用作双重胱天蛋白酶-2/-6抑制剂的新肽及其生物学应用的制作方法

专利名称：：用作双重胱天蛋白酶-2/-6抑制剂的新肽及其生物学应用的制作方法用作双重胱天蛋白酶-2/-6抑制剂的新肽及其生物学应用本发明涉及用作双重胱天蛋白酶-2/胱天蛋白酶-6抑制剂的新肽类。本发明还涉及其生物学应用。所有胱天蛋白酶(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶)均表现出具有在天冬氨酸残基和裂解位点N-末端一般4个连续氨基酸的识别序列后裂解的绝对要求的高度特异性。使用组合手段将它们分类成三个不同的特异性组对Trp-Glu-His-Asp具有优先性的I组(胱天蛋白酶-l，-4，-5);对Asp-Glu-X-Asp具有优先性的11组(胱天蛋白酶-2，-3，-7);和对(Leu/Val)-Glu-X-Asp具有优先性的III组(胱天蛋白酶-6，-8，-9和-IO)。这种特征特异性对细胞凋亡过程而言是决定性的，因为它涉及以有序方式(而非无差别蛋白水解)裂解特定组的蛋白质。基于其在细胞环境中的作用，可以将胱天蛋白酶视为执行(直接裂解在细胞结构、细胞周期调节或信号传导途径中起作用的特异性下游蛋白底物)或起始胱天蛋白酶(作为细胞凋亡途径上游调节物起作用)。由于其在调节细胞凋亡中的中枢作用，所以胱天蛋白酶为重要的治疗靶标。多种神经疾病与胱天蛋白酶细胞凋亡途径相关并且已经证实某些小的胱天蛋白酶抑制剂可阻断神经元细胞死亡效应。作为癌症和神经变性疾病治疗所期望的，胱天蛋白酶的受控活化更难以实现。可能的策略可以包括设计特异性抑制指定病理环境中的必需胱天蛋白酶而非所有胱天蛋白酶的化合物。发现胱天蛋白酶-2作为第一种哺乳动物细胞凋亡的胱天蛋白酶。近期研究揭示出胱天蛋白酶-2作为起始物参与非神经元细胞细胞凋亡的外在和内在途径(Lassus等，2002)。另外，胱天蛋白酶-2既作为默认起始物起作用，又作为默认执行胱天蛋白酶起作用。近来，本发明者证实胱天蛋白酶-2启动原代皮质神经元即部分模拟体内脑缺血的体外模型中血清剥夺所诱导的细胞凋亡(Chauvier等，2005)。胱天蛋白酶-2还能够裂解亨廷顿蛋白，由此可能参与亨廷顿疾病的发病机制。其底物特异性尚未完全了解，并且仅获得了基于两种五肽VDVAD和LDESD的抑制剂。胱天蛋白酶-6涉及神经元(发育)细胞死亡并且是执行胱天蛋白酶而非起始物。存在至少4种病理学情况，已知胱天蛋白酶-6在其中被活化在阿尔茨海默病的营养不良的神经突和神经原纤维缠结中；在人胎儿和成年人脑缺血过程中(Guo等，2004);在提示对于癫痫发生和癫痫的作用的大鼠红藻氨酸癫痫发作模型中；在胃肠内衬上皮细胞的失巢凋亡中。对胱天蛋白酶-6底物特异性了解不足。获得了基于四肽VEI(或H)D的抑制剂，但是未获得用于胱天蛋白酶-6抑制的基于五肽的抑制剂。I/发明领域本发明属于分子建模、医学生物学和化学领域，并且涉及新化合物和包含所述化合物的药物组合物，它们抑制促细胞凋亡性胱天蛋白酶-2(Nedd-2;Ich-l)和/或抑制促细胞凋亡性胱天蛋白酶-6(Mch2)并且用于治疗涉及胱天蛋白酶-2活性和/或胱天蛋白酶-6的疾病和损伤。本发明涉及具有选自下组的核心序列的新肽类SEQIDN°1:VDEADSEQIDN。2:LDEGDSEQIDN°3:VDEGDSE(JIDN°4:VDESDSEQIDN°5:LDEKDSEQIDN°6:FDESDSEQIDN°7:LDEAD。所述的肽类有利地具有N-末端和/或C-末端保护基。按照本发明的一个实施方案，所述的肽类具有N-末端保护基M，其表示A-(CH2)nl，其中.nl=0-20;.当nl-O时，M为H;.A为C1-C20烷基、一个或几个稠合环和/或杂环；.当不为H，并且当nl大于2时，A为饱和或不饱和的并且任选被一个或几个基团取代，所述的基团诸如为H、0H、0Ra、(CH2)nlOH、(CH2)nlORa、COOH、C00Ra、(CH2)nlC00H、(CH2)nlC00Ra、C广C3烷基或环烷基、(CH丄广烷基、CO-NH-烷基、Ar、(CH丄广Ar、CO-NH-Ar、卣素、CF3、S03H、(CH2)xP03H2,B(0H)2、N02、S0萬、S02NHRa;其中x=0,1或2;Ra为d-C3烷基并且Ar为任选取代的芳基或杂芳基；或.A为一个或几个氨基酸残基；或.A表示发色、荧光、发光、吸收(UV至近IR)基团；放射性同位素；金属粒子，诸如用于电子显微镜检查的金属粒子；比色基团；生物素/链審抗生物素/neutravidin标记系统；或类似物。按照可选与上述披露的实施方案联用的另一个实施方案，本发明的肽类具有羰基(carbony)，其中X为H或羧基保护基，所述的羧基保护基选自下组0Rb、NHRb、SRb、CH20Rb、CH2NHRb、CH2SRb、CH肌和CH2Y,其中Rb-酰基、烷基、取代的烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基或杂芳基，其任选与一个或几个环和/或杂环稠合；C1-C20取代或未被取代的脂族基团、芳烷基碳环、烷基碳环或杂环基，其任选与一个或几个芳族或非芳族环稠合，并且Y为卣原子(F、Cl、Br或I)或N02，或X表示发色、荧光、发光、吸收(UV至近IR)基团、放射性同位素诸如用于电子显微镜检查的金属粒子、比色基团、生物素/链霉抗生物素/neutravidin标记系统或类似物。正如通过实施例解释的，上述披露的肽类特别具有对胱天蛋白酶-2和/或-6活性的抑制剂特性。本发明由此还涉及其作为抑制剂用于预防或阻断细胞死亡，特别是神经元、神经元细胞或非神经元细胞中胱天蛋白酶-2活性的应用。此外，本发明的肽类具有高度无害性。通过在成年Swiss小鼠中iv或ip注射100mg/kg未观察到毒性。所述的特性有利地用于药物组合物。本发明还涉及包含治疗有效量的至少一种诸如上述定义的肽或胱天蛋白酶-2和/或-6抑制剂与药学上可接受的载体的药物组合物。所述的药物组合物采用适合于通过口服、鼻部、局部(例如皮下、脑室内、大脑内植入浸渍了化合物或药物组合物的材料、大脑内植入机械递送装置)或全身(例如腹膜内、静脉内….)给药以减少细胞死亡的形式。以适合于所治疗的病理学情况和患者年龄的剂量给予本发明的组合物。所述的剂量特别为l(Tmg-lOOg/Kg，尤其是0.1-10mg/kg。这类剂量可有效地治疗新生儿(足月分娩)、儿童、成年人的总体缺血。可以通过口服途径或通过ip、iv或皮下注射(1次或几次)给予它们。所述的药物组合物特别用于治疗病理情况，包括缺氧-缺血(H-1)H-I(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)损伤和中风样情况(例如脑、肾、心力衰竭)；病理情况，包括脑缺氧-缺血(H-I)(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)损伤和中风样情况(例如脑、肾、心力衰竭)；神经元死亡，特别是在总体性或局部性H-I(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)损伤和中风样情况(例如脑、肾、心力衰竭)中；.神经元死亡，特别是在成年人、胎儿或围产期H-I(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)损伤和中风样情况(例如脑、肾、心力衰竭)中；.神经元死亡，特别是暂时性或永久性H-I(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)损伤和中风样情况(例如脑、肾、心力衰竭)中；.神经元死亡，特别是H-I(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)损伤和中风样情况，存在或不存在再灌注情况的脑损伤(例如脑、肾、心力衰竭)；.神经元死亡，特别是在成年人、胎儿或围产期H-I中的大脑中动脉闭塞(MCA0)中；.神经元死亡，特别是当合并下列病理事件的至少一种或多种时存在或不存在再灌注的总体或局部、暂时性或永久性、成年人或胎儿或围产期H-I(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)，在脑水平上或在整体水平上；.神经元死亡，特别是在脑损伤后的至少一种或多种情况时；.神经元死亡，特别是在围产期脑损伤后的至少一种或多种情况时。更具体地说(a)本发明涉及五肽-胱天蛋白酶-2蛋白质复合物的分子对接，所述的复合物使得能够(i)鉴定提供与胱天蛋白酶-2接触所需的氨基酸残基和(ii)确定这些序列与胱天蛋白酶-2之间相互作用的性质。(b)本发明涉及获得新的五肽序列/基于它们的抑制剂，其诱导与胱天蛋白酶-2的可逆或不可逆复合物形成(即具有更低的最小能量)，由此产生对胱天蛋白酶-2活性的实验性抑制。(c)本发明涉及获得第一种五肽序列/基于五肽的化合物，其抑制胱天蛋白酶-2和胱天蛋白酶-6活性，但不抑制其它胱天蛋白酶或蛋白酶(需钙蛋白酶，粒酶B)。(d)本发明涉及获得第一种五肽序列或基于五肽的化合物，其导致胱天蛋白酶-6抑制。(e)本发明涉及获得第一种五肽序列或基于五肽的化合物，其以相似剂量范围抑制胱天蛋白酶-2和胱天蛋白酶-6活性。(f)可以通过组合分子对接和功能性裂解体外试验而对新的胱天蛋白酶-2抑制剂进行合理设计。(g)在一种非限制性实施方案中，可以将这些序列合并到在其N-末端的甲基丙二酰衍生物、喹啉基衍生物。在一种非限制性实施方案中，可以将离核体如2,6-二氟苯基酯、2，6-二氟苯氧基、2-溴苯甲酰氧基、氟添加到羧基末端位置上。在一种非限制性实施方案中，氨基酸侧链可包含保护基，诸如甲基，以便改善细胞渗透性和保留。基于先前的数据，这类五肽序列/相关化合物为抑制体外缺血性神经元细胞死亡(尤其是细胞凋亡，Chauvier等，2005)和体内病理学情况包括脑(缺氧-)缺血性损伤(局部暂时性围产期H-1或MCA0(大脑中动脉闭塞)FR专利申请0306190和W02004/103389;TheraptosisSA)的精确模板。(h)本发明涉及如下发现新的胱天蛋白酶-2抑制剂预防或减少体内病理学情况中的脑细胞死亡，所述病理学情况包括心脏停搏或心血管损伤过程中血流减少/缺氧后成年人全脑缺血。(i)本发明涉及新的胱天蛋白酶抑制剂的新的应用，包括局部(例如脑室内、海马内……)递送或全身(腹膜内、静脉内….)给药以便减少病理学情况过程中的脑细胞死亡，在所述的病理学情况中，血流和氧压受到扰乱，即脑(暂时性或永久性)局部或总体缺血。(j)本发明涉及治疗存在细胞死亡的病理学情况，特别是缺血和中风性损伤的方法，包括给予治疗有效剂量的诸如上述定义的药物组合物。(k)包含有效量的本发明肽类的药物组合物特别用于预防、减少和治疗存在细胞死亡的病理情况，特别是在H-I损伤和中风样情况的脑损伤中例如总体或局部的暂时或永久性成年人、胎儿、围产期H-I(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)，其源自脑或心脏水平，存在或不存在再灌注；或MCAO(大脑中动脉闭塞)。本发明的具体特征和优点在下列数据中给出并且参照附图1-17,这些附图分别表示-附图l:本发明胱天蛋白酶-2抑制剂的结构；-附图2:胱天蛋白酶-2活性部位上的化合物i(Ac-LDESD-cho);—附图3:Ac-LDESD-cho1_的结构和某些残基和官能团；-附图4:胱天蛋白酶-2活性部位上Ac-LDESD-cho]_和Ac-LDEAD-choH的重叠；-附图5:胱天蛋白酶-2活性部位上Ac-LDESD-choL和Qco-VDVAD-choH的重叠；-附图6:胱天蛋白酶-2活性部位上Ac-LDESD-cho1_和Ac-LDEAD-choH的重叠；-附图7:胱天蛋白酶-2活性部位上Ac-LDESD-cho匕和Ac-LDEKD-choH的重叠；—附图8:新设计的五肽抑制剂对人重组胱天蛋白酶-2的抑制曲线；—附图9:本发明五肽抑制剂对人重组胱天蛋白酶-2抑制作用的三种典型模式；—附图10:胱天蛋白酶-2抑制的实验推定(IC50以nM计)，-附图11:Ac-VDVAD-cho的抑制i脊；-附图12:Ac-LDEAD-cho的抑制镨；—附图13:Ac-VDEAD-cho的抑制谦；一附图14:新设计的五肽抑制剂对重组需钩蛋白酶I和II的抑制谱；—附图15:新设计的五肽抑制剂对重组粒酶B的抑制谱；—附图16:SEQ8对胱天蛋白酶-2的体外抑制；-附图17:当缺血后l小时i.p.给药时SEQ8使得新生儿缺血性脑损伤的梗塞体积减小(48小时)。11/序列和胱天蛋白酶-2抑制剂的合理设计11-1/胱天蛋白酶-2-抑制剂复合物相当于蛋白质数据库的结构lpyo(Schweizer等，2003)。以不带电荷形式在介电常数为1时研究所有模型。通过Accelrys的Biopolymer模块(SanDiego，CA)手动修饰抑制剂。固定酶原子并且使用2000个步骤的接合梯度，应用Discover模块使该抑制剂最小化，直到RMS<0.0001Kcal/mol.A。使用InsightII模块计算非共价能值(范德瓦耳斯能和库仑能)。11-2/结果和讨论附图1显示通过使用上述方法进行分子建模研究的一系列化合物。这些化合物抑制胱天蛋白酶-2酶的功效的特征在于相应酶-抑制剂复合物的最低能量(Ucal/mo1)(附图1)。该能量由两种成分组成(i)因抑制剂与酶残基之间的氢键和盐桥所致的电或库仑成分(E库仑)5(U)因抑制剂与酶之间的范德瓦耳斯相互作用产生的排斥-吸引(E范德瓦耳斯)。附图2显示胱天蛋白酶-2活性部位上的参考分子Ac-LDESD-choi。正如所示的，将这种五肽的原子表示如下(a)绿色-碳；(b)白色=氢；(c)蓝色=氮；(d)红色=氧。这种抑制剂与胱天蛋白酶-2之间的电相互作用(氢键和盐桥)由绿色虚线表示。在该附图中，与抑制剂1_发生相互作用的酶残基用黄色表示并且那些不与抑制剂发生相互作用的酶残基用红紫色表示。抑制剂残基由其1字母密码随后是表明其在抑制剂序列中的位置的数字表示。还显示了第一个残基上的氨基的保护。为清楚目的，未在附图1中显示范德瓦耳斯互作用。在全文中将相同的条理用于表示其它新设计的五肽抑制剂与胱天蛋白酶-2酶之间形成的复合物。正如附图2中所示，使Ac-LDESD-cho1_与胱天蛋白酶-2活性部位之间的复合物稳定的氬鍵和盐桥如下Ll(mO-TB233(OH)，L1(C0)-TB233(NH)，D2(NH)-YB273(CO)，D2(0&)-YB273(NH)，D2(0&)-WB238(巧I咮)和NB232(NH2)，E3(NH)-RB231(CO)，E3(0&)-RB231(胍，盐桥)，E3(C0)-RB231(NH)，D5(NH)-AB229(CO)，D5(0&)-QA153(NH》和RA54(NH2)，D5(0&)-RB231(胍，盐桥)和RA54(胍，盐桥)，D5(C0)-CA155(NH)和HA112(咪唑)和GA113(NH)。用于设计残基的命名、残基侧链的氧原子和第一个残基的氨基保护如附图3所示。将所研究的每种化合物抑制胱天蛋白酶-2酶的能力与在所用模型中表现出-76.6Kcal/mol最低能量(Ein)的参照五肽Ac-LDESD-choL进行比较。由此可以从本发明者的工作中推导出下列结论。〃絲f换Ll被VI置换(Ac-VDESD-cho2，Erain--101.2Kcal/mol)使得抑制剂-胱天蛋白酶-2复合物的稳定性更好。该抑制剂的功效在S4被下列残基置换时甚至更大(i)K4(Ac-LDEKD-choH，Emin=-101.2Kcal/mol);(ii)A4(Ac-LDEAD-cho，化合物M，Enin=-133.7Kcal/mol);或(iii)G4(Ac-LDEGD-cho，化合物Enin=-135.0kcal/mole)。这些观察结果由此证实化合物2，11，H和1L为比参照化合物i(Ac-LDESD-cho)更好的胱天蛋白酶-2抑制剂。附图4显示在胱天蛋白酶-2活性部位中化合物L和11(Ac-LDEAD-cho)的重叠。将化合物M(Emin=-113.2Kcal/mol,Ll被VI置换且S4被A4置换，Ac-VDEAD-cho)与化合物2(E^=-101.2Kcal/mo1，Ll被VI置换，Ac-VDESD-cho)比较显示，在4位上丙氨酸(A4)比丝氨酸(S4)使得酶-抑制剂复合物更好的稳定。使用化合物|(EninE-85.4kcal/mole，Ll被VI置换，E3被V3置换且S4被A4置换，Ac-VDVAD-cho)和l--113.2Kca1/mo1，Ll被VI置换且S4被A4置换，Ac-VDEAD-cho)获得的结果表明谷氨酸(E3)能够使得胱天蛋白酶-2稳定优于3位上为缬氨酸(V3)。此外，将化合物l(Ein=-97.2Kcal/mo1，Ll被Fl置换，Ac-FDESD-cho)与l(Enin=-128.6Kcal/mol,Ac-LDESD-cho)比较显示在1位上为亮氨酸(Ll)使得酶-抑制剂复合物稳定优于苯丙氨酸(F1)残基。此外，在所有所研究的化合物中，D2和/或D5被其它氨基酸置换显示出抑制剂-胱天蛋白酶-2复合物的最低能量(Ein)大大增加(结果未显示)，从而表明这两种残基必须在新设计的胱天蛋白酶-2抑制剂中保持不变。？/岸一个戎差W我差保^为了鉴定胱天蛋白酶-2酶的更有效抑制剂，研究了第一个残基的氨基官能基的不同保护基对抑制剂-酶复合物稳定性的作用。为了这一目的，使用所用的4种不同五肽序列LDESD、VDVAD、LDEAD和VDEAD。结果如下所示(在文件的最后定义所用的缩写)广WZ/^5^系/厶胱天蛋白酶-2酶与化合物i(Ac-LDESD-cho，Enin=-76.6Kcal/mol)，^(Qop-LDESD-cho，Efflin--8.3Kcal/mol)，!(Suc-LDESD-cho，Emin=-85.7Kcal/mol),，a卜LDESD-cho，Enin=-128.6Kcal/mol),互(Qmal-LDESD-cho，E"=-53.8kcal/mole)或^!(0xa-LDESD-cho，Enin=-9.5Kcal/mol)之间形成的复合物显示出(i)琥珀酰(Sue)和丙二酰(Mai)基团使得能够远比乙酰基更好地抑制胱天蛋白酶-2酶；(ii)3-氧代-3-喹啉基丙酰基(Qop)、3-(2-喹啉基)丙二酰基(Qma1)和草酰基(Oxa)导致形成的酶-抑制剂复合物的稳定性比乙酰基低。0,raWZ,/y。胱天蛋白酶-2与化合物，(Ac-VDVAD-cho，Ein=-85.4Kcal/mol),^(Qop-VDVAD-cho，Erain--14.2Kcal/mol),M(Mal-VDVAD-cho，Enin=-134,9Kcal/mol),U(Suc-VDVAD-cho，Enin=-91.9Kcal/mol)，U(Qmal-VDVAD-cho，Ein=—59.0Kcal/mol),U(Qco-VDVAD-cho，Ein=+38.0Kcal/mol附图5)，n(Bz-VDVAD-cho，Enin--4.8Kcal/mol),U(Z-雷AD-cho，Emin--31.8Kcal/mol),li(Hxa-VDVAD-cho，Erain=-59.0Kcal/mol)和H(雨AD-cho,Erain=-32.0kcal/mol)之间形成的复合物显示出(i)琥珀酰(Sue)和丙二酰(Mai)基团比乙酰基导致形成更稳定性的酶-抑制剂复合物且由此对胱天蛋白酶-2的抑制更好；(ii)3-氧代-3-喹啉基丙酰基(Qop)、2-喹啉基丙二酰基(Qmal)、2-喹淋基羰基(Qco)、苯甲酰基(Bz)和己酰基(Hxa)导致抑制剂的功效低于乙酰基。正如使用未被保护的五肽H所证实的，第一个残基上缺乏保护还导致形成的酶-抑制剂复合物的稳定性较低。应注意是在酶的原子固定情况下实现对接。这可以解释对2-喹啉基羰基化合物U，^和ll的最低能量观察到的正值。表1.某些抑制剂-胱天蛋白酶-2复合物的最低能量(Kcal/mo1)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>该系列化合物还表明，Qco-VDVAD-cho13表现出作为胱天蛋白酶-2酶抑制剂的功效较低。实际上，正如上文表l中所示，当化合物i被化合物il替换时，Enin的电(E库仑)和疏水性(E范德瓦耳斯)成分均增加。下表2和3显示不同残基(V1，D2，V3，A4和D5)和保护基(乙酰基和2-喹啉基羰基)对抑制剂-胱天蛋白酶-2复合物稳定的促进。这些结果表明乙酰基被2-奮啉基羰基置换(表3)导致-1位上的缬氨酸(Vl)与胱天蛋白酶-2活性部位之间的相互作用较弱；-保护基的羰基(O0)官能团与酶之间的相互作用较弱；-酶-抑制剂复合物因位阻的2-会啉基羰基而不稳定。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>经证实实验室中合成的Qco-VDVAD-CH20(2,6-二氟苯基)为胱天蛋白酶-2的有效抑制剂(IC5=80nM)。这表明在形成酶-抑制剂复合物的过程中可能存在酶的调节以便诱导抑制剂更好地适合于胱天蛋白酶-2活性部位。另一种解释可能为这种类型的化合物结合入酶上的变构部位(另外参见化合物U，ll和ll，附图l)。将进行使用未固定的胱天蛋白酶-2残基的额外研究以便获得对Qco-VDVAD-CH20(2，6-二氟苯基)观察到的生物学结果的洞察。ZZ^4"-/厶对化合物H(Ac-LDEAD-cho，Emin=-133.7kcal/mole),U(Mal-LDEAD-cho，Enin=-179.2Kcal/mol)，i^(Memal-LDEAD-cho，Emin=-145.9Kcal/mol),^(Mac-LDEAD-cho，Emin=-97.6Kcal/mol)和li(Ps-LDEAD-cho，Enin--71.6Kcal/mol)的研究进一步证实了丙二酰基(Mal)和3-甲基丙二酰基(Memal)比乙酰基使酶-抑制剂复合物稳定性更好。该系列还显示出3-甲氧基乙酰基(Mac)和苯基磺酰基(Ps)产生的抑制剂有效性比乙酰基所产生的低。f刃ra^/#/{/。使用化合物^((Ac-VDEAD-cho，Emin=-113.2kcal/mole)和21(Memal-VDEAD-cho，Enin=-126.1Kcal/mol)获得的结果进一步证实3-曱基丙二酰基(Memal)比乙酰基产生了更有效的抑制剂。班絲麟费为了研究D5残基构型对抑制胱天蛋白酶-2的作用，还研究了化合物M(d5，Emin=+65.5Kcal/mole)。将由此观察到的最低能量(Erain)与化合物U(Emin=+38.0Kcal/mol)和化合物l￡(d5，Ein=+65.5Kcal/mol)比较清楚地表明5位上的少构型导致抑制剂的功效降低。这一结果通过比较酶与化合物M(Ac-LDEAD-cho，Erain=-133.7kcal/mole)和化合物li(Ac-LDEAd-cho,Enin=-107.8Kcal/mol)之间形成的复合物的能量而得以证实。实际上，正如附图6中所示，化合物ll与酶之间形成的复合物会丧失D5羰基与胱天蛋白酶-2半胱氨酸A155残基的巯基之间的C-S共价鍵。此外，该天冬氨酸残基的側链与酶之间的氢键会丧失。4/减凝辨农类使用化合物ll(Z-VAD-cho，Erain=-7.6Kcal/mol)和H(Z-VD-choEmin=+66.6Kcal/mol)获得的结果表明这些截短的肽类为有效性较低的胱天蛋白酶-2抑制剂。II-3/结论这种对新胱天蛋白酶-2抑制剂的搜寻显示(a)VDVAD序列产生了比LDESD序列稍更有效的胱天蛋白酶-2抑制剂(对比化合物1_和1，1和2,l和ii，l和j^，i和U)。(b)LDEAD，LDEGD和LDEKD序列产生了比VDVAD序列更有效的胱天蛋白酶-2抑制剂(对比化合物i与ii，li与U,l与&，和l与iy。(c)VDESD(参见化合物2)和VDEAD(参见化合物1序列提供了优于VDVAD序列的胱天蛋白酶-2酶抑制剂。Z/婆洽逸举和放射'胜标记本研究清楚地证实胱天蛋白酶-2活性部位可以适应五肽抑制剂4位上的不同残基。例如，在化合物1L中，如附图7中所示，这通过将赖氨酸残基(K4)侧链定位在酶活性部位外部来实现。在这种情况中形成的高度稳定的复合物(化合物II,在4位上的丝氨酸被赖氨酸置换)表明，荧光发色团(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明和AlexaFluor)或生物素可以被引入该位置，由此能够在生物系统中对这些五肽抑制剂进行路由选择。这种胱天蛋白酶-2酶容纳在4位上几种残基的能力还表明，在该位置上可以引入离代苯丙氨酸或酪氨酸残基以便进行放射性标记。J/f^iJ:天冬扇^的^藝用于合成化合物i(附图l)的醛或甲基酮类似物的常规操作步骤有时产生D5残基的差向异构化。形成的异构体混合物有时难以分离。正如在II-2.3/部分中所示的，由此形成的头差向异构体的功效因该残基与酶之间的氢键和共价相互作用的丧失而低于Z-异构体。4力在丄扇差f雜窗^保^乙酰基被其它保护基置换产生了如下结论和评价(a)2-喹啉基羰基(Qco)表现出导致酶-抑制剂复合物不稳定(参见化合物13，23和30)。这一观察结果并不严格按照使用Qco-VD(0me)VAD(0me)-CH20(2，6-二氟苯基)获得的生物数据，表明诱导的适应机制可能在形成抑制剂-胱天蛋白酶-2复合物的过程中起作用。变构结合也可以解释这种在//w7/co与体外结果之间观察到的差异。(b)在所研究的保护基中，丙二酰基(Mal)表现出导致对胱天蛋白酶-2的抑制远优于其它基团(参见化合物11，Erain=-179.2Kcal/mo1)。此外，3-甲基丙二酰基(Memal,化合物16，Erain--145.9Kca1/mo1)也表现出产生高度稳定的酶-五肽复合物。如果诸如H这类化合物可以被酯酶水解成相应的衍生物11，此后与胱天蛋白酶-2活性部位结合，那么甚至可以观察到更有效的抑制作用。因此，极大的注意力会集中在这种Mema1基团用于设计新胱天蛋白酶-2抑制剂。J/-义J/席去差时逸举为了研究离去基对这些抑制剂功效的作用，合成并且在不同生物系统中评价了在D5残基上具有不同离核体的五肽类。根据其理化特性及其报导的生物特性诸如毒性和细胞渗透性和保留性选择这些离去基。这些选择的抑制剂由此具有通式32:其中(i)GP如上述对M所定义且特别-保护基，诸如丙二酰基、甲基丙二酰基、2-会啉基羰基、琥珀酰基、曱基琥珀酰基、乙酰基、2-喹啉基丙二酰基；杂环，诸如取代或未被取代的四氢喹啉、四氢异喹啉、二氢吖啶、苯并吖庚因、吡咯烷、吗啉、硫代吗啉、哌溱、哌咬、二氢吡咬、苯并咪唑、咪唑、咪唑啉、吡咯、吡咯烷、吡咯啉、吡唑啉、吡唑烷、三唑、旅咬、吗啉、减，代吗啉、腺溱、呼唑、吩逸嗪、吩喁嗪、二氢吩嗪、二氢噌啉、二氢喹喔啉、二氢萘啶、四氢萘啶、二氢吖啶、吲哚、异吲哚、二氢吲哚、吲哚满、吲唑、嘌呤、9,10-二氢菲啶、5H-二苯并[b，f]吖庚因、10，11-二氢-5H-二苯并[b，f]吖庚因、p-^啉、吡啶并[4，3-b]吲哚、2，3，9-三氮杂芴、9-硫杂-2，10-二氮杂蒽、噻吩并[3，2b]吡咯、二氢菲、千氧羰基等....；氢原子、Cw。脂族基团、芳基、取代的芳基(实例4-硝基苯基或香豆素衍生物)、杂芳基(实例2-吡啶)、取代的杂芳基、环烷基、萘基、取代的萘基、(CH丄环烷基、(CH丄苯基、(CH丄取代的苯基(实例2，6-二卤代苯基)、(CH丄(l-或2-萘基)、(CH丄杂芳基或(未被)取代的(2-，3-，4-，5-，6-，7-或8-)喹啉基、药甲基；GP还可以为R、U、CO(CH丄歸)、CO(CH2)nS(U),其中U为(未被)取代的(2-，3-，4-，5-,6-，7-或8-)奮啉基、Ch。直链或支链烷基、(CH2)n环烷基、(CH丄苯基、(CH丄取代的苯基、(CH丄(l-或2-萘基)、(CH丄杂芳基、生物素、二硝基苯基(DNP)、碘乙酰胺类、DTNB、C0R(实例2-喹啉基羰基)、C00R、CO(CH2)nNH(Z)、吖啶衍生物(红、黄、橙….)、荧光素衍生物(荧光素、FITC、FAM(羧基荧光素)、5-(和-6)-羧基萘并荧光素、羧基荧光素、BCECF、萘并荧光素(napto荧光素)……)、OregonGreen(2'，7'-二氟荧光素)染料(OregonGreen488，OregonGreen514".)、B0DIPY(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂"-indacene-3-丙酸)染料(B0DIPYFL，B0DIPYTMR，B0DIPYTR，B0DIPY630/650，B0DIPY630/665.....)、Bimane、香豆素衍生物(氨曱基香豆素(AMC)、AMCA、氨基香豆素、二乙氨基香豆素、羟甲基香豆素；羟基香豆素、甲氧基香豆素、AFC、…)、花青苷衍生物(藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白(APC)、CY3.18、CY5.18、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7...)、赤藓素/藻红蛋白衍生物(R-藻红蛋白(PE)、B-藻红蛋白…)、APC/PE-Cy缀合物(PE-Cy5缀合物、PE-Cy7缀合物、APC-Cy7缀合物….)、钓黄绿素衍生物(钙黄绿素、SNAFL钙黄绿素….)、DANS、DANSA、CascadeBlue、Luciferyellow、NBD、Red613、FluorX、若丹明衍生物(若丹明123、若丹明110、若丹明B、若丹明6A、若丹明6G、TRITC、X-若丹明、磺基若丹明、若丹明Red-X、Lissamine若丹明B、DHR、若丹明Green….)、PerCP、德克萨斯红、TruRed、AlexaFluo(AlexaFluor350、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor555、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor633、AlexaFluor647、AlexaFluor660、AlexaFluor680、AlexaFluor700、AlexaFluor750...,)、Q-DOTs7"衍生物(655、605、585、525，…)、SNARF、ZenonTM衍生物(ZenonAlexaFluor350、ZenonAlexaFluor488、ZenonAlexaFluor555、ZenonAlexaFluor594、ZenonAlexaFluor647、Zenon另'J藻蓝蛋白、Zenon生物素-XX、ZenonR-藻红蛋白............);NBD、TexasRed、QSY⑧染料(QSY⑧7、QSY9、QSY35、QSY21)、Hoechst(33342、33258)、DAPI、色霉素A3、普卡霉素、SYTOX(蓝、绿、橙)、乙锭、溴乙锭、7-AAD、TOTO染料、YOYO染料、TO-PRO染料、B0B0染料、JO-PRO染料、L0-PR0染料、P0-PR0染料、Y0-PR0染料、ThiazoleOrange、碘乙锭(PI)、LDS751、Indo⑧染料(Indo-1…)、Fluo⑧染料(Fluo-3".)、DCFH、pNA、SYBR绿II、SyPro(橙、深红)、EDANS、IR800、Dil、DiO、DiD、SNARF⑧衍生物、Fura染料、QUIN染料、NAN0G0LD颗粒、NAN0G0LD马来酰亚胺、AlexaFluorFluoroNANOGOU)、AlexaFluorFluoroNANOGOLD链霉抗生物素、孔雀绿、Dabcyl，Dabsyl、Cascadeyellow、dansyl、Dapoxyl、PyMPO、芘、苯并噍二哇衍生物、链霉抗生物素"Vneutravidin-/生物素-标记的焚光微球、CMNB-笼形链霉抗生物素荧光缀合物、calcofluorwhite、尼罗红、Y66F、Y66H、EBFP、GFP野生型、QFP突变体H9/P4/P9/P11/W、GFPuv、ECFP、Y66W、S65A、S65C、S65L、S65T、EGFP、EYFP、ECFP、DsRedl、DsRed2、NAN0G0LD颗粒、链霉抗生物素-Nanogold、MonomaleidoNanogold、Mono-Sulfo-NHS-Nanogold⑧、MonoaminoNanogold⑧、带正电荷/负电荷的Nanogold(NN、NHSN、NHSNA、NHSNS)、非官能化Nanogold、MonomaleidoNanogold、Mono-Sulfo-NHS-Nanogold⑧、MonoaminoNanogold、非官能Nanogold、Nanogold⑧一缀合物、Nanogold⑧一链霉抗生物素、月旨质-Nanogold(棕榈酰Nanogold、DPPENanogold、棕榈酰Undecagold、DPPEUndecagold)、Ni-NTA-Nanogold⑧、AlexaFluor488FluoroNanogold、AlexaFluor594FluoroNanogold、荧光素FluoroNanogold、HRP底物-Nanogold、比色基团(pNA…)或生物发光底物、放射性同位素……放射性同位素(实例I125、H3、S35、C"、P33、P32、Cr51、Ca45、Fe59、Ni63、Ba133、Cs137，Eu152、Ra226、Xe133、锝99、铊201)。在一种非限制性实施方案中，产荧光部分发射光，将电子转移至受体(FRET)或在裂解后淬灭或对FLIP、FLIM、FRAP技术敏感。(n)X=氢原子、0R、NHR、SR、CH2OR、CH2NHR、CH2SR、CH2OR和CHJ;其中R=酰基、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基和为脂族基团、芳基、芳烷基、碳环基、烷基碳环基或杂环基，Y=卣原子(F、Cl、Br或I)或N2。X还可以为Cw。脂族基团、取代或未被取代的芳基、环烷基、萘基、取代的萘基、2-苯并喁唑基、取代的2-喁唑基、(CH丄环烷基、(CH丄苯基、(CH丄取代的苯基、(CH丄(l-或2-萘基)、(CH丄杂芳基、CH2N2、CH2Y、0H、0R、NH2、NHR、NR2、SR、COR、C02R、CONR2、CH2OCOR、CH20-C0芳基、CH20-C(0)取代的芳基(实例2，6-二甲基苯甲酰氧基甲基)、CH20-C(0)取代的芳基、CH20-C(0)杂芳基、CH20-C(0)取代的杂芳基或CH2OPOR2;其中R-氢原子、Ch。脂族基団、芳基、取代的芳基(实例4-硝基苯基或香豆素衍生物)、杂芳基(实例2-吡啶)、取代的杂芳基、环烷基、萘基、取代的萘基、(CH丄环烷基、(CH丄苯基，(CH丄取代的苯基(实例:2，6-二面代苯基)、(CH丄(l-或2-萘基)、(CH丄杂芳基或(未被)取代的(2-，3-，4-，5-，6-，7-或8-)喹啉基、努甲基。其中Y为负电离去基，包括面素，诸如F、Cl、Br或I;芳基或烷基磺酰氧基、三氟曱磺酰氧基、0R、SR、C00R、0P(0)R2，其中R为脂族基团、芳基、芳烷基、碳环基、烷基碳环基或杂环基；其中X-U为(未被)取代的(2-，3-，4-，5-，6-，7-或8-)喹啉基、d—2。直连或支链烷基、(ClUn环烷基、(CH丄苯基、(CH丄取代的苯基、(CH丄(l-或2-萘基)、(CH丄杂芳基、生物素、二硝基苯基(DNP)、DTNB、吖啶衍生物(红、黄、橙….)、荧光素衍生物(荧光素、FITC、FAM(羧基荧光素)、5-(和-6)-羧基萘并荧光素、羧基荧光素、BCECF、萘并荧光素……)、OregonGreen(2'，7'-二氟荧光素)染料(OregonGreen488、OregonGreen514…)、BODIPY(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-3-丙酸)染料(BODIPYFL，BODIPYTMR、BODIPYTR、BODIPY630/650、BODIPY630/665"...)、Bimane、香豆素衍生物(氨曱基香豆素(AMC)、AMCA、氨基香豆素、二乙氨基香豆素、羟甲基香豆素；羟基香豆素、甲氧基香豆素、AFC、…)、花青苷衍生物(藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白(APC)、CY3.18、CY5.18、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7...)、赤藓素/藻红蛋白衍生物(R-藻红蛋白(PE)、B-藻红蛋白…)、APC/PE-Cy缀合物(PE-Cy5缀合物、PE-Cy7缀合物、APC-Cy7缀合物….)、钙黄绿素衍生物(钙黄绿素、SNAF"丐黄绿素….)、DANS、謹SA、CascadeBlue、Uciferyellow、NBD、Red613、FluorX、若丹明衍生物(若丹明123、若丹明110、若丹明B、若丹明6A、若丹明6G、TRITC、X-若丹明、磺基若丹明、若丹明Red-X、Lissamine若丹明B、DHR，若丹明Green….)、PerCP、德克萨斯红、TruRed、AlexaFluo(AlexaFluor350、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor555、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor633、AlexaFluor647、AlexaFluor660、AlexaFluor680、AlexaFluor700、AlexaFluor750"..)、Q-D0Ts"*衍生物(655、605、585、525，...)、S膽F、Zenon衍生物(ZenonAlexaFluor350、ZenonTMAlexaFluor488、ZenonAlexaFluor555、ZenonAlexaFluor594、ZenonAlexaFluor647、ZenonTM别藻蓝蛋白、ZenonTM生物素-XX、ZenonR—藻红蛋白、...........);NBD、TexasRed、QSY⑧染料(QSY⑧7、QSY9、QSY35、QSY21)、Hoechst(33342、33258)、DAPI、色霉素A3、普卡霉素、SYTOX(蓝、绿、橙)、乙锭、溴乙锭、7-AAD、TOTO染料、YOYO染料、TO-PRO染料、BOBO染料、JO-PRO染料、LO-PRO染料、P0-PR0染料、Y0-PR0染料、ThiazoleOrange、捵丙锭(PI)、LDS751、Indo⑧染料(Indo-l…)、Fluo⑧染料(Fluo-3…)、DCFH、pNA，SYBRgreenII、SyPro(橙，深红)、EDANS、IR800、Dil、DiO、DiD、SNARF砂时生物、Fura染料、QUIN染料、NANOGOLD颗粒、NAN0G0LD马来酰亚胺、AlexaFluorFluoroNANOGOLD、AlexaFluorFluoroMN0G0LD链霉抗生物素、孔雀绿、Dabcyl、Dabsyl、Cascadeyellow、dansyl、Dapoxyl、PyMPO、芘、苯并嚙二唑衍生物、比色基团(pNA…)或生物发光底物、放射性同位素(实例I125、H3、S35、C14、P33、P32、Cr51、Ca"、Fe59、Ni63、Ba133、Cs137、Eu152、Ra226、Xe133、锝99、铊201)。在一种非限制性实施方案中，产荧光部分发射光，将电子转移至受体(FRET)或在裂解后淬灭或对FLIP、FLIM、FRAP技术敏感。(iii)R1，113和R4-天然和非天然氨基酸侧链，每种氨基酸的绝对构型为Z或Z;(iv)R2和R5=氢原子、烷基、取代的烷基、芳基和取代的芳基；(x)n为0-20;除非另作陈述，否则，应使用如本文所用的下列定义。缩写Qco表示喹啉基羰基。本文的术语"脂族"意指完全饱和或含有一个或多个不饱和单元的直链或支链d-2。烃类。术语"烷基"单独使用或作为较大部分的组成部分意指含有l-20个碳原子的直链或支链。术语"芳基"意指带有5-14个原子的单环或多环芳环基团，诸如苯基、萘基或蒽基。术语"杂环基，，意指含有一个或多个杂原子且环大小为3-9的饱和或不饱和多环或单环环系，诸如呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、二氧戊环基、鳴唑基、噻唑基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、吡唑基、吡唑啉基、吡唑烷基、异噍唑基、异噻唑基、鳴二唑基、二喁烷基、吗啉基、二噻烷基、硫代吗啉基、哒唤基、嘧啶基、吡嗪基、哌嗪基、三嗪基、三噻烷基、吲嗪基、吲哚基、异吲哚基、二氢吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、嘌呤基、喹溱基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞溱基、喹唑啉基、喹喔啉基、1，8-萘啶基、蝶啶基、奎宁环基、^"唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基或吩喁嗪基。"杂芳基"意指为芳族的杂环。术语"碳环基"意指3-14个碳的可以与芳基或杂环基稠合的不饱和单环或多环碳环系。脂族基团、烷基、芳基、杂芳基(实例喹啉)、杂环基或碳环基在单独使用或作为较大部分的组成部分时意指取代或未被取代的基团。当取代时，这些基团可以含有一个或多个取代基。这些取代基可以为卤素(F、Cl、Br、I)、0H、U、CO(CH2)nNH(U)、CO(CH2)nS(U)、0R、SR、NH2、NHR、NR2、0C0R、0P(0)R"其中R为月旨族基团、芳基或取代的基团、芳烷基、碳环基、烷基碳环基、杂环基或放射性同位素(实例I125、H3、S35、C"、P33、P32、Cr51、Ca"、Fe59、Ni63、Ba133、Cs137、Eu152、Ra226、Xe133、锝99、铊201)。FITC表示异硫氦酸荧光素。尽管使用肽醛类进行本研究，但是强调采用治疗上可靠的化合物，如曱基酮衍生物或苯氧基衍生物，因为醛类在输送过程中易于降解。此外，这些衍生物表现出-比相应的醛类在代谢上更为稳定；和-产生不可逆的胱天蛋白酶抑制。in/序列和胱天蛋白酶-2抑制剂的功能性验证ni-i/按照下列方案在体外胱天蛋白酶-2裂解试验中比较新设计的抑制剂(Ac-LDEAD-CH0、Ac-VDEAD-CHO.......)与Ac-VDVAD-CHO(附图8)。将人重组胱天蛋白酶(25-50U;QuantiZymeAssaySystem,BI0M0L，Plymouth,Pennsylvania,USA)与抑制剂(0.005-2jjM)在最终100|jl最终试验緩沖液(50mMHEPES，pH7.4，lOOmMNaCl，0.1%CHAPS，10mMDTT，ImMEDTA，10%甘油)中预温育30分钟且然后与200pM产荧光的胱天蛋白酶底物(BIOMOL)Ac-VDVAD-AMC混合。根据剂量响应S形曲线确定相当于可以抑制50%胱天蛋白酶活性的浓度的ICs。值。在371C下2小时后在荧光微量平板读出器上通过在405nm激发后监测510nm处的发射来测定人重组胱天蛋白酶1-10对基于AMC的底物的裂解。111-2/结果和讨论正如通过分子对接和体外胱天蛋白酶试验所测定的，基于LDEAD-和VDEAD-的化合物为推定有效的胱天蛋白酶-2抑制剂，其中对胱天蛋白酶-2的E^值高于通常基于VDVAD-或LDESD-的抑制剂提供的值，而IC5。值低于其提供的值(附图8;表1和4)。其它新设计的基于五肽的胱天蛋白酶-2抑制剂具有高于基于LDEAD-和VDEAD-的化合物的IC5。，但可以认为(根据其ICs。值)是中度(VDESD、VDEGD、LDEKD)或弱(LDEGD、FDESD)的胱天蛋白酶-2抑制剂(附图8和表4)。然而，这些基于五肽的化合物抑制胱天蛋白酶-2的抑制性内在功效还可以根据其相应的抑制曲线确定(表4和附图9):2组涉及基于VDVAD-的抑制剂，具有特征性S形剂量响应；1组涉及在较低剂量下对胱天蛋白酶-2的活性相对高于基于VDVAD-的抑制剂的抑制剂，但它们具有相似的IC50值(LDEAD和VDEAD);3组涉及基于五肽的抑制剂，它们在较低剂量下对胱天蛋白酶-2的活性低于基于VDVAD-的抑制剂，并且表现出较高的ICs。(LDEGD、FDESD、LDESD、LDEKD、VDESD、VDEGD)e因此，这些实验数据提供了如附图9中所示的胱天蛋白酶-2抑制剂的合理设计的一致性(根据肽性胱天蛋白酶抑制剂的P5P4P3P2P1常规命名法)(i)需要D1和D4;(ii)需要V3或D3;对S2或G2的耐受如同P2残基，但V1对L1而言是优选的。在这类情况中，基于LDEAD-和VDEAD-的化合物表现为更有意义的基于五肽的胱天蛋白酶-2抑制剂，因为它们与基于VDVAD的抑制剂相比具有低IC50并且在较低剂量下具有抑制功效。就细胞和体内目的而言，这类序列为在产生如下所述在N和C末端具有修饰的其它嵌合分子中具有巨大意义的模板。表4.新的基于五肽的胱天蛋白酶-2抑制剂的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>IV/序列和抑制剂对胱天蛋白酶-6的功能性验证IV-1/方法按照下列方案在体外裂解试验过程中对一大组胱天蛋白酶(1-10)测试新设计的抑制剂(Ac-LDEAD-CH0、Ac-VDEAD-CHO.......)。将人重组胱天蛋白酶(25-50U;Biomol)与抑制剂(0.005-2yM)在最终IOOjjI最终试验緩沖液(50mMHEPES，pH7.4，100mMNaCl，0.1%CHAPS10mMDTT，lmMEDTA，10%甘油)中预温育30分钟且然后与200jjM其特异性产荧光胱天蛋白酶底物(BIOMOL)(Ac-YVAD-AMC(胱天蛋白酶-l)、Ac-VDVAD-AMC(胱天蛋白酶-2)、Ac-DEVD-AMC(胱天蛋白酶-3/-7)、Ac-VEID-AMC(胱天蛋白酶-6)、Ac-IETD-AMC(胱天蛋白酶-8/-10)、Ac-LEHD-AMC(胱天蛋白酶-9)混合。在37T下2小时后在荧光微量平板读出器上通过在405nm激发后监测510nm处的发射来测定人重组胱天蛋白酶l-10对基于AMC的底物的裂解。IV-2/结果和讨论因为五肽序列与胱天蛋白酶-2的分子对接并不预示对其它胱天蛋白酶的识别和抑制，所以对一组人重组胱天蛋白酶测定了最有效的基于五肽的胱天蛋白酶-2抑制剂(Ac-LDEAD-cho和Ac-VDVEAD-cho)的抑制i普(附图14-16)。增加剂量的常规Ac-VDVAD-cho胱天蛋白酶-2抑制剂并未显示出对其它胱天蛋白酶的高度交叉反应(在高剂量下在低于20%抑制的可接受的阈值范围内)(附图11)。令人意外的是，新的基于LDEAD-和VDEAD-的抑制剂表现出对胱天蛋白酶-6的一定交叉抑制作用(附图15和16)。尽管这些化合物抑制50%的胱天蛋白酶-2活性表现出100nM范围(表4，附图8)，但是它们也能够以较高IC5。抑制胱天蛋白酶-6(附图15和16)，对基于LDEAD-和VDEAD-的化合物而言分别为接近2|jM和0.1-05jjM。VDEAD为比LDEAD更有效的胱天蛋白酶-6抑制剂(附图15和16)。首次描述了基于五肽的胱天蛋白酶-6抑制剂。此外，首次描述了基于五肽的胱天蛋白酶-2和胱天蛋白酶-6双重抑制剂.这些抑制剂表现出对两种胱天蛋白酶即胱天蛋白酶-2和胱天蛋白酶-6的区别敏感性。VDEAD-衍生的化合物能够以接近相似剂量范围以接近相似水平抑制这两种胱天蛋白酶(附图13)。相比之下，LDEAD-衍生的抑制剂可以在对胱天蛋白酶-6活性较低的剂量下抑制胱天蛋白酶-2(附图12)。V/对其它蛋白酶的无交叉反应性V-l/方法另外，对需钾蛋白酶和粒酶B检查新设计的抑制剂的特异性。将人重组需钙蛋白酶1(0.8U)和大鼠重组需钙蛋白酶IH20U)(均来自Biomol)与抑制剂在最终IOOjjI最终试验緩冲液(50mMHEPES，pH7.4，100mMNaCl，0.1%CHAPS，5mMCaCh，lmMEDTA，10%甘油，2mMp-巯基乙醇)中预温育30分钟且然后分别与20pM产荧光的需钙蛋白酶底物I或II(Calbiochem)混合。ALLN和ALLM(lyM)为抑制的内部对照。在37*€下2小时后在荧光微量平板读出器上通过对需钙蛋白酶I在380nm激发后监测460nm处的发射或对需钩蛋白酶II在485nm激发后监测530nm处的发射而测定重组酶对底物的裂解。将人粒酶B(50U;Biomol)与抑制剂在最终100jjl最终粒酶试验緩冲液(Biomol)中预温育10分钟且然后与400jjMAc-IEPD-pNA(Biomol)混合。3,4DCIC(ljjM)用作抑制的阳性对照。在371c下1小时后在分光光度计上在360nm处测定底物的裂解。V-2/结果和讨论基于LDEAD-和VDEAD-的抑制剂(2JJM)并非对其它半胱氨酸蛋白酶需钙蛋白酶I/II的强抑制剂(附图14)。基于LDEAD-和VDEAD-的抑制剂(2JJM)并非其它蛋白酶粒酶B的强抑制剂(附图15)。VI/胱天蛋白酶抑制减轻了围产期缺血性损伤VI-1/新生Wistar大鼠(雌亲加上每窝9只幼仔)获自Janvier(LeGenest-St-Isle，France),此时幼仔为3-4日龄，使幼仔与其雌亲圏养在一起，处于12:12小时光照-黑暗周期中，并且可自由地取食和饮水。按照法国和欧共体对实验动物的护理和使用指导原则进行动物实验。使用腹膜内注射水合氯醛(350mg/kg)麻醉大鼠幼仔。如先前所述使7日龄大鼠(17-21g)中发生缺血(Renolleau等，1998)。将麻醉大鼠仰卧定位并且在颈部做正中切口，以便暴露左颈总动脉。然后将大鼠置于右侧卧位并且在耳与眼之间做斜皮肤切口。在切除颞肌后，从额缝至颧弓以下的水平去除颅骨。然后使恰在其在嗅裂上出现后暴露的左侧大脑中动脉在大脑静脉下方水平处凝固。在该操作步骤后，力文置夹子以便封闭左颈总动脉。然后将大鼠放入保温箱以避免低体温。50分钟后，取下夹子。借助于显微镜验证恢复的颈动脉血流。然后关闭颈部和颅部皮肤切口。在手术操作过程中，使体温维持37-38匸。将幼仔转移至保温箱(321C)中，直到其恢复，然后使其返回雌亲。在缺血后1小时(相应于再灌注)通过腹膜内或静脉内给予化合物。对照组动物接受等体积的溶解五肽胱天蛋白酶抑制剂所需的载体。在再灌注后48小时处死大鼠并且取出大脑。由不了解动物治疗的观察者对梗塞损害(苍白区)目视评分。在放大镜下观察无清晰缺血性苍白区的脑。将那些未显示出明显MCA(大脑中动脉)闭塞的脑弃去。选择从前紋状体到后海马的切片(相当于Paxinos，大鼠脑图镨中第9-27片)，取O.5-咖间隔的等距。使用图像分析仪对甲酚紫-染色的切片测定损害面积并且将相应冠状切片之间的距离用于计算梗塞体积。VI-2/结果和讨论其中R-H、甲基、烷基或芳基；n-0，12-喹啉基羰基-Z-缬氨酰基-Z-天冬氨酰基(甲基酯)-Z-缬氨酰基-Z-丙氨酰基-Z-天冬氨酰基(甲基酯)2，6-二氟苯基酯-SEQ8对重组胱天蛋白酶-2测试新设计的五肽-抑制剂SEQ8的特异性。SEQ8阻断胱天蛋白酶-2在体外对VDVAD-AMC的裂解，与商购胱天蛋白酶-2可逆(Ac-VDVAD-Cho)或不可逆(Z-VDVAD-FMK)抑制剂同样有效(附图16)，但不同于胱天蛋白酶-9抑制剂z-LEHD-fmk。然后在发育中的大脑中的缺氧-缺血性损伤的急性模型中测试SEQ8，其中细胞死亡因细胞凋亡而非坏死而发生。在这种暂时单侧缺血模型中，大鼠幼仔发生永久性的左侧大脑中动脉闭塞以及具有再灌注的左颈总动脉暂时闭塞。然后在这种围产期缺血模型中给药时检验SEQ8的神经保护作用。在缺血发作后1小时通过i.p.(附图17)或i.v.(附图18)给予l剂量的SEQ8(0.l或lmg/kg)或栽体。然后在48小时后分析大脑，在此时间点时梗塞稳定，无明显水肿(不超过1.550。缺血性梗塞体积在受损同侧半球中约占22-25%损害。缺血后1小时通过i.p.给予单剂量的SEQ8(0.1或1mg/kg)将梗塞体积显著减少了44-53%(附图17)。在所研究的动物上，超过50%展示出部分或极为明显减少的梗塞(参见直方图中的中值和甲酚紫染色的切片)。此外，单剂量的SEQ8(1mg/kg)在缺血后1小时给予时也显著减少了(至少30%)梗塞体积(附图18)。在所研究的动物上，接近50%展示出部分或极为明显减少的梗塞(参见直方图中的中值和新鲜提取的脑上的灰白色斑点区)。总而言之，我们的数据证实新的胱天蛋白酶-2抑制剂提供了对新生儿缺血性脑损伤的强神经保护作用。VII/胱天蛋白酶抑制减轻了成年缺血性损伤VII-1/方法按照Pulsinelli衍生的方法(Pulsinelli和Buchman，1988)在年轻-成年大鼠(雄性10-12周龄Wistar，320g+/-10g;Janvier)中通过4-血管闭塞(4V0)诱发全脑缺血。第一天，在脑功能区定位耳棒上对麻醉大鼠的头定位并且向下倾斜与水平线成约30°。在颈推水平上做正中切口后，在显微镜下暴露两条推动脉且然后在第一颈稚水平通过翼孔用电烙针凝固。然后在24小时后暴露两条颈总动脉并且钳夹20-30分钟(在对两条推动脉充分进行电烙术时，大鼠陷入昏迷)。然后解开颈动脉的夹子以使血流再灌注。在缺血(颈动脉闭塞)的头5分钟内在左侧脑室水平给予载体和SEQ8。将大鼠放回其笼中并且可以自由取食和饮水。在72小时时评价了脆弱细胞的选择性丧失和SEQ8的作用。处死大鼠并且通过使用低聚曱醛经心脏灌注固定脑。用甲酚紫染色额脑切片(25jjm)或用Hoechst33342和FluorojadeB共同染色以便评估海马和皮层中的细胞死亡。甲酚紫为标记活细胞中胞质尼氏体(内质网结构)和核的粉红色染料，由此在濒死细胞中产生浅染色或无染色。FluoroJadeB(绿色荧光)摄入仅能够在具有可渗透的质膜的细胞发生，由此更是濒死细胞的特征。Hoechst33342(蓝色荧光)标记所有细胞的核并且能够在细胞死亡过程中识别核形态的改变。在左侧脑半球中的海马(CA1)中在这类水平上在3个连续的切片中计数细胞。在白色光下观察甲酚紫染色的切片。在安装了x40物镜和LEICAIM1000/Qfluorobase软件的LeicaDMIRB倒置荧光显微镜下观察FluoroJadeB和Hoechst染色的切片(就Hoechst而言，合并有LP425发射滤光片的BP340-80的激发滤光片；就FluoroJadeB而言，合并有BP515-560发射滤光片的BP480/40激发滤光片)。VII-1/结果和讨论附图23-25显示缺血后72小时成年大鼠海马中CA1水平发生的细胞死亡90-100%的细胞已经丧失了其甲酚紫染色并且具有异常细胞形态(附图19)，40-60%表现出核改变和缺血性脑的CA1中保留的FluoroJadeB(附图20)。在脑缺血后72小时中在单一i.c.v60ngSEQ8给药后研究了SEQ8在CA1水平的细胞保护作用。与缺血性大鼠形成鲜明对比，SEQ8治疗的动物较少存在异常核(核较大并且收缩较少)并且几乎没有细胞掺入了FluorojadeB(10-2(^而非50-60%)(附图20)。因此，染色的切片看起来非常象非缺血切片。此外，曱酚紫染色强度部分恢复至无缺血的动物的水平，但细胞形态未完全恢复(附图19)。死亡定量。成年大鼠中缺血后72小时海马(CA1，CA3，DG，)和皮层(C0R)中的细胞死亡。通过4血管闭塞((4V0;n=5)诱发总体和暂时性脑缺血。用DMSO处理(icv)大鼠(此处，7,255%;0.7255%，未显示)(n-5)。A:在注射DMS0或TRP6(1)，(2)后650ym或(3)后780pm水平，甲酚紫阳性细胞的定量。B:通过缺血和无缺血脑的海马(CAla,b,。，CA3，DG)和皮层(C0R)中Hoechst染色评价的异常核定量。C:缺血和无缺血脑的海马(CAla,b,e，CA3，DG)和皮层(C0R)中FluoroJadeB阳性细胞的定量。权利要求1.具有在包含下列序列的组中选择的核心序列的肽类SEQIDN°1VDEADSEQIDN°2LDEGDSEQIDN°3VDEGDSEQIDN°4VDESDSEQIDN°5LDEKDSEQIDN°6FDESDSEQIDN°7LDEAD。2.权利要求l的肽类，具有N-末端保护基和/或C-末端保护基。3.权利要求2的肽类，其中N-末端保护基为M=A-(CH2)nl，其中.nl=0-20;.当nl-0时，M为H;.A为C1-C20烷基、一个或几个稠合环和/或杂环；.当不为H，并且当nl大于2时，A为饱和或不饱和的并且任选被一个或几个基团取代，所述的基团诸如为H、0H、0Ra、(CH2)nlOH、(CH2)nlORa、COOH、C00Ra、(CH2)nlC00H、(CH2)nlC00Ra、C广C3烷基或环烷基、(CH丄广烷基、C0-NH-烷基、Ar、(CH丄广Ar、CO-NH-Ar、卣素、CF3、S03H、(CH2)XP03H2、B(0H)2、N02、SO萬、S02NHRa;其中x-0，1或2;Ra为d-C3烷基并且Ar为任选取代的芳基或杂芳基；或.A为一个或几个氨基酸残基；或.A表示发色、荧光、发光、吸收(UV至近IR)基团；放射性同位素；金属粒子，诸如用于电子显微镜检查的金属粒子；比色基团；生物素/链霉抗生物素/neutravidin标记系统；或类似物。4.权利要求2或3的肽类，其中所述的肽类具有C-末端保护基X，其中X为H或羧基保护基，所述的羧基保护基选自下组0Rb、NHRb、SRb、CH20Rb、CH識b、CH2SRb、CH20Rb和CH2Y，其中Rb=酰基、烷基、取代的烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基或杂芳基，其任选与一个或几个环和/或杂环稠合；Cl-C20取代或未被取代的脂族基团、芳烷基碳环烷基碳环或杂环基，其任选与一个或几个芳族或非芳族环稠合，并且Y为卤原子(F、Cl、Br或I)或N02，或X表示发色、荧光、发光、吸收(UV至近IR)基团、放射性同位素、诸如用于电子显微镜检查的金属粒子、比色^&团、生物素/链霉抗生物素/neutravidin标记系统或类似物。5.药物组合物，包含治疗有效量的至少一种权利要求1-4中任意一项的肽或抑制剂与药学上可接受的载体。6.权利要求5所述的药物组合物，用于通过口服、鼻部、局部(例如，皮下、脑室内、大脑内植入浸渍了化合物或药物组合物的材料、大脑内植入用于机械递送的装置)或全身(例如腹膜内、静脉内….)给药进行给药以便减少细胞死亡。7.权利要求5或6所述的药物组合物，用于治疗病理情况，包括缺氧-缺血(H-1)H-I(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)损伤和中风样情况(例如脑、肾、心力衰竭)。8.权利要求5或6所述的药物组合物，用于治疗病理情况，包括脑缺氧-缺血(H-I)(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)损伤和中风样情况(例如脑、肾、心力衰竭)。9.权利要求5或6所述的药物组合物，用于治疗神经元死亡，特别是在总体性或局部性H-I(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)损伤和中风样情况(例如脑、肾、心力衰竭)中的神经元死亡。10.权利要求5或6所述的药物组合物，用于治疗神经元死亡，特别是在成年人、胎儿或围产期H-I(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)损伤和中风样情况(例如脑、肾、心力衰竭)中的神经元死亡。11.权利要求5或6所述的药物组合物，用于治疗神经元死亡，特别是暂时性或永久性H-I(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)损伤和中风样情况(例如脑、肾、心力衰竭)中的神经元死亡。12.权利要求5或6所述的药物组合物，用于治疗神经元死亡，特别是H-1(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)损伤和中风样情况，存在或不存在再灌注情况的脑损伤(例如脑、肾、心力衰竭)。13.权利要求5或6所述的药物组合物，用于治疗神经元死亡，特别是在成年人、胎儿或围产期H-I中的大脑中动脉闭塞(MCAO)中的;f中经元死亡。14.权利要求5或6所述的药物组合物，用于治疗神经元死亡，特别是当合并下列病理事件中的至少一种或多种时存在或不存在再灌注的总体或局部、暂时性或永久性、成年人或胎儿或围产期H-I(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)，在脑水平上或在整体水平上。15.权利要求5或6所述的药物组合物，用于治疗神经元死亡，特别是在脑损伤后的至少一种或多种情况时。16.权利要求5或6所述的药物组合物，用于治疗神经元死亡，特别是在围产期脑损伤后的至少一种或多种情况时。17.权利要求5或6所述的药物组合物-用于预防和/或治疗慢性变性疾病过程中的细胞死亡，例如神经变性疾病，包括阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈病、帕金森病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、脊髄延髄萎缩、朊病毒疾病、痴呆；或-用于预防和/或治疗癫痫或癫痫发生；或-用于预防和/或治疗脊髄损伤过程中的细胞凋亡或用于预防和/或治疗因外伤性脑损伤导致的细胞凋亡；或-用于提供神经保护作用；或-用于提供大脑保护作用；或-用于预防和/或治疗与自身免疫病和移植物排斥相关的细胞毒性T细胞和天然杀伤细胞介导的细胞凋亡；或-用于预防心肌细胞的细胞死亡，包括心力衰竭、心肌病、心脏病毒感染或细菌感染、心肌缺血、心肌梗塞和心肌缺血、冠状动脉旁路移植术；或-用于预防和/或治疗例如作为化疗或HIV疗法结果的线粒体药物毒性；或-用于预防病毒感染或细菌感染过程中的细胞死亡；或-用于预防和/或治疗炎症或炎性疾病、炎症性肠病、脓毒病和脓毒性休克；或-用于预防从卵泡到卵母细胞阶段，从卵母细胞到成熟卵阶段的细胞死亡(Nutt等2Q05;Bergeron等，1998);和精子死亡(例如冷冻和移植卵巢组织、人工受精(fecondation)的方法)，或-用于保存化疗后女性和男性的生育力；或-用于保存雌性和雄性动物的生育力；或-用于预防和/或治疗黄斑变性和青光眼或用于预防和/或治疗急性肝炎、慢性活动性肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎；-用于预防脱发和因男性型秃、放射、化疗或情绪应激导致的所述脱发；或-用于治疗或改善皮肤损害(因接触高水平放射、热、灼伤、化学品、日晒和自身免疫病导致)；或-用于预防骨髓增生异常综合征中骨髄细胞的细胞死亡；或-用于治疗胰腺炎；或-用于治疗呼吸综合征；或-用于预防和/或治疗胃肠内衬上皮细胞的死亡；或-用于治疗骨关节炎、类风湿性关节炎、银屑病、肾小球肾炎、动脉粥样硬化和移植物抗宿主疾病；或-用于治疗视网膜周细胞细胞凋亡、视网膜神经元细胞凋亡、青光眼、视网膜损害、因缺血、糖尿病性视网膜病或其它创伤导致的黄斑变，性；或-用于治疗与细胞凋亡增加相关的疾病状态；或-用于预防植物中的细胞死亡(例如植物、花、原植体植物(蘑菇、海藻)...)。抑制胱天蛋白酶-2和/或6活性的体外方法，包括使用权利要求1-4中任意一项的肽。全文摘要本发明涉及具有选自包含下列序列的组中的核心序列的肽类SEQIDN°1VDEADSEQIDN°2LDEGDSEQIDN°3VDEGDSEQIDN°4VDESDSEQIDN°5LDEKDSEQIDN°6FDESDSEQIDN°7LDEAD，它们用作胱天蛋白酶-2和/或-6活性抑制剂的应用。文档编号C07K7/00GK101223187SQ200580046297公开日2008年7月16日申请日期2005年11月24日优先权日2004年11月24日发明者D·肖维耶,J·厄贝克,R·卡齐米尔申请人:萨拉普托斯股份公司