专利名称：利用est-ssr分子标记构建荔枝核心种质的方法
技术领域：
本发明涉及荔枝核心种质的构建方法。
背景技术：
荔枝Hitchi chinensis Sonn.)为无患子科{Sapindaceae)荔枝属 Hitchf)植物，原产于我国南部，是重要的热带亚热带水果，也是世界最古老的栽培果树之一，分布于东、西半球的热带和亚热带的广阔地区，我国荔枝主要分布在北纬18° M° 30'的热带亚热带地区，主要栽培省份是广东、广西、福建、海南、台湾、云南，此外，在四川、贵州、浙江的一些特殊小气候区也有少量种植(张展薇等，1997)。吴淑娴等(1996)年对各地的荔枝种质资源进行了统计认为我国已发现的荔枝种质达222份，现已增加至300多份(陈洁珍等 2003)。其中，广东荔枝栽培面积最大，品种资源丰富，栽培品种也较多，目前，我国荔枝种质资源保存主要是利用种质资源圃。1988年建立的广州荔枝圃到目前为止保存了包括广东、 广西、福建、四川、云南等地的野生、半野生和栽培品种等130多份种质，是世界上最大的荔枝种质基因库。荔枝现存资源保存方式单一，各地几乎仅采用建立资源圃进行田间种植保存，而且资源的重复保存现象较严重；其保护力度也远远不够，荔枝的遗传多样性遭到严重的破坏(王艳琼2008)。此外，由于荔枝是多年生木本植物，树体大，作为资源保存，占地面积大， 随着近年来遗传资源数量的增加也给种质资源的保存、研究与利用带来了很大的困难。Frankel (1984)最早提出核心种质(Core collection)即是以最小的资源份数和遗传重复最大限度地代表该物种的遗传多样性。核心种质的构建能有效解决资源的重复保存，且由于资源数量大给育种工作者带来的困难也能随之解决。传统的核心种质的是用农艺学和形态学数据来构建的，但这些表型数据不能准确的反应群体固有的遗传变异及材料间的遗传关系(Gu et al，2005)，与表型数据相比，DNA 分子标记数据能直接反映出DNA序列水平上的变化，是构建核心种质的有效特征数据(李银霞等2007)。目前，核心种质已成为国际遗传资源研究的热点，在水稻等许多一年生作物上得至丨J 广泛应用(Chandra 2002 ；Amalraj 2006 Juneja 2006 ；Ronfort 2006 ；Upadhyaya 2007)，在园艺作物花卉郁金香(Raamsdonk 2000)、梅花(明军2005)和蜡梅(赵冰2007) 等上也有报道，在果树上，仅在苹果(Hokanson 1998)、果梅(高志红等2008)、柚类(刘勇 2006)和桃(李银霞等2007)上有少量报道。现阶段，缺乏荔枝核心种质与分子指纹的构建方法。
发明内容
本发明的目的在于提供荔枝核心种质与分子指纹的构建方法。本发明所采取的技术方案是 荔枝核心种质的构建方法，包括以下步骤1)选取荔枝的嫩叶，按品种提取其基因组DNA，得到荔枝的基因组DNA样品；
2)根据荔枝的EST序列，搜索荔枝的EST-SSR，设计EST-SSR引物；
3)使用EST-SSR引物进行PCR，扩增荔枝的基因组DNA；
4)对PCR产物进行电泳分析，得到其等位基因的存在数据；
5)对获得的数据进行分析处理，构建核心种质。优选的，PCR的扩增程序为:94°c,4min ；94°C，Imin ；50°C, Imin ；72°C，2min ；35 个循环；72°C，10min ；4°C，完成扩增。本发明方法中，EST-SSR标记的引物形成和实验操作过程简单，易操作，扩增谱带清晰，结果稳定，适合于分析荔枝资源之间的遗传多样性，在此基础上构建的核心种质几乎代表了原种质全部的遗传多样性，有很好的代表性，对荔枝种质管理、新种质收集及种质繁殖更新具有现实意义，更重要的是促进了荔枝种质资源利用的深入，从而提高荔枝种质资源的利用效率。
图1是三种相似系数下抽取不同样品数保留的等位基因数。图2是三种系数下构建的核心种质与原种质的主坐标图。图3是9个EST-SSR标记的多态性类型分类简图。图4 6分别是使用EST-SSR标记EST-21、EST-29、EST_30对96份荔枝种质资源进行PCR产物的电泳分析图。
具体实施例方式下面结合实施例，进一步说明本发明。1材料与方法 1.1植物材料
本实验所采用的96个荔枝品种均取自广东省农科院果树研究所的国家荔枝资源圃， 取样时，挑选枝条生长健壮，且叶片无病虫害的嫩叶，放入保鲜袋，然后用冰盒盛放，取完后迅速带回实验室，放在_80°C的超低温冰箱储藏备用。1.2 方法
1. 2. 1 DNA的提取
采用改进的SDS法(陈亮等，1997)(陈亮，陈大明，高其康等.茶树基因组DNA提纯与鉴定，茶叶科学，1997，17 (2) 172-176)提取基因组DNA0用PERKIN ELMER PTP6型紫外分光光度计测定其在230nm，260nm, 280nm处的紫外吸收光谱，根据OD26tl值算出样品中DNA的浓度，并结合0. 8%琼脂糖凝胶电泳判断DNA的质量和浓度。为了最终实验的方便和统一， 将每种样品的DNA稀释成大约IOng/ μ L，_20°C保存备用。1.2.2引物的设计与退火温度的确定
从荔枝cDNA文库测序所得的EST序列，应用SSRIT (simple sequence repeat identification tool)软件在线(http://www. gramene. org/db/markers/ssrtool)搜索 EST-SSR，应用引物设计软件I^rimer Premier 5. 0设计引物，由上海生物工程技术服务有限公司合成。参考不同引物的Tm值，采用梯度PCR确定相应的退火温度。选用10个品种的基因组DNA对能扩出目的条带的引物进行多态性筛选，选择多态性高、重现性好的引物作为以后全部96份资源扩增的核心引物。1. 2. 3 PCR扩增与电泳检测
本实验采用 25 μ 1 反应体系CldH2O 17.5“1，8吐€61~(含]\%2+)2.5“1，(1^138 0. 5μ 1, Taq DNA聚合酶0. 5 μ 1，primer各1 μ 1，模板DNA 2 μ 1.优化的荔枝SSR-PCR的扩增反应程序:94°C,4min ；94°C, Imin ；50°C, Imin ；72°C，2min ；35cycles ；72°C, IOmin ；4°C，完成扩增。PCR产物，先在2. 5%的琼脂糖凝胶电泳上进行检测，然后再在8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，银染检测。最后用数码相机拍照，保存。1. 2. 4数据的统计、处理和分析
数据的统计SSR是一种共显性标记，根据其扩增产物在电泳胶上出现谱带的位置和频率，将不同材料某位点存在的等位基因记为1，不存在的记为0。数据的处理和分析所有记录的数据均录入计算机，然后利用NTSYS 2. IOe生物学软件进行相似性数据分析，相似系数采用Dice、SM和Jaccard系数进行UPGMA聚类。1. 2. 5核心种质的构建
利用相似系数Dice、SM和Jaccard估测遗传距离，用NTSYSpc-2. IOe软件进行 UPGMA聚类分析，根据Hu等(2000)的多次聚类方法(Hu J, Zhu J，Xu H M. Methods of constructing core collections by stepwise clustering with three sampling strategies based on the genotypic values of crops. Theoretical and Applied Genetics, 2000，101:沈4力68)，利用张春雨等(2009)提出的位点优先取样策略(张春雨，陈学森，张艳敏等.采用分子标记构建新疆野苹果核心种质的方法.中国农业科学[J]，2009， 42(2) :597-604)构建核心种质。1. 2. 6核心种质的评价与确认
通过P0PGENE 1.32来计算等位基因数(A)、Nei，s基因多样度(He)、香农信息指数 (Ho)，用SPSS 13. 0软件进行t检验和计算核心种质相对于原种质的保留率来确认其代表性，然后采用柱坐标轴分析法来确认核心种质。2结果与分析
2. 1 EST-SSR的特点与多态性
从3391条荔枝EST序列中，筛选出305条含有SSR，比例为8. 99%，而陈海梅(2005)在小麦上得到比例为1.34%，说明荔枝的EST序列中含有丰富的SSR。根据以上SSR序列共设计了 100对EST-SSR引物对，有62对在荔枝上有扩增产物，有30对引物能96个荔枝样品上扩出清晰，多态性高的条带，共扩出284条带，不同引物的扩增条带在3 18条，平均9. 47， 其中有282条为多态性带，多态率高达99. 30 %。2. 2遗传多样性分析
用EST-SSR标记对96份荔枝资源进行扩增，其遗传多样性见表1.从表看出，每对引物的Nei，s基因多样度范围0. 186 0. 396，香农信息指数范围0. 318 0. 558，由此说明96 份荔枝资源有丰富的遗传多样性。表1 EST-SRR标记下96份荔枝资源的遗传多样性
权利要求
1.荔枝核心种质的构建方法，包括以下步骤1)选取荔枝的嫩叶，按品种提取其基因组DNA，得到荔枝的基因组DNA样品；2)根据荔枝的EST序列，搜索荔枝的EST-SSR，设计EST-SSR引物；3)使用EST-SSR引物进行PCR，扩增荔枝的基因组DNA；4)对PCR产物进行电泳分析，得到其等位基因的存在数据；5)对获得的数据进行分析处理，构建核心种质。
2.根据权利要求1所述的荔枝核心种质的构建方法，其特征在于PCR的扩增程序为 94°C，4min ；94°C, Imin ；50°C, Imin ；72°C，2min ；35 个循环；72°C, IOmin ；4°C，完成扩增。
3.根据权利要求1所述的荔枝核心种质的构建方法，其特征在于使用的EST-SSR引物为 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :59、 SEQ ID NO :60。
全文摘要
本发明公开了荔枝核心种质的构建方法，包括以下步骤选取荔枝的嫩叶，按品种提取其基因组DNA，得到荔枝的基因组DNA样品；根据荔枝的EST序列，搜索荔枝的EST-SSR，设计EST-SSR引物；使用EST-SSR引物进行PCR，扩增基因组DNA；对PCR产物进行电泳分析，得到其等位基因的存在数据；对获得的数据进行分析处理，构建核心种质。本发明方法EST-SSR标记的引物形成和实验操作过程简单，易操作，扩增谱带清晰，结果稳定，适合于分析荔枝资源之间的遗传多样性，在此基础上构建的核心种质几乎代表了原种质全部的遗传多样性，有很好的代表性，对荔枝种质管理、新种质收集及种质繁殖更新具有现实意义，更重要的是促进了荔枝种质资源利用的深入，从而提高荔枝种质资源的利用效率。
文档编号C12N15/10GK102174510SQ20111000182
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月6日 优先权日2011年1月6日
发明者向旭, 孙清明, 李志强, 欧良喜, 蔡长河, 袁沛元, 邱燕萍, 陈洁珍 申请人:广东省农业科学院果树研究所