可拆分外消旋胺制备手性胺的转氨酶及其编码基因与应用
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种可拆分外消旋胺制备手性胺的转氨酶及其编码基因与应用。转氨酶是如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，转氨酶的基因是如SEQ ID NO.2所示的碱基序列。采用本发明所述转氨酶作为催化剂来拆分外消旋胺，与化学法相比，有着高的选择性和转化率，且反应条件温和，对环境无污染，对于医药及化工领域手性胺的高效、绿色合成具有重大意义。
【专利说明】
可拆分外消旋胺制备手性胺的转氨酶及其编码基因与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种转氨酶应用于拆分外消旋胺制备手 性胺的方法。该酶能利用外消旋胺作为氨基供体，丙酮酸作为氨基受体，在PLP存在下，将外 消旋胺中一个对映体完全转化为酮，剩下另一个未反应的对映体，同时生成副产物丙氨酸。
【背景技术】
[0002] 手性胺类化合物是一类重要的药物合成中间体。近年来，手性制药工业迅速发展 壮大，单一对映体药物每年以大于20%的速度增长，其对手性胺的需求也随之增长。目前， 超过70%的药物都是手性胺及其衍生物，如神经类药物、心血管药物、抗高血压药物、抗感 染药物及疫苗等的合成都是以手性胺作为中间体。因此，找到一种高效制备手性胺的方法 迫在眉睫。制备手性胺的方法主要有两种:化学法和生物法。化学法主要通过化学拆分和化 学合成来制备手性胺，化学拆分法是利用手性胺中的氨基(拆分基团）与纯的旋光化合物 (拆分剂)发生反应从而把一对对映体分成两个非对映体，产生物理性质上的差异，用蒸馏、 结晶、色谱分离等常规的方法将其分离。化学合成法是在手性助剂的帮助下，将底物在一定 的条件下反应转化为手性胺。
[0003] 虽然化学的方法生产手性胺类化合物的工艺已经比较成熟，但是操作过程复杂 (如手性拆分R，S-苯乙胺时，可能需要反复的重结晶)或是需要特殊的手性助剂帮助并且产 物的e. e.值并不高，同时也易对环境造成严重污染。
[0004] 生物法是主要利用转氨酶作为生物催化剂促使化学反应的进行，将底物转化为手 性胺的过程。转氨酶(4111；[1101^3118€6抑86 8,418)是依赖5-磷酸[1比咳醛(？1^>)的一种酶，它在 细胞的氮代谢过程中有着重要的氨基转移作用，并且广泛存在于大自然中。转氨酶催化的 转氨反应由两步反应组成，第一步反应是转醛亚胺过程，酶活性位点上赖氨酸残基上5-磷 酸吡哆醛(PLP)和-NH 2之间的席夫碱被氨基供体和PLP之间的席夫碱所取代形成一个外部 的醛亚胺，释放出来的赖氨酸残基成为以后的催化剂，然后是1，3氢转移到从外部醛亚胺去 质子化的亚胺，得到酮亚胺中间体，再将酮亚胺中间体水解释放氧化产物和5-磷酸吡哆胺 (PMP)。第二步反应包括氨基受体接受氨基生成相应的胺类产品和辅酶再生的过程。
[0005] 生物法以转氨酶为催化剂有着高的选择性和转化率，且反应条件温和，对环境无 污染，对于医药及化工领域手性胺的高效、绿色合成具有重大意义。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在提供一种以转氨酶为催化剂的生物法制备手性胺，具体是一种可拆分 外消旋胺制备手性胺的转氨酶及其编码基因与应用。
[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的：转氨酶，是如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序 列。
[0008] 本发明的另一目的是提供转氨酶的基因，是如SEQ ID N0.2所示的碱基序列。
[0009] 上述转氨酶的制备步骤为：
[0010] S1:将如SEQ ID NO.2所示的转氨酶的基因插入到质粒中得到重组表达载体；
[0011] S2:将所述重组表达载体转移到宿主微生物中得到基因工程菌；
[0012] S3:培养所述基因工程菌得到重组转氨酶，即本发明所述转氨酶。
[0013] 该转氨酶来源于恶臭假单胞菌Pseudomonas putida，其具有的酶学性质为：（a)通 过SDS-PAGE测定的分子量为45-60kDa;(b)酶活最大为3.6U/mg，Km为130.9mM，kcat/km为 0·; (c)与紫色色杆菌Chromobacterium violaceum中获得的CV2025具有的58% 氨基酸序列同源性。
[0014]本发明另一目的是提供所述转氨酶或转氨酶的基因在拆分外消旋胺制备手性胺 中的应用。具体实施时，该应用是在转氨酶、氨基供体、氨基受体以及PLP辅酶存在下，反应 体系中底物外消旋胺的其中一个对映体发生氧化反应生成酮，剩下另一个未反应的对映 体。外消旋胺的拆分是在pH为5.0~11.0的反应体系中实现的。
[0015]优选的，外消旋胺的拆分是在4~60°C的反应体系中实现的。所述反应体系中PLP 辅酶的添加量为〇. 01~1. 〇mM。所述反应体系中底物外消旋胺的添加量为5.0~100.0 mM。
[0016]下面以拆分外消旋苯乙胺(底物)为例来解释本发明所述应用的反应过程:在磷酸 缓冲液中，氨基受体丙酮酸和辅酶PLP存在下，底物外消旋苯乙胺被拆分反应生成苯乙酮， 剩下未反应的R-苯乙胺，同时生产副产物丙氨酸。其转化生成路线如下：
[0018] 式中：PpTA指转氨酶;PLP指5-磷酸吡哆醛。
[0019] 采用本发明所述转氨酶作为催化剂来拆分外消旋胺，与化学法相比，有着高的选 择性和转化率，且反应条件温和，对环境无污染，对于医药及化工领域手性胺的高效、绿色 合成具有重大意义。
【附图说明】
[0020] 图1为PpTA经蛋白纯化后聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。
[0021]图2为PpTA最佳pH研究结果示意图。
[0022]图3为PpTA最适催化温度的研究结果示意图。
[0023]图4为PpTA温度稳定性的研究结果示意图。
[0024]图5为PpTA在一定酶量下，酶活随底物浓度变化的研究结果示意图。
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图，给出本发明的较佳实施例，并予以详细描述。
[0026] SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒（SK8141)购于生工生物工程(上海)股份有限公 司。SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒（SK8192)购于生工生物工程(上海）股份有限公 司；PCR扩增试剂dNTP，Buf f er，Taq酶购于生工生物工程(上海)股份有限公司；限制性内切 酶BamHI、XhoI购于Takara;连接酶和ligation buffer购于SCIENTIFIC;PCR引物购于生工 生物工程(上海)股份有限公司；DNA上样缓冲液，DNA标准分子量Marker购于生工生物工程 (上海)股份有限公司；蛋白双染色Marker购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0027] 下列实施中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
[0028] 1.在本发明的下述实施例中，使用的大肠杆菌培养基配制方法如下：
[0029] (1)LB 培养基
[0030] 1L的LB液体培养基中加入10.0g NaCl，10.0g胰蛋白胨，5.0g酵母浸粉，定容到1L 后，用pH计检测其pH，一般显酸性，然后用5mol/L的NaOH慢慢调节pH至7.0。若是配置固体培 养基，可在配好的液体培养基的基础上，按1.5 %的含量加入琼脂粉。密封好后，用高压蒸汽 灭菌锅在121°C下，灭菌30min，待冷却后放在4 °C低温冰箱中保存待用。
[0031] (2)TB 培养基
[0032]将下列组分溶解在0.9L水中：胰蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。将各组分溶 解后高压灭菌。冷却到60°C，再加入100mL灭过菌的磷酸缓冲液(2.31g的KH2P〇4和12.54g的 K2HPO4溶于 100mL水中。）。
[0033] 2.底物苯乙胺和产物苯乙酮含量的检测方法:将反应液加氯化钠到饱和，用等体 积含有内标(十二烷）乙酸乙酯进行萃取，取有机相用无水硫酸钠干燥，在气相色谱仪上进 行分析，在进样口 250 °C，柱温120 °C，检测器250 °C下进行检测。
[0034]实验例1转氨酶基因的筛选和分析
[0035] 通过对NCBI基因数据库进行筛选和分析，确定在恶臭假单胞菌Pseudomonas putida基因组中与紫色色杆菌Chromobacterium violaceumCV2025转氨酶具有较高同源性 的蛋白基因序列为候选研究对象，基因序列SEQ ID N0.2所示。
[0036] 实验例2重组表达载体pET28a_PpTA构建
[0037]根据基因序列（P p T A )设计引物，P p T A基因上游引物为 C G C G G A T C CATGAGTGAAAAGAATTCGCAGACC，下游弓| 物为 CCCCTCGAGTCAGCGGACAGCTTCGTAGGTCAGG;引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 下划线部分为BamHI和Xhol酶切位点。再以恶臭假单胞菌Pseudomonas putida基因组为模 板PCR扩增得到PpTA基因，琼脂糖凝胶电泳结果表明扩增得到的基因大小与理论值一致。将 回收的PpTA基因和pET28a，用限制性内切酶BamHI和Xho I在37 °C水浴中酶切2小时，经纯化 回收的目的片段与质粒在T4连接酶的作用下室温过夜连接，得到重组表达载体pET28a-PpTA。将重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中，在含有卡纳抗性的平板 上对阳性重组体进行筛选，挑取单菌落PCR验证挑选阳性子。
[0038]可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中制得所述重组表达转化体。 所述宿主微生物可以是本领域的各种常见宿主微生物，只要该微生物可以稳定的自行复制 重组表达载体，且能有效的表达所携带的本发明的PpTA基因即可。本发明优选大肠杆菌，更 优选大肠杆菌BL21(DE3)。
[0039]实验例3大肠杆菌重组PpTA的表达及纯化
[0040]所述的培养重组表达转化体中所用的培养基可以是本领域内常规的任何可使转 化体生长并且产生本发明PpTA的培养基，对于大肠杆菌接种时优选LB培养基，扩培时优选 TB培养基。培养方法和培养条件没有特殊限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不 同按本领域普通知识进行选择，只要能使转化体生长并且产生本发明PpTA即可。其他培养 转化体具体操作均可按本领域常规操作进行。
[0041]对于大肠杆菌菌株本发明选用下述方法:将实施例2中构建好的菌株，接种至含卡 纳的LB培养基中，37°C180r振荡培养8h，按2%的接种量接入装有50mL TB培养基的摇瓶中， 37°C 180r培养，当培养液的0D6Q()达到0.6时加入终浓度为0.1 mM的IPTG，20°C，180r诱导12h。 4°C，8000r离心5min收集菌体，用100mM pH为7.0的磷酸钠缓冲液洗涤两次。将获得的菌体 用100mM pH为7.0的磷酸钠缓冲液悬浮，冰浴中超声破碎，离心收集上清，即为PpTA的粗酶 液。上清液中的重组蛋白经过镍柱进行纯化，500mM咪唑进行洗脱，获得纯化的PpTA，聚丙烯 酰胺凝胶电泳结果见图1。
[0042]实施例4 PpTA酶活测定
[0043]利用气相色谱仪检测苯乙酮的生成量计算重组转氨酶PpTA的酶活。
[0044] PpTA活力测定方法如下：在lmL体系中，50mM苯乙胺，0 · ImM PLP，50mM丙酮酸钠， 0.1 mM磷酸缓冲液(pH7)，30°C、200r震荡反应lOmin后按苯乙酮含量测定方法进行测定。 [0045] PpTA转氨酶活力单位定义:在上述条件下，lmL转氨酶酶液每分钟转化底物生成1μ mol苯乙酮定义为一个酶活单位(U)。
[0046] 公式:酶活⑶=a/(c · t)
[0047]比活力(U/mg)=酶活/m
[0048] 其中：a:苯乙酮的物质的量(μπιο?)
[0049] t:反应时间(min)
[0050] c:酶的体积(mL)
[0051] m:酶液中蛋白含量(mg)
[0052] 实验例5 PpTA酶学性质
[0053] 接种子液后，在20°C诱导12h，收取菌液后进行细胞超声破碎5min，8000g、4°C离心 5min，取上清粗酶液，测定PpTA酶活，对酶纯化之后进行酶学性质表征。
[0054] (1)ΡρΤΑ 最佳 pH 测定
[0055] 分别取pH为5、6、7、8、9、10、11、12测定PpTA的酶活，绘制酶活随pH的变化曲线，比 较在不同pH值条件下PpTA酶活的大小，确定PpTA的最适催化pH。实验结果如图2所示。
[0056] (2)PpTA最佳温度测定
[0057]分别取温度为20°C、25 °C、30°C、35 °C、40°C、45 °C、50°C，测定PpTA的酶活，绘制酶 活随温度的变化曲线，比较在不同温度条件下PpTA酶活的大小，确定PpTA的最适催化温度。 实验结果如图3所示。
[0058] (3)PpTA温度稳定性
[0059] 分别取温度为冰浴，4°C、20°C、30°C、40°C、50°C、60°C，在相应温度下放置2h后，测 定PpTA残余的酶活，绘制酶活随温度的变化曲线，确定PpTA的温度稳定性。实验结果如图4 所示。
[0060] (4)不同底物浓度对PpTA酶活影响测定
[0061 ]分别取底物苯乙胺的浓度为 5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、 90mM、100mM，测定PpTA的酶活，制作酶活随底物浓度的变化曲线，比较在不同底物条件下 PpTA酶活的大小。实验结果如图5所示。
[0062]实验例6 PpTA拆分外消旋苯乙胺的转化率及e.e.值测定 [0063] 标准反应体系为1 mL的10OmM pH8.0的磷酸钾缓冲液，含有5OmM外消旋苯乙胺， 0 · ImM PLP，50mM丙酮酸钠，1 · 0-3 · OU/mL PpTA酶液。反应液置于1 · 5mL离心管中，30 °C，200r 振荡反应〇-24h，隔不同时间进行取样测定反应体系中苯乙酮的含量。取反应液500yL，加氯 化钠到饱和，用等体积乙酸乙酯进行萃取，充分震荡混匀后，12000r离心5min，取有机相用 无水硫酸钠干燥，用气相色谱仪测定苯乙酮的含量，以4-二甲氨基吡啶在醋酸酐中的浓度 为50mg/mL为衍生剂，同时在40°C、700r下衍生有机相，再与饱和氯化胺溶液混合均匀后离 心，取有机相，无水硫酸钠干燥后用于气相色谱仪测定底物e.e.值。实验结果如表1所示。 [0064]实验例7 PpTA拆分外消旋1-甲基-3-苯基丙胺的转化率及e.e.值测定 [0065] 标准反应体系为lmL的100mM pH8.0的磷酸钾缓冲液，含有10mM 1-甲基-3-苯基丙 胺，0.1 mM PLP，1 OmM丙酮酸钠，4U/mLPpTA。反应液置于1.5mL离心管中，30°C，200r振荡反应 0-24h，隔不同时间进行取样测定转化率和e.e.值。实验结果如表1所示。
[0066]实施例8 PpTA拆分外消旋苯甘氨醇的转化率及e.e.值测定 [0067]标准反应体系为lmL的100mM pH8.0的磷酸钾缓冲液，含有5mM外消旋苯甘氨醇， O.lmM PLP，10mM丙酮酸，4U/mLPpTA。反应液置于1.5mL离心管中，30°C，200r振荡反应0-24h，隔不同时间进行取样测定转化率和e. e.实验结果如表1所示。
[0068]实施例9 PpTA拆分外消旋1-氨基茚满的转化率及e.e.值测定
[0069] 标准反应体系为lmL的100mM pH8.0的磷酸钾缓冲液，含有10mM外消1-氨基茚满， O.lmM PLP，10mM丙酮酸，4U/mLPpTA。反应液置于1.5mL离心管中，30°C，200r振荡反应0-24h，隔不同时间进行取样测定转化率和e. e.实验结果如表1所示。
[0070] 实施例10 PpTA拆分外消旋1，2，3，4_四氢-1-萘胺的转化率及e.e.值测定
[0071 ] 标准反应体系为lmL的100mM pH8.0的磷酸钾缓冲液，含有5mM外消旋1，2，3，4-四 氢-1-萘胺，〇. ImM PLP，10mM丙酮酸，4U/mLPpTA。反应液置于1.5mL离心管中，30°C，200r振 荡反应0-24h，隔不同时间进行取样测定转化率和e. e.实验结果如表1所示。
[0072]表1. PpTA拆分外消旋手性胺的转化率及e.e.值
[0073]
[0074]表中la:外消旋苯乙胺；lb:外消旋1-甲基-3-苯基丙胺；lc:外消旋苯甘氨醇；Id: 外消旋1_氨基讳满;le:外消旋1,2,3,4-四氢-1-萘胺;上述外消旋胺的结构式如下：
[0076]当然，在本发明的某些实施例中反应体系中PLP辅酶的添加量还可以为O.OlmM、 1.OmM〇
【主权项】
1. 转氨酶，其特征在于，是如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。2. 转氨酶的基因，其特征在于，是如SEQ ID NO.2所示的碱基序列。3. 如权利要求1所述的转氨酶，其特征在于，所述转氨酶来源于恶臭假单胞菌 Pseudomonas putida〇4. 权利要求1或3所述转氨酶或者是权利要求2所述转氨酶的基因在拆分外消旋胺制备 手性胺中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，该应用是在转氨酶、氨基供体、氨基受体以 及PLP辅酶存在下，反应体系中底物外消旋胺的其中一个对映体发生氧化反应生成酮，剩下 另一个未反应的对映体。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，外消旋胺的拆分是在pH为5.0~11.0的反 应体系中实现的。7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，外消旋胺的拆分是在4~60°C的反应体系 中实现的。8. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述反应体系中PLP辅酶的添加量为0.01 ~1·0 mM〇9. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述反应体系中底物外消旋胺的添加量为 5.0~100.0 mM〇
【文档编号】C12P13/00GK105969746SQ201610458515
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】张建栋, 范晓军, 武华磊, 张照昱, 常宏宏
【申请人】太原理工大学