专利名称：流感病毒h1n1亚型神经氨酸酶及其基因、其抑制剂筛选模型及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于抗流感病毒药物筛选领域，具体涉及一种流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶及其基因并利用该酶构建其抑制剂筛选模型及应用。
背景技术：
流感病毒长期以来一直严重威胁着人类的健康，近年来其H5m和Hmi亚型的相继暴发加大了全世界对抗流感病毒药物的需求。目前FDA许可的治疗流感的药物主要有四种金刚烷胺(Amantadine)、金刚乙胺(Rimantadine)、奥司他韦(Oseltamivir)和扎那米韦(Zanamivir)。随着耐药病例的不断增加，人类正面临着流感病毒大规模爆发的严峻考验，新型抗流感病毒药物的研发势在必行，这使得设计合成或从化合物库中筛选新型神经氨酸酶抑制剂成为当前研究的热点和难点。在创制新药的研究中，寻找和发现具有生物活性的先导化合物是至关重要的环节之一，而对大量化合物进行活性筛选则是发现先导化合物的主要手段和途径。在目前流感病毒神经氨酸酶(Neuraminidase，·)抑制剂的多种筛选模型中，神经氨酸酶主要由全病毒制备，制备过程比较繁琐耗时，并存在安全问题。分子水平的药物筛选模型具有材料用量少、药物作用机制比较明确、可实现大规模的筛选等特点，已经成为目前药物筛选的主要方法。到目前为止，国内外尚无利用毕赤酵母表达的甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶构建的模型大规模筛选抗流感病毒药物得报道。异源表达是获得靶点蛋白的一个有效途径，相对于哺乳动物和昆虫细胞表达系统，毕赤酵母表达系统操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低；具有aox强启动子，外源蛋白受甲醇严格诱导调控而表达；具有后修饰能力，可以对表达蛋白进行糖基化、蛋白磷酸化、折叠、信号序列加工、脂类酰化等一系列的后修饰，从而使其表达的蛋白具有生物活性。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的流感病毒Hmi亚型神经氨酸酶抑制剂筛选模型中使用的神经氨酸酶制备繁琐耗时，并存在安全问题的不足，而提供一种甲型流感病毒神经氨酸酶及其基因和制备方法，以及流感病毒神经氨酸酶抑制剂的筛选模型的构建方法。本发明的第一方面是提供一种甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶基因，其核苷酸序列是以下任何的一种1)序列表中SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；2)编码氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示蛋白的核苷酸序列。本发明中，SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的神经氨酸酶基因的核酸序列全长1407bp，编码469个氨基酸，所用密码子有利于NA基因在毕赤酵母中表达。
本发明中，氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示的蛋白为去除了全长NA蛋白N端的82个氨基酸，是截短NA。本发明的第二方面是提供含有如上所述的甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶基因的重组载体。所述的重组载体的所用的载体是本领域的常规载体，优选载体PPICZ α A。本发明的第三方面是提供含有如上所述的重组载体的转化子。所述的转化子的宿主细胞是本领域常规的宿主细胞，优选毕赤酵母，更优选毕赤酵母ΚΜ71或者SMDl 168表达菌株。本发明的第四方面是提供一种重组的甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶，其氨基酸序列是序列表中SEQ ID No. 2所示。其为去除了 NA全长基因N端的82个氨基酸，是截短ΝΑ，具有神经氨酸酶生物活性。本发明的第五方面是提供一种制备分泌表达甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶的基因工程菌的方法，包括以下步骤1)合成经密码子优化的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示的神经氨酸酶基因；2)将神经氨酸酶基因克隆入酵母表达载体中构建重组质粒，然后将重组质粒导入毕赤酵母表达菌株获得重组毕赤酵母，即得表达神经氨酸酶的基因工程菌。本发明中，步骤1)所述的神经氨酸酶基因的合成方法可以常规方法，可以人工合成全长基因。步骤幻所述的神经氨酸酶基因可以是步骤1)合成的经密码子优化的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示的神经氨酸酶基因，也可以以序列表中SEQ ID No. 1所示的神经氨酸酶基因为模板，利用引物扩增扩增获得截短的仅含有功能区域，去除了可能与催化活性无关区域的神经氨酸酶基因，较佳的是利用引物扩增获得编码氨基酸序列是序列表中SEQ ID No. 2所示蛋白的截短的神经氨酸酶基因；所述的利用引物扩增获得截短的神经氨酸酶基因的方法是本领域的常规方法，以步骤1)所合成的神经氨酸酶基因为模板扩增得到编码氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示蛋白的截短的神经氨酸酶基因。所述的引物较佳的是上游引物NA_F的序列为5，-GCCTCGAGAAAAGAGTTAAGTTGGCTGG-3，(如序列表中 SEQ ID No. 3 所示)，下游引物 NA_R 的序列为 5 ’ -GCTCTAGACCCTTGTCAATGGTGAATGG-3 ’(如序列表中SEQ ID似.4所示)，分别具有》!01和)0^1酶切位点。所述的酵母表达载体较佳的是质粒PPICZ α Α。所述的毕赤酵母表达菌株较佳的是毕赤酵母KM71或者SMD1168。KM71或者SMD1168两种重组子表达的截短NA分泌至胞外时均经Kex2切割而具有天然的N端序列，无额外增加的氨基酸。所述的将截短的神经氨酸酶基因克隆入酵母表达载体的克隆方法是本领域常规方法。较佳的，如上利用引物NA_F和NA_R扩增获得截短NA基因，通过BioI和^CbaI酶切位点构建含有截短NA基因的重组载体pPICZ α A-NAS,然后用电转化法将McI酶切线性化的pPICZ α A-NAS导入毕赤酵母中，利用kocin 抗性筛选重组菌株，最后诱导重组毕赤酵母分泌表达截短NA。本发明的第六方面是提供如上所述的方法制备得到的分泌表达甲型流感病毒HlNl亚型的神经氨酸酶的基因工程菌。本发明的第七方面是提供如上所述的重组的甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶在神经氨酸酶抑制剂筛选模型中的应用。本发明的第八方面是提供一种神经氨酸酶抑制剂筛选模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤将所述的甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶基因克隆入酵母表达载体中构建重组质粒，然后将重组质粒导入毕赤酵母表达菌株获得重组毕赤酵母，即获得分泌表达甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶的基因工程菌，培养后得到具有生物活性的神经氨酸酶，在反应体系中加入该截短神经氨酸酶、底物4-MUNANA和待筛选的抑制剂，温育后在360nm的激发光和460nm的发射光下检测荧光强度的变化。其中，获得分泌表达甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶的基因工程菌的较佳方法如上文所述，即所述的甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶基因的核苷酸序列是以下任何的一种1)序列表中SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，幻编码氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示蛋白的核苷酸序列；所述的毕赤酵母优选毕赤酵母KM71或者 SMD1168 表达菌株。而化合物 4-MUNANAG-methylumbelliferyl-N-acetyl- α -D_neuralminic acid)是神经氨酸酶的特异性底物，在神经氨酸酶作用下产生的代谢产物4-MU(4-methylumbelliferone)被360nm照射光激发可以产生460nm荧光，荧光强度的变化可以灵敏地反应神经氨酸酶活性。本发明优化神经氨酸酶的酶量、底物浓度、反应时间、反应体系PH值、钙离子浓度和反应温度等条件，从而建立一种神经氨酸酶抑制剂的高通量筛选模型。较佳的所述的反应体系为32. 5mM pH6. 5 MES缓冲液，4mM CaCl2 ；底物较佳的为100 μ M4-MUNANA ；温育温度较佳的是37°C。本发明中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果如下本发明用毕赤酵母分泌表达甲型流感病毒Hmi亚型神经氨酸酶，获得了具有生物活性的神经氨酸酶，避免了繁琐耗时且存在安全问题的由全病毒制备NA的操作过程。特别的是去除了 NA全长序列N端的82个氨基酸的截短神经氨酸酶，截短的基因仅含有功能区域，去除了可能与催化活性无关的部分，蛋白的分泌表达效率高。本发明还利用该酶构建甲型流感病毒Hmi亚型神经氨酸酶抑制剂筛选模型，具有药物作用机制明确、材料用量少、筛选速度快、灵敏度高、可实现高通量筛选等优点。
以下结合
本发明的特征和有益效果。图1为扩增截短NA基因的琼脂糖凝胶电泳图，其中，1、2 截短NA基因(引物NA_F 和 NA_R) ,3,4 截短 NA 基因(引物 NA_F2 和 NA_R2)，M 分子量 Marker DL2000。图2为重组质粒的酶切鉴定电泳图，其中，M 分子量Marker DL2000,1 未酶切的重组质粒 pPICZ α A-NAS, 2 经 Xho I 和 Xba I 双酶切的 pPICZ α A-NAS, 3 经 EcoR I 和 NotI 双酶切的 pPICZ α A-NAS2。图3为重组菌株诱导发酵上清液的酶活测定结果，其中，1 空载体pPICZ α A转化KM71的重组菌株，2 4 重组质粒pPICZ α A-NAS转化ΚΜ71的重组菌株，5 7 重组质粒pPICZ α A-NAS2转化ΚΜ71的重组菌株，8 10 重组质粒pPICZ α A-NA转化ΚΜ71的重组菌株，11 空载体pPICZ α A转化SMDl 168的重组菌株，12 14 重组质粒pPICZ α A-NAS转化SMDl 168的重组菌株，15 17 重组质粒pPICZ α A-NAS2转化SMDl 168的重组菌株，18 20 重组质粒pPICZ α A-NA转化SMDl 168的重组菌株。图4为奥司他韦、扎纳米韦、金刚烷胺和金刚乙胺对截短NA的抑制实验结果。
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。 实施例1重组质粒pPICZ α A-NAS的构建1)从NCBI网站获得2009年4月至2010年3月报道的16 条甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶氨基酸序列，经CluxtalX软件比对分析后，选取最有代表性的病毒株A/ffisconsin/629-S0247/2009 (HlNl) (GenBank :CY051377)作为研究对象，该基因的核酸全长为1407bp，编码469个氨基酸。根据毕赤酵母的表达习惯将该基因进行密码子优化，密码子优化的NA全长基因的序列见序列表SEQ ID NO. 1所示。对优化后的基因采用化学合成的方法进行全基因合成，把合成的全长基因连接到克隆载体PUC57上得克隆载体PUC57-NA，序列测定验证完全正确(委托上海闪晶生物合成)。2)设计用于PCR扩增截短NA基因的引物，上游弓丨物NA_F5，-GCCTCGAGAAAAGAGTTAAGTTGGCTGG-3，(如序列表中 SEQ ID No. 3 所示)，下游引物NA_R 5，-GCTCTAGACCCTTGTCAATGGTGAATGG-3，(如序列表中SEQ ID No. 4所示)，该截短NA基因去除了其N端的82个氨基酸的编码序列，截短NA基因编码的氨基酸序列见SEQ ID NO. 2。3)以含有密码子优化的全长NA基因的克隆载体PUC57-NA为模板，利用引物NA_F和NA_R在LA Taq(TaKaRa)的催化下进行PCR扩增，获得1. 2kb的截短NA基因片段。扩增的程序为94°C预变性5min ；94°C变性30s，58°C退火45s，72°C延伸1. 5min，共30个循环；72°C再延伸lOmin)，扩增结果如图1所示。4)用B10I和^CbaI分别对扩增的截短NA基因片段和毕赤酵母表达载体pPICZciA(购自Invitrogen)进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，利用T4连接酶(TaKaRa)于16°C过夜连接，连接产物转化E. coli DH5 α并涂布于含有25mg/L kocin 的低盐LB琼脂平板，37°C培养12 16h。5)挑取抗性平板上生长的单菌落10个接种5mL含有25mg/L zeocin 的低盐LB液体培养基，200rpm 37°C条件下过夜培养，提取质粒，以BioI和^CbaI进行双酶切鉴定，得到含有截短NA基因的重组质粒pPICZ α A-NAS,对酶切正确的质粒进行测序，酶切电泳结果如图2所示。实施例2重组毕赤酵母菌株的构建及截短NA的诱导表达1)制备ΚΜ71和SMDl 168感受态，具体步骤包括a.挑取30 °C下YPD平板生长的KM71 (购自hvitrogen)和SMDl 168 (购自Invitrogen)单菌落，接种20mL YPD液体培养基250rpm 30°C过夜培养。b.取0. 1 0. 5mL过夜培养物，接种含有500mL新鲜培养基的2L摇瓶，过夜培养至 0D600 = 1. 3 1. 5.c.在4°C下，1500g离心5min收集细胞，用500mL预冷的灭菌水悬浮细胞。d.如上离心，用250mL预冷的灭菌水悬浮细胞。
e.如上离心，用20mL预冷的IM山梨醇悬浮细胞。f.如上离心，用ImL预冷的IM山梨醇悬浮细胞，至终体积约1. 5mL。2)线性化pPICZ α A-NAS电转化ΚΜ71和SMDl 168，具体步骤包括a.用McI对表达载体pPICZ α A-NAS进行线性化，线性化片段经乙醇沉淀回收。b.混合80 μ L感受态细胞和约10 μ g线性化的pPICZ α A-NAS片段并转移至0°C预冷的0. 2cm电击杯，冰上静置5min。c.根据BioRad电转化仪操作手册电转化，电击参数为电压2. 5KV，电阻200 Ω，电容20kF。d.电击结束后立刻加入ImL冰冷IM山梨醇至电击杯并转移至离心管中。e.将离心管静置于30°C温育60 90min。f.以100-30(^17平板涂布于10011^/1 Zeocin YPDS平板，30°C培养至单菌落形成。3)利用引物 5，AOXl (5，-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3，)禾Π 3，AOXl (5，-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’ )进行菌落PCR鉴定，菌落PCR的模板为经冻融法处理的菌体，扩增条件为:94°C预变性5min ；94°C变性30s，58°C退火45s，72°C延伸3min，共30个循环；72°C再延伸 IOmin04)分别挑取PCR鉴定且测序正确的单菌落，接种于25mL BMGY培养基中，在280C 250rpm的摇床中用500mL三角瓶进行培养，直至细胞浓度达到0D600 = 2 6。室温4000rpm条件下离心5min，收集细胞，倒掉上清后用20mL BMMY培养基重悬细胞，280C 250rpm下诱导表达，每24h加甲醇至终浓度为0. 5 %继续诱导，分别在Mh，48h，72h和96h取样。实施例3NA活性测定及抑制实验0. 5%甲醇诱导重组毕赤酵母分泌表达截短NA，诱导表达96h的菌液在12000rpm下离心5min，取上清液做为粗酶液用于NA活性测定实验，同时利用超滤浓缩离心管将粗酶液浓缩约10倍，用于奥司他韦、扎纳米韦、金刚烷胺和金刚乙胺对截短NA的抑制实验，实验仪器为BioTek多功能酶标仪和96孔黑色酶标板。NA活性测定取30 μ 1发酵上清液，加入75 μ 1反应底物(终浓度为32. 5mM MES缓冲液，pH6. 5，4mM CaCl2,100 μ M底物4-MUNANA)，动力法在360nm的激发光和460nm的发射光下检测荧光强度的变化。以倍比稀释至适当浓度的4-MU做为标准品绘制标准曲线用于定量截短NA的酶活性，一个单位的酶活定义为37°C下每分钟催化底物4-MUNANA生成一微摩尔4-MU的酶量。活性测定结果如图3所示。奥司他韦、扎纳米韦、金刚烷胺和金刚乙胺抑制实验将四种试剂用水倍比稀释，取15 μ 1，加入30 μ 1 NA粗酶液，75 μ 1反应底物，37°C下反应30min，混勻后在360nm的激发光和460nm的发射光下检测荧光强度。抑制实验结果如图4所示。实施例4 (对比例)重组载体pPICZ α A-NAS2的构建、转化及截短NAS2的活性测定1)设计引物(上游引物 NA_F2 5，~GCGAATTCGTTAAGTTGGCTGGTAACTCC~3‘和下游引物 NA_R25，-AATGCGGCCGCCTTGTCAATGGTGAATG-3‘)用于 PCR 扩增截短 NAS2 基因，该截短NAS2基因同样去除了神经氨酸酶N端的82个氨基酸，酶切位点分别为EcoR I和Not 1(下划线处)。由于采用的酶切位点与实施例1不同，用此对引物扩增的产物构建质粒转化毕赤酵母，重组子分泌表达的蛋白不具有天然的N端，会多出6个氨基酸(EAEAEF)，这6个氨基酸的存在直接导致表达的神经氨酸酶没有催化活性。2)以含有密码子优化的NA基因的克隆载体PUC57-NA为模板，利用引物NA_F2和NA_R2在LA Taq (TaKaRa)的催化下进行PCR扩增，获得1. 2kb的截短NA基因片段。扩增的程序为94°C预变性5min ；94°C变性30s，58°C退火45s，72°C延伸1. 5min，共30个循环；72°C再延伸IOmin)，电泳结果如图1所示。3)用EcoR I和Not I分别对扩增的截短NA基因片段和毕赤酵母表达载体pPICZ α A进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，利用Τ4连接酶(TaKaRa)于16°C过夜连接，连接产物转化E. coli DH5a并涂布于含有25mg/I^e0CinTM的低盐LB琼脂平板，37°C培养 12 16h。4)挑取抗性平板上生长的单菌落10个接种5mL含有25mg/L zeocin 的低盐LB液体培养基，200rpm 37°C条件下过夜培养，提取质粒，以EcoR I和Not I进行双酶切鉴定，得到含有截短NA基因的重组质粒pPICZ a A-NAS2，对酶切正确的质粒进行测序。5)重组质粒pPICZ a A_NAS2转化KM71和SMDl 168感受态，筛选重组菌株，培养并诱导重组菌株表达NAS2，测定NAS2活性，具体步骤同实施例1、2和3，活性测定结果如图3所示。实施例5 (对比例)重组载体pPICZ a A-NA的构建、转化及全长NA的活性测定1)用EcoR I和Not I分别对含有密码子优化的全长NA基因的克隆载体pUC57_NA和毕赤酵母表达载体pPICZ a A进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，利用T4连接酶(TaKaRa)于16°C过夜连接，连接产物转化E. coliDH5a并涂布于含有25mg/L kocin 的低盐LB琼脂平板，37°C培养12 16h。2)挑取抗性平板上生长的单菌落10个接种5mL含有25mg/L zeocin 的低盐LB液体培养基，200rpm 37°C条件下过夜培养，提取质粒，以EcoR I和Not I进行双酶切鉴定，得到含有截短NA基因的重组质粒pPICZ a A_NA，对酶切正确的质粒进行测序。3)重组质粒pPICZ a A-NA转化KM71和SMDl 168感受态，筛选重组菌株，培养并诱导重组菌株表达全长NA，测定NA活性，具体步骤同实施例1、2和3，活性测定结果如图3所
权利要求
1.一种甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶基因，其特征在于，其核苷酸序列是以下的任何一种1)序列表中SEQID No. 1所示的核苷酸序列；2)编码氨基酸序列如序列表中SEQID No. 2所示蛋白的核苷酸序列。
2.含有如权利要求1所述的甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶基因的重组载体。
3.含有如权利要求2所述的重组载体的转化子。
4.一种重组的甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶，其特征在于，其氨基酸序列是序列表中SEQ ID No. 2所示。
5.一种制备分泌表达甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶的基因工程菌的方法，其特征在于，包括以下步骤1)合成经密码子优化的核苷酸序列如序列表中SEQID No. 1所示的神经氨酸酶基因；2)将神经氨酸酶基因克隆入酵母表达载体中构建重组质粒，然后将重组质粒导入毕赤酵母表达菌株获得重组毕赤酵母，即得表达神经氨酸酶的基因工程菌。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤幻所述的神经氨酸酶基因是以序列表中SEQ ID No. 1所示的神经氨酸酶基因为模板，利用引物扩增获得编码氨基酸序列是序列表中SEQ ID No. 2所示蛋白的截短的神经氨酸酶基因；所述的引物是上游引物NA_F的序列如序列表中SEQ ID No. 3所示，下游引物NA_R的序列如序列表中SEQ ID No. 4所示；所述的酵母表达载体是质粒PPICZ α A ；所述的毕赤酵母表达菌株是毕赤酵母KM71或者SMDl168。
7.如权利要求5或6所述的方法制备得到的分泌表达甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶的基因工程菌。
8.如权利要求2所述的重组的甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶在神经氨酸酶抑制剂筛选模型中的应用。
9.一种神经氨酸酶抑制剂筛选模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤将如权利要求1所述的甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶基因克隆入酵母表达载体中构建重组质粒，然后将重组质粒导入毕赤酵母表达菌株获得重组毕赤酵母，即获得分泌表达甲型流感病毒Hmi亚型的神经氨酸酶的基因工程菌，培养后得到具有生物活性的神经氨酸酶，在反应体系中加入该截短神经氨酸酶、底物4-MUNANA和待筛选的抑制剂，温育后在360nm的激发光和460nm的发射光下检测荧光强度的变化。
10.权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述的反应体系为32.5mM pH6. 5MES缓冲液，4mM CaCl2 ；底物为100 μ M 4-MUNANA ；温育温度是37°C。
全文摘要
本发明提供一种甲型流感病毒神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)及其基因和制备方法，以及流感病毒神经氨酸酶抑制剂的筛选模型的构建方法。尤其用毕赤酵母分泌表达甲型流感病毒H1N1亚型神经氨酸酶，获得了具有生物活性的神经氨酸酶，特别的是去除了NA全长序列N端的82个氨基酸的截短神经氨酸酶，避免了繁琐耗时且存在安全问题的由全病毒制备NA的操作过程。本发明还利用该酶构建甲型流感病毒H1N1亚型神经氨酸酶抑制剂筛选模型，具有药物作用机制明确、材料用量少、筛选速度快、灵敏度高、可实现高通量筛选等优点。
文档编号C12N1/19GK102586295SQ201110002029
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月6日 优先权日2011年1月6日
发明者朱宝泉, 林军, 胡又佳, 胡海峰 申请人:上海医药工业研究院