaiser试验(参见上文)测试少许珠粒中存在的游离胺。Kaiser试验产生了黄色，由此认为偶联完成。在通过烧结玻璃漏斗过滤后，用N-甲基吡咯烷(3×20mL)，甲醇(3×20mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×20mL)洗涤含有树脂的产物而得到化合物61。
反应2树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-Orn(NHBoc)-NH2(60)的制备 将化合物61在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(12mL)中搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，重新悬浮于含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(12mL)中并且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×10mL)，甲醇(3×10mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×10mL)洗涤固体而得到化合物60。
实施例1-14肽树脂化合物62的合成 树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-Ala-NH2(62) 反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-Ala-NHFmoc(63)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-丙氨酸(0.78g)、2-(1H-苯并三唑-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU，0.80g)、HOBt(0.27g)和二异丙基乙胺(DIPEA，0.81mL)作为在N-甲基吡咯烷酮(NMP，20mL)中的溶液加入到化合物56(2g)中。将该混合物振摇30分钟，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用标准Kaiser试验(参见上文)测试少许珠粒中存在的游离胺。Kaiser试验产生了黄色，由此认为偶联完成。在通过烧结玻璃漏斗过滤后，用N-甲基吡咯烷(3×20mL)，甲醇(3×20mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×20mL)洗涤含有树脂的产物而得到化合物63。
反应2树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-Ala-NH2(62)的制备 将化合物63在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(20mL)中搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，重新悬浮于含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(20mL)中并且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×20mL)，甲醇(3×20mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×20mL)洗涤固体而得到化合物62。
实施例1-15肽树脂化合物64的合成 树脂-Ala-Sar-Thr-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-NH2(64) 反应1树脂-Ala-Sar-NMeFmoc(65)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-肌氨酸(1.56g)、2-(1H-苯并三唑-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU，1.61g)和二异丙基乙胺(DIPEA，871μl)的溶液作为在N-甲基吡咯烷酮(NMP，25mL)中的溶液加入到商购的丙氨酸2-氯三苯甲基树脂(66，2.5g)中。将该混合物振摇30分钟，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用标准Kaiser试验(参见上文)测试少许珠粒中存在的游离胺。Kaiser试验产生了黄色，由此认为偶联完成。在通过烧结玻璃漏斗过滤后，用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤含有树脂的产物而得到化合物65。
反应2树脂-Ala-Sar-NMeH(67)的制备 将化合物65在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(20mL)中搅拌1小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到化合物67。
反应3树脂-Ala-Sar-Thr-NHFmoc(68)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-苏氨酸(853mg)、溴-三-吡咯烷磷鎓六氟磷酸盐(PyBrOP，1.165g)和DIPEA(1.31mL)作为在二氯甲烷(25mL)中的溶液加入到化合物67(334mg)中。将该混合物振摇1小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到化合物68。
反应4树脂-Ala-Sar-Thr-NH2(69)的制备 将化合物38(参见上文)在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(25mL)中搅拌1小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到化合物69。
反应5树脂-Ala-Sar-Thr-Asp(OtBu)-NHFmoc(70)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-天冬氨酸β-叔丁基酯(2.06g)、TBTU(1.61g)，和DIPEA(871μL)作为在NMP(25mL)中的溶液加入到化合物69中。将该混合物振摇3小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到化合物70。
反应6树脂-Ala-Sar-Thr-Asp(OtBu)-NH2(71)的制备 将化合物70在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(25mL)中搅拌1小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到化合物71。
反应7树脂-Ala-Sar-Thr-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-NHFmoc(72)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-D-天冬酰胺δ-N-三苯甲基(1.49g)、TBTU(1.61g)和DIPEA(871μL)作为在NMP(25mL)中的溶液加入到化合物71中。将该混合物振摇17小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到化合物72。
反应8树脂-Ala-Sar-Thr-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-NH2(73)的制备 将化合物72在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(25mL)中搅拌2小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到化合物73。
反应9树脂-Ala-Sar-Thr-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-NHFmoc(74)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-色氨酸(1.07g)、TBTU(802mg)和DIPEA(435μL)作为在NMP(10mL)中的溶液加入到树脂73中。将该反应混合物振摇43小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到化合物74。
反应10树脂-Ala-Sar-Thr-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-NH2(64)的制备 将化合物74在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(25mL)中搅拌1小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到化合物64。
实施例1-16肽树脂化合物(75)的合成 树脂-Ala-Sar-Thr-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-十一烷酰胺(75) 将商购的十一烷酸(930mg)、1，3-二异丙基碳二亚胺(0.78mL)，和1-羟基-苯并三唑(676mg)作为在N-甲基吡咯烷(20mL)中的溶液加入到化合物64中。将该反应混合物振摇23小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用Kaiser试验(参见上文)判断反应未完成。然后通过烧结玻璃漏斗过滤树脂并且用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤。使用Kaiser试验测得反应已完成，得到树脂结合的化合物75。
实施例1-17肽树脂化合物(76)的合成 树脂-Gly-Thr-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-8-甲基癸酰胺(76) 将商购的8-甲基癸酸(1.55g)、2-(1H-苯并三唑-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU，2.67g)、二异丙基乙胺(DIPEA，2.9mL)和1-羟基-苯并三唑(1.12g)作为在N-甲基吡咯烷(80mL)中的溶液加入到化合物1(7.6g)中。将该反应混合物振摇18小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用Kaiser试验(参见上文)判断反应完成而得到树脂结合的化合物76。
实施例1-18肽树脂化合物(77)的合成 树脂-Gly-Thr-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-十三酰胺(77) 将商购十三酸(2.39g)、2-(1H-苯并三唑-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU，3.47g)、二异丙基乙胺(DIPEA，3.75mL)和1-羟基-苯并三唑(1.46g)作为在N-甲基吡咯烷(80mL)中的溶液加入到化合物1(10g)中。将该混合物振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用Kaiser试验(参见上文)判断反应完成而得到树脂结合的化合物77。
实施例1-19肽树脂化合物(78)的合成 树脂-Gly-Thr-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-8-甲基癸酰胺(78) 反应1树脂-Gly-Thr-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-NHFmoc(79)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-D-谷氨酸γ-叔丁基酯(1.14g)、TBTU(0.87g)、HOBt(0.37g)和DIPEA(940μL)作为在NMP(20mL)中的溶液加入到化合物5中。将该反应混合物振摇1小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体。使用Kaiser试验(参见上文)判断反应完成而得到树脂结合的化合物79。
反应2树脂-Gly-Thr-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-NH2(80)的制备 将化合物79在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(20mL)中搅拌15分钟。通过烧结玻璃漏斗过滤，将树脂重新悬浮于含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(20mL)中且搅拌15分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到树脂结合的化合物80。
反应3树脂-Gly-Thr-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-NHFmoc(81)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-色氨酸(1.15g)、TBTU(0.87g)、HOBt(0.37g)和DIPEA(940μL)作为在NMP(20mL)中的溶液加入到化合物80中。将该反应混合物振摇1小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体。使用Kaiser试验(参见上文)判断反应完成而得到树脂结合的81。
反应4树脂-Gly-Thr-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-NH2(82)的制备 将树脂结合的化合物81在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(20mL)中搅拌15分钟。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤并且重新悬浮于含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(20mL)中且搅拌15分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到树脂结合的化合物82。
反应5树脂-Gly-Thr-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-8-甲基癸酰胺(78)的制备 将商购的8-甲基癸酸(0.71g)、2-(1H-苯并三唑-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU，1.21g)、二异丙基乙胺(DIPEA，2.0mL)和1-羟基-苯并三唑(0.508g)作为在N-甲基吡咯烷(80mL)中的溶液加入到化合物82(4.0g)中。将该反应混合物振摇18小时，通过烧结玻璃漏斗过滤，并且使用Kaiser试验(参见上文)判断反应完成。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×6mL)，甲醇(3×6mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×6mL)洗涤固体而得到树脂结合的化合物78。
实施例1-20肽树脂化合物(83)的合成 树脂-Ala-Sar-Thr-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-8-甲基癸酰胺(83) 将商购的8-甲基癸酸(0.71g)、2-(1H-苯并三唑-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU，0.60g)、二异丙基乙胺(DIPEA，0.64mL)和1-羟基-苯并三唑(0.25g)作为在N-甲基吡咯烷(20mL)中的溶液加入到化合物34(1.8g)中。将该反应混合物振摇18小时，通过烧结玻璃漏斗过滤，并且使用Kaiser试验(参见上文)判断反应完成。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×6mL)，甲醇(3×6mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×6mL)洗涤固体而得到树脂结合的化合物83。
实施例1-21肽树脂化合物(84)的合成 树脂-Ala-Sar-Thr-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-8-甲基癸酰胺(84)
反应1树脂-Ala-Sar-Thr-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-NHFmoc(85)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-D-谷氨酸γ-叔丁基酯(0.98g)、TBTU(0.74g)、HOBt(0.31g)和DIPEA(810μL)作为在NMP(20mL)中的溶液加入到化合物71(1.8g)中。将该反应混合物振摇17小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到化合物85。
反应2树脂-Ala-Sar-Thr-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-NH2(86)的制备 将化合物85在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(20mL)中搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤并且重新悬浮于含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(20mL)中且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×20mL)，甲醇(3×20mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×20mL)洗涤固体而得到化合物86。
反应3树脂-Ala-Sar-Thr-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-NHFmoc(87)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-色氨酸(0.98g)、TBTU(0.74g)、HOBt(0.31g)和DIPEA(810μL)作为在NMP(25mL)中的溶液加入到化合物86(2.2g)中。将该反应混合物振摇17小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×25mL)，甲醇(3×25mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×25mL)洗涤固体而化合物87。
反应4树脂-Ala-Sar-Thr-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-NH2(88)的制备 将化合物87在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(25mL)中搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，重新悬浮于含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(25mL)中且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×30mL)，甲醇(3×30mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×30mL)洗涤固体而得到化合物88。
反应5树脂-Ala-Sar-Thr-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-8-甲基癸酰胺(84)的制备 将商购的8-甲基癸酸(0.34g)、2-(1H-苯并三唑-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU，0.60g)、二异丙基乙胺(DIPEA，0.64mL)和1-羟基-苯并三唑(0.25g)作为在N-甲基吡咯烷(20mL)中的溶液加入到化合物88(2.0g)中。将该反应混合物振摇18小时，通过烧结玻璃漏斗过滤，并且使用Kaiser试验(参见上文)判断反应完成。用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×16mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×16mL)洗涤固体而得到树脂结合的化合物84。
实施例1-22肽树脂化合物89的合成 树脂-Ala-Gly-Thr-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-十一烷酰胺(89) 反应1树脂-Ala-Gly-NHFmoc(90)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-甘氨酸(1.49g)、TBTU(1.61g)和DIPEA(871μL)作为在NMP(25mL)中的溶液加入到商购的丙氨酸-2-氯三苯甲基-树脂(66，2.5g)中。将该混合物振摇3小时，通过烧结玻璃漏斗过滤，并且使用Kaiser试验(参见上文)测试少许珠粒中存在的游离胺。Kaiser试验产生了黄色，由此认为偶联完成。在通过烧结玻璃漏斗过滤后，用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤含有树脂的产物而得到化合物90。
反应2树脂-Ala-Gly-NH2(91)的制备 将化合物90在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(20mL)中搅拌1小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到化合物91。
反应3树脂-Ala-Gly-Thr-NHFmoc(92)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-苏氨酸(853mg)、溴-三-吡咯烷磷鎓六氟磷酸盐(PyBrOP，1.165g)和DIPEA(1.31mL)作为在二氯甲烷(25mL)中的溶液加入到化合物91(334mg)中，将该混合物振摇1小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到化合物92。
反应4树脂-Ala-Gly-Thr-NH2(93)的制备 将化合物92在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(20mL)中搅拌1.5小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到树脂结合的化合物93。
反应5树脂-Ala-Gly-Thr-Asp(OtBu)-NHFmoc(94)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-天冬氨酸β-叔丁基酯(2.06g)、TBTU(1.61g)和DIPEA(871μL)作为在NMP(25mL)中的溶液加入到化合物93中。将该混合物振摇3小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到化合物94。
反应6树脂-Ala-Gly-Thr-Asp(OtBu)-NH2(95)的制备 将化合物94在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(20mL)中搅拌1小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到化合物94。
反应7树脂-Ala-Gly-Thr-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-NHFmoc(96)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-D-天冬酰胺δ-N-三苯甲基(1.49g)、TBTU(0.80g)和DIPEA(435μL)作为在DMF(10mL)中的溶液加入到化合物95中。将该混合物振摇17小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到化合物96。
反应8树脂-Ala-Gly-Thr-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-NH2(97)的制备 将化合物96在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(20mL)中搅拌2小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到化合物97。
反应9树脂-Ala-Gly-Thr-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-NHFmoc(98)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-色氨酸(1.07g)、TBTU(0.80g)和DIPEA(435μL)作为在NMP(25mL)中的溶液加入到化合物97中。将该混合物振摇43小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到化合物98。
反应10树脂-Ala-Gly-Thr-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-NH2(99)的制备 将化合物98在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(20mL)中搅拌1小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到化合物99。
反应11树脂-Ala-Gly-Thr-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-十一烷酰胺(89)的制备 将商购的十一烷酸(930mg)、1，3-二异丙基碳二亚胺(0.78mL)和1-羟基-苯并三唑(676mg)作为在N-甲基吡咯烷(20mL)中的溶液加入到化合物99中。将该混合物振摇23小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用Kaiser试验(参见上文)判断反应未完成。然后将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤。使用Kaiser试验测定反应完成，得到化合物89。
实施例1-23肽树脂化合物100的合成 树脂-Ala-Gly-Thr-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-十一烷酰胺(100) 反应1树脂-Ala-Gly-Thr-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-NHFmoc.(101)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-D-谷氨酸γ-叔丁基酯(1.06g)、TBTU(0.80g)和DIPEA(435μL)作为在DMF(10mL)中的溶液加入到化合物95中。将该混合物振摇17小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到化合物101。
反应2树脂-Ala-Gly-Thr-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-NH2(102)的制备 将化合物101在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(20mL)中搅拌1小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到化合物102。
反应3树脂-Ala-Gly-Thr-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-NHFmoc(103)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-色氨酸(1.07g)、TBTU(0.80g)和DIPEA(435μL)作为在NMP(25mL)中的溶液加入到化合物102中。将该混合物振摇43小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到103。
反应4树脂-Ala-Gly-Thr-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-NH2(104)的制备 将化合物103在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(20mL)中搅拌1小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤固体而得到化合物104。
反应5树脂-Ala-Gly-Thr-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-十一烷酰胺(100)的制备 将商购十一烷酸(930mg)、1，3-二异丙基碳二亚胺(0.78mL)和1-羟基-苯并三唑(676mg)作为在N-甲基吡咯烷(20mL)中的溶液加入到化合物104中。将该混合物振摇23小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用Kaiser试验(参见上文)判断反应未完成。然后将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吡咯烷(3×15mL)，甲醇(3×15mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×15mL)洗涤。使用Kaiser试验测定反应完成，得到化合物100。
实施例1-24肽树脂105的合成 树脂-Orn(NHBoc)-Sar-Thr-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-8-甲基癸酰胺(105) 反应1树脂-Orn(NHBoc)-NHFmoc(106)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-N-δ-叔丁氧羰基-L-鸟氨酸(8.73g)作为在二氯甲烷(100mL)和二异丙基乙胺(DIPEA，13.4mL)中的溶液加入到预先溶胀的商购的2-氯三苯甲基树脂107(10.0g)中。将该混合物振摇1小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用Kaiser试验(参见上文)判断反应完成。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×100mL)，甲醇(3×100mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×100mL)洗涤固体而得到化合物106。
反应2树脂-Orn(NHBoc)-NH2(108)的制备 将化合物106在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(100mL)中搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，重新悬浮于含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(100mL)中且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×130mL)，甲醇(3×130mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×130mL)洗涤固体而得到化合物108。
反应3树脂-Orn(NHBoc)-Sar-NMeFmoc(109)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-肌氨酸(2.6g)、2-(1H-苯并三唑-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU，2.7g)、HOBt(1.13g)和二异丙基乙胺(DIPEA，2.9mL)作为在N-甲基吡咯烷酮(100mL)中的溶液加入到化合物108(10g)中。将该混合物振摇60分钟，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用标准Kaiser试验(参见上文)测试少许珠粒中存在的游离胺。Kaiser试验产生黄色，由此认为偶联完成。在通过烧结玻璃漏斗过滤后，用N-甲基吡咯烷(3×115mL)，甲醇(3×115mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×115mL)洗涤含有树脂的产物而得到化合物109。
反应4树脂-Orn(NHBoc)-Sar-NMeH(110)的制备 将化合物109在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(100mL)中搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，重新悬浮于含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(100mL)中且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×130mL)，甲醇(3×130mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×130mL)洗涤固体而得到化合物110。
反应5树脂-Orn(NHBoc)-Sar-Thr-NHFmoc(111)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-苏氨酸(2.9g)、2-(1H-苯并三唑-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU，2.7g)、HOBt(1.13g)和二异丙基乙胺(DIPEA，2.9mL)作为在中N-甲基吡咯烷酮的溶液(100mL)加入到化合物1110(11g)中。将该混合物振摇60分钟，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用标准Kaiser试验(参见上文)测试少许珠粒中存在的游离胺。Kaiser试验产生黄色，由此认为偶联完成。在通过烧结玻璃漏斗过滤后，用N-甲基吡咯烷(3×115mL)，甲醇(3×115mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×115mL)洗涤含有树脂的产物而得到化合物111。
反应6树脂-Orn(NHBoc)-Sar-Thr-NH2(112)的制备 将化合物111在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(110mL)中搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，重新悬浮于含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(110mL)中且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×110mL)，甲醇(3×110mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×110mL)洗涤固体而得到化合物112。
反应7树脂-Orn(NHBoc)-Sar-Thr-Asp(OtBu)-NHFmoc(113)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-天冬氨酸β-叔丁基酯，TBTU(2.7g)、HOBt(1.13g)作为在N-甲基吡咯烷酮中的溶液(100mL)加入到化合物112(11g)中，随后添加二异丙基乙胺(DIPEA，2.9mL)。将该混合物振摇60分钟，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用标准Kaiser试验(参见上文)测试少许珠粒中存在的游离胺。Kaiser试验产生黄色，由此认为偶联完成。在过滤后，用N-甲基吡咯烷(3×115mL)，甲醇(3×115mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×115mL)洗涤含有树脂的产物而得到化合物113。
反应8树脂-Orn(NHBoc)-Sar-Thr-Asp(OtBu)-NH2(114)的制备 将化合物113在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(115mL)中搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，重新悬浮于含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(115mL)中且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×120mL)，甲醇(3×120mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×120mL)洗涤固体而得到化合物114。
反应9树脂-Orn(NHBoc)-Sar-Thr-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-NHFmoc(115)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-D-天冬酰胺(5.0g)、2-(1H-苯并三唑-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU，2.7g)、HOBt(1.13g)和二异丙基乙胺(DIPEA，2.9mL)作为在NMP中的溶液(120mL)加入到化合物114(12g)中。将该混合物振摇60分钟，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用标准Kaiser试验(参见上文)测试少许珠粒中存在的游离胺。Kaiser试验产生黄色，由此认为偶联完成。在通过烧结玻璃漏斗过滤后，用N-甲基吡咯烷(3×125mL)，甲醇(3×125mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×125mL)洗涤含有树脂的产物而得到化合物115。
反应10树脂-Orn(NHBoc)-Sar-Thr-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-NH2(116)的制备 将化合物115在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(130mL)中搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，重新悬浮于含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(130mL)中且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×130mL)，甲醇(3×130mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×130mL)洗涤固体而得到化合物116。
反应11树脂-Orn(NHBoc)-Sar-Thr-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-NHFmoc(117)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-色氨酸(3.57g)、2-(1H-苯并三唑-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU，2.7g)、HOBt(1.13g)和二异丙基乙胺(DIPEA，2.9mL)作为在N-甲基吡咯烷酮中的溶液(130mL)加入到化合物116(13g)中。将该混合物振摇60分钟，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用标准Kaiser试验(参见上文)测试少许珠粒中存在的游离胺。Kaiser试验产生黄色，由此认为偶联完成。在通过烧结玻璃漏斗过滤后，用N-甲基吡咯烷(3×135mL)，甲醇(3×135mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×135mL)洗涤含有树脂的产物而得到化合物117。
反应12树脂-Orn(NHBoc)-Sar-Thr-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-NH2(118)的制备 将化合物117在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(130mL)中搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，重新悬浮于含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(130mL)中且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×130mL)，甲醇(3×130mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×130mL)洗涤固体而得到化合物118。
反应13树脂-Orn(NHBoc)-Sar-Thr-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-8-甲基癸酰胺(105)的制备 将商购8-甲基癸酸(1.56g)、2-(1H-苯并三唑-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU，2.7g)、二异丙基乙胺(DIPEA，2.9mL)和1-羟基-苯并三唑(1.25g)作为在N-甲基吡咯烷中的溶液(120mL)加入到化合物118(13.8g)中。将该混合物振摇18小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用标准Kaiser试验(参见上文)判断反应完成。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×120mL)，甲醇(3×120mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×120mL)洗涤固体而得到化合物105。
实施例1-25肽树脂化合物119的合成 树脂-Orn(NHBoc)-Sar-Thr-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-8-甲基癸酰胺(119) 反应1树脂-Orn(NHBoc)-Sar-Thr-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-NHFmoc.(120)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-D-谷氨酸γ-叔丁基酯(2.29g)、TBTU(1.73g)、HOBt(0.73g)和DIPEA(1.9mL)作为在NMP中的溶液(25mL)加入到化合物114(3.3g)中。将该混合物振摇3小时。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×25mL)，甲醇(3×25mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×25mL)洗涤固体而得到化合物120。
反应2树脂-Orn(NHBoc)-Sar-Thr-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-NH2(121)的制备 将化合物120在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(25mL)中搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，重新悬浮于含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(25mL)中且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×30mL)，甲醇(3×30mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×30mL)洗涤固体而得到化合物121。
反应3树脂-Orn(NHBoc)-Sar-Thr-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-NHFmoc(122)的制备 将商购的Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-色氨酸(2.30g)、2-(1H-苯并三唑-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU，1.7g)、HOBt(0.73g)和二异丙基乙胺(DIPEA，1.9mL)作为在N-甲基吡咯烷酮中的溶液(25mL)加入到化合物121(3.5g)中。将该混合物振摇60分钟，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用标准Kaiser试验(参见上文)测试少许珠粒中存在的游离胺。Kaiser试验产生黄色，由此认为偶联完成。在通过烧结玻璃漏斗过滤后，然后用N-甲基吡咯烷(3×25mL)，甲醇(3×25mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×25mL)洗涤含有树脂的产物而得到化合物122。
反应4树脂-Orn(NHBoc)-Sar-Thr-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-NH2(123)的制备 将化合物122在含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(25mL)中搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，重新悬浮于含20％哌啶的N-甲基吡咯烷(25mL)中且搅拌30分钟。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，然后用N-甲基吡咯烷(3×30mL)，甲醇(3×30mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×30mL)洗涤固体而得到化合物123。
反应5树脂-Orn(NHBoc)-Sar-Thr-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-8-甲基癸酰胺(119)的制备 将商购的8-甲基癸酸(0.50g)、2-(1H-苯并三唑-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU，0.86g)、二异丙基乙胺(DIPEA，0.94mL)和1-羟基-苯并三唑(0.35g)作为在N-甲基吡咯烷中的溶液(30mL)加入到化合物123(3.8g)中。将该混合物振摇18小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且使用Kaiser试验(参见上文)判断反应完成。将该反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤后，然后用N-甲基吡咯烷(3×36mL)，甲醇(3×36mL)并且再次用N-甲基吡咯烷(3×36mL)洗涤固体而得到化合物119。
实施例1-26肽树脂化合物76的酯化和裂解 Gly-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-8-甲基癸酰胺(126) 用氩气充分净化商购Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-异亮氨酸(1.7g)、4-二甲氨基吡啶(117mg)和N-甲基-2-氯吡啶鎓碘化物(1.23g)，然后悬浮于二氯甲烷(20mL)中。加入三乙胺(76μL)并且将该反应混合物搅拌至得到均匀溶液。向该溶液中加入化合物76(2.0g)，再次用氩气净化烧瓶并且振摇14小时。然后将所得树脂通过烧结玻璃漏斗过滤并且用二氯甲烷充分洗涤。将固体悬浮于二氯甲烷(21mL)、2，2，2-三氟乙醇(7mL)和乙酸(7mL)中并且振摇3小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤并且蒸发滤液而得到所需的肽126(285mg)，为白色固体。
实施例1-27肽树脂化合物77的酯化和裂解 Gly-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-十三酰胺(127)的制备 用氩气充分净化商购Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-异亮氨酸(1.48g)、4-二甲氨基吡啶(102mg)和N-甲基-2-氯吡啶鎓碘化物(1.07g)，然后悬浮于二氯甲烷(20mL)中。加入三乙胺(1.17mL)并且将该反应混合物搅拌至得到均匀溶液。向该溶液中加入化合物77(1.75g)，再次用氩气净化烧瓶并且振摇14小时。然后将所得树脂通过烧结玻璃漏斗过滤并且用二氯甲烷充分洗涤。将固体悬浮于二氯甲烷(15mL)、2，2，2-三氟乙醇(5mL)和乙酸(5mL)中并且振摇4小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤并且蒸发滤液而得到所需肽127(490mg)，为白色固体。
实施例1-28肽树脂化合物78的酯化和裂解 Gly-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-8-甲基癸酰胺(128)的制备 向化合物78(5.9g)中加入商购Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-异亮氨酸(4.9g)、溴-三-吡咯烷磷鎓六氟磷酸盐(PyBrOP，6.5g)和二-异丙基乙胺(7.3mL)在二氯甲烷(60mL)中的溶液。加入二甲氨基吡啶(25mg)并且将该混合物振摇2小时。2小时后，将该混合物通过烧结玻璃漏斗过滤并且用二氯甲烷(3×60mL)洗涤且重复偶联操作步骤。将所得树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×60mL)和甲醇(3×60mL)洗涤且在减压下用氢氧化钾颗粒干燥。将该干燥的树脂悬浮于二氯甲烷(27mL)，2，2，2-三氟乙醇(9mL)和乙酸(9mL)中并且振摇3小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤而得到所需的肽128(2.1g)，为白色固体。
实施例1-29肽树脂化合物83的酯化和裂解 Ala-Sar-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DAsn(ONHTrt)-Trp-8-甲基癸酰胺(129)的制备 向化合物83(3.3g)中加入商购Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-异亮氨酸(3.2g)、溴-三-吡咯烷磷鎓六氟磷酸盐(PyBrOP，4.2g)和二-异丙基乙胺(4.7mL)在二氯甲烷(60mL)中的溶液。加入二甲氨基吡啶(23mg)并且将该混合物振摇2小时。2小时后，将该混合物通过烧结玻璃漏斗过滤并且用二氯甲烷(3×30mL)洗涤且重复偶联操作步骤。将所得树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×30mL)和甲醇(3×30mL)洗涤且在减压下用氢氧化钾颗粒干燥。将该干燥的树脂悬浮于二氯甲烷(24mL)，2，2，2-三氟乙醇(6mL)和乙酸(6mL)中并且振摇3小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤而得到所需的肽129(2.9g)，为白色固体。
实施例1-30肽树脂化合物75的酯化和裂解 Ala-Sar-Thr(OIleNHAlloc)-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-十一烷酰胺(130)的制备 用氩气充分净化商购Nα-(烯丙氧羰基)-L-异亮氨酸124(1.34g，参见下文)、4-二甲氨基吡啶(15mg)和N-甲基-2-氯吡啶鎓碘化物(1.59g)，然后悬浮于二氯甲烷(30mL)中。加入三乙胺(1.74mL)并且将该反应混合物搅拌至得到均匀溶液。向该溶液中加入化合物75(1.25g)，再次用氩气净化烧瓶并且振摇14小时。然后将所得树脂通过烧结玻璃漏斗过滤并且用二氯甲烷充分洗涤。将固体悬浮于二氯甲烷(12mL)、2，2，2-三氟乙醇(4mL)和乙酸(4mL)中并且振摇3小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤并且蒸发滤液而得到所需肽130(154mg)，为白色固体。
实施例1-31肽树脂化合物84的酯化和裂解 Ala-Sar-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-8-甲基癸酰胺(131)的制备 向化合物84(4.8g)中加入商购Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-异亮氨酸(3.2g)、溴-三-吡咯烷磷鎓六氟磷酸盐(PyBrOP，4.2g)和二-异丙基乙胺(4.7mL)在二氯甲烷(60mL)中的溶液。加入二甲氨基吡啶(23mg)并且将该混合物振摇2小时。2小时后，将该混合物通过烧结玻璃漏斗过滤并且用二氯甲烷(3×30mL)洗涤且重复偶联操作步骤。将所得树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×30mL)和甲醇(3×30mL)洗涤且在减压下用氢氧化钾颗粒干燥。将该干燥的树脂悬浮于二氯甲烷(24mL)，2，2，2-三氟乙醇(6mL)和乙酸(6mL)中并且振摇3小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤而得到所需的肽131(2.92g)，为白色固体。
实施例1-32肽树脂化合物89的酯化和裂解 Ala-Gly-Thr(OIleNHAlloc)-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-十一烷酰胺(132)的制备 用氩气充分净化Nα-(烯丙氧羰基)-L-异亮氨酸124(1.34g，参见下文)、4-二甲氨基吡啶(15mg)和N-甲基-2-氯吡啶鎓碘化物(1.59g)，然后悬浮于二氯甲烷(30mL)中。加入三乙胺(1.74mL)并且将该反应混合物搅拌至得到均匀溶液。向该溶液中加入化合物89(1.25g)，再次用氩气净化烧瓶并且振摇14小时。然后将所得树脂通过烧结玻璃漏斗过滤并且用二氯甲烷充分洗涤。将固体悬浮于二氯甲烷(12mL)、2，2，2-三氟乙醇(4mL)和乙酸(4mL)中并且振摇3小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤并且蒸发滤液而得到所需肽132(147mg)，为白色固体。
实施例1-33肽树脂化合物100的酯化和裂解 Ala-Gly-Thr(OIleNHAlloc)-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-十一烷酰胺(133)的制备 用氩气充分净化Nα-(烯丙氧羰基)-L-异亮氨酸124(1.34g，参见下文)、4-二甲氨基吡啶(15mg)和N-甲基-2-氯吡啶鎓碘化物(1.59g)，然后悬浮于二氯甲烷(30mL)中。加入三乙胺(1.74mL)并且将该反应混合物搅拌至得到均匀溶液。向该溶液中加入化合物100(1.25g)。再次用氩气净化烧瓶并且振摇14小时。然后将所得树脂通过烧结玻璃漏斗过滤并且用二氯甲烷充分洗涤。将固体悬浮于二氯甲烷(12mL)、2，2，2-三氟乙醇(4mL)和乙酸(4mL)中并且振摇3小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤并且蒸发滤液而得到所需肽133(95mg)，为白色固体。
实施例1-34肽树脂化合物105的酯化和裂解 Orn(NHBoc)-Sar-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-8-甲基癸酰胺(134)的制备 用氩气充分净化商购Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-异亮氨酸(2.0g)、4-二甲氨基吡啶(140mg)和N-甲基-2-氯吡啶鎓碘化物(1.46g)，然后悬浮于二氯甲烷(20mL)中。加入三乙胺(1.6mL)并且将该反应混合物搅拌至得到均匀溶液。向该溶液中加入化合物105(2.0g)。再次用氩气净化烧瓶并且振摇14小时。然后将所得树脂通过烧结玻璃漏斗过滤并且用二氯甲烷充分洗涤。将固体悬浮于二氯甲烷(21mL)、2，2，2-三氟乙醇(7mL)和乙酸(7mL)中并且振摇3小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤并且蒸发滤液而得到所需肽134(890mg)，为白色固体。
实施例1-35肽树脂化合物119的酯化和裂解 Orn(NHBoc)-Sar-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-8-甲基癸酰胺(135)的制备 用氩气充分净化商购Nα-(9-芴基甲氧羰基)-L-异亮氨酸(2.0g)、4-二甲氨基吡啶(140mg)和N-甲基-2-氯吡啶鎓碘化物(1.46g)，然后悬浮于二氯甲烷(20mL)中。加入三乙胺(1.6mL)并且将该反应混合物搅拌至得到均匀溶液。向该溶液中加入化合物119(1.75g)，再次用氩气净化烧瓶并且振摇14小时。然后将所得树脂通过烧结玻璃漏斗过滤并且用二氯甲烷充分洗涤。将固体悬浮于二氯甲烷(21mL)、2，2，2-三氟乙醇(7mL)和乙酸(7mL)中并且振摇3小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤并且蒸发滤液而得到所需肽135(761mg)，为白色固体。
实施例1-36化合物C16的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-Orn(NHBoc)-Gly-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-8-甲基癸酰胺(137)的制备 将羟基-苯并三唑(17mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(benzotriazole-l-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorophosphonate)(BOP，55mg)和二异丙基乙胺(22μL)加入到化合物126(174mg)在二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中，然后加入化合物9(300mg)并且将该混合物振摇17小时。移出部分树脂并使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联完成。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×3mL)洗涤并且在减压下干燥，得到树脂结合的化合物137。
反应2
(138)的制备 将化合物137置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠(sodium thiocarbozoate)的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体并且在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物138。
反应3化合物(C16)的制备 将干燥的化合物138悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到纯的产物C16(3.7mg)。
实施例1-37化合物C76的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-Orn(NHBoc)-Gly-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-8-甲基癸酰胺(140)的制备 将羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，66mg)和二异丙基乙胺(26μL)加入到化合物128(174mg)在二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中，然后加入化合物9(300mg)并且将该混合物振摇17小时。移出部分树脂并使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联完成。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×3mL)洗涤并且在减压下干燥，得到树脂结合的化合物140。
反应2
的制备 将化合物140置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体并且在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物141。
反应3化合物(C76)的制备 将干燥的化合物141悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到纯的产物C76(9.0mg)。
实施例1-38化合物C75的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-Orn(NHBoc)-Sar-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-8-甲基癸酰胺(143)的制备 将羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，66mg)和二异丙基乙胺(26μL)加入到化合物134(243mg)在二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中，然后加入化合物21(322mg)并且将该混合物振摇17小时。移出部分树脂并使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联完成。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×3mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物143。
反应2
的制备 将化合物143置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体并且在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物144。
反应3化合物(C75)的制备 将干燥的化合物144悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C75(8.1mg)。
实施例1-39化合物C74的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-Ala-Gly-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-8-甲基癸酰胺(146)的制备 将羟基-苯并三唑(27mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，88.5mg)和二异丙基乙胺(100μL)加入到化合物126(278mg)在二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中，然后加入化合物38(227mg)并且将该混合物振摇17小时。移出部分树脂并使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联未完成。再加入羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，60mg)和二异丙基乙胺(30μL)，并且将该混合物振摇26小时。使用Kaiser试验判断偶联完成，由此将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×5mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物146。
反应2化合物(147)的制备
将化合物146置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体并且在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物147。
反应3化合物(C74)的制备 将干燥的化合物147悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C74(3.9mg)。
实施例1-40
的制备 反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-Ala-Sar-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-8-甲基癸酰胺(149)的制备 将羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，66mg)和二异丙基乙胺(26μL)加入到化合物129(228mg)在二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中，加入化合物21(280mg)并且将该混合物振摇17小时。移出部分树脂并使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联完成。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×3mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物149。
反应2
的制备 将化合物149置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体并且在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇7小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物150。
反应3(C86)的制备 将干燥的化合物150悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C86(2.8mg)。
实施例1-41化合物C79的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-Orn(NHBoc)-Sar-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-8-甲基癸酰胺(152)的制备 将羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，66mg)和二异丙基乙胺(52μL)加入到化合物135(217mg)在二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中，然后加入化合物21(278mg)并且将该混合物振摇17小时。移出部分树脂并使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联完成。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×3mL)洗涤并且在减压下干燥，得到树脂结合的化合物152。
反应2
的制备 将化合物151置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体并且在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇7小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物153。
反应3化合物(C79)的制备 将干燥的化合物153悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C79(1.5mg)。
实施例1-42化合物C81的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-Ala-Gly-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-8-甲基癸酰胺(155)的制备 将羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，66mg)和二异丙基乙胺(26μL)加入到化合物128(183mg)在二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中，然后加入化合物38(227mg)并且将该混合物振摇17小时。移出部分树脂并使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联完成。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×3mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物155。
反应2
的制备 将化合物155置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体并且在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物156。
反应3(C81)的制备 将干燥的化合物156悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C81(2.3mg)。
实施例1-43化合物C80的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-Ala-Sar-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-8-甲基癸酰胺(158)的制备 将羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，66mg)和二异丙基乙胺(26μL)加入到化合物131(196mg)在二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中，然后加入化合物21(278mg)并且将该混合物振摇17小时。移出部分树脂并使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联完成。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×3mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物158。
反应2

的制备 将树脂158置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体并且在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物159。
反应3化合物(C80)的制备 将干燥的化合物159悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C80(6.2mg)。
实施例1-44化合物C72的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-Orn(NHBoc)-Gly-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-8-甲基癸酰胺(161)的制备 将羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，66mg)和二异丙基乙胺(26μL)加入到化合物126(274mg)在二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中。加入化合物50(303mg)并且将该混合物振摇17小时。移出部分树脂并使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联完成。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×3mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物161。
反应2
的制备 将化合物161置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体并且在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物162。
反应3(C72)的制备 将干燥的化合物162悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C72(2.9mg)。
实施例1-45C352的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-Orp(NHBoc)-Gly-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-8-甲基癸酰胺(164)的制备 将羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，66mg)和二异丙基乙胺(26μL)加入到化合物127(183mg)在二甲基甲酰胺(2mL)中的溶液中。加入化合物50(265mg)并且将该混合物振摇17小时。移出部分树脂并使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联未完成。再加入部分羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑e-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，60mg)和二-异丙基乙胺(30μL)并且将该混合物振摇26小时。使用Kaiser试验判断偶联完成，由此将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×5mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物164。
反应2
的制备 将化合物164置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体并且在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物165。
反应3化合物(C352)的制备 将干燥的化合物165悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C352(4.7mg)。
实施例1-46化合物C85的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-Orn(Boc)-Sar-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-8-甲基癸酰胺(167)的制备 将羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，66mg)和二异丙基乙胺(30μL)加入到化合物134(248mg)在二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中。加入化合物40(238mg)并且将该混合物振摇17小时。移出部分树脂并使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联完成。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×3mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物167。
反应2
的制备 将化合物167置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体并且在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物168。
反应3化合物(C85)的制备 将干燥的化合物168悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C85(3.7mg)。
实施例1-47化合物C353的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-Ala-Gly-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-8-甲基癸酰胺(170)的制备 将羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，66mg)和二异丙基乙胺(52μL)加入到化合物126(209mg)在二甲基甲酰胺(2mL)中的溶液中。加入化合物52(340mg)并且将该混合物振摇17小时。移出部分树脂并使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联未完成。再加入部分羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，60mg)和二-异丙基乙胺(30μL)并且将该混合物振摇26小时。使用Kaiser试验判断偶联完成，由此将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×5mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物170。
反应2
的制备 将树脂170置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤。用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体并且在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物171。
反应3化合物(C353)的制备 将干燥的化合物171悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C353(6.8mg)。
实施例1-48化合物C82的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-Ala-Sar-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DAsn(NHTpt)-Trp-8-甲基癸酰胺(173)的制备 将羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，66mg)和二异丙基乙胺(26μL)加入到化合物129(221mg)在二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中。加入化合物40(238mg)并且将该混合物振摇17小时。除去部分树脂并且使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联完成。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×3mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物173。
反应2
的制备 将化合物173置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体并且在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物174。
反应3制备(C82) 将干燥的化合物174悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C82(3.8mg)。
实施例1-49化合物C83的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-Orp(NHBoc)-Sar-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-8-甲基癸酰胺(176)的制备 将羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，66mg)和二异丙基乙胺(26μL)加入到化合物135(221mg)在二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中。加入化合物40(238mg)并且将该混合物振摇17小时。除去部分树脂并且使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联完成。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×3mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物176。
反应2
的制备 将化合物176置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体并且在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物177。
反应3化合物(C83)的制备 将干燥的化合物177悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C83(4.3mg)。
实施例1-50化合物C84的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-Ala-Gly-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-8-甲基癸酰胺(179)的制备 将羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，66mg)和二异丙基乙胺(26μL)加入到化合物128(183mg)在二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中。加入化合物52(212mg)并且将该混合物振摇17小时。除去部分树脂并且使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联完成。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×3mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物179。
反应2
的制备 将化合物179置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体并且在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物180。
反应3化合物(C84)的制备 将干燥的化合物180悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C84(6.6mg)。
实施例1-51化合物C354的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DAla-Asp(OtBu)-Ala-Sar-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-8-甲基癸酰胺(182)的制备 将羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，66mg)和二异丙基乙胺(26μL)加入到化合物131(196mg)在二甲基甲酰胺(2mL)中的溶液中。加入化合物40(238mg)并且将该混合物振摇17小时。除去部分树脂并且使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联未完成。再加入部分羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，60mg)和二-异丙基乙胺(30μL)且然后将该混合物振摇26小时。使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联完成，由此将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×5mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物182。
反应2
的制备 将化合物182置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体并且在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物183。
反应3化合物(C354)的制备 将干燥的化合物183悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C354(4.7mg)。
实施例1-52化合物C73的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-Orn(NHBoc)-Gly-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-8-甲基癸酰胺(185)的制备 将羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，66mg)和二异丙基乙胺(26μL)加入到化合物126(298mg)在二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中。加入化合物54(312mg)并且将该混合物振摇17小时。除去部分树脂并且使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联完成。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×3mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物185。
反应2
的制备 将化合物185置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体并且在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物186。
反应3化合物(C73)的制备 将干燥的化合物186悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C73(24.6mg)。
实施例1-53化合物C355的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-Orn(NHBoc)-Gly-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)u-Trp-8-甲基癸酰胺(188)的制备 将羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，66mg)和二异丙基乙胺(26μL)加入到化合物128(183mg)在二甲基甲酰胺(2mL)中的溶液中。加入化合物54(322.6mg)并且将该混合物振摇17小时。除去部分树脂并且使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联未完成。再加入部分羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，60mg)和二-异丙基乙胺(30μL)且然后将该混合物振摇26小时。使用Kaiser试验判断偶联完成，由此将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×5mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物188。
反应2
的制备 将化合物188置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体并且在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物189。
反应3(C355)的制备 将干燥的化合物189悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并合有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C355(8.2mg)。
实施例1-54化合物C356的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-Orn(NHBoc)-Sar-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-8-甲基癸酰胺(191)的制备 将羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，66mg)和二异丙基乙胺(26μL)加入到化合物134(243mg)在二甲基甲酰胺(2mL)中的溶液中。加入化合物34(263mg)并且将该混合物振摇17小时。除去部分树脂并且使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联未完成。再加入部分羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，60mg)和二-异丙基乙胺(30μL)且然后将该混合物振摇26小时。使用Kaiser试验判断偶联完成，由此将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×5mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物191。
反应2
的制备 将化合物191置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体并且在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物192。
反应3(C356)的制备 将干燥的化合物192悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C356(8.7mg)。
实施例1-55化合物C 357的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-Ala-Gly-Thr(OIleNHAlloc)-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-十一烷酰胺(194)的制备 将羟基-苯并三唑(14mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，44mg)和二异丙基乙胺(20μL)加入到化合物132(147mg)在二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中。加入化合物34(200mg)并且将该混合物振摇17小时。除去部分树脂并且使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联未完成。再加入部分羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，60mg)和二-异丙基乙胺(30μL)且然后将该混合物振摇26小时。使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联完成，由此将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×5mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物194。
反应2
的制备 将化合物194置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％-二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物195。
反应3(C357)的制备 将干燥的化合物195悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物(43mg)。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C357(4.5mg)。
实施例1-56化合物C358的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp-Ala-Sar-Thr(OIleNHAlloc)-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-十一烷酰胺(197)的制备 将羟基-苯并三唑(14mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，44mg)和二异丙基乙胺(20μL)加入到化合物130(154mg)在二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中。加入化合物34(200mg)并且将该混合物振摇17小时。除去部分树脂并且使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联未完成。再加入部分羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，60mg)和二-异丙基乙胺(30μL)且然后将该混合物振摇26小时。使用Kaiser试验判断偶联完成，由此将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×5mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物197。
反应2
的制备 将化合物197置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体并且在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物198。
反应3化合物(C358)的制备 将干燥的化合物198悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C358(2.7mg)。
实施例1-57化合物C359的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-Orn(NHBoc)-Sar-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-8-甲基癸酰胺(200)的制备 将羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，66mg)和二异丙基乙胺(26μL)加入到化合物135(217mg)在二甲基甲酰胺(2mL)中的溶液中。加入化合物34(263mg)并且将该混合物振摇17小时。除去部分树脂并且使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联未完成。再加入部分羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，60mg)和二-异丙基乙胺(30μL)且然后将该混合物振摇26小时。使用Kaiser试验判断偶联完成，由此将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×5mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物200。
反应2
的制备 将化合物200置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物201。
反应3(C359)的制备 将干燥的化合物201悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C359(4.7mg)。
实施例1-58化合物C360的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-Ala-Gly-Thr(OIleNHAlloc)-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-十一烷酰胺(203)的制备 将羟基-苯并三唑(14mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，44mg)和二异丙基乙胺(20μL)加入到化合物133(95mg)在二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中。加入化合物34(200mg)并且将该混合物振摇17小时。除去部分树脂并且使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联未完成。再加入部分羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，60mg)和二异丙基乙胺(30μL)且然后将该混合物振摇26小时。使用Kaiser试验判断偶联完成，由此将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×5mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物203。
反应2
的制备 将化合物203置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物204。
反应3化合物(C360)的制备 将干燥的化合物204悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C360(3.4mg)。
实施例1-59化合物C361的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DSer(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-Ala-Sar-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-8-甲基癸酰胺(206)的制备 将羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，66mg)和二异丙基乙胺(26μL)加入到化合物131(196mg)在二甲基甲酰胺(2mL)中的溶液中。加入化合物34(270mg)并且将该混合物振摇17小时。除去部分树脂并且使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联未完成。再加入部分羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，60mg)和二-异丙基乙胺(30μL)且然后将该混合物振摇26小时。使用Kaiser试验判断偶联完成，由此将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×5mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物206。
反应2
的制备 将化合物206置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物207。
反应3化合物(C361)的制备 将干燥的化合物207悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C361(6.3mg)。
实施例1-60化合物C77的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-Orn(NHBoc)-Gly-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-8-甲基癸酰胺(209)的制备 将羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，66mg)和二异丙基乙胺(26μL)加入到化合物126(243mg)在二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中。加入化合物60(217mg)并且将该混合物振摇17小时。除去部分树脂并且使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联完成。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×3mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物209。
反应2
的制备 将化合物209置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物210。
反应3化合物(C77)的制备 将干燥的化合物210悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C77(3.8mg)。
实施例1-61化合物C362的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-Orn(NHBoc)-Gly-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-8-甲基癸酰胺(212)的制备 将羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，66mg)和二异丙基乙胺(26μL)加入到化合物128(183mg)在二甲基甲酰胺(2mL)中的溶液中。加入化合物60(217mg)并且将该混合物振摇17小时。除去部分树脂并且使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联未完成。
再加入部分羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，60mg)和二-异丙基乙胺(30μL)且然后将该混合物振摇26小时。使用Kaiser试验判断偶联完成，由此将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×5mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物212。
反应2
的制备 将化合物212置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物213。
反应3化合物(C362)的制备 将干燥的化合物213悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C362(3.1mg)。
实施例1-62化合物C363的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-Orn(NHBoc)-Sar-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-8-甲基癸酰胺(215)的制备 将羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，66mg)和二异丙基乙胺(26μL)加入到化合物134(342mg)在二甲基甲酰胺(2mL)中的溶液中。加入化合物56(416mg)并且将该混合物振摇17小时。除去部分树脂并且使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联未完成。再加入部分羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，60mg)和二-异丙基乙胺(30μL)且然后将该混合物振摇26小时。使用Kaiser试验判断偶联完成，由此将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×5mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物215。
反应2
的制备 将化合物215置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物216。
反应3化合物(C363)的制备 将干燥的化合物216悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C363(6.1mg)。
实施例1-63化合物C364的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-Ala-Gly-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-十三酰胺(218)的制备 将羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，66mg)和二异丙基乙胺(26μL)加入到化合物127(146mg)在二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中。加入化合物62(171mg)并且将该混合物振摇17小时。除去部分树脂并且使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联完成。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×3mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物218。
反应2
的制备 将化合物218置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物219。
反应3化合物(C364)的制备 将干燥的化合物219悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C364(4.8mg)。
实施例1-64化合物C365的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-Ala-Sar-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DAsn(NHTrt)-Trp-8-甲基癸酰胺(221)的制备 将羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，66mg)和二异丙基乙胺(26μL)加入到化合物129(195mg)在二甲基甲酰胺(2mL)中的溶液中。加入化合物56(400mg)并且将该混合物振摇17小时。除去部分树脂并且使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联未完成。再加入部分羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，60mg)和二-异丙基乙胺(30μL)且然后将该混合物振摇26小时。使用Kaiser试验判断偶联完成，由此将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×5mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物221。
反应2
的制备 将化合物221置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物222。
反应3化合物(C365)的制备 将干燥的化合物222悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C365(10.2mg)。
实施例1-65化合物C366的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-Orn(NHBoc)-Sar-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-8-甲基癸酰胺(224)的制备 将羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，66mg)和二异丙基乙胺(26μL)加入到化合物135(217mg)在二甲基甲酰胺(2mL)中的溶液中。加入化合物56(217mg)并且将该混合物振摇17小时。除去部分树脂并且使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联未完成。再加入部分羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，60mg)和二-异丙基乙胺(30μL)且然后将该混合物振摇26小时。使用Kaiser试验判断偶联完成，由此将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×5mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物224。
反应2
的制备 将化合物224置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物225。
反应3化合物(C366)的制备 将化合物225悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C366(1.1mg)。
实施例1-66化合物C367的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-Ala-Gly-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-8-甲基癸酰胺(227)的制备 将羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，66mg)和二异丙基乙胺(26μL)加入到化合物128(183mg)在二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中。加入化合物62(249mg)并且将该混合物振摇17小时。除去部分树脂并且使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联完成。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×3mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物227。
反应2
的制备 将化合物227置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物228。
反应3(C367)的制备 将干燥的化合物228悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C366(6.9mg)。
实施例1-67化合物C368的制备
反应1树脂-Glu(αO烯丙基)-DAsn(NHTrt)-Gly-Asp(OtBu)-DLys(NHBoc)-Asp(OtBu)-Ala-Sar-Thr(OIleNHFmoc)-Asp(OtBu)-DGlu(OtBu)-Trp-8-甲基癸酰胺(230)的制备 将羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，66mg)和二异丙基乙胺(26μL)加入到化合物131(296mg)在二甲基甲酰胺(2mL)中的溶液中。加入化合物56(416mg)并且将该混合物振摇17小时。除去部分树脂并且使用Kaiser试验(参见上文)判断偶联未完成。再加入部分羟基-苯并三唑(20mg)、苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(BOP，60mg)和二-异丙基乙胺(30μL)且然后将该混合物振摇26小时。使用Kaiser试验判断偶联完成，由此将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷(3×5mL)洗涤并且在减压下干燥，得到化合物230。
反应2
的制备 将化合物230置于氩气气氛下并且用四-(三苯膦)钯(0)(340mg)在二氯甲烷(9.25mL)，乙酸(0.5mL)和N-甲基吗啉(0.25mL)中的溶液处理。将该混合物在环境温度下振摇4.5小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用含0.5％全硫碳酸钠的二甲基甲酰胺(10mL)，含0.5％二-异丙基乙胺的二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。用DMF∶哌啶4∶1(10mL)将树脂洗涤4小时，然后通过烧结玻璃漏斗过滤。用二甲基甲酰胺(10mL)和二氯甲烷(10mL)洗涤固体，然后在减压下干燥。将树脂悬浮于N-甲基吗啉(3mL)中，然后加入1-羟基-苯并三唑(135mg)和1，3-二异丙基碳二亚胺(157μL)。将该反应体系振摇17小时，通过烧结玻璃漏斗过滤并且用N-甲基吗啉充分洗涤而得到化合物231。
反应3化合物(C368)的制备 将干燥的化合物231悬浮于二氯甲烷(2.5mL)、三氟乙酸(2.5mL)、乙二硫醇(125μl)和三异丙基硅烷(125μl)中并且将该反应混合物在环境温度下搅拌4.5小时。将树脂通过烧结玻璃漏斗过滤，用二氯甲烷洗涤，并且在减压下蒸发合并的滤液。然后使粗产物在乙醚(10mL)与水(2.5mL)之间分配。冷冻干燥水层而得到粗产物。通过反相HPLC(C1810μM Jupiter柱250×21.2mm)，用20％乙腈0.5％甲酸∶80％水0.5％甲酸-80％乙腈0.5％甲酸∶20％水0.5％甲酸的梯度在25分钟内洗脱纯化粗产物。合并含有产物的级分并且冷冻干燥而得到化合物C368(11.8mg)。
实施例1-682S，3R-N-Fmoc-L-3-甲基-谷氨酸α烯丙基酯232的立体选择性合成
反应1
在氮气环境中将碘化四丁基铵(39.4g)加入到商购Garner’s醛233(98g)在3M碳酸钾(K2CO3，100mL)中的溶液中而得到非均相溶液。15分钟后，加入膦乙酸叔丁基-二乙酯(130g)并且将该反应混合物剧烈搅拌18小时。加入水(500ml)并且用甲基叔丁基醚(MTBE，3×250mL)萃取所得混合物。将合并的有机级分合并，用饱和氯化钠(1×250mL)洗涤，用硫酸镁(MgSO4)干燥，过滤并且浓缩至得到粗产物，为黄色油状物。通过硅胶柱色谱法纯化，用乙酸乙酯∶己烷1∶9洗脱而得到所需产物234(95.3g)。
反应2
将在氮气环境中的碘化亚铜(CuI，137g)的无水四氢呋喃(THF，2250mL)溶液冷却至-10℃并且搅拌30分钟。向该溶液中加入1.6M甲基碘(MeLi)的乙醚(900mL)溶液，使得温度保持在-10℃以下。将所得混合物在-10℃下搅拌30分钟，然后冷却至-78℃并且搅拌45分钟。加入三甲基氯硅烷TMSCl(91mL)，将温度保持在-78℃以下，然后将该反应混合物搅拌15分钟。在1小时内滴加底物酯234(85.45g)在THF(250ml)中的溶液。将该反应混合物在-78℃下搅拌1小时并且升温至-40℃，此后缓慢加入90％饱和氯化铵(NH4Cl)∶10％氢氧化铵(NH4OH，1500mL)的猝灭溶液。将该反应混合物搅拌30分钟并且升温至-30℃，此后分3个单独的1500mL部分完成(work up)。分配各部分并且用MTBE(500mL)萃取水层。通过C盐过滤合并的有机相并且用90％饱和NH4Cl∶10％NH4OH溶液(4×400mL)洗涤，用硫酸钠(Na2SO4)干燥，过滤并且浓缩至得到产物。在高度真空下从产物中除去挥发性物质而得到产物235(85.45g)。不经进一步纯化使用化合物235。
反应3
将噁唑烷235(70g)在甲醇(1800mL)中的溶液冷却至0℃并且搅拌1小时。在2小时内滴加三氟化硼乙酸复合物(BF3.2HOAc，450mL)，使内部温度保持在3℃以下。然后通过在2小时内添加20％碳酸氢钠(Na2CO3，3000mL)使该反应混合物猝灭并且将所得溶液分5个单独的1000mL部分完成。用二氯甲烷(3×300mL)萃取各个1000mL部分，合并有机萃取物，用NaHCO3，(1×300mL)，饱和氯化钠(1×300mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并且浓缩得到粗产物。通过硅胶柱色谱法纯化合并的产物，用20％乙酸乙酯∶80％己烷-50％乙酸乙酯∶50％己烷梯度洗脱。合并并且蒸发含有产物的级分而得到所需产物236(36.3g)。
反应4
将醇236(24g)在乙腈(238mL)和水(29.7mL)中的溶液冷却至0℃并且逐份加入高碘酸(52.2g)以便将温度维持在0℃。将该反应混合物在0℃下搅拌45分钟并且加入三氧化铬(CrO3，460mg)。将该反应混合物搅拌15分钟，此后通过缓慢添加0.4M磷酸氢二钠溶液(Na2HPO4，560mL，pH9.0)猝灭。用MBTE(4×300mL)萃取所得混合物并且用饱和氯化钠(1×250mL)，NaHCO3(1×250mL)和饱和氯化钠(1×250mL)洗涤合并的有机萃取物。然后用MgSO4干燥有机部分，过虑并且浓缩得到粗产物。通过制备型硅胶薄层色谱法纯化，用20％乙酸乙酯∶80％己烷洗脱并且用二氯甲烷从硅胶中萃取而得到所需产物237(15.32g)。
反应5
向酸237(15.32g)在N，N-二甲基甲酰胺(DMF，200mL)中的溶液中加入碳酸氢钾(KHCO3，9.66g)并且将所得悬浮液搅拌15分钟。然后在30分钟内滴加烯丙基溴(21mL)在DMF(200mL)中的溶液并且将该反应混合物搅拌19小时。加入水(500mL)并且用乙酸乙酯(5×200mL)萃取所得混合物，并且用水(2×200mL)和饱和氯化钠(1×200mL)洗涤合并的有机萃取物。然后用Na2SO4干燥有机部分，过滤并且浓缩得到粗产物，为黄色油状物。通过硅胶柱色谱法纯化，用乙酸乙酯己烷1∶4洗脱而得到所需产物238(9.2g)。
反应6
将三氟乙酸(TFA，25mL)和三异丙基硅烷(TIPS，1mL)加入到酯238(9.2g)在二氯甲烷中的溶液中并且将该反应混合物搅拌1小时。然后真空浓缩该混合物并且将所得残余物溶于己烷(100mL)并且再蒸发三次。然后将残余物溶于饱和NaHCO3(53mL)和1，4-二噁烷(50mL)并且在30分钟内滴加9-芴基甲氧羰基-N-羟基琥珀酰亚胺(FmocOSu，9.52g)在1，4-二噁烷(50mL)中的溶液。在此过程中，该反应混合物变混浊，由此再加入部分1，4-二噁烷(20mL)而得到非均相溶液，将其再搅拌17小时。过滤该反应混合物并且用1，4-二噁烷(50mL)洗涤残余物。蒸发合并的有机级分并且再溶于乙酸乙酯(250mL)且在用硫酸钾(KHSO4，3×50mL)和饱和氯化钠(1×50mL)洗涤前酸化。然后用Na2SO4干燥有机部分，过滤并且浓缩得到粗产物。通过硅胶柱色谱法纯化产物，使用20％乙酸乙酯∶80％己烷-40％乙酸乙酯∶60％己烷梯度洗脱。合并并且蒸发含有产物的级分而得到所需产物232(6.32g)。
实施例1-692S，3S-N-Fmoc-L-3-甲基-谷氨酸α烯丙基酯239的选择性合成
反应1
使甘氨酸苄基酯甲苯磺酸盐(6.75g)在二氯甲烷(100mL)与10％w/vK2CO3水溶液(100mL)之间分配。用二氯甲烷(2×50mL)萃取含水部分并且用MgSO4干燥合并的有机部分，过滤且蒸发得到玻璃状固体(3.29g)。将该固体溶于无水二氯甲烷(80mL)并且加入二苯酮亚胺(3.62g)在二氯甲烷(20mL)中的溶液。将所得混合物在环境温度下搅拌17小时。在真空下将该混合物浓缩得到油状物，再溶于乙醚(80mL)并且用水(2×40mL)洗涤。用MgSO4干燥有机层，过滤并且蒸发得到粗产物，为澄清油状物。通过从温热的乙醚/己烷中重结晶进行纯化而得到纯的241(3.82g)。
反应2
在氮气气氛下向冷却至-78℃的苄基-N-(二苯基亚甲基)甘氨酸酯241(5.7g)和O-烯丙基-N-(9-蒽基甲基)辛可尼丁鎓溴化物(O-allyl-N-(9-anthracenylmethyl)cinchonidinium bromide)(1.05g)在二氯甲烷(80mL)中的悬浮液中加入氢氧化铯(14.53g)。将该混合物搅拌20分钟并且滴加巴豆酸叔丁酯(9.13mL)，使温度保持在-78℃。在-78℃下搅拌2小时后，将该混合物升温至-50℃，持续30分钟，然后在2小时内将该混合物升温至环境温度。再将该混合物倾入乙醚(600mL)和水(200mL)中，进行分配并且用水(2×170mL)和饱和氯化钠(1×150mL)洗涤有机层。然后用MgSO4干燥乙醚级分，过滤并且蒸发得到产物242(4.46g)，随后将其不经进一步纯化使用。
反应3
向被保护的谷氨酸3-甲酯64(4.46g)在四氢呋喃(250mL)中的溶液中加入10％w/v柠檬酸(120mL)并且将该混合物搅拌17小时。然后真空浓缩该溶液以便除去四氢呋喃并且加入乙醚(100mL)和1N HCl(250mL)。在分配后，用乙醚(2×100mL)洗涤水层，通过添加固体K2CO3碱化至pH 14并且用乙酸乙酯(4×100mL)萃取。向合并的乙酸乙酯级分中加入乙酸(3mL)和10％钯/碳(500mg)并且将所得悬浮液在氢气气氛下搅拌16小时。加入甲醇(300mL)并且通过C盐过滤该反应混合物。将滤液蒸发得到油状物，将其溶解并且首先在乙酸乙酯(300mL)且然后在乙醚(300mL)中蒸发而得到白色凝胶。将残余物溶于四氢呋喃(200mL)并且加入10％w/v K2CO3(100mL)和9-芴基甲氧羰基-N-羟基琥珀酰亚胺(5.83g)。将该反应混合物搅拌22小时并且真空浓缩以便除去四氢呋喃。向该浓缩溶液中加入乙醚(170mL)和水(300mL)。进行分配后，用乙醚(3×130mL)洗涤水层，用浓HCl酸化至pH2，并且用乙酸乙酯(3×200mL)萃取。然后用MgSO4干燥乙酸乙酯级分，过滤并且蒸发得到产物243(3.31g)，随后将其不经进一步纯化使用。
反应4
向2S，3S-N-Fmoc-L-3-甲基-谷氨酸γ叔丁基酯243(3.3g)在二氯甲烷(150mL)中的溶液中加入N，N’二异丙基碳二亚胺聚苯乙烯树脂(10.8g)和4-二甲氨基吡啶(92mg)并且将该反应混合物搅拌5分钟。加入烯丙基醇(0.612mL)并且将该反应混合物再搅拌90分钟。过滤并且蒸发溶剂而得到所需二酯244(2.02g)。
反应5
向冷却至0℃的二酯244在二氯甲烷(42mL)中的溶液中加入三异丙基硅烷(0.82mL)和三氟乙酸(4mL)。将该反应混合物在0℃下搅拌10分钟，升温至环境温度并且搅拌90分钟。加入己烷(600mL)并且蒸发该混合物，将残余物溶于乙醚(150mL)和5％w/v K2CO3(200mL)。用乙醚(2×80mL)洗涤水层，用浓HCl酸化至pH 2并且用乙酸乙酯(3×100mL)萃取。然后用MgSO4干燥乙酸乙酯级分，过滤并且蒸发得到产物239(1.48g)。
实施例1-702S-N-Fmoc-L-3-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-天冬酰胺的制备
反应1
向商购天冬氨酸酯246(2.75g)在70％高氯酸(HClO4，3mL)中的悬浮液中加入叔丁基乙酸酯(100mL)。24小时后，将该溶液倾入饱和K2CO3(200mL)。用乙醚(3×100mL)萃取所得双相混合物并且用饱和K2CO3(3×50mL)洗涤合并的有机萃取物，用Na2SO4干燥，过滤并且减压浓缩而得到澄清无色油状物。然后将该油状物溶于冷(0℃)乙醚(50mL)并且加入1N在乙醚中的HCl(15mL)。20分钟后，减压浓缩该溶液而得到247(2.0g)。
反应2
向二酯247(4.78g)在甲基叔丁基醚(100mL)中的悬浮液中加入饱和K2CO3水溶液(100mL)。用甲基叔丁基醚(3×100mL)洗涤所得水层。合并有机萃取物并且用饱和K2CO3(2×100mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并且减压浓缩。将所得无色油状物与三苯甲基氯(5.57g)、CH3CN(100mL)和三乙胺(5.60mL)混合。16小时后，过滤该混合物并且用甲基叔丁基醚(200mL稀释。用1N柠檬酸(3×100mL)，饱和NaHCO3(3×100mL)，饱和NaCl(3×100mL)洗涤所得有机萃取物，用Na2SO4干燥，过滤并且减压浓缩。使用含有1％三乙胺的1∶11乙酸乙酯-己烷在碱洗的快速硅胶(flash silica gel)(20×4cm)上进行色谱分离而得到产物248(7.12g)。
反应3
向冷却的(-78℃)248(2.22g)在四氢呋喃(20mL)中的溶液中加入16.5mL 0.91M六甲基二硅氮烷钾的四氢呋喃溶液。在-78℃下保持1小时后，逐份加入氧代二过氧(吡啶)(1，3-二甲基-3，4，5，6-四氢-2(1H)-嘧啶酮)钼(IV)(MoOPD，3.68g，获自STREM Chemicals，Inc；参见Anderson，JC.和Smith，SC.，1990，Synlett 107-109有关该试剂的合成)。将该混合物在-78℃下搅拌1小时，将其升温至-55℃并且再搅拌1小时。用饱和Na2SO3水溶液(20mL)使该混合物猝灭并且升温至室温。用甲基叔丁基醚(3×100mL)洗涤所得的双相混合物并且合并有机层且用1N柠檬酸(3×50mL)，饱和NaHCO3水溶液(3×50)和饱和NaCl水溶液(3×50)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并且减压浓缩。使用1∶5乙酸乙酯-己烷在快速硅胶(20×3cm)上进行色谱分离而得到产物249(1.64g)。
反应4
向249(650mg)在1∶1二噁烷-水(50mL)的溶液中加入氢氧化锂(507mg)。1小时后，用甲基叔丁基醚(3×50mL)洗涤该溶液并且用1N柠檬酸将所得水层酸化至pH～4。用甲基叔丁基醚(3×100mL)萃取所得溶液。用1N柠檬酸(3×100mL)和饱和NaCl水溶液(3×100mL)洗涤有机相，用Na2SO4干燥，过滤并且减压浓缩而得到250(630mg)。
反应5
向250(650mg)、苯并三唑-1-基氧基-三(二甲氨基)-磷鎓六氟膦酸酯(997mg)和NH4Cl(153mg)在二甲基甲酰胺(30mL)中的溶液中加入二异丙基乙胺(0.78mL)。1小时后，加入乙酸乙酯(150mL)并且用10％K2CO3(3×100mL)，水(3×100mL)，1N柠檬酸(3×100mL)和饱和NaCl洗涤所得溶液，用Na2SO4干燥，过滤并且减压浓缩而得到251(640mg)。
反应6
向251(1.91g)在二氯甲烷(5mL)中的溶液中加入水(1mL)，随后加入三氟乙酸(10mL)。4小时后，减压浓缩该溶液并且将余下的浆状物从甲苯中浓缩两次。将所得固体与乙醚一起研磨并且过滤所得固体且用乙醚洗涤。减压干燥所得固体而得到252(952mg)。
反应7
向252的溶液中加入9-芴基甲氧羰基-N-羟基琥珀酰亚胺(3.37g)在1-4-二噁烷(50mL)中的溶液。16小时后，用5％K2CO3水溶液(25mL)稀释所得溶液并且用乙醚(3×50mL)萃取。用1N HCl溶液将所得含水萃取物酸化至pH～2并且加入乙醚(50mL)。使所得固体在酸性溶液与乙醚之间分配。收集固体并且用1N HCl和乙醚洗涤而得到253(1.50g)。
反应8
向253(370mg)在二甲基甲酰胺(10mL)中的溶液中加入叔丁基二甲基氯硅烷(300mg)，随后加入咪唑(200mg)。8小时后，用乙酸乙酯稀释该溶液并且用1N HCl(3×100mL)和饱和氯化钠洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并且减压浓缩。使用19∶1∶0.1 CH2Cl2∶MeOH∶AcOH作为洗脱剂在快速硅胶(25×2cm)上进行色谱分离而得到245(300mg)。
实施例1-712S-N-Fmoc-L-(3-甲氧基)-β-叔丁基天冬氨酸酯254的制备
反应1
向商购二酯255(4.78g)在甲基叔丁基醚(100mL)中的悬浮液中加入饱和K2CO3水溶液(100mL)。用甲基叔丁基醚(3×100mL)洗涤所得水层。合并有机萃取物并且用饱和K2CO3(2×100mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并且减压浓缩。将所得无色油状物溶于三苯甲基氯(5.57g)和三乙胺(5.60mL)在乙腈(100mL)中的溶液。16小时后，过滤该混合物并且用甲基叔丁基醚(200mL)稀释。用1N柠檬酸(3×100mL)，饱和NaHCO3(3×100mL)和饱和NaCl(3×100mL)洗涤所得有机萃取物，用Na2SO4干燥，过滤并且减压浓缩。使用含有1％三乙胺的1∶11乙酸乙酯-己烷在碱洗过的快速硅胶(20×3cm)上进行色谱分离而得到256(7.12g)。
反应2
向冷却的(-78℃)256(2.22g)的四氢呋喃(20mL)溶液中加入16.5mL0.91M钾六甲基二硅氮烷的四氢呋喃溶液。在-78℃下1小时后，逐份加入氧代二过氧(吡啶)(1，3-二甲基-3，4，5，6-四氢-2(1H)-嘧啶酮)钼(IV)(MoOPD，3.68g，获自STREM Chemicals，Inc；参见Anderson，JC.和Smith，SC.，1990，Synlett 107-109有关该试剂的合成)。将该混合物在-78℃下搅拌1小时，将其升温至-55℃并且再搅拌1小时。用饱和Na2SO3水溶液(20mL)使该混合物猝灭并且升温至室温。用甲基叔丁基醚(3×100mL)洗涤所得的双相混合物并且合并有机层且用1N柠檬酸(3×50mL)，饱和NaHCO3水溶液(3×50)和饱和NaCl水溶液(3×50)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并且减压浓缩。使用1∶5乙酸乙酯-己烷在快速硅胶(20×4cm)上进行色谱分离而得到257(1.64g)。
反应3
向257(4.61g)在二氯甲烷(100mL)中的溶液中加入三氟乙酸(2mL)。1小时后，减压浓缩所得溶液并且加入5％K2CO3水溶液(50mL)，随后加入苄氧羰基-N-羟基琥珀酰亚胺(2.49g)在二噁烷(50mL)中的溶液。16小时后，用乙酸乙酯(3×100mL)萃取所得溶液。用1N柠檬酸(3×50mL)，饱和NaHCO3(3×50mL)和NaCl(3×50mL)洗涤有机萃取物，用Na2SO4干燥，过滤并且减压浓缩。使用1∶3乙酸乙酯-己烷在快速硅胶(25×3cm)，上进行色谱分离而得到258(2.01g)。
反应4
向冷(0℃)的258(353mg)和氧化银(462mg)在四氢呋喃(25mL)中的悬浮液中加入碘甲烷(0.62mL)。在4小时内将该混合物升温至室温。48小时后，将该悬浮液通过C盐过滤并且减压浓缩。使用1∶3乙酸乙酯-己烷在快速硅胶(25×2cm)上进行色谱分离而得到259(300mg)。
反应5
向冷的(0℃)含有259(300mg，0.81mmol)的25mL二噁烷溶液中加入在25mL水中的240mg(10mmol)LiOH。1小时后，用1N柠檬酸将该混合物酸化至pH～4并且用乙醚(3×50mL)萃取。用1N柠檬酸(3×50mL)和饱和NaCl(3×30mL)洗涤所得有机萃取物，用Na2SO4干燥，过滤并且减压浓缩而得到260，为澄清无色油状物(280mg)。
反应6
如上述将242转化成243所述的，在氢气气氛下，通过用10％钯/碳处理260的乙酸乙酯溶液，随后如上述将252转化成253所述的进行胺保护，将化合物260转化成254。
实施例1-72Na-(烯丙氧羰基)-L-异亮氨酸124的制备 反应1
将商购异亮氨酸(22g)加入到烯丙氧羰基氧基琥珀酰亚胺(AllocOSu，51g)在四氢呋喃(150mL)中的溶液中。将10％K2CO3水溶液(100mL)加入到该混悬液中并且将该混合物搅拌17小时，此后在减压下浓缩至约120ml。将该溶液加入到10％K2CO3水溶液(100mL)和水(200ml)中并且用乙醚(4×150mL)洗涤。然后将水相部分酸化至pH 1并且用二氯甲烷(4×200mL)萃取。用无水MgSO4干燥合并的酸性二氯甲烷洗涤液并且蒸发至得到粗产物(38.1g)。通过硅胶柱色谱法纯化(使用100％二氯甲烷-二氯甲烷∶甲醇9∶1的二氯甲烷/甲醇梯度洗脱)，随后蒸发溶剂而得到化合物124，为黄色油状物(36g)。
实施例2-1基于玫瑰孢链霉菌的用于产生新生物合成途径的反式表达系统的构建 为了表达杂交非核糖体多肽合成酶(NRPS)途径，构建缺乏所有NRPS基因的玫瑰孢链霉菌的达托霉素高产菌株(NRRL 11379)形式。使杂交途径在以位点特异性方式整合在玫瑰孢链霉菌基因组中性位点中φC31 attB位点上的基于BAC的载体上接合到该菌株中。
为了从玫瑰孢链霉菌中缺失所有指定的NRPS基因，构建包含来自dptEF上游和dptH下游的侧翼DNA的缺失盒(附图2)。
在包含tsr(硫链丝菌肽抗性)和cat(氯霉素抗性)的选择盒附近克隆来自dptEF上游(5’)和dptH下游(3’)的侧翼区。5’片段长度为1478bp且3’片段长度为1862bp。将这两个片段克隆入已经包含tsr和cat抗性盒的pUC19拷贝(New England Biolabs)以便生成缺失盒。然后将该盒转入称作pRHB538的递送质粒(Hosted，T.J.和Baltz，R.H.，1997，J Bacteriol.179(1)180-6)，其含有温敏性复制起点和rpsL的显性等位基因(链霉素敏感性)。将该质粒导入携带赋予链霉素抗性的隐性rpsL等位基因的玫瑰孢链霉菌菌株。然后将该重组菌株在肉汤培养基中孵育过夜，此后将细胞在含有链霉素+硫链丝菌肽的平板上铺板并且在39℃下孵育。在这些条件下，仅通过同源重组以dptA-H基因座交换缺失盒(包含tsr和cat)的那些菌株在选择下存活；所有其它基因型被消除。
PCR和DNA印迹证实了dptA-H缺失突变体的基因型。设计PCR片段以便从位于5’和3’侧翼区外部和tsr和cat基因内部的引物扩增。按照这种方式，仅当细胞已经以dptA-H基因座交换缺失盒时，可以形成PCR产物。DNA印迹进一步证实dptA-H已经缺失并且在该基因座周围未出现异常整合或重组。一旦通过遗传方式证实dptA-H缺失，就测试它们以便观察它们是否确实为表型无效突变体。然后将该菌株命名为玫瑰孢链霉菌UA431。
实施例2-2发酵玫瑰孢链霉菌 通过悬浮培养了10日的培养基A(在5mL 10％甘油水溶液(BDH)中的2％经照射的燕麦(Quaker)、0.7％胰蛋白胨(Difco)、0.2％大豆蛋白胨(Sigma)、0.5％氯化钠(BDH)、0.1％痕量盐溶液、1.8％琼脂no.2(Lab M)、0.01％安普霉素(Sigma))斜面培养物来收集玫瑰孢链霉菌UA431的孢子。在1.5mL冷冻小瓶中的1mL该混悬液包含从-135℃储存中取出的起始材料。通过将0.3mL该起始材料以无菌方式置于培养基A斜面上并且在28℃孵育9天产生预培养物。
通过以无菌方式用4mL 0.1％Tween 80(Sigma)溶液处理该预培养物并且缓慢浸软斜面表面以便产生营养菌丝体和孢子的混悬液而产生种子培养物。将2mL该混悬液的等分部分转入含有40mL营养液S(调整至pH 7.0并且高压灭菌的1％D-葡萄糖(BDH)、1.5％甘油(BDH)、1.5％大豆蛋白胨(Sigma)、0.3％氯化钠(BDH)、0.5％麦芽提取物(Oxoid)、0.5％酵母提取物(Lab M)、0.1％Junlon PW100(Honeywell and Stein Ltd)、0.1％Tween 80(Sigma)、4.6％MOPS(Sigma))的250mL带有挡板的烧瓶中并且以240rpm在30℃振摇44小时。
通过以无菌方式将5％的种子培养物转入含有50mL培养基P(调整至pH 7.0并且高压灭菌的1％葡萄糖(BDH)、2％可溶性淀粉(Sigma)、0.5％酵母提取物(Difco)、0.5％酪蛋白(Sigma)、4.6％MOPS(Sigma))的带有挡板的250mL烧瓶中产生生产培养物并且以240rpm在30℃振摇可长达7天。
实施例2-3对来自玫瑰孢链霉菌发酵的A21978C脂肽类的分析 通过在分析前以无菌方式取出2mL完整培养物并且离心10分钟对实施例2-2中所述的生产培养物取样以便分析。分析体积可多达50微升的上清液以便监测如由玫瑰孢链霉菌产生的天然脂肽类(A21978C)的产生。在环境温度使用带有4.6×50mm Symmetry C83.5μm柱和Phenomenex SecurityGuard C8柱体的Waters Alliance 2690HPLC系统和996PDA检测器进行这种分析。最初梯度保持在90％水和10％乙腈2.5分钟，随后在6分钟内通过线性梯度至100％乙腈。流速为1.5mL/分钟并且用0.01％三氟乙酸缓冲梯度。截止到发酵的第2天，正如通过在所述分析状态下的保留时间为5.62、5.77和5.90分钟(λmax 223.8、261.5和364.5nm)的HPLC峰证实的，显然产生了天然脂肽类中的三种，A21978C1、A21978C2和A21978C3，其UV/可见光谱与达托霉素相同。然后在7天过程中在每一采样点，脂肽类显然保持在发酵中。脂肽类A21978C1、A21978C2和A21978C3的总产量在10-20mg/升发酵物质的范围。
在使用正离子模式的电喷射离子化的Finnigan SSQ710c LC-MS系统上进行液相色谱-质谱(LC-MS)分析，其中扫描范围在200-2000道尔顿和2秒扫描。在Waters Symmetry C8柱(2.1×50mm，3.5μm颗粒大小)上进行色谱分离，用含有0.01％甲酸的线性水-乙腈梯度洗脱，在最初的0.5分钟延迟后的6分钟期限内乙腈从10％增加至100％，然后在100％乙腈再保持3.5分钟，此后再平衡。流速为0.35mL/分钟并且使该方法在环境温度进行。
如在m/z为1634.7，1648.7和1662.7的分子离子([M+H]+)所示，在对照(玫瑰孢链霉菌野生型)中证实了三种天然脂肽类的鉴定，分别与对玫瑰孢链霉菌产生的主要A21978C脂肽因子A21978C1、A21978C2和A21978C3报导的质量一致(Debono等，1987，J.Antibiotics40761-777)。UA431突变体无法生成A21978C脂肽类中的任意种，从而证实它们确实为无效突变体。
实施例2-4构建pDA300和补足玫瑰孢链霉菌dptA-H缺失 不同于酵母和有些天然感受态细菌，线性DNA片段不易于转化大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)。这一结果的原因部分在于胞内外切核酸酶，诸如RecBCD对外来DNA的降解(Lorenz，M.G.，和Wackernagel，W.，1994，Microbiol.Rev.58563)。传统上，通过使用缺乏RecBCD的突变株(Jasin，M.，和Schimmel，P.，1984，J.Bacteriol 159783)或通过使用不能在限制性条件下在宿主中复制的辅助质粒载体递送DNA(Link，A.J.等，1997，J.Bacteriol.1796228)进行同源重组。重组事件仍然罕见并且需要成千碱基的同源性。
近来，几种文库中已经产生了利用噬菌体λ诱导的“超重组”状态的菌株(Datsenko，K.A.，和Wanner，B.L.，2000，Proc.Nat Acad Sci U.S.A.976640；美国专利号6,355,412和6,509,156B；Yu，D.等，2000，Proc.Nat Acad Sci U.S.A.975978)。即使在使用线性DNA时，也会发生具有少至40-50bp相同序列的DNA分子之间的重组。λRed基因(exo、bet和gam)导致重组率升高。λ-外切核酸酶和β-蛋白质导致通过修复双链断裂的重组，而gam基因产物结合宿主RecBCD复合物并且抑制其功能(Murphy，K.，1998，J.Bacteriol.1802063)。我们将这种技术称作“Red”系统或Red介导的重组系统。
使用“Red”系统构建pDA300(仅含有dptA-H基因的B1203A05的截短形式)。由B1203A05(含有所有dpt生物合成基因簇的BAC质粒，它分离自玫瑰孢链霉菌染色体文库(Miao等，2005，Microbiology1511507-1523))构建该质粒，使用通过Red介导的重组系统的同源重组缺失dptA-H上游的所有基因和dptA-H下游的所有基因。通过将B1203A05导入在质粒(pKD78，Datsenko，KA.，和Wanner，BL.，2000，Proc.Nat Acad Sci U.S.A.976640)上携带Red基因的大肠杆菌菌株实现这一目的。然后通过tet抗性基因的PCR产物转化这种菌株，所述的tet抗性基因的侧翼为与dpt簇上游或下游区同源的寡核苷酸。一旦构建，就将pDA300通过接合导入UA431以便生成菌株UA493。质粒pDA300含有来自质粒RK2的oriT(Baltz，1998，Trends inMicrobiol.676-83(1998)，将该文献完整地引入本文作为参考)以便自大肠杆菌至玫瑰孢链霉菌的接合。通过从大肠杆菌S17.1或含有自主复制质粒RK2的菌株(文献同前)的接合，将质粒pDA300导入玫瑰孢链霉菌。分别使用实施例2-2和2-3中所述的技术发酵玫瑰孢链霉菌UA493并且进行分析。
如在m/z为1634.7，1648.7和1662.7处的分子离子([M+H]+)所示，证实了对三种天然脂肽类的鉴定，分别与对玫瑰孢链霉菌产生的主要A21978C脂肽因子A21978C1、A21978C2和A21978C3报导的质量一致(Debono等，1987，J.Antibiotics 40761-777)。这一结果证实pDA300能够成功地补足dptA-H缺失以便恢复UA493中的脂肽生成。
实施例2-5将非核糖体肽合成酶(NRPS)亚基交换催化不同氨基酸引入的亚基 编码达托霉素NRPS第三亚基的基因(参见附图1)含有编码引入第12位氨基酸(3-甲基-谷氨酸(3-MeGlu))和第13位氨基酸(L-犬尿氨酸(L-Kyn))的特异性的两个组件。编码环脂肽CDA的生物合成的第三亚基的基因(Kempter等，1997，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.36498-501；Chong等，1998，Microbiology 144193-199；将这些文献各自完整地引入本文作为参考)还编码最后两个氨基酸，在这种情况中为第10位氨基酸(3-MeGlu)和第11位氨基酸(L-色氨酸(L-Trp)；附图1)。通过缺失基因dptD并且通过用编码CDA的PS3的基因取代它，生成在第13位上含有L-Trp替代L-Kyn的达托霉素衍生物(Hojati等，2002，Chem Biol.9(11)1175-87)。载体pMF23自强启动子(例如ermEp*启动子；Baltz，1998，Trends Microbiol.676-83，将该文献完整地引入本文作为参考)表达PS3基因，并且在以位点特异性方式插入玫瑰孢链霉菌基因组的中性位点前通过种间接合(Baltz，1998，Trends Microbiol.676-83)导入玫瑰孢链霉菌时，使得cdaPS3能够补足dptD突变并且导致具有L-Trp取代L-Kyn的改变的达托霉素产生而得到化合物Cl、化合物C2和化合物C3。如实施例2-2和2-3中所述发酵重组菌株并且通过LC-MS分析重组菌株产物。进行类似的实验，其中用编码环脂肽A54145生物合成的第三亚基的基因补足dptD缺失(pMF30为含有由ermEp*表达的lptD的pHM11a的衍生物(Motamedi等.，1995，Gene 16025-31)，它还编码最后两个氨基酸，在这种情况中为第12位氨基酸(3-MeGlu)和第13位氨基酸(L-异亮氨酸(L-Ile)或L-缬氨酸(L-Val))。通过破坏基因dptD并且通过用编码A54145(化合物C4、C5、C6、C7、C8、C9)的lptD的基因取代它而生成在13位上含有L-Ile或L-Val替代L-Kyn的两种达托霉素衍生物。
进行类似操作，以便对其它亚基进行反式补足，即在达托霉素生物合成基因簇或A54145生物合成基因簇的亚基中产生破坏或缺失，且然后用一个或多个来自NRPS的天然或修饰的亚基进行反式补足(后者可以包括用达托霉素或A54145生物合成基因簇亚基的修饰形式进行反式补足)。NRPS亚基之间的反式补足随后导致新的非核糖体肽产生，可以通过如上述实施例中所述对其进行分析。
为了使用部分达托霉素或A54145生物合成基因簇和钙依赖性抗生素(CDA)生物合成基因簇进行反式补足实验，将该组达托霉素生物合成基因或该组达托霉素生物合成基因和附加基因，诸如BAC克隆B1203A05中包含的那些基因，通过转化或接合导入放线菌纲的其它天然或改造的菌株或物种。接受者可以为次生代谢物的已知生产者或未表征的菌株，或可以通过重组技术产生以便携带达托霉素生物合成途径以外的生物合成途径。在各种培养基中发酵转化体或接合后体，并且对其全部肉汤或提取物筛选新的达托霉素类化合物或针对达托霉素抗性测试生物体的生物学活性。
通常通过使达托霉素或A54145生物合成途径中的亚基基因中的某些失活以便于补足(如上文对缺失dptD并且用cdaPS3或lptD补足所述)。使编码NRPS亚基的序列缺失或用标记基因取代以便形成改变的NRPS生物合成途径；可以在原始生产菌株(对达托霉素而言，为玫瑰孢链霉菌，对A54145而言，为弗氏链霉菌或回头链霉菌(S.refuineus)，对CDA而言，为天蓝色链霉菌)或携带这些生物合成途径的质粒中进行这一过程。
为了生产新的脂肽，将通过侧翼DNA序列的同源重组用于将pDA300中的dptD编码区主体交换异源标记基因。为了进行同源重组，设计两种寡核苷酸以便扩增正好位于dptD上游(“5′片段”)和下游(“3′片段”)的区。使用下列具有导入了唯一限制位点(加下划线)的5′-末端延伸的引物组从玫瑰孢链霉菌的染色体DNA扩增5’和3’片段 5′片段(1122bp) 5′GCG AAG CTT CTG GTG GCG CAT CAC CTG G 3′(SEQ ID NO1) 5′GCT CTA GAT GGA AGT ATG TCC TCC ATC GC 3′(SEQ ID NO2) 3′片段(1535bp) 5′CGG ATC CCG CCG GCA CCT GAC CC 3′(SEQ ID NO3) 5′CCG AAT TCC GCC TCC GAG TAC ATC GAG G 3′(SEQ ID NO4) 将扩增的片段连续克隆入pNEB193(New England Biolabs)的多克隆位点中相应的唯一位点。分别通过限制消化分析和通过测序证实所得构建体pSD002的取向和通过PCR产生的部分中不存在错误。将含有标记基因ermE(红霉素抗性基因；参见Hopwood，文献同上)的SpeI片段插入pSD002的XbaI位点并且通过限制消化分析验证。所得质粒pSD005由此包括由侧翼为与dptD的上游和下游DNA序列同源的DNA区段的ermE构成的盒。一旦通过同源重组插入达托霉素生物合成基因簇途径，此盒就可以用ermE基本上取代整个dptD，但前31bp和最后12bp除外。然后将包含这种取代盒的区亚克隆入携带温敏性复制起点和rpsL(赋予链霉素敏感性的基因)的载体(pRHB538的克隆位点修饰形式；(Hosted和Baltz，1997，J.Bacteriol.179180-186)以便生成pSD030，即导入玫瑰孢链霉菌的系列载体中的最终质粒。
通过种间接合将质粒pSD030导入玫瑰孢链霉菌(Baltz，1998，TrendsMicrobiol.，676-83)。然后就用含有1.25mg红霉素的1mL水淹没每个平板，一旦液体被吸收入培养基，得到50μg/ml终浓度。将7天后在转化平板上产生的红霉素抗性菌落接种入25mL TSB(Hopwood，文献同上)+红霉素并且在30℃孵育48小时。收集菌丝体并且浸软1/10的菌丝体块且将其转入新的25mL TSB+红霉素的等分部分。然后将所得溶液在40℃孵育以便对pSD030的温敏性复制子选择。48小时后，通过离心收集菌丝体，浸软并且重新悬浮于2mL TSB终体积中。将该混悬液(100μL)在含有50μg/mL红霉素和30μg/mL链霉素的SPMR平板(Babcock等.，1988，J.Bacteriol.1702802-2808)上铺板。筛选存活的菌落并且通过PCR证实具有正确的基因型以便鉴定其中ermE成功地取代了dptD的菌株，诸如玫瑰孢链霉菌UA378。然后通过最初的dptD对该突变体进行反式补足，其中dptD由表达质粒pHM11a(Motamedi H，等.，1995，Gene 160(1)25-31)在组成型启动子ermEp*控制下表达。
通过悬浮培养了10日的培养基A(参见Kieser T.，等的“PracticalStreptomyces genetics”，John Innes Foundation，Norwich，2000，本文中的“Kieser”；在5mL 10％甘油水溶液(BDH)中的2％经照射的燕麦(Quaker)、0.7％胰蛋白胨(Difco)、0.2％大豆蛋白胨(Sigma)、0.5％氯化钠(BDH)、0.1％痕量盐溶液、1.8％琼脂no.2(Lab M)、0.01％安普霉素(Sigma))斜面培养物，再生UA378的起始材料。取出在-135℃储存的含有1mL起始材料的1.5mL冷冻小瓶并且快速解冻。通过将0.3mL该起始材料以无菌方式置于培养基A斜面上并且在28℃孵育9天产生预培养物。通过以无菌方式用4mL 0.1％Tween 80(Sigma)溶液处理该预培养物并且缓慢浸软斜面表面以便产生营养菌丝体和孢子的混悬液而产生用于种子培养物接种的材料。
通过以无菌方式将1mL接种材料放入含有250mL营养液S(参见Kieser，文献同上)的2L带挡板的埃伦迈尔烧瓶并在30℃以240rpm振摇2天，产生种子培养物。
通过以无菌方式将种子培养物转入含有14升营养液P(参见Kieser，文献同上)的20L发酵罐而产生生产培养物。将生产发酵罐以350rpm搅拌，以0.5vvm通气并且将温度控制在30℃。在20小时孵育后，在整个发酵过程中以5g/hr给培养物进料50％(w/v)葡萄糖溶液。
40小时孵育后，以0.5g/hr给发酵罐进料50∶50(w/w)癸酸∶油酸甲酯掺合物(分别来自Sigma和Acros Organics)以便进行剩余的发酵。112小时后收集培养物，并且通过经转筒式(沉降式)离心机批量处理从培养物上清液中除去生物质。
弃去来自20L发酵的生物质，并且将澄清的液体施加至填充了Mitsubushi HP20树脂(60×300mm)并且用甲醇和水调节的开口玻璃柱。在洗脱前，用2L水，随后用2L甲醇/水(1∶4)洗涤柱。然后用2L甲醇/水(4∶1)，随后用1L甲醇洗脱柱并且收集为两份分开的级分。
液相色谱-质谱(LC-MS)电喷射离子化(ESI)分析显示两份级分均含有A21978C/CDA杂种分子并且进一步处理较不复杂的甲醇/水(4∶1)级分。在真空中蒸发至得到含水残余物且然后用水制成500mL。然后在2L分液漏斗中用3×500mL乙酸乙酯进行反萃取而得到含水和有机级分。LC-MS(ESI)显示有机相中不存在杂种分子并且将其弃去。将含水级分冻干过夜。
通过制备型高效液相色谱法(HPLC)，使用Waters Prep LC系统和具有40×10mm防护的Waters 40×200mm Nova-Pak C1860

6μm径向压紧的双柱体纯化杂种分子。将冷冻干燥的材料溶于水并且使用梯度法纯化。该方法在90％水和10％乙腈保持2分钟且随后是13分钟内的线性梯度至25％水和75％乙腈。流速为55mL/min并且用0.04％三氟乙酸缓冲整个梯度。收集级分并且在Finnigan SSQ710c LC-MS系统上使用正离子模式的电喷射离子化(ESI)通过LC-MS进行分析，其中扫描范围在200-2000道尔顿和2秒扫描。在Waters Symmetry C8柱(4.6×50mm，3.5μm颗粒大小)上进行色谱分离供LC-MS分析，用含有0.01％甲酸的线性水-乙腈梯度洗脱，乙腈在最初的0.5分钟延迟后的6分钟期限内从10％增加至100％，然后乙腈在100％再保持3.5分钟，此后再平衡。流速为1.5mL/分钟并且使该方法在环境温度进行。
该分析鉴定了化合物Cl和化合物C2。两份级分均需要在进行NMR研究前进一步纯化。使用用0.04％三氟乙酸缓冲的60％水和40％乙腈通过等度方法进一步纯化化合物Cl。分离了约1.8mg材料。化合物C2的最终纯化使用了等度方法，其中使用用0.04％三氟乙酸缓冲的58％水和42％乙腈。分离了约1.5mg材料。有关化合物Cl和化合物C2的UV最大值和ESI-MS分子离子信息(在负离子模式中观察到的带二价电荷的离子)如下所示 实施例2-6dptBC中第8和11位处构建的组件交换 通过截短携带达托霉素生物合成(dpt)基因簇的B1203A05构建携带dptBC pKN24的质粒。将Red介导的重组系统用于导入侧翼为与所关注的dpt基因上游或下游区同源的45bp序列的抗生素抗性基因的线性PCR产物(如实施例2-4中所述)。dptBC(pKN24-26)或dptD(pKN27)的上游(5’)区用含有大观霉素抗性基因(spec)和强的组成型表达的ermEp*的spec-ermEp*盒缺失。使用引物Sp6Del-1-2和dptBC-ermEp扩增该片段。dptBC(pKN24)的下游(3’)区用β-内酰胺酶基因(amp，来自pBR322)缺失。使用引物GTC del2和DptD-3’::amp扩增该片段。
使用携带与研究中的组件的接头区同源的50bp的PCR引物扩增用于缺失CAT组件的选择盒(参见附图5的接头位置；国际专利申请号WO01/30985)。当将这些PCR片段导入包含pKN24(仅含由组成型启动子ermEp*表达的dptBC的pDA300的截短形式，Bibb，MJ.等.，1985，Gene 38(1-3)215-26)和诱导的Red系统的电感受态细胞时，抗性盒通过同源重组以位点特异性方式整合在pDA300中的靶位点(附图3)。
5’缺失，3’缺失 Sp6Del-1-2 5’-GCCAGCATGGAGCCGAACTGCCGGAACACCGCGTCCCGGTCCACCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’，(SEQ ID NO5) GTC del2 5’-GCCGACTGGGAGTGGGTCAAGTGGCTGCCGCACGTGCTGGATCCGCCATATGAATATCCTCCTTA-3’，(SEQ ID NO6) dptBC-ermEp 5’-CCGAGACAGGCAGGATCTCCTCGACTACCTTCGACCGGCGGTTCATATG TCCGCCTCCTTTGGTCAC-3’，(SEQ ID NO7) DptD-3’::amp 5’-CATACTTCCTCTCACTCCGCTGCAGGAGGGACTGCTGTTCCACAGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’，(SEQ ID NO8) 然后对这些细胞选择tet抗性标记的存在并且对所得菌落进行遗传分析以便验证适当缺失或破坏的构建。部分引物设计包括将限制位点置于所关注的接头区内(附图3)。一旦验证了缺失BAC，就使用引入接头区的唯一限制位点切下选择盒(附图3AvrII和PmeI)。
使用Red介导的重组再次将取代组件(丝氨酸；丙氨酸)亚克隆入pBR322(Yanisch-Perron等.，1985，Gene33(1)103-19；侧翼为合适的位点)。这项技术称作缺口填补，其中引物包含与所需组件接头内部区重叠的50bp(Lee，EC.等.，2001，Genomics7356)。这些引物用于扩增部分pBR322，包括复制起点和ampr以便产生侧翼为与所需组件(丝氨酸；丙氨酸)内部同源的区的线性片段。将这些PCR片段导入含有pKN24(参见上文)和pKD78(Datsenko，KA.，和Wanner，BL.，2000，Proc.Nat Acad Sci U.S.A.976640)的DH10B电感受态大肠杆菌细胞。一旦通过两同源区发生重组，则组件从原始载体被转入pBR322，从而将线性PCR片段转化成可以复制和选择的环状形式(附图3)。优选从其中克隆组件的原始载体具有F-质粒复制起点(与具有较高拷贝数的复制起点相反)。
从pBR322中切下克隆的组件并且使用在缺失附近引入的相容限制位点连入pKN24的缺失形式。该步骤产生2种质粒1)pDR2155，其中达托霉素的D-丝氨酸-11通过组件交换被D-丙氨酸取代；和2)pDR2160，其中达托霉素的D-丙氨酸-8被D-丝氨酸取代。通过PCR和测序证实了pDR2155和pDR2160。
然后在玫瑰孢链霉菌中构建用于这些质粒的合适的表达宿主。使用实施例2-1中所述的技术构建含有除去dptBC，D的染色体缺失的dptB-D突变体KN100。通过种间接合将pKN24和pRB04(在ermE*组成型启动子控制下表达dptD亚基的载体pHM11a中构建的质粒)加入KN100菌株而生成KN101。当在实施例2-2和2-3中所述的条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了天然脂肽类A21978C1、A21978C2和A21978C3。一旦验证了玫瑰孢链霉菌KN100菌株，就生成了第二种衍生物KN156(携带pRB04的KN100)。然后将该菌株用作在dptBC中进行的所有组件交换的宿主。通过将pDR2155添加至KN156而构建PB103。当在实施例2-2和2-3中所述的条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了化合物C46、C47和C48(附图4)。
通过将pDR2160添加到KN156而构建菌株PB118。当在实施例2-2和2-3中所述的条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了化合物C22、C23和C24(附图4)。
在实施例2-2中所述的条件下发酵和分析上述重组菌株且然后使用实施例2-3中所述的技术进行分析(将数据概括在表VI中)。
通过组件交换，使用融合位点TC(B)和TE(CAT)制备在第8或11位处具有Asn的衍生物。将Red介导的重组系统用于用侧翼为改造的AvrII和PmeI限制位点的庆大霉素抗性基因(ahp2)(Chow JW，Kak V，You I，Kao SJ，Petrin J，Clewell DB，Lerner SA，Miller GH，Shaw KJ.2001，Antimicrob.AgentsChemother.45，2691-2694)取代pKN24上的组件8或11。由于组件8和11的DNA序列高度同源，所以将相同的引物对用于缺失接头B和CAT处的两个组件。
通过缺口-修复法克隆编码Asn组件(B-CAT)，即来自A54145 NRPS的11th组件的DNA片段。将缺口-修复引物用于pBR322包括amp抗性基因和复制起点的部分的PCR扩增，以便产生侧翼为引入的NheI和HpaI限制位点侧翼和与所需组件片段内部同源的45bp的线性片段。将线性PCR片段转化入携带SF110D08(编码部分A54145生物合成基因簇的，＞100kb DNA的BAC克隆。(该克隆来源于弗氏链霉菌基于基因组BAC的文库，该文库使用Miao等.，2005，Microbiology 1511507-1523中所述的方案构建。使用Miao等.，2005，Microbiology 1511507-1523)中的方案从该文库中分离克隆BAC-P13和编码Red重组系统的tetR-pKD119(Datsenko，KA.，和Wanner，BL.，2000，Proc.NatAcad Sci U.S.A.976640))的电感受态大肠杆菌。一旦在两同源区处发生Red诱导的重组，Asn组件就从BAC-P13转至线性pBR322以便产生环状和复制的质粒。通过NheI和HpaI消化切下具有正确序列的组件片段(通过测序验证)并且用于与适当缺失的pKN24形式连接而生成杂种质粒。
用于组件8缺失的引物 pKN24-Mod8::Gen。B-CAT 8_B TTGTTCGAGGCGCCGACGGTGAGCCGTTTGGAGCGGTTGCTGCGGGAGCGCCTAGGACGTTGACACCATCGAATGG(SEQ ID NO9) 8_CAT-Pme ACAATCTCAGCACCCCCCACCACACCAACCGCCCCAGCGTCCGAACCACGTTTAAACCCTCATTCATCGGGCGAAAG(SEQ ID NO10) 用于组件11缺失的引物 pKN24-Mod11::Gen。B-CAT 8_B TTGTTCGAGGCGCCGACGGTGAGCCGTTTGGAGCGGTTGCTGCGGGAGCGCCTAGGACGTTGACACCATCGAATGG(SEQ ID NO11) 8_CAT-Pme ACAATCTCAGCACCCCCCACCACACCAACCGCCCCAGCGTCCGAACCACGTTTAAACCCTCATTCATCGGGCGAAAG(SEQ ID NO12) 用于lptAsn11的缺口-修复的引物 Lpt-N11-B-P13 TCGGGGCGCGGGTCGGCGGGGCGCAGCCGGGGTCCGGCCTCGCCCGCTAGCTTCTTAGACGTCAGGTGGCAC(SEQ ID NO13) Lpt-N11-CAT-P14 CGCGACATCTTCGAACAGCGCACGCCCGCCGCCCTCGCCGGCCGCGTTAACCGATACGCGAGCGAACGTGA(SEQ ID NO14) 通过PCR和限制消化筛选质粒，然后将具有正确基因型的质粒命名为pKN45(在第8位插入D-Asn组件)和pKN47(在第11位插入D-Asn组件)。然后将这两种质粒接合到表达宿主KN156(ΔdptBCD+pRB04)中。在含有安普霉素(50μg/mL)的ASI平板上选择接合后体且然后使用实施例2-2和2-3中所述的方案发酵从这些平板选择的重组菌株并且进行分析。通过LC-MS检测来自KN392发酵肉汤的新脂肽类C189、C190和C191，其具有的分子量与A21978C1，2，3第8位插入Asn一致(参见表VI)。通过LC-MS检测来自KN404发酵肉汤的新脂肽类C233、C234和C235，其具有的分子量与A21978C1，2，3第11位插入Asn一致(参见表VI)。
表VI-来自第8，11位处的组件交换的数据 (#参见附图5的T-C和T-E位置) 一旦证实存在预计质量的离子，就以较大规模发酵PB103、PB118、KN392和KN404，并且使用实施例2.5中所述的技术纯化化合物C22、C46、C189、C233。
实施例2-7dptD中第13位处的组件交换 在dpt簇中的第13位处构建组件交换以便取代犬尿氨酸。在亚基表达质粒pRB04(在如实施例2-5中所述在ermE*组成型启动子控制下表达dptD亚基的载体pHM11a中构建的质粒)中制备这些构建体。将唯一的AvrII位点引入T-C接头内部。恰在dptD编码区下游引入第二种唯一的PmeI。这使得能够与硫酯酶一起从dptD中除去Kyn的末端组件。将含有结构域排列CATTe的两种取代组件制备成侧翼为AvrII和PmeI位点的片段。异亮氨酸和色氨酸组件导致在A54145(Ile)和CDA(Trp)途径中引入了末端氨基酸。在将取代组件克隆入缺失的pRB04后，将杂种构建体导入dptD缺失的玫瑰孢链霉菌并且使用实施例2-1中所述的技术完成发酵和分析。将该数据概括在表VII中。
表VII-来自第13位处的组件交换的数据 #接头在附图5中定义。
实施例2-8从达托霉素NRPS基因簇中缺失dptI基因导致在第12位上带有谷氨酸的脂肽类产生 dptI、lptI和glmT基因之间的序列比较提示dptI可能在第12位上的谷氨酸甲基化中起作用(认为glmT基因产物使在相关脂肽CDA中类似位置上的谷氨酸甲基化；认为lptI基因产物使A54145合成中的谷氨酸甲基化)。为了检验这一理论，在含有pDA300的玫瑰孢链霉菌UA431中的dptI基因中产生缺失。构建侧翼为dptI上游和下游的2x1kb片段的缺失质粒。将这些片段按照它们将会产生dptI框内(in-frame)缺失的方式连接。将该盒克隆入pRHB538(参见实施例2-1)并且导入玫瑰孢链霉菌UA431/pDA300。在适当选择条件下(参见实施例2-1)，用缺失盒交换染色体上的dptI基因，由此构建dptI的框内缺失。通过PCR和DNA印迹证实该突变体的基因型。使用实施例2-1中所述的技术发酵并且分析该突变体。这一分析的结果是，这些菌株仅能够产生1620、1634和1648质量的脂肽类，它们相当于在第12位上含有谷氨酸替代3-甲基-谷氨酸的脂肽类的预计质量分别为化合物C10、化合物C11和化合物C12。从该数据中可以推断dptI在达托霉素合成过程中的谷氨酸甲基化中起作用。
实施例2-9由重组玫瑰孢链霉菌构建新脂肽类的组合文库 通过联合pDR2155和pDR2160进一步强化由实施例2-5产生的成功组件交换，所述的pDR2155和pDR2160具有交换为dptD的亚基，其可以包括lptD(来自编码表达质粒中克隆的3MeGlu和Ile/Val的弗氏链霉菌A54145生物合成途径的末端亚基，上文)和cdaPS3(来自编码表达质粒中克隆的3MeGlu和Trp的天蓝色链霉菌钙依赖性抗生素CDA生物合成途径的末端亚基，上文)。通过在含有导致在第12位上包含谷氨酸替代3-甲基-谷氨酸的dptI(达托霉素第12位上的谷氨酸甲基化中涉及的推定甲基转移酶)缺失的宿主中表达，进一步强化这些组合。
联合上述方法中的一种或多种 1.组件交换以便在第8和11位上进行改变； 2.dptI缺失以便在第12位上进行改变；和 3.亚基补足以便在第13位上进行改变以便构建含有48种新脂肽类的组合文库。
除构建实施例2-5中所述的KN100外，还构建了第二种玫瑰孢链霉菌突变体，将其命名为KN125(使用实施例2-1中所述的技术)，其含有除去了dptBC，D，G，H，I，J的染色体缺失。在将KN125证实为无效突变体后，通过将pKN24和pRB04添加至KN125，将其用于构建KN159。当在实施例2-2和2-3中所述条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了在A21978C中观察到的在第12位谷氨酸上均缺乏甲基的化合物C10、C11和C12。
通过将pKN24和pMF23添加至KN100，构建菌株KN107。当在实施例2-2和2-3中所述条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了化合物C1、C2和C3。
通过将pKN24和pMF30添加至KN100，构建菌株KN110。当在实施例2-2和2-3中所述条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了化合物C4、C5、C6、C7、C8和C9。
通过将pKN24和pMF23添加至KN125，构建菌株KN160。当在实施例2-2和2-3中所述条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了化合物C13、C14和C15。
通过将pKN24和pMF30添加至KN125，构建菌株KN161。当在实施例2-2和2-3中所述条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了化合物C16、C17、C18、C19、C20和C21。
然后通过在pDR2155和pDR2160中添加经修饰的dptBC构建体，强化上述组合手段。通过将pDR2155和pMF23添加至KN100，构建菌株PB105。当在实施例2-2和2-3中所述条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了化合物C49、C50和C51。
通过将pDR2155和pMF30添加至KN100，构建菌株PB108。当在实施例2-2和2-3中所述条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了化合物C52、C53、C54、C55、C56和C57。
通过将pDR2155和pRB04添加至KN125，构建菌株PB110。当在实施例2-2和2-3中所述条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了化合物C58、C59和C60。
通过将pDR2155和pMF23添加至KN125，构建菌株PB113。当在实施例2-2和2-3中所述条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了化合物C61、C62和C63。
通过将pDR2155和pMF30添加至KN125，构建菌株PB116。当在实施例2-2和2-3中所述条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了化合物C64、C65、C66、C67、C68和C69。
通过将pDR2160和pMF23添加至KN100，构建菌株PB120。当在实施例2-2和2-3中所述条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了化合物C25、C26和C27。
通过将pDR2160和pMF30添加至KN100，构建菌株PB123。当在实施例2-2和2-3中所述条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了化合物C28、C29、C30、C31、C32和C33。
通过将pDR2160和pRB04添加至KN125，构建菌株PB128。当在实施例2-2和2-3中所述条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了化合物C34、C35和C36。
通过将pDR2160和pMF23添加至KN125，构建菌株PB130。当在实施例2-2和2-3中所述条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了化合物C37、C38和C39。
通过将pDR2160和pMF30添加至KN125，构建菌株PB131。当在实施例2-2和2-3中所述条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了化合物C40、C41、C42、C43、C44和C45。
通过将pKN45和pMF23添加至KN100，构建菌株KN393。当在实施例2-2和2-3中所述条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了化合物C198、C199和C200。
通过将pKN45和pMF30添加至KN100，构建菌株KN394。当在实施例2-2和2-3中所述条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了化合物C201、C202、C203、C210、C211和C212。
通过将pKN45和pRB04添加至KN125，构建菌株KN395。当在实施例2-2和2-3中所述条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了化合物C192、C193和C194。
通过将pKN45和pMF23添加至KN125，构建菌株KN396。当在实施例2-2和2-3中所述条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了化合物C195、C196和C197。
通过将pKN45和pMF30添加至KN125，构建菌株KN397。当在实施例2-2和2-3中所述条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了化合物C204、C205、C206、C207、C208和C209。
通过将pKN47和pMF23添加至KN100，构建菌株KN405。当在实施例2-2和2-3中所述条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了化合物C224、C225和C226。
通过将pKN47和pMF30添加至KN100，构建菌株KN406。当在实施例2-2和2-3中所述条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了化合物C221、C222、C223、C213、C214和C215。
通过将pKN47和pRB04添加至KN125，构建菌株KN407。当在实施例2-2和2-3中所述条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了化合物C230、C231和C232。
通过将pKN47和pMF23添加至KN125，构建菌株KN408。当在实施例2-2和2-3中所述条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了化合物C227、C228和C229。
通过将pKN47和pMF30添加至KN125，构建菌株KN409。当在实施例2-2和2-3中所述条件下发酵和分析时，证实该菌株产生了化合物C72、C219、C220、C216、C217和C218。
实施例2-10达托霉素第2-4位处构建的组件交换 在dptA、dptBC或dptA与BC的组合中进行多组件交换，为了完成这些交换，需要新的表达质粒，像仅含有dptBC的pKN24。新载体pKN18为能够表达dptA和dptBC二者的B12:03A05(含有完整达托霉素生物合成途径的BAC克隆，参见实施例2-1)的截短产物。通过使用Red介导的重组(参见实施例2-5)系统截短B12:03A05，经B12:03A05的两步连续缺失构建质粒pKN18。两步缺失缺失了dptR上游的所有基因和dptBC下游的所有基因(pKN18携带基因座dptR-drrAB-dptEFABC)。首先，该基因座的上游(5’)区(在B12:03A05上插入片段坐标0.552kb-45,576kb，参见表VI对引物所述)用大观霉素抗性基因缺失。dptBC的下游区(3’)(插入片段坐标91,093kb-127,392kb，参见表V对引物所述)用amp基因缺失。
为了联合dptA，BC中的组件交换与dptD(参见实施例2-6)和肽剪裁甲基转移酶dptI(参见实施例2-8)的亚基交换，有必要构建可以在具有经修饰的pKN18质粒的dpt缺失宿主UA431(参见实施例2-1)中表达dptIJ基因的新表达质粒。为了在UA431(ΔdptE-J)中表达谷氨基甲基转移酶，以kanR pRT802(Gregory，M.A.；Till，R.；Smith，M.C.；.2003.J Bacteriol.1855320-5323.)为基础构建携带强启动子permEp*和在来自phi-BT1噬菌体的染色体上有整合功能的质粒pKN54。将来自携带ermEp*和转录终止子的pHM11a(用于链霉菌属物种中异源基因表达的整合型载体，Motamedi，H；Shafiee，A；Cai，SJ；1995，Gene.，16025-31)的1.8kb BglII/SmaI片段克隆在编码phi-BT1整合系统的pRT802(Gregory，M.A.；Till，R.；Smith，M.C.；.2003.J Bacteriol.1855320-5323)的BamHI/EcoRV位点处。在含有卡那霉素(50μg/mL)的选择培养基中使质粒倍增。
使用B12:03A05作为模板对编码dptI和dptI二者的DNA片段进行PCR扩增。将两种引物(具有改造的限制位点，加下划线)dptJ-C-HindIII5’-GGCGGAAGCTTACGGCACGGCAAGGCCGTTTC-3’(SEQ ID NO15)和dptI-N-NdeI5’-GGCGGCATATGACCGTGCACGACTACCAC-3’(SEQ IDNO16)用于PCR扩增。在pKN54的NdeI和HindIII位点处克隆PCR片段以便产生pKN55。
最终，生成可以用于本实施例中所述多组件交换的一系列表达宿主。通过将pRB04(自小环整合位点表达dptD，参见实施例2-6)导入UA431(ΔdptE-J)，构建KN576。通过将pRB04(参见实施例2-6)和pKN55(自phi-BT1整合位点表达dptIJ)导入UA431(ΔdptE-J)，构建KN580。通过将pMF30(自小环整合位点表达lptD，参见实施例2-6)导入UA431(ΔdptE-J)，构建KN577。通过将pMF30(参见实施例2-6)和pKN55导入UA431(ΔdptE-J)，构建KN587。
Sp6 del3 5’-GCATCCGATGCAAGTGTGTCGCTGTCGACGGTGACCCTATAGTCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO17) Sp6 del4 5’-CCGAGGAAAAGAGGGAACGGGACAGGTCAGTGACCGGCGACCGTGCATATGAATATCCTCCTTA-3’(SEQ ID NO18) DptD-3’::amp 5’-CATACTTCCTCTCACTCCGCTGCAGGAGGGACTGCTGTTCCACAGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO19) GTC del2 5’-GCCGACTGGGAGTGGGTCAAGTGGCTGCCGCACGTGCTGGATCCGCATATGAATATCCTCCTTA-3’(SEQ ID NO20) 使用Red介导的重组系统在pKN18上进行多组件交换以便同时改变达托霉素母核上的几种氨基酸残基。首先，将genR(Wohlleben，W.等.，1989，Mol.Gen.Genet.217202-208)基因导入pKN18以取代编码接头区B和CAT之间组件2-3-4(2-4)的DNA片段(交换2-4)。然后通过AvrII/PmeI消化除去genR基因。
通过如实施例2-5中对单一组件交换所述的缺口-修复法将编码来自A54145途径的组件2-4的DNA片段克隆到pBR322上。通过NheI和HpaI消化切下该片段并且与缺失的pKN18连接而生成pKN51(携带达托霉素中第2位处的D-Glu和第3位处的Asn)。将该质粒pKN51通过重组导入表达宿主KN576而产生KN630，导入KN580而产生KN631，导入KN577而产生KN632，及导入KN587而产生KN633。使用如实施例2-2和2-3中所述的技术发酵和分析重组菌株。KN633的发酵肉汤是含有与产生C259、C260、C261、C262、C263和C264一致的质量离子的唯一菌株。对来自其它菌株KN630、KN631和KN632的发酵肉汤的LC/MS分析未揭示出存在任何新的脂肽类。
用于dpt2-4缺失的引物 dpt-Asn2-Del-B GTTCGCCTTCCCCACCGTCGCCGGCCTTCTCCCGCTCCTGGACGACAACCTAGGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG(SEQ ID NO21) dpt-Thr4-Del-CAT TCAGGGCGCCGGTCGATCCTGGTCACAGGTGGCAGGGCGGTGCCGGGTTTAAACCATATGAATATCCTCCTTA(SEQ ID NO22) 用于lpt2-4缺口修复克隆的引物 LptGlu2-Pickup-B 5’TCC GGG CGG GGC CGG ACG GGA CGG ACG TGG TCG TCC GGCACG GCC GCTAGCTTCTTAGACGTCAGGTGGCAC 3’(SEQ ID NO23) lpt-Thr4-pickup-CAT 5’TTC GAG GCG CCC ACG CCC GCC GCG CTG TCC CGG CGC CTCGACACCGTTAACCGATACGCGAGCGAACGTGA 3’(SEQ ID NO24) 实施例2-11达托霉素中第8-11位处构建的组件交换 使用如实施例2-5中所述的Red介导的重组系统生成含有第8和11位处的2种改变的达托霉素衍生物。简而言之，用侧翼为AvrII和PmeI限制位点的庆大霉素抗性基因使来自pKN24的编码4组件(D-Ala8-Asp9-Gly10-D-Ser11)的DNA片段缺失。然后通过AvrII/PmeI消化除去genR基因。
将通过缺口-修复法(实施例2-5)亚克隆在pBR322上的编码来自A54145BAC-P13的组件8-9-10-11(D-Lys-Asp-Gly-D-Asn)的相应DNA片段用于连接缺失的pKN24以便生成pKN50。将pKN50导入KN156(参见实施例2-9，玫瑰孢链霉菌ΔdptBC，D+pRB04[在ermE*组成型启动子控制下表达dptD亚基的载体pHM11a中构建的质粒，参见实施例2-5])而生成KN410。使用实施例2-2和2-3中所述的方案发酵和分析KN410。对LC/MS数据的分析显示存在与A21978C1，2，3的第8位处插入赖氨酸和第11位处插入天冬酰胺一致的质量离子。将这些化合物命名为C236、C237、C238。
用于组件8-11缺失的引物 8_B TTGTTCGAGGCGCCGACGGTGAGCCGTTTGGAGCGGTTGCTGCGGGAGCGCCTAGGACGTTGACACCATCGAATGG(SEQ ID NO25) 11_SUE(在dptBC 3’末端处终止的缺失) CAGCTCGCTGATGATATGCTGACGCTCAATGCCGTTTGGCCTCCGACTAAGTTTAAACCCTCATTCATCGGGCGAAAG(SEQ ID NO26) 用于组件8-11的缺口修复的引物 lptK8-B-P13 GTCCTCCGACCGCGACATCCGTCGCAACGCGGGGCGGGTGTCAGGGCGGGCTAGCTTCTTAGACGTCAGGTGGCAC(SEQ ID NO27) lpt-N11-SUE-P14(延伸至lptBC 3’末端的克隆片段) CACCGAACTCGACCAGCTCGAAGCAGAGTGGAAGGCCGGCTGATGGTTAACCGATACGCGAGCGAACGTGA(SEQ ID NO28) 实施例2-12用于生产新脂肽类的基于弗氏链霉菌的反式表达系统的构建 为了表达杂种非核糖体多肽合成酶(NRPS)途径，构建缺乏所有NRPS和可能的氨基酸修饰基因的弗氏链霉菌A54145因子高产菌株形式。使改造的经修饰途径在以位点特异性方式整合在弗氏链霉菌基因组中性位点中φC31 attB位点上的基于BAC的载体上接合到该菌株中。
为了从弗氏链霉菌中缺失所有指定的NRPS基因，构建含有来自lptEF上游和lptI下游的侧翼DNA的缺失盒。
在含有tsr和cat的选择盒附近克隆来自lptEF上游(5’)和lptI下游(3’)的侧翼区。5’片段长度为3665 bp且3’片段长度为2004 bp。将这两种片段与tsr和cat抗性盒一起克隆入称作pRHB538(Hosted，TJ.和Baltz，RH.，1997，J Bacteriol.179(1)180-6)的递送质粒的拷贝，其含有温敏性复制起点和rpsL的显性等位基因(链霉素敏感性)。将该质粒导入携带赋予链霉素抗性的隐性rpsL等位基因的弗氏链霉菌菌株。然后将该重组菌株在39℃的肉汤培养基中孵育过夜，此后将细胞在含有链霉素+硫链丝菌肽的平板上铺板并在39℃孵育。在这些条件下，仅那些通过同源重组用缺失盒(含有tsr和cat)交换lptE-I基因座的菌株在选择条件下存活；所有其它基因型被消除。然后将该菌株命名为弗氏链霉菌DA1187。
实施例2-13发酵弗氏链霉菌菌株 将在-80℃储存的弗氏链霉菌DA1187的菌丝体甘油原种在培养基R[10.3％蔗糖(Sigma)、0.025％硫酸钾(Sigma)、1.01％氯化镁六水合物(Sigma)、1％葡萄糖(Sigma)、0.01％酪蛋白氨基酸(Difco)、0.5％酵母提取物(Difco)、0.57％TES缓冲液(Sigma)、2.2％琼脂(MBI)、0.005％磷酸钾(Sigma)、0.29％氯化钙二水合物(Sigma)和0.07％氢氧化钠(Sigma)](参见Kieser)的琼脂平板上铺板并且使其在30℃生长3-5天。
通过缓慢浸软来自琼脂平板表面的物质以便产生营养菌丝体和孢子的混悬液而产生起子培养物，并加至50ml培养管中含有合适抗生素的8ml C培养基[3％胰胨豆胨培养基(Difco)、0.3％酵母提取物(Difco)、0.2％硫酸镁(Sigma)、0.5％葡萄糖和0.4％麦芽糖(Sigma)，Hosted，TJ.，和Baltz，RH.，1996，Microbiology 1422803-2813]。在30℃将起子培养物以240rpm振摇24-36小时。
将1mL该培养物的等分部分转入含有25mL营养液S(调整至pH7.0和高压灭菌的1％D-葡萄糖(BDH)、1.5％甘油(BDH)、1.5％大豆蛋白胨(Sigma)、0.3％氯化钠(BDH)、0.5％麦芽提取物(Oxoid)、0.5％酵母提取物(LabM)，0.1％Junlon PW100(Honeywell and Stein Ltd)、0.1％Tween 80(Sigma)、4.6％MOPS(Sigma))的125mL带挡板的烧瓶中并且在30℃下以200rpm振摇24-36小时。
通过以无菌方式将5％种子培养物转入含有50mL培养基D(调整至pH7和高压灭菌的3％葡萄糖(Sigma)、2.5％大豆粉(Arkady)、0.5％赤糖糊糖蜜(DSM Bakeries)、0.06％硫酸铁铵(Sigma)、0.79％L-异亮氨酸(Sigma)和6％碳酸钙(Sigma)(Boeck等.，1990，J.Antibiotics43607-615))的带挡板的250mL烧瓶产生生产培养物并且在30℃以200rpm振摇可长达7天。已经证实将L-异亮氨酸添加到培养基D中可以增加在第13位处含有异亮氨酸(Ile13)的因子的比例并且减少第13位处含有缬氨酸(Val13)的因子的比例(Boeck等.，1990，J.Antibiotics 43607-615)。有时，发酵在不含异亮氨酸的培养基D中进行并且这些发酵肉汤具有Ile13和Val13因子二者的混合物。
实施例2-14对来自弗氏链霉菌发酵的A54145脂肽类的分析 通过在分析前以无菌方式取出2mL完整培养物并且离心10分钟对实施例2-2中所述的生产培养物取样以用于分析。分析体积可多达50微升的上清液以便监测如由玫瑰孢链霉菌产生的天然脂肽类(A21978C)的产生。在环境温度使用带有4.6×50mm Symmetry C8 3.5μm柱和PhenomenexSecurity Guard C8柱体的Waters Alliance 2690 HPLC系统和996 PDA检测器进行这种分析。最初梯度保持在90％水和10％乙腈2.5分钟，随后在6分钟内通过线性梯度至100％乙腈。流速为1.5mL/分钟并且用0.01％三氟乙酸缓冲梯度。截止到发酵的第2天，正如通过HPLC峰证实的，显然产生了天然脂肽类中的三种，A21978C1、A21978C2和A21978C3，其UV/可见光谱与达托霉素相同，并且在所述分析状态下的保留时间为5.62、5.77和5.90分钟(λmax 223.8、261.5和364.5nm)。然后在7天过程中在每一采样点，脂肽类显然保持在发酵中。脂肽类A21978C1、A21978C2和A21978C3的总产量在10-20mg/升发酵物质的范围。
在使用正离子模式的电喷射离子化的Finnigan SSQ710c LC-MS系统上进行液相色谱-质谱(LC-MS)分析，其中扫描范围在200-2000道尔顿和2秒扫描。在Waters Symmetry C8柱(2.1×50mm，3.5μm颗粒大小)上进行色谱分离，用含有0.01％甲酸的线性水-乙腈梯度洗脱，在最初的0.5分钟延迟后的6分钟期限内乙腈从10％增加至100％，然后在100％乙腈再保持3.5分钟，此后再平衡。流速为0.35mL/分钟并且使该方法在环境温度进行。
如在m/z为1630.7，1644.7，1644.7，1658.7，1658.7，1658.7，1672.7的分子离子([M+H]+)所示，在对照(生长在不合异亮氨酸的培养基D中的弗氏链霉菌野生型)中证实了天然A54145脂肽类的鉴定，分别与对弗氏链霉菌产生的主要A54145脂肽因子F，A，A1，B1，B，D，E报导的质量一致(Boeck等.，1990，J.Antibiotics 43587-593)。DA1187突变体无法在含有或不含异亮氨酸的培养基D中生成A54145脂肽类中的任意种，从而证实它们确实为无效突变体。
实施例2-15构建pDA2002和补足弗氏链霉菌lptE-I缺失 使用“Red”系统构建链霉菌属整合型BAC载体pDA2002(含有lpt生物合成基因簇)。由SF1:10D08(含有所有lpt生物合成基因簇以及侧翼DNA的大肠杆菌BAC质粒，分离自弗氏链霉菌的染色体文库)构建该质粒。通过进行DNA克隆以便具有与BAC载体骨架和弗氏链霉菌插入片段的orf21具有同一性的侧翼DNA区来改造含有phiC31整合酶和attP位点、来自质粒RK2的oriT和安普霉素(apr)抗性标记的链霉菌属整合盒。将链霉菌属整合盒插入BAC载体并且使用同源重组经Red介导的重组系统缺失BAC插入片段的区。通过将SF1:10D08导入在质粒(pKD119，Datsenko，KA.，和Wanner，BL.，2000，Proc.Nat Acad Sci U.S.A.976640)上携带Red基因的大肠杆菌菌株达到这一目的。然后用含有侧翼为适当描述的同源性区的链霉菌属整合盒的凝胶纯化片段转化该菌株。然后对这些细胞选择apr和cat两种抗性并且对所得菌落进行遗传分析以便验证整合盒的插入和orf21上游序列的缺失。一旦构建，就通过接合将质粒pDA2002导入弗氏链霉菌DA1187而生成菌株DA1116。质粒pDA2002含有来自质粒RK2(Baltz，1998，Trends in Microbiol.676-83(1998)，将该文献完整地引入本文作为参考)的oriT以便自大肠杆菌至弗氏链霉菌的接合。通过从大肠杆菌S17.1或含有自主复制质粒RK2(文献同上)的菌株的接合将质粒pDA2002导入弗氏链霉菌。分别使用实施例2-13和2-14中所述的技术发酵和分析弗氏链霉菌DA1116。
如在m/z为1630.7，1644.7，1644.7，1658.7，1658.7，1658.7，1672.7的分子离子([M+H]+)所示，证实了对天然A54145脂肽类的鉴定，分别与对当生长在不合异亮氨酸的培养基D中时，弗氏链霉菌产生的主要A54145脂肽因子F，A，A1，B1，B，D，E报导的质量一致(Boeck等.，1990，J.Antibiotics43587-593)。当生长在含异亮氨酸的培养基D中时，如在m/z为1644.7，1644.7，1658.7，1658.7，1658.7，1672.7的分子离子([M+H]+)所示，主要是含Ile13的天然A54145脂肽类，分别与对主要A54145脂肽因子A，A1，B1，B，D，E报导的质量一致。这表明pDA2002能够成功地补足lptE-I缺失以便恢复DA1116中的脂肽生成。
实施例2-16通过插入终止子盒除去下游簇基因以便鉴定推定的氨基酸修饰基因 改造终止子盒以便将来自λ噬菌体的t0终止子置于amp抗性基因前。使用携带与可能的氨基酸修饰基因和BAC载体末端具有同源性的40-50bp的PCR引物扩增终止子盒(t0终止子+amp)。当将这些PCR片段导入含有pDA2002和诱导的Red系统的电感受态细胞时，通过同源重组将终止子以位点特异性方式整合入pDA2002。然后对这些细胞选择存在的amp抗性标记以及apr抗性标记，并且对所得菌落进行遗传分析以便验证插入的终止子盒和缺失的BAC载体末端序列。
使用将会在orf46下游插入终止子的PCR引物扩增终止盒以便生成pDA2080。将pDA2080接合入弗氏链霉菌DA1187以便生成菌株DA1339。当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示该菌株产生了具有在m/z为1644.7，1644.7，1658.7，1658.7，1658.7，1672.7的分子离子([M+H]+)的脂肽类，分别与对弗氏链霉菌产生的主要A54145脂肽因子A，A1，B1，B，D，E报导的质量一致(Boeck等.，1990，J.Antibiotics43587-593)。这表明pDA2080能够成功地补足lptE-I缺失，即使终止子盒插入BAC也能恢复DA1339中脂肽的产生。
使用将会将终止子插入lptI基因(推定的第12位谷氨酸的甲基转移酶，参见2-8)以便生成pDA2054的PCR引物扩增终止子盒。将pDA2054接合入弗氏链霉菌DA1187以便生成菌株DA1312。当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示DA1312产生了具有在m/z为1644.7，1644.7和1 658.7的分子离子([M+H]+)的脂肽类。这一结果分别与对在第12位处具有谷氨酸(Glu12)替代3-甲基-谷氨酸(mGlu12)的弗氏链霉菌产生的主要A54145脂肽因子A，A1和D报导的质量一致(Boeck等.，1990，J.Antibiotics 43587-593)。从该数据中推断lptI在A54145合成过程中的谷氨酸甲基化中起作用。
使用将会将终止子插入lptL基因(推定的第3位天冬酰胺加氧酶)以便生成pDA2076的PCR引物扩增终止子盒。将pDA2076接合入弗氏链霉菌DA1187以便生成菌株DA1336。当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示DA1336产生了具有在m/z为1628.7，1628.7和1642.7的分子离子([M+H]+)的脂肽类。这一结果分别与对在第3位处具有天冬酰胺(Asn3)替代3-羟基-天冬酰胺(hAsn3)的Glu12因子A，A1和D的类似物的质量一致。显示DA1336产生了Ile13化合物C93，C94和C95，尽管在这些发酵条件下未得到鉴定，但是该菌株还将具有产生具有Val13 C144，C145和C146的因子的可能性。从该数据中可以推断lptL在A54145合成过程中将羟基添加到第3位处天冬酰胺中起作用。
使用将会将终止子插入lptK基因(推定的第9位天冬氨酸甲氧基化中涉及的O-甲基转移酶)以便生成pDA2074的PCR引物扩增终止子盒。将pDA2074接合入弗氏链霉菌DA1187以便生成菌株DA1333。当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示DA1333产生了具有在m/z为1614.7，1614.7和1628.7的分子离子([M+H]+)的脂肽类。这一结果分别与对在第9位处具有3-羟基-天冬氨酸(hAsp9)替代3-甲氧基-天冬氨酸(moAsp)和Asn3替代hAsn3的Glu12因子A，A1和D的类似物的质量一致。显示DA1333产生了Ile13化合物C102，C103和C104，尽管在这些发酵条件下未得到鉴定，但是该菌株还将具有产生具有Val13 C132，C133和C134的因子的可能性。从该数据中可以推断lptK在A54145合成过程中第9位处羟基-天冬氨酸甲氧基化中起作用。
使用可以将会将终止子插入lptJ基因(推定的syrP调节物)以便生成pDA2060的PCR引物扩增终止子盒。将pDA2060接合入弗氏链霉菌DA1187以便生成菌株DA1327。当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示DA1327产生了具有在m/z为1598.7，1598.7和1612.7的分子离子([M+H]+)的脂肽类。这一结果分别与对具有天冬氨酸(hAsp9)替代moAsp9和Asn3替代hAsn3的Glu12因子A，A1和D的类似物的质量一致。显示DA1327产生了Ile13化合物C105，C106和C107，尽管在这些发酵条件下未得到鉴定，但是该菌株还将具有产生具有Val13 C135，C136和C137的因子的可能性。从该数据中可以推断lptJ并非A54145生物合成的调节物，而是在A54145合成过程中第9位处天冬氨酸羟基化中起作用。
实施例2-17构建用于补足实验的基于φBT1的质粒 使用以位点特异性方式整合在弗氏链霉菌基因组中性位点中φC31 attB位点上的基于apr抗性BAC的载体进行经修饰的A54145生物合成途径在lptE-I突变体中的表达。这些菌株的额外补足将会需要使用具有不同选择标记的相容整合质粒。具有新霉素(neo)或潮霉素(hyg)抗性标记的基于φBT1的载体(Gregory等.J.Bacteriol 20035320-5323)可以以位点特异性方式整合在弗氏链霉菌基因组中性位点中φBT1 attB位点上。也可以在已经含有整合的基于φC31的BAC载体的apr抗性菌株中实现这一目的。
通过进行DNA克隆以便具有与BAC载体骨架和弗氏链霉菌插入片段具有同一性的侧翼DNA区来改造从MS82(Gregory等.，2003，J.Bacteriol5320-5323)中切出的并且含有φBT1整合酶和attP位点、来自质粒RK2的oriT和hyg抗性标记的基于φBT1整合酶的链霉菌属整合盒。φBT1整合盒还含有将会驱动下游基因表达的ermE*组成型启动子。通过将凝胶纯化片段转移入携带SF1:10D08和含有Red基因的质粒pKD119的经诱导大肠杆菌菌株，在BAC载体与侧翼为具有同源性的适当区的链霉菌属整合盒之间进行同源重组。然后对这些细胞选择hyg和cat两种抗性并且对所得菌落进行遗传分析以便验证整合盒的插入和上游序列的缺失。
使用“Red”系统构建链霉菌属整合型BAC载体pJR2012。基于φBT1整合酶的链霉菌属整合盒侧翼为与BAC载体骨架和弗氏链霉菌插入片段的lptK具有同一性的DNA区。通过转化入含有SF1:10D08 BAC和诱导的Red系统(参见实施例2-5)的细胞，在BAC载体与链霉菌属整合盒之间进行同源重组。φBT1整合盒的插入使ermE*组成型启动子位于紧邻在lptK前，以确保其和保留在BAC载体上的下游基因的表达。
使用“Red”系统构建链霉菌属整合型BAC载体pJR2015。基于φBT1整合酶的链霉菌属整合盒侧翼为与BAC载体骨架和弗氏链霉菌插入片段的lptL具有同一性的DNA区。通过转化入含有SF1:10D08 BAC和诱导的Red系统的细胞，在BAC载体与链霉菌属整合盒之间进行同源重组。φBT1整合盒的插入使ermE*组成型启动子位于紧邻在lptL前，以确保其和保留在BAC载体上的下游基因的表达。
通过插入含有驱动侧翼为fd和t0终止子的大观霉素(spec)抗性标记表达的ermE*组成型启动子的盒，将neo抗性φBT1 pRT802质粒转变成表达质粒以生成pDA2113。将PCR扩增的表达盒插入用EcoRV和NotI消化的pRT802质粒。通过用PCR扩增的生物合成基因和cat终止子盒(在cat抗性基因前改造t0终止子)取代pDA2113中的spec标记和t0终止子，生成共同表达lptI(mGlu12甲基转移酶)或lptL(hAsn3加氧酶)的补足质粒。
用NdeI和HindIII消化neo抗性φBT1 pDA2113以便除去spec标记和t0终止子并且与用NdeI和XbaI消化的PCR扩增lptI基因和用XbaI和HindIII消化的cat终止子盒连接。新生成的pDA2129具有在组成型ermE*启动子控制下的lptI基因，它编码Glu12甲基转移酶。
用NdeI和HindIII消化neo抗性φBT1 pDA2113以便除去spec标记和t0终止子并且与用NdeI和XbaI消化的PCR扩增lptL基因和用XbaI和HindIII消化的cat终止子盒连接。新生成的pDA2105具有在组成型ermE*启动子控制下的lptL基因，它编码Asn3加氧酶。
实施例2-18用基于φBT1的质粒补足含有φC31 BAC的弗氏链霉菌突变株用于生产新脂肽类 一旦构建，将含有lptK(hAsp9 methoxylase)、在组成型ermE*启动子控制下的lptL(Asn3加氧酶)和lptI(Glu12甲基转移酶)的质粒pJR2012通过接合导入弗氏链霉菌DA1333以便生成菌株DA1449。当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示弗氏链霉菌DA1449产生了具有在m/z为1644.7，1644.7，1658.7，1658.7，1658.7，1672.7的分子离子([M+H]+)的脂肽类，分别与对弗氏链霉菌产生的主要A54145脂肽因子A，A1，B1，B，D，E报导的质量一致(Boeck等.，1990，J.Antibiotics 43587-593)。这表明pJR2012能够成功地补足DA1333菌株以便恢复脂肽生成。
将含有lptK(hAsp9 methoxylase)、在组成型ermE*启动子控制下的lptL(Asn3加氧酶)和lptI(Glu12甲基转移酶)的质粒pJR2012通过接合导入弗氏链霉菌DA1327以便生成菌株DA1553。当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示弗氏链霉菌DA1553产生了具有在m/z为1628.7，1628.7和1642.7的分子离子([M+H]+)的脂肽类，这分别与具有Asp9替代moAsp9的mGlu12因子B1，B和E的类似物的质量一致。显示DA1553产生Ile13化合物C114，C115和C116，尽管在这些发酵条件下未得到鉴定，但是该菌株还将具有产生具有Val13 C117，C118和C119的因子的可能性。这表明推定的LptK蛋白质需要存在lptJ蛋白以便使Asp9羟基化，此后可以进行甲氧基化。
一旦构建，将含有在组成型ermE*启动子控制下的lptL(Asn3加氧酶)和lptI(Glu12甲基转移酶)的质粒pJR2015通过接合导入弗氏链霉菌DA1336以便生成菌株DA1621。当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示弗氏链霉菌DA1621产生了具有在m/z为1644.7，1644.7，1658.7，1658.7，1658.7，1672.7的分子离子([M+H]+)的脂肽类，分别与对弗氏链霉菌产生的主要A54145脂肽因子A，A1，B1，B，D，E报导的质量一致(Boeck等.，1990，J.Antibiotics 43587-593)。这表明pJR2015能够成功地补足DA1336菌株以便恢复脂肽生成。
将含有在组成型ermE*启动子控制下的lptL(Asn3加氧酶)和lptI(Glu12甲基转移酶)的质粒pJR2015通过接合导入弗氏链霉菌DA1333以便生成菌株DA1627。当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示弗氏链霉菌DA1627产生了具有在m/z为1644.7，1644.7和1658.7的分子离子([M+H]+)的脂肽类，这分别与具有Asp9替代moAsp9的mGlu12因子B1，B和E的类似物的质量一致。显示DA1627产生Ile13化合物C111，C112和C113，尽管在这些发酵条件下未得到鉴定，但是该菌株还具有产生具有Val13 C126，C127和C128的因子的可能性。
一旦构建，将含有在组成型ermE*启动子控制下的lptI(Glu12甲基转移酶)的质粒pDA2129通过接合导入弗氏链霉菌DA613以便生成菌株DA1491。当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示弗氏链霉菌DA1491产生了具有在m/z为1644.7，1644.7，1658.7，1658.7，1658.7，1672.7的分子离子([M+H]+)的脂肽类，分别与对弗氏链霉菌产生的主要A54145脂肽因子A，A1，B1，B，D，E报导的质量一致(Boeck等.，1990，J.Antibiotics 43587-593)。这表明pDA2129能够成功地补足DA613菌株以便恢复Glu12和mGlu12脂肽类生成。
将含有在组成型ermE*启动子控制下的lptI(Glu12甲基转移酶)的质粒pDA2129通过接合导入弗氏链霉菌DA1327以便生成菌株DA1489。当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示弗氏链霉菌DA1489产生了具有在m/z为1612.7，1612.7和1626.7的分子离子([M+H]+)的脂肽类，这分别与具有Asp9替代moAsp9和Asn3替代hAsn3的mGlu12因子B1，B和E的类似物的质量一致。显示DA1489产生Ile13化合物C108，C109和C110，尽管在这些发酵条件下未得到鉴定，但是该菌株还具有产生具有Val13 C138，C139和C140的因子的可能性。
将含有在组成型ermE*启动子控制下的lptI(Glu12甲基转移酶)的质粒pDA2129通过接合导入弗氏链霉菌DA1327以便生成菌株DA1489。向此菌株中添加质粒pDA2076以便生成DA2000。当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示弗氏链霉菌DA2000产生了具有在m/z为1642.7，1642.7和1656.7的分子离子([M+H]+)的脂肽类。这一结果分别与具有Asn3替代hAsn3的mGlu12因子B1，B和E的类似物的质量一致。显示DA1489产生Ile13化合物C96，C97和C98，尽管在这些发酵条件下未得到鉴定，但是该菌株还具有产生具有Val13 C141，C142和C143的因子的可能性。
将含有在组成型ermE*启动子控制下的lptI(Glu12甲基转移酶)的质粒pDA2129通过接合导入弗氏链霉菌DA1333以便生成菌株DA1459。当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示弗氏链霉菌DA1459产生了具有在m/z为1628.7，1628.7和1642.7的分子离子([M+H]+)的脂肽类。这一结果分别与具有hAsp9替代moAsp9和Asn3替代hAsn3的mGlu12因子B1，B和E的类似物的质量一致。显示DA1489产生Ile13化合物C99，C100和C101，尽管在这些发酵条件下未得到鉴定，但是该菌株还具有产生具有Val13 C129，C130和C131的因子的可能性。
一旦构建，将含有在组成型ermE*启动子控制下的lptL(Asn3加氧酶)的质粒pDA2117通过接合导入弗氏链霉菌DA1336以便生成菌株DA1470。
当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示弗氏链霉菌DA1470产生了具有在m/z为1644.7，1644.7和1658.7的分子离子([M+H]+)的脂肽类，分别与具有Glu12替代mGlu12的弗氏链霉菌产生的主要A54145脂肽因子A，A1，D报导的质量一致(Boeck等.，1990，J.Antibiotics 43587-593)。这表明pDA2117能够成功地补足DA1336菌株以便恢复Glu12脂肽类生成。
将含有在组成型ermE*启动子控制下的lptL(Asn3加氧酶)的质粒pDA2117通过接合导入弗氏链霉菌DA1327以便生成菌株DA1484。当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示弗氏链霉菌DA1484产生了具有在m/z为1614.7，1614.7和1628.7的分子离子([M+H]+)的脂肽类，这一结果分别与具有Asp9替代moAsp9的Glu12因子A，A1和D的类似物的质量一致。显示DA1484产生Ile13化合物C90，C91和C92，尽管在这些发酵条件下未得到鉴定，但是该菌株还具有产生具有Val13 C120，C121和C122的因子的可能性。
将含有在组成型ermE*启动子控制下的lptL(Asn3加氧酶)的质粒pDA2117通过接合导入弗氏链霉菌DA1333以便生成菌株DA1453。当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示弗氏链霉菌DA1453产生了具有在m/z为1630.7，1630.7和1644.7的分子离子([M+H]+)的脂肽类。这一结果分别与具有hAsp9替代moAsp9的Glu12因子A，A1和D的类似物的质量一致。显示DA1453产生Ile13化合物C87，C88和C89，尽管在这些发酵条件下未得到鉴定，但是该菌株还具有产生具有Val13 C123，C124和C125因子的可能性。
实施例2-20A54145中第8或11位处构建的组件交换 对质粒pDA2054(参见实施例2-16，能够表达lptABCD的质粒-不含PmeI位点)进行组件交换以改变A54145母核的第8或11位。该质粒能够恢复ΔlptE-I弗氏链霉菌中的A54145生物合成。使用实施例2-6中所述的Red介导的重组系统使pDA2054上编码组件8或组件11的DNA片段用接头区B和CAT处的genR基因取代(参见下文使用的引物)。一旦将genR基因插入pDA2054，就通过NheI/PmeI消化(组件8)或AvrII/PmeI(组件11)除去第8位处的赖氨酸CAT组件或第11位处的天冬酰胺组件。使用实施例2-6中所述的缺口-修复技术克隆用于取代赖氨酸或天冬酰胺的组件并且可以使用限制位点NheI/HpaI从pBR322中除去它们。这些组件包括编码克隆自达托霉素dptD-Ala 8、dpt D-Ser11或来自A54145 lpt D-Asn11的异源组件的DNA片段。构建第8或11位处Ser、Ala和Asn的所有可能的组合并且将其命名为下列杂种质粒pKN56(含有D-Ala8的pDA2054)，pKN57(含有D-Ser8的pDA2054)，pKN5 8(含有D-Asn8的pDA2054)，pKN59(含有D-Ala11的pDA2054)和pKN60(含有D-Ser11的pDA2054)，将它们导入弗氏链霉菌突变体DA1187(ΔlptE-I，参见实施例2-12)和DA740(DA1187+表达lptI的质粒pDA2129，参见实施例2-18)以便生成在第8或11和12位处具有2处改变的杂种脂肽类。
用于缺失的引物 lpt-D-Lys8 lpt-Del-Lys8-B-Nhe 5’-GTG TTC GAG GCC CGA ACG GTC GCC GCG CTG GCG GCC CGGCTG CGG ACC GCGCT AGC TGTG TAG GCT GGA GCT GCT TCG-3’(SEQID NO29) lpt-Lys8-CAT-II 5’-CGG CGA GAG CGG GGT CCT CGT CGC CTG CCG CGT CGG TCCTGC GGG GTTTAAACCATATGAATATCCTCCTTA-3’(SEQ ID NO 30) lpt-D-Asn11 lpt-Asn11-B。
5’-CGAGACACCGACCGTGGCCGGTCTCGCCGCCGCGCTCTCCGCGGCCCTAGGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’(SEQ ID NO31) lpt-Asn11-CAT. 5’-GTCCCGCGACCGCCGAGTACCTCGGTCGCCGGACCGCCGGGGCGCGGTTTAAACCATATGAATATCCTCCTTA-3’(SEQ ID NO32) 用于dpt-Ala8和dpt-Ser11组件的缺口-修复克隆的引物 Ala/Ser-B-P13 5’-CGTCCGCTCCCGTGCCACCAGAGGCACCCGCACCCCCAAAGCCGACGCTAGCTTCTTAGACGTCAGGTGGCAC-3’(SEQ ID NO33) Ser-CAT-P14-II 5’-GTTCGGGATGTTTTCGAGGGCCGTACGGTACGTGCTCTGGCGGCTGTGGTTAACCGATACGCGAGCGAACGTGA-3’(SEQ ID NO34) 通过将pKN56添加至DA1187，构建菌株KN707。当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示该菌株产生了化合物C313，C314，C315，C316，C317和C318。
通过将pKN56添加至DA740，构建菌株KN681。当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示该菌株产生了化合物C319，C320，C321，C322，C323和C324。
通过将pKN57添加至DA1187，构建菌株KN715。当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示该菌株产生了化合物C292，C293，C294，C295，C296和C297。
通过将pKN57添加至DA740，构建菌株KN689。当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示该菌株产生了化合物C289，C290，C291，C298，C299和C300。
通过将pKN58添加至DA1187，构建菌株KN723。当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示该菌株产生了化合物C307，C308，C309，C310，C311和C312。
通过将pKN58添加至DA740，构建菌株KN697。当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示该菌株产生了化合物C301，C302，C303，C304，C305和C306。
通过将pKN59添加至DA1187，构建菌株KN728。当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示该菌株产生了化合物C334，C335，C336，C337，C338和C339。
通过将pKN59添加至DA740，构建菌株KN701。当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示该菌株产生了化合物C328，C329，C330，C331，C332和C333。
通过将pKN60添加至DA1187，构建菌株KN730。当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示该菌株产生了化合物C147，C148，C149，C325，C326和C327。
通过将pKN60添加至DA740，构建菌株KN705。当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示该菌株产生了化合物C150，C151，C152，C153，C154和C155。
实施例2-21A54145中第2-4位处构建的组件交换 在pDA2054(该质粒表达来自BAC载体的lptABCD，参见实施例2-16对其构建所述)上构建lptA(D-Glu-2/hAsn-3/Thr-4)中的组件2-4交换。pDA2054能够恢复突变体pDA1187中A54145的谷氨酸衍生物的生物合成(参见实施例2-15)。使用实施例2-6中所述的Red介导的重组系统使pDA2054上编码lptA中的组件2-4的DNA片段用接头区B和CAT间的genR基因取代(组件交换2-4)。genR基因侧翼为使之易于通过限制消化从BAC载体中除去的NheI/PmeI的限制位点。使用实施例2-6中所述的缺口-修复系统将取代片段从dptA克隆入pBR322并且使其侧翼为NheI/HpaI的限制位点。来自lptA的该片段编码来自达托霉素的组件2-4(D-Asn-2/Asp-3/Thr-4)，将该片段与pDA2054的2-4缺失形式连接而生成pKN61。将质粒pKN61导入DA1187和xH1000(携带pKN55的DA1189，参见实施例2-10)而产生重组菌株KN650(DA1187+pKN651)和KN665(XH1000+pKN61)。
当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示菌株KN650产生了化合物C271，C272，C273，C274，C275和C276。
当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示菌株KN665产生了化合物C265，C266，C267，C268，C269和C270。
用于Lpt2-4缺失的引物 lpt-Del-Glu2-B-Nhe CCG GTC CCC GAC CGT CGC CCG CCT CGC GGA GGA ACT GGG CGACGG GCTAGCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG(SEQ ID NO35) lptGlu2-CAT 5’-CCT GCG GCG CGG GAC GCT CCG CGT CCG CGT CCG GTC CGGCGG ACCGTTTAAACCATATGAATATCCTCCTTA-3’(SEQ ID NO36) 用于Dpt2-4缺口修复克隆的引物 dpt-Asn2-Pick-B AGGCGCTCCGGGCGCGGAGGCAGCGGCGGGGTGGTGTGCTGCCGTCCGGCTAGCTTCTTAGACGTCAGGTGGCAC(SEQ ID NO37) dpt-Thr4-Pick-CAT CTCTTCGCCGCGCCCACGCCTGCCGGGCTCGCGACCGTACTGGCGGCCGTTAACCGATACGCGAGCGAACGTGA(SEQ ID NO38) 实施例2-22A54145中第2-8位处构建的组件交换 在pDA2054(该质粒表达来自BAC载体的lptABCD，参见实施例2-16对其构建所述)上构建lptA，B，C(D-Glu-2/hAsn-3/Thr-4/Sar-5/Ala-6/Asp-7/D-Lys-8)中的组件2-8交换。pDA2054能够恢复突变体pDA1187中A54145的谷氨酸衍生物的生物合成(参见实施例2-15)。使用实施例2-6中所述的Red介导的重组系统使pDA2054上编码lptA，B，C中的组件2-8的DNA片段用接头区B和CAT间的genR基因取代(组件交换2-8)。genR基因侧翼为使之易于通过限制消化从BAC载体中除去的NheI/PmeI的限制位点。使用实施例2-6中所述的缺口-修复系统将取代片段从dptA，BC克隆入pBR322并且使其侧翼为NheI/HpaI的限制位点。来自dptA，BC的该片段编码来自达托霉素的组件2-8(D-Asn-2/Asp-3/Thr-4/Gly-5/Om-6/Asp-7/D-Ala-8)，将该片段与pDA2054的2-8缺失形式连接而生成pKN62。将质粒pKN62导入DA1187和XH1000(携带pKN55的DA1189，参见实施例2-10)而产生重组菌株KN653(DA1187+pKN62)和KN669(XH1000+pKN62)。
当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示菌株KN653产生了化合物C283，C284，C285，C286，C287和C288。
当在实施例2-13和2-14中所述的条件下发酵和分析时，显示菌株KN669产生了化合物C277，C278，C279，C280，C281和C282。
用于Lpt2-8缺失的引物 lpt-Del-Glu2-B-Nhe CCG GTC CCC GAC CGT CGC CCG CCT CGC GGA GGA ACT GGG CGACGG GCTAGCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG(SEQ ID NO39) lpt-Lys8-CATE2-II 5’GGGG GGC GAC CGG CAG GAT GTC CTC CAA GGC GGT GCC GGTGCG GCGTTTAAACCATATGAATATCCTCCTTA 3’(SEQ ID NO40) 用于Dpt2-8缺口修复克隆的引物 dpt-Asn2-Pick-B AGGCGCTCCGGGCGCGGAGGCAGCGGCGGGGTGGTGTGCTGCCGTCCGGCTAGCTTCTTAGACGTCAGGTGGCAC(SEQ ID NO41) Ala-CATE2-P14-II CGACGTGACGCTGGTGGAAGTGAACCAGGTGGAGCTCGACCGTCTGCAGGTTAACCGATACGCGAGCGAACGTGA(SEQ ID NO42) 实施例2-23缺失肌氨酸组件中的甲基化以便在A54145中第5位处产生甘氨酸 使用携带与研究中的结构域接头区同源的50 bp的PCR引物扩增用于lptA5-Sar组件内甲基化结构域缺失的选择盒(参见附图5的接头位置)。当将这些PCR片段导入含有pDA2054(含有完整lpt途径的lptBAC的截短形式，参见实施例2-16)和诱导的Red系统(参见实施例2-6)的电感受态细胞时，通过同源重组将抗性盒以位点特异性方式整合在pDA2054中的靶位点处(附图3)。
然后对这些细胞选择存在的gent抗性标记，并且对所得菌落进行遗传分析以便验证构建的合适的缺失或破坏。部分引物设计包括将限制位点置于所关注的接头区内(PmeI和SwaI)。(附图3)。
随后使用唯一限制位点PmeI和SwaI消化含有甲基化结构域的gent缺失的BAC以便切下选择标记并且重新连接，且对所得菌落进行遗传分析以便验证构建的甲基化结构域的合适的缺失。将所得克隆命名为pSD409。
通过自大肠杆菌至DA1187(弗氏链霉菌的lptE-I缺失，参见实施例2-12)的种间接合加入pSD409以便生成SD409。分别使用实施例2-13和2-14中所述的技术发酵和分析弗氏链霉菌SD409。
如通过在m/z为1616.7(C183)，1630.7(C182)，1630.7(C181)和1644.7(C180)的分子离子([M+H]+)所示，证实了对脂肽类的鉴定，与对主要A54145脂肽类弗氏链霉菌-14m/z报导的质量一致。尽管在这些发酵条件下未得到鉴定，但是该菌株还将具有产生具有Val13 C184和C185的因子的能力。
实施例2-24.A54145中第2位处构建的组件交换 在质粒plpt-J14-P上进行组件交换以便用D-Asn，D-Ser或D-Ala组件取代D-Glu-2组件。质粒pDA2054能够恢复突变体DA1187中A54145的谷氨酸衍生物的生物合成。首先使pDA2054上编码组件2的DNA片段用接头区CAT处的genR基因取代(参见实施例2-20)。通过NheI/PmeI消化除去genR基因并且用编码lpt D-Asn11的NheI/HpaI DNA片段(通过如实施例2-5中所述的切口-修复法，使用引物Lpt-N11-B-P13和Lpt-N11-CAT-P1克隆)取代。该步骤产生杂种质粒pXH2000，将其导入DA1189和XH1000(携带pKN55的DA1189)以便产生重组菌株XH1001(DA1889+pXH2000)和XH1002(XH1000+pXH2000)。使用实施例2-13和2-14中所述的方案发酵和分析XH1001和XH1002。显示弗氏链霉菌XH1001产生具有在m/z为1629.7，1629.7和1643.7的分子离子([M+H]+)的脂肽类。这一结果分别与具有Asn-2的Glu12因子A，A1和D的类似物的质量一致。显示XH1001产生了Ile13化合物C343，C344和C345。尽管在这些发酵条件下未得到鉴定，但是该菌株还将具有产生具有Val13 C346，C347和C348的因子的能力。显示弗氏链霉菌XH1002产生具有在m/z为1643.7，1643.7和1657.7的分子离子([M+H]+)的脂肽类。这一结果分别与具有Asn-2的Glu12因子B，B1和E的类似物的质量一致。显示XH1002产生了Ile13化合物C340，C341和C342。尽管在这些发酵条件下未得到鉴定，但是该菌株还将具有产生具有Val13 C349，C350和C351的因子的能力。
用于D-Glu-2组件缺失的引物 lptGlu2-B 5’-CCG GTC CCC GAC CGT CGC CCG CCT CGC GGA GGA ACT GGGCGA CGG CCTAGGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’(SEQ ID NO43) lptGlu2-CAT 5’-CCT GCG GCG CGG GAC GCT CCG CGT CCG CGT CCG GTC CGGCGG ACCGTTTAAACCATATGAATATCCTCCTTA-3’(SEQ ID NO44) 用于lpt-Asn-11的缺口-修复的引物 Lpt-N11-B-P13 TCGGGGCGCGGGTCGGCGGGGCGCAGCCGGGGTCCGGCCTCGCCCGCTAGCTTCTTAGACGTCAGGTGGCAC(SEQ ID NO45) Lpt-N11-CAT-P14 CGCGACATCTTCGAACAGCGCACGCCCGCCGCCCTCGCCGGCCGCGTTAACCGATACGCGAGCGAACGTGA(SEQ ID NO46) 实施例3-1生物学活性 按照National Committee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS文件M7-A6，Vol.23，Number 2，2003)所述的标准程序对式I的化合物测试针对一组生物体的抗菌活性，但所有测试均在37℃和以200rpm恒定搅拌下进行。根据化合物的溶解性，将化合物溶于100％二甲亚砜或水或按体积计50∶50的二甲亚砜与水的混合物并且在微生物生长培养基中稀释至最终反应浓度(0.1μg/mL-100μg/mL)。在所有情况中，与细胞一起孵育的二甲亚砜的终浓度低于或等于1％。为了进行最低抑菌浓度(MIC)计算，向含有5×104个细菌细胞的微量滴定板的孔中加入化合物的2倍稀释液，终体积100μL培养基(补充了50mg/L Ca2+的Mueller-Hinton肉汤)。使用商购平板读出器测量细菌细胞的光密度(OD)，它测量细菌细胞的生长和增殖。将MIC值定义为抑制测试生物体生长的最低化合物浓度。将本发明有代表性化合物的MIC(按μg/ml计)值列在表V中。
表V式I化合物的生物学活性




其中 其中″+++″表示化合物具有1μg/ml或以下的MIC(μg/ml)或者1mg/kg或以下的ED50； ″++″表示化合物具有分别大于1μg/ml或1mg/kg但分别小于或等于10μg/ml或10mg/kg的MIC(μg/ml)或ED50；且 ″+″表示化合物具有大于10μg/ml的MIC(μg/ml)或大于10mg/kg的ED50。
实施例3-2体内活性 小鼠保护测试为测量测试化合物体内功效的工业标准(该模型的实例参见Clement，JJ.等.，1994，Antimicrobial Agents and Chemotherapy 38(5)1071-1078)。如下文所例示的，本测试用于证实本发明化合物针对细菌的体内功效。
通过给体重为19-23g的雌性CD-1小鼠(Charles River Lab，MA)经腹膜内感染甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)接种物，建立体内抗菌活性。由甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(ATCC 43300)制备接种物。将MRSA接种物在37℃在Mueller-Hinton(MH)肉汤中培养18小时。测定过夜培养物的1∶10稀释液在600nm处的光密度(OD600)。将细菌(8×108cfu)加入到含有5％猪(hog)胃粘蛋白(Sigma M-2378)的20ml磷酸盐缓冲盐水(Sigma P-0261)中。给所有动物注射相当于2×107cfu/小鼠的0.5ml该接种物，这是导致未经治疗的动物～100％死亡的剂量。
将测试化合物溶于10.0ml盐水溶液而得到1mg/ml溶液(pH＝7.0)。用媒介物将该溶液连续稀释4倍(1.5ml-6.0ml)而得到0.25，0.063和0.016mg/ml溶液。用0.2μm Nalgene注射器式滤器过滤所有溶液。在细菌接种后1小时，给第1组动物经皮下(sc)注射缓冲液(不含测试化合物)并且对第2-5组分别sc给予10.0，2.5，0.63和0.16mg/kg的测试化合物。第6组动物sc接受10mg/kg的测试化合物(或最高治疗剂量的指定化合物)，目的仅在于监测急性毒性。在对相应组接种后4小时时，这些注射重复一次。每次注射体积为10ml/kg体重。基于接种后7天存活小鼠的数目计算50％保护剂量(PD50)。
将本说明书中引述的所有出版物和专利申请引入本文作为参考，就如同将每一篇出版物或专利申请各自特别和分别引入作为参考相同。尽管已经为清楚理解的目的而通过解释和实施例较为详细地描述了上述本发明，但是对本领域技术人员而言显而易见的是，可以根据本文的教导，在不脱离所披露的本发明精神或范围的情况下对其进行一定的改变和修改。
权利要求
1.组合物，包含式F11的化合物及其盐
其中
a)R13*为H或CH3；且
b)R1和R6*各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
2.组合物，包含式F1的化合物及其盐
其中
a)R8为氢、
或
b)R11为甲基、
或
c)R12为H或CH3；
d)R13为CH(CH3)2、CH(CH2CH3)CH3、
或
且
e)R1和R6*各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
3.组合物，包含式F2的化合物及其盐
其中
a)R8为氢、甲基、
或
b)R12为H或CH3；
c)R13为CH(CH3)2、CH(CH2CH3)CH3、
或
且
d)R1、R6*和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
4.组合物，包含式F3的化合物及其盐
其中
a)R8为氢、
或
b)R11为甲基、
或
c)R12为H或CH3；且
d)R1、R6*和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
5.组合物，包含式F4的化合物及其盐
其中
a)R8为氢、甲基、
或
b)R11为甲基或
c)R12为H或CH3；且
d)R1、R6*和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
6.组合物，包含式F5的化合物及其盐
其中
a)R8为氢、甲基
或
b)R11为甲基、
或
且
c)R1、R6*和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
7.组合物，包含式F6的化合物及其盐
其中
a)R8为
或
b)R9为
或
c)R11为甲基、
或
d)R12为H或CH3；且
e)R1为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
8.组合物，包含式F7的化合物及其盐
其中
a)R8为甲基、
或
b)R9为
或
c)R12为H或CH3；且
d)R1和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
9.组合物，包含式F8的化合物及其盐
其中
a)R3**为羟基或氢；
b)R8为甲基、
或
c)R11为氨基酸侧链、甲基、
或
d)R12为H或CH3；且
e)R1和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
10.组合物，包含式F9的化合物及其盐
其中
a)R12为H或CH3；且
b)R1和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
11.组合物，包含式F10的化合物及其盐
其中
a)R13*为H或CH3；且
b)R1和R6*各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
12.组合物，包含式F12的化合物及其盐
其中
a)R13为CH(CH2CH3)CH3或
且
b)R1和R6*各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
13.组合物，包含式F13的化合物及其盐
其中R1、R6*和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
14.组合物，包含式F14的化合物及其盐
其中
a)R12为H或CH3；且
b)R1和R6*各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
15.组合物，包含式F15的化合物及其盐
其中
a)R12为H或CH3；且
b)R1和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
16.组合物，包含式F16的化合物及其盐
其中
a)R12为H或CH3，且
b)R1和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
17.组合物，包含式F17的化合物及其盐
其中
a)R12为H或CH3；且
b)R1为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
18.组合物，包含式F18的化合物及其盐
其中R1和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
19.组合物，包含式F19的化合物及其盐
其中
a)R2为
或
b)R6为甲基或
c)R8为甲基或
且
d)R1、R6*和R8**各自独立为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
20.组合物，包含的化合物式F20及其盐
其中
a)R12为H或CH3；和
b)R1和R8**各自为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
21.组合物，包含式F21的化合物及其盐
其中
a)R1为
或
b)R12为H或CH3，且
c)R8**为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
22.组合物，包含式F22的化合物及其盐
其中
R6*为氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、NH-氨基保护基、酰氨基、脲基、胍基、氨基甲酰基、磺氨基、硫代酰氨基、硫脲基、亚氨基氨基或膦氨基。
23.权利要求10所述的化合物，其中R8**为氨基、NH-氨基保护基或氨基甲酰基。
24.权利要求23所述的化合物，其中R8**为氨基。
25.权利要求10所述的化合物，其中R1为氨基、烷酰基氨基、NH-氨基保护基或氨基甲酰基。
26.权利要求25所述的化合物，其中R1为C10-C13烷酰基氨基。
27.权利要求26所述的化合物，其中R1为
或
28.权利要求10所述的化合物，其中R12为CH3。
29.权利要求28所述的化合物，其中R1为烷酰基氨基。
30.权利要求29所述的化合物，其中R1为C11-烷酰基氨基。
31.权利要求30所述的化合物，其中R1为
32.权利要求31所述的化合物，其中R8**为氨基。
33.权利要求10所述的化合物，选自
或
34.权利要求10所述的化合物，选自
或
35.权利要求1所述的化合物，其中R6*为氨基、NH-氨基保护基或氨基甲酰基。
36.权利要求35所述的化合物，其中R6*为氨基。
37.权利要求1所述的化合物，其中R1为氨基、酰氨基、NH-氨基保护基。
38.权利要求37所述的化合物，其中R1为C10-C13酰氨基。
39.权利要求38所述的化合物，其中R1为
或
40.权利要求39所述的化合物，其中R1为
或
41.权利要求1所述的化合物，选自
或
42.权利要求1所述的化合物，选自
或
43.下式的化合物
44.下式的化合物
45.药物组合物，包含权利要求1的化合物和药学上可接受的载体。
46.抗菌组合物，包含在含水缓冲液中的权利要求1的化合物。
47.治疗受治疗者细菌感染的方法，包含在改善所述细菌感染的一段时间和条件下将治疗有效量的权利要求1的组合物给予有此需要的受治疗者。
48.权利要求1的组合物在制备用于治疗受治疗者细菌感染的药物中的应用。
49.权利要求1的组合物，其中所述的化合物以约80％-约90％的量存在于该组合物中。
50.权利要求1所述的组合物，其中所述的化合物以约90％存在于该组合物中。
51.权利要求1所述的组合物，其中所述的化合物的存在量大于该组合物的约90％。
52.用于生产重组细胞的方法，包含下列步骤
a.在细胞中重组至少一种编码NRPS组件的外源性多核酸，以便在细胞中提供将能够在细胞中产生式F11的化合物的NRPS进行编码的重组NRPS基因簇。
53.权利要求52所述的方法，其中至少一种编码NRPS组件的外源性多核酸来自达托霉素NRPS基因簇或A54145NRPS基因簇。
54.权利要求52所述方法生产的重组细胞。
55.制备式F11的化合物的方法，包含下列步骤
在适合于产生式F11的化合物的条件下培养权利要求54所述的细胞。
56.权利要求55所述的方法，进一步包含下列步骤
纯化式F11的化合物。
57.权利要求55所述的方法，其中培养细胞的步骤进一步包含
在有预定的式F11的R1基团的前体存在下发酵细胞以便增加带有预定R1基团的式F11的化合物的产量。
58.权利要求57所述的方法，进一步包含下列步骤
a.纯化式F11的化合物。
59.权利要求55所述方法生产的化合物。
全文摘要
本发明涉及新型酯肽化合物。本发明还涉及这些化合物的药物组合物和这些化合物作为抗菌化合物的使用方法。本发明还涉及生产这些新型酯肽化合物的方法和用于生产这些化合物的中间体。
文档编号C07K7/08GK101189253SQ200580046465
公开日2008年5月28日 申请日期2005年11月11日 优先权日2004年11月12日
发明者迪伦·C·亚历山大, 理查德·H·巴尔茨, 保罗·布赖恩, 玛丽-弗朗索瓦·科菲特-勒盖尔, 萨沙·多科尔, 贺晓蔚, 维迪亚·库尔卡尼, 克里斯托弗·莱泰瑟, 维维安·P·W·米奥, 基恩·T·古扬, 伊恩·B·帕尔, 丹尼尔·里茨, 张艳芝 申请人:丘比斯特药物股份有限公司