专利名称：新型双功能抗瘢痕和组织纤维化寡聚核苷酸药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，特别是涉及一种抗瘢痕和组织纤维化治疗用的诱骗寡聚 核苷酸，更具体而言，涉及一种能够同时与转录因子活化蛋白-KActivator protein-1, AP-1)和Smad3特异结合并抑制这两个转录因子活性的诱骗寡聚核苷酸。本发明还涉及这 种寡聚核苷酸的制备及其在治疗瘢痕和组织纤维化疾病中的应用。
背景技术：
病理性瘢痕是创面过度修复和组织纤维化的结果，不仅影响美观，且可导致组织 和器官不同程度的功能障碍，甚至是某些疾病治疗失败的主要原因，如抗青光眼滤过术后， 滤过泡瘢痕的形成是导致抗青光眼手术失败的主要原因。输卵管阻塞再通术后瘢痕形成、 腹腔术后形成肠粘连致肠梗阻，以及因炎性等刺激因素所致的肾纤维化和肝纤维化等疾病 的发生均与组织过度修复和纤维化相关。因此，针对受创后组织过度修复和组织纤维化的 形成机制，设计、研发并制备治疗病理性瘢痕和组织纤维化疾病的药物成为本领域的研究 执占之一。目前用于治疗病理性瘢痕和组织纤维化的主要措施包括以下几个方面(1)细胞 因子抑制剂如TGF-β 2的单克隆抗体、TGF-β 2受体阻滞剂、核心蛋白多糖(Decorin)、 TGF-β 2反义寡核苷酸(OGN)、IL-I受体阻断剂、整合素抗体等；(2)抑制成纤维细胞的 增殖与迁移如5-氟尿嘧啶(5-Fu)、丝裂霉素c(MMC)、伊洛马司他(ilomastat)、苏拉明 (Suramin)、光动力疗法、β射线局部照射、Ρ21基因转染等方法；(3)抑制早期炎症的发 生包括皮质类固醇及非激素类消炎药两类；(4)抑制胶原合成与收缩如β氨基丙腈 (β APN)、D青霉胺等；(5)增加细胞外基质的降解如组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、尿激 酶、肝素等；(6) —些中药制剂抑制成纤维细胞的增殖如丹参、苦参碱、川芎和积雪苷等。上述抗瘢痕和组织纤维化药物对过渡性瘢痕形成和组织纤维化的治疗具有一定 的疗效，但也存在一些无法回避的问题，如5-氟尿嘧啶和丝裂霉素是很强的细胞有丝分裂 抑制剂，毒副作用较大，可造成伤口不愈合等一些严重并发症；而针对TGF-β 2的抑制剂是 抗瘢痕和纤维化的研究热点，虽然其也可减轻瘢痕的形成和组织纤维化，但也存在明显不 足，首先，其不能抑制TGF-β 1和TGF-i3 3介导的瘢痕化和纤维化作用；其次，我们知道瘢痕 形成和纤维化是多个细胞因子综合作用的结果，阻断单一细胞因子的生物学效应并不能达 到彻底减少瘢痕形成和纤维化的目的；此外，如针对胶原等细胞外基质的合成与降解的药 物，由于其不能消除细胞外基质合成的始动因素，以及阻滞成纤维细胞的增殖效应，其抗瘢 痕和纤维化的作用也就受到了限制。综上所述，为了预防病理性瘢痕的形成和组织纤维化， 必须以病理性瘢痕形成和组织纤维化的关键环节为突破口，寻找特异高效的抗瘢痕和纤维 化药物。伤口愈合是一个错综复杂的生物学过程，包括炎症产生、细胞增生、纤维组织增生 和组织重塑(瘢痕形成)四个阶段。细胞因子在伤口愈合过程中占有非常重要的作用，参与 伤口愈合的全过程，众多的细胞因子形成网络，共同调控成纤维细胞等各种效应细胞的增生和代谢活动，维持胶原等细胞外基质沉积与降解 之间的动态平衡，并对表皮细胞和血管内皮细胞的增殖、迁移和凋亡活动进行有秩序地调 节。正性和负性的细胞因子在调节伤口愈合的过程中保持平衡状态，一旦平衡被打破，则会 出现增生性瘢痕或不愈合等病理性愈合。比如，伴有过渡炎症反应的伤口，由于IL-1、IL_6 等炎症因子大量分泌，造成细胞因子之间的平衡失调，最终导致增生性瘢痕的形成。TGF-β (transforming growth factor-β，TGF-β )是组织纤维化、创伤修复及 瘢痕形成的关键调控分子之一。研究表明，活化的TGF-β可通过与细胞膜上具有丝/苏 氨酸激酶活性的TGF-β I型和II型受体结合，形成三聚体复合物，后诱导I型受体磷酸 化。磷酸化的I型受体特异性地识别并磷酸化激活TGF-β信号通路的胞内信号分子-Smad 蛋白家族中的受体调节型 Smads (Receptor-regulated Smads, R-Smads)(包括 Smad2 和 Smad3)，活化的R-Smads与Co-Smad (即Smad4)结合成为转录复合物，并进入细胞核内，直 接与靶基因启动子或增强子内的一个回纹结构DNA序列(5' -GTCTAGAC-3')顺式作用元 件，即Smad结合元件(Smad-binding element, SBE)特异性结合，调节TGF-β反应性靶基 因的转录和表达。已证实，许多参与伤口愈合和瘢痕形成的基因，如纤溶酶原激活剂抑制 物-I(PAI-I)、血小板源性生长因子(PDGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、纤维结合素、I型 和III型胶原等基因的增强子或启动子内，均含有SBE反应元件。Smad转录复合物可直接上 调这些基因的转录和表达。另外，Smad转录复合物还可通过与AP-I (c-Fos和c_Jim)、FAST/ R)xH、ATF2、VDR等DNA结合蛋白(即转录因子)结合，与这些转录因子的信号通路发生交 互作用(Cross-talk)，以间接方式，调节TGF-β反应性基因的转录和表达，且这种间接方 式是TGF-β信号通路的主要调节方式。研究发现，Smad3的抑制剂柚皮素(Naringenin) 可明显减弱TGF-β诱导的鼠肝星形细胞合成I型胶原、纤维连接蛋白和PAI-I等细胞外 基质的能力。此外，Smad3基因缺失小鼠肺泡纤维明显减少，肺泡腔呈现进行性扩大，且将 TGF-β 1转染入肺组织也不能诱导肺的纤维化。另外，值得注意的是，TGF-β信号通路除了 通过Smad信号通路转导外，还可通过丝裂素蛋白活化激酶信号途径(MAPK)介导，活化AP-I 等转录因子，调控靶基因的表达。活化蛋白-l(activator protein-1，ΑΡ-1)是一类由Fos蛋白和Jun蛋白同源 或异源二聚体组成的转录因子，能以许多基因启动子或增强子内顺式作用元件AP-I位 点(5' -TGAGTGA-3')，即佛波酯反应元件结合，参与介导多种与炎症、细胞增殖、组织纤 维化和细胞外基质沉积等相关基因的转录和表达。在伤口愈合的过程中，许多细胞因子 (TGF- β、PDGF, EGF、bFGF、IL-I、TNF 等)都能通过 MAPK 信号通路激活 AP-I，活化的 AP-I 进入细胞核内调节靶基因的表达。目前已证实，参与伤口愈合和瘢痕形成的许多基因，如 TGF-β、IL-I β、IL-8、ICAM-I、丝状分裂控制蛋白_1 (MCP-I)、细胞周期素D1、纤维连接蛋 白、层粘连蛋白B、I型胶原、金属蛋白酶组织抑制物-I(TIMP-I)等基因的启动子或增强子 内均含有AP-I位点，其可调控这些基因的转录和表达。抑制AP-I的信号通路，可明显减少 增生性瘢痕的形成和组织纤维化。综上所述，Smad信号通路和AP-I信号通路是两条与伤口愈合、瘢痕形成和组织纤 维化关系最为密切的信号通路。Smad信号通路主要参与TGF-β诱导的应答反应，还可上调 Ap-I的JunB亚基转录和表达，以及与c-Fos和c-Jun亚基结合，协助AP-I诱导与伤口愈合 和瘢痕形成相关基因的表达。而AP-I信号通路则是许多刺激因素的共同信使传导分子，不仅介导伤口愈合早期的炎症反应相关基因的表达，还是伤口愈合和瘢痕形成相关基因的调 控者。此外，AP-I是伤口愈合和瘢痕形成过程中信号放大效应的始动者，其可被TGF-β活 化，而活化的AP-I又可上调TGF-β的表达，由此放大伤口愈合的信号。总之，Smad和AP-I 两条信号通路相互协调，共同参与介导了伤口愈合和瘢痕的形成。由此，我们认为，如能同 时成功抑制这两条信号通路，将能有效抑制伤口愈合过程中病理性瘢痕的形成和组织纤维 化。目前，同时针对这两条信号通路的抑制剂国内外均未见报道。从Smads和AP-I的活化途径不难看出，Smads和AP-I与靶基因启动子或增强子内 的DNA顺式作用元件结合是特异性的，只有直接干预Smads和AP-I与DNA顺式作用元件相 结合，才能达到真正意义上的特异性控制瘢痕的形成和组织纤维化，有效阻滞增生性瘢痕 形成和组织纤维化过程中的信号放大效应和成纤维细胞的过度增殖，减少细胞外基质的过 度合成，同时加强细胞外基质的降解速度。而对Smads和AP-I活化的上下游途径进行干预 则难以达到这一目的。此外，在寻找阻断Smads和AP-I的活化策略时，应把握“适度抑制” 原则，而不是“完全封闭/永久阻断”。故研制特异性的Smads和AP-I抑制剂(而不是阻断 剂)将为最终获得高效、低副作用的理想抗瘢痕药物提供可能。而应用转录因子“诱骗”策 略可达到同时拮抗Smads和AP-I活化的目的，且这一策略是实现这一理想治疗病理性瘢痕 形成和组织纤维化的最佳选择之一。自1996年第一个经美国FDA批准的转录因子E2F “诱骗”策略(decoy strategy) 用于治疗血管旁路移植术后新生内膜增生(neointimal hyperplasia in vein bypass grafts)病人以来，许多研究已经报道了该策略作为体内基因治疗的效果。其基本原理是 合成与顺式作用元件相一致的双链寡聚脱氧核苷酸(被称为诱骗ODNs)，转染入细胞，竞争 性抑制转录因子与顺式作用元件的结合，干扰转录因子的DNA结合活性及其后续基因的表 达。由于该策略具有以下优点(1)潜在的药物靶点(转录因子)；( 诱骗ODNs的合成相 对简单且可靶向特异的组织；(3)不必弄清转录因子靶分子的精确分子结构；(4)诱骗ODNs 可阻断与同一顺式作用元件结合的多种转录因子的效应，且也可阻断同一转录因子所调控 的多个靶基因的表达，其作用能力比反义ODNs更强。因此国外众多学者一致认为该策略可 作为治疗某些人类疾病一种有效的手段。目前，有关单独靶向Smad或者AP-I的“诱骗”策 略，已应用于探讨Smad和AP-I在癌症、心血管和肾脏等相关疾病中的作用机制，以及对这 些疾病的治疗性研究，体外实验和动物试验结果已显示出确切而诱人的结果。这与该策略 具有拮抗Smad或AP-I活性的特异性、竞争抑制性(不是完全阻断)、使用时间及剂量的可 控性等特性有关。为此，我们以介导瘢痕形成和组织纤维化的关键调控分子Smads和AP-I为靶点， 应用核转录因子的诱骗策略，设计并合成可同时与Smad和AP-I结合，并具有同时抑制两种 转录因子转录活性的双功能诱骗寡核苷酸，同时证实此寡核苷酸能高效抑制成纤维细胞的 增殖，胶原的合成，有效阻止瘢痕的形成和组织纤维化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗瘢痕和组织纤维化的核酸药物。本发明所述药物包含既能与AP-I高亲和结合的AP-I顺式作用元件，又能与Smad 高亲和结合的Smad顺式作用元件的双链诱骗寡核苷酸。
其中，所述双链诱骗寡核苷酸包括核心序列TGACXTCAGACA或CAGACATGACXTCA或 GTCTAGACTGACXTCA或其功能等价物，其中所述核苷酸序列中，X代表G或者缺失。其中，所述双链诱骗寡核苷酸包括序列TGACGTCAGACA或TGACTCAGACA或其功能等 价物。其中，所述双链诱骗寡核苷酸包括序列CAGACATGACGTCA或CAGACATGACTCA或其功 能等价物。其中，所述双链诱骗寡核苷酸包括序列GTCTAGACTGACGTCA或GTCTAGACTGACTCA或 其功能等价物。优选的核酸，序列如下:ASCES101A 序列2 ；ASCES101B 序列3 ；ASCES101C 序列 4 ；ASCES101D 序列 5 ；ASCES102A 序列 7 和序列 8 ；ASCES102B 序列 9 ；ASCES103A 序列 11 和序列 12 ；ASCES103B 序列 13。本发明是一系列序列特异的诱骗核酸，可特异性结合转录调控因子。本发明的药 物通过下调smad和AP-I的转录活性，从而抑制成纤维细胞的过度增殖，以及细胞外胶原等 基质的分泌，达到治疗病理性瘢痕和组织纤维化的目的。为此，本发明另一个目的在于，本发明的核酸在制备抗AP-I和Smad转录活性的药 物中的应用。所述抗AP-I和Smad转录活性的药物是治疗AP-I和Smad异常表达或活化引 起的瘢痕化和组织纤维化相关疾病的药物；所述药物是治疗纤维化疾病、异常伤口愈合、异 常骨生成、免疫/炎症相关疾病或抗青光眼滤过性手术后抗愈合的药物。本发明的目的可通过以下措施来达到抗瘢痕和组织纤维化药物的设计是将转录因子特异结合的序列作为药物诱骗核 酸的核心序列，并适当增加核心序列的侧翼长度，使其易形成空间结构，以加强药物的稳定 性及与靶因子的亲和力。药物ASCES101、ASCES102和ASCES103系列是为调控AP-I和Smads的过度活化 而设计。将转录因子AP-I顺式作用元件和转录因子Smads顺式作用元件以不同的先后顺 序融合成交错重叠的寡核苷酸TGA(C/G)TCAGACA(序列1)、CAGACATGACGTCA(序列6)和 GTCTAGACTGACGTCA(序列10)，以这些寡核苷酸作为药物诱骗核酸的核心序列，竞争结合 AP-I和Smads，抑制AP-I和Smads的转录活性，下调含AP-I和Smads增强子基因的表达， 从而抑制成纤维细胞的增殖、生长和细胞外基质的分泌，达到治疗病理性瘢痕和组织纤维 化的目的。例如药物ASCES101A由30个核苷酸的序列2组成，含上述核心序列1，并能通 过自身配对形成双链线性DNA结构。药物ASCES101B由28个核苷酸的序列3组成，含上述 核心序列1，并能通过自身配对形成双链线性DNA结构。药物ASCES101C由44个核苷酸组 成的序列4组成，含上述核心序列1，通过自身环化配对形成一个双链DNA发夹结构。药物 ASCES101D由42个核苷酸组成的序列5形成，含上述核心序列1，通过自身环化配对形成一 个双链DNA发夹结构。药物ASCES102A由M个核苷酸的序列7和8组成，含上述核心序列 6，两个序列配对结合成双链线性DNA结构。药物ASCES102B由44个核苷酸的序列9组成， 含上述核心序列6，通过自身环化成双链DNA发夹结构。药物ASCES103A由沈个核苷酸组 成的序列11和序列12组成，含上述核心序列10，两个序列配对结合成双链线性DNA结构。 药物ASCES1(X3B由46个核苷酸组成的序列13形成，含上述核心序列10，通过自身环化配对 形成一个双链DNA发夹结构。总之，这些诱骗核酸药物，可以设计为以AP-I和Smads顺式作用元件交错形成的序列为核心序列，核苷酸总数为12-46个，并易形成线性、发夹、假结、 茎环、哑铃等多种结构的双链寡聚DNA分子。诱骗核酸药物经DNA全自动合成仪合成，硫代化，脱保护，纯化和冻干，溶于水中， 定性定量测定分析后，进行体外筛选和药效试验，用成纤维细胞作为筛选体系，将细 胞加入96孔培养板，用RPMI1640完全培养液培养24h后，加入脂质体和上述诱骗核酸，继 续于37°C，5%C02中培养48h。用ATP生物素荧光法测定细胞的增殖。筛选结果表明8种 诱骗核酸对细胞均有不同程度的抑制作用，其中ASCES101D的抑制作用最大。这些诱 骗核酸均可开发成为抗瘢痕和组织纤维化药物。具有上述核苷酸核心序列结构的寡聚诱骗DNA可同时与AP-I和Smads结合，并抑 制AP-I和Smads与其顺式作用元件的结合，从而抑制AP-I和Smads的转录活性，即抑制 AP-I和Smads调控各种含其顺式作用元件的靶基因表达。此种结构寡聚诱骗DNA既可以以 DNA形式单独存在，也可与其它核酸和多肽融和，或被甲基化、硫代化、锁核酸化和硼烷磷酸 酯化等修饰，或进行个别碱基的突变、缺失或替代，或与其它物质连接。无论以什么形式存 在，含此结构DNA的物质可能表现出与AP-I和Smads结合，并抑制AP-I和Smads生物学活 性的作用。本发明通过细胞增殖试验筛选，获得的DNA不仅能够竞争性阻断AP-I与其顺式作 用元件的结合，也能够抑制Smad与其顺式作用元件的结合，进而抑制含AP-I和Smads顺式 作用元件的靶基因的表达，具有抗瘢痕和组织纤维化的功能，因而可以成为新的靶向AP-I 和Smads的抗瘢痕和组织纤维化药物或药物前体。本发明的DNA可以用于治疗各种瘢痕和 组织纤维化相关疾病。可以将其作为药物活性成分制备成药物组合物，该组合物根据需要 可以加入一些药物可接受的载体，可以采用制剂学常规技术制备该组合物，本发明的组合 物可以口服，也可以非胃肠道给药，优选的组合物是单位剂量的纳米型喷雾剂、注射剂和软 膏形式。本发明的诱骗DNA可通过化学方式合成，也可将含此序列的核苷酸与其它核酸或 多肽融合或进行化学修饰，用于抑制AP-I和Smads活性为目的的各种瘢痕相关疾病、各种 纤维化疾病以及其它相关疾病的治疗，这对于设计和研制同时靶向AP-I和Smads的高效特 异抗瘢痕和组织纤维化药物具有重要意义。本发明的优点与反义核酸和SiRNA相比，无论是作用机理还是作用效率，诱骗核酸均有着明显 的差异结构存在明显差异，反义核酸和siRNA为单链线性寡聚核酸，诱骗核酸是具有二级 结构的双链DNA ；作用位点也存在明显的差异，反义核酸和siRNA互补于靶基因的转录产物 mRNA的某段序列，而诱骗核酸则直接结合于转录因子(蛋白质)上；另外，用量上也存在明 显的差异，一个拷贝基因可转录出200-300条mRNA，且mRNA具有瞬时性，需要大量的反义核 酸和siRNA才能达到抑制靶基因表达的目的。相反，一种转录因子可控制多种效应基因的 转录，且可被循环利用转录生成多拷贝的效应基因mRNA，然而一个拷贝的转录因子仅需要 一个拷贝诱骗分子即能封阻转录因子的活性，因此相对而言，诱骗核酸药的用量较反义核 酸和siRNA的用量将少1-2个数量级。值得注意的是，因诱骗核酸的核心序列一般在6-12个碱基对之间，链短易降解， 双链不稳定，常温下易解链。而无二级空间结构的诱骗核酸则不易与转录因子蛋白结合，因 此设计药物时需要适当增加碱基，加长链长，增强稳定性及与转录因子的亲和性，其中以回文结构、发夹、十字、茎环和哑铃状等结构最佳。本发明将靶向AP-I和Smads的诱骗核酸有 机融合成一个核酸分子，如此一定程度上增加了诱骗核酸的长度，且这种长度的增加并不 是为了增加诱骗核酸长度，进而添加无效核酸序列，而是在增加长度的同时，赋予了诱骗核 酸的新功能。与若各自设计并合成AP-I和Smads的诱骗核酸，后将其混合成组合药相比， 一方面减少了无效碱基的参入量，节约了药物合成的成本。另一方面又能避免两种诱骗核 酸间可能相互交错配对形成无效二聚体，而降低诱骗核酸的效用。另外，本发明在设计上 也充分考虑诱骗核酸的二级结构及其稳定性，因此诱骗核酸被设计成含有上述核心序列的 14-46碱基之间，可合成出单链，自交形成双链及其二级结构，也可各合成两条单链，杂交形 成双链。另外，因核酸在细胞内极易被核酸酶降解失去活性，因此需修饰保护，以增强其抗 降解能力，提高稳定性。硫代修饰为最常见的保护基团。本发明的另一目的是提供一种含有本发明诱骗核酸药物的药物组合物。本发明的诱骗核酸药物可以将其作为药物活性成分制备成药物组合物，该组合物 根据需要可以加入一些药物可接受的药用载体，制备成任何药用的剂型。其中，所述药物活 性成分占制剂总重量的0. 1-99. 9%，所述药学上可接受的载体以重量计可以是制剂总重量 的0. 1-99. 9%。所述药用载体包括生理盐水等常用载体和缓冲液、脂质体、聚合物等，可以 采用制剂学常规技术制备该组合物。本发明的组合物可以口服，也可以非胃肠道给药，优选 的组合物是单位剂量的纳米型喷雾剂、注射剂和软膏形式。本发明所述的靶向AP-I和Smad 的诱骗核酸药物对纤维细胞的增殖、生长和胞外基质分泌均有抑制作用，在制造抗瘢痕和 组织纤维化药物中具有广泛的应用价值及广阔的市场前景。
图1为ASCES系列诱骗核酸对TGF-1和TGF-2诱导的成纤维细胞的生长抑 制结果。图2A为ELISA方法检测ASCES系列诱骗核酸对AP-I与其顺式作用元件结合竞争 性抑制实验的结果。图2B为ELISA方法检测ASCES系列诱骗核酸对Smad与其顺式作用元件结合竞争 性抑制实验的结果。表1为流式细胞仪检测ASCES系列诱骗核酸对TGF-I诱导的成纤维细胞细胞周期 影响的实验结果表2为流式细胞仪检测ASCES系列诱骗核酸对TGF-2诱导的成纤维细胞细胞周期 影响的实验结果图3A荧光素酶报告基因实验检测诱骗核酸对Ap-I反应性荧光素酶报告基因表达 的抑制效应。图;3B荧光素酶报告基因实验检测诱骗核酸对Ap-I反应性荧光素酶报告基因表达 的抑制效应。
具体实施例方式实施例1、诱骗核酸药物的制备和分析合成八种下述硫代诱骗核酸药物:ASCES101A 序列2 ；ASCES101B 序列3 ；ASCES101C 序列 4 ；ASCES101D 序列 5 ；ASCES102A 序列 7 和序列 8 ；ASCES102B 序列 9 ； ASCES103A 序列 11 和序列 12 ；ASCES103B 序列 13。阴性对照序列正义5' -TGTGGTCATGTGGTCATGTGGTCA-3‘反义5, -TGACCACATGACCACATGACCACA-3‘AP-I 阳性对照序列5' -TGACGTCATGACGTCATGACGTCA-3‘Smad 阳性对照序列正义5 ‘ -ATGCAGACAATGCAGACAATGCAGACA-3 ‘反义5' -TGTCTGCATTGTCTGCATTGTCTGCAT-3‘应用美国PE公司391型DNA合成仪，以亚磷酰胺固相合成法合成所设计的硫代诱 骗核酸。主要原料有四种二异丙基β -氰乙基亚磷酰胺单体腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C) 和胸苷(T)；四种控制孔径玻璃粉(CPG)固相合成柱(A、G、C、T)。盖帽试剂分别为乙酸酐/ 二甲基吡啶/四氢呋喃和1-甲基咪唑/四氢呋喃；硫代反应试剂=Beaucage试剂/乙腈；脱 三苯甲基试剂三氯乙酸/ 二氯甲烷；液体溶剂乙腈和三氯甲烷。合成规模为100D。碱基 单体溶于无水乙腈中，浓度为100豪摩尔，其它试剂浓度及用量按照仪器操作手册进行。合 成过程由仪器程序自动控制。合成产物置于装有浓氨水的密封耐压玻璃瓶中，于55°C 处理15小时，脱去核酸分子上各种碱基保护基团和氨基保护基团。脱保护结束后，挥发脱 去大部分氨气，冻干得白色粉末状粗制品，重溶于缓冲液中，用Wiarmacia Source 30 Q层 析及AKTA层析系统进行纯化。纯化样品经G-15分子筛葡聚糖凝胶层析柱除盐，后冻干得 到白色絮状核酸纯品，储存于-20°C，并取少量样品进行纯度和分子量分析。用毛细管电泳 法和高效液相层析法测其纯度及分子量，要求纯度均大于90%，DNA测序法测定序列完全 正确，核磁共振法测硫代化程度大于98. 5%。实施例2、八种ASCES系列诱骗核酸对L9W成纤维细胞的生长抑制复苏并接种成纤维细胞于细胞培养瓶，在37°C、5 % CO2条件下，用含10 % FBS 的RPMI 1640完全培养液培养细胞；待细胞汇合至70% -80%时，胰酶消化细胞，活细胞计 数后并将细胞浓度调整至2 X IO5个/ml ；于96孔板以每孔100 μ L细胞悬液接种细胞，培 养12小时；后更换成无血清培养液，将细胞随机分成空白对照组、阳性对照组、阴性对照组 和八种ASCES药物组，且每组设3复孔，其中空白对照组仅加入0. 6 μ 1/孔脂质体，其余均 加入0. 6 μ 1/孔脂质体和终浓度为IOOnM的不同诱骗核酸；转染5小时后，更换成含10% FBS的RPMI 1640完全培养液100 μ L，同时加入终浓度5ng/ml的TGF- β 1或TGF- β 2诱导 细胞增殖，在37°C、5% CO2条件下培养72h ；每孔加入ATP提取液100 μ L，混勻后室温下放 置30min，取50 μ L细胞提取液于检测板中，加入荧光素_荧光素酶50 μ L，混勻后置于荧光 分析仪进行检测，测定每孔样品的荧光值。并计算细胞生长抑制率，作为诱骗核酸抑制
细胞增殖的评价指标，细胞生长抑制率=(空白对照组荧光值-药物组荧光值)/空白对照 组荧光值。细胞生长抑制实验结果表明，较随机诱骗核酸相比，本发明的八种ASCES序列药 物以及AP-I和Smad阳性对照诱骗核酸均对细胞的生长均有明显的抑制作用，其中 ASCES102A和ASCES102B对细胞的生长的抑制作用最强，明显强于AP-I和Smad阳性 对照诱骗核酸，见图1。实施例3、ELISA方法检测诱骗核酸对AP-1和Smad与其顺式作用元件结合的竞争 抑制实验
分别将IOpmol的ASCES系列药物稀释于30 μ 1完全结合缓冲液，并以每孔30 μ 1 量加入包被了 Ap-I或Smad顺式作用元件的96孔酶联板(购自美国Active Motif公司的 TransAM Transcription factor assay kits)中；再TPAi秀导的 K—562 细胞核才由 提物(针对Smad则用TGF-β 1诱导的成纤维细胞核抽提物)稀释于20 μ 1完全结合缓 冲液中，后依次加入96孔酶联板中混勻，室温孵育lh。注以3复孔进行各种样品的检测，实 验分组如下空白阴性对照仅加入不含ASCES药物和细胞核抽提物的50μ 1完全结合缓冲 液；空白阳性对照则为加入不含ASCES药物，只含5 μ g核抽提物的50 μ 1完全结合缓冲液； 阴性对照则为加入同等浓度阴性对照诱骗核酸和5 μ g细胞核抽提物的50 μ 1完全结合缓 冲液；阳性对照则为加入同等浓度阳性对照诱骗核酸和5μ g细胞核抽提物的50μ 1完全结 合缓冲液；实验组则为加入含IOpmol的ASCES系列药物，以及5 μ g细胞核抽提物的50 μ 1 完全结合缓冲液。以200 μ 1/孔加入洗脱液洗涤3次，每次細化，去除洗涤液；以1 500 稀释度用抗体结合缓冲液稀释c-fos抗体或Smad3抗体，后以100 μ 1/孔加入稀释的抗体， 室温孵育Ih;再以200 μ 1/孔加入洗脱液洗涤3次，每次細化，去除洗涤液；以1 1000稀 释度用抗体结合缓冲液稀释羊抗兔IgG-HRP 二抗，后以100 μ 1/孔加入稀释的二抗，室温孵 育Ih ；再以200 μ 1/孔加入洗脱液洗涤4次，每次％iin，去除洗涤液；以100 μ 1/孔加入底 物反应液，室温孵育2-20min，待阳性对照液变深蓝色后，以100 μ 1/孔加入终止液终止反 应；于450nm和655nm双波长检测OD值。ASCES系列药物对AP-1或Smad与其顺式作用元 件结合的抑制百分数计算公式为(空白阳性对照OD-ASCES药物OD)/空白阳性对照0D。结果表明，与随机诱骗核酸对照相比，本发明的ASCES系列诱骗药物均能明显抑 制AP-I的DNA结合活性。但对Smad的DNA结合活性的抑制作用，除ASCES102A和ASCES102B 外，本发明的其它诱骗核酸对Smad的DNA结合活性虽也有一定的抑制作用，但抑制效应不 甚明显，如图2A和2B所示。实施例4、流式细胞仪检测诱骗核酸对成纤维细胞细胞周期的影响将细胞以1\105个/平板接种于6011平板中，在371、5% CO2条件下，用含 10% FBS的RPMI 1640完全培养液培养细胞12小时；后更换成无血清培养液，将细胞随机 分成空白对照组、阳性对照组、随机诱骗核酸对照组以及ASCES102A和ASCES102B药物组， 且每组设3复孔，其中空白对照组仅加入12 μ 1/孔脂质体，其余均加入12 μ 1/孔脂质体和 终浓度为IOOnM的不同诱骗核酸；转染5小时后，更换成含10% FBS的RPMI1640完全培养 液，同时加入终浓度5ng/ml的TGF-β 1或TGF-β 2诱导细胞，在37°C、5% CO2条件下培养 24h ；收获细胞，300g离心5min，弃上清，后将细胞团重悬于残留液体中；缓慢滴加200 μ 1 70%的乙醇进行细胞固定，在滴加乙醇的同时注意旋涡震荡细胞。后将细胞于4°C放置 30min ；用2ml含2% BSA的PBS洗细胞一次，300g离心5min，弃上清，后将细胞团重悬于残 留液体中；于细胞悬液中加入0. 5ml的Pl/foiase溶液，混勻，分析前室温孵育15min。最后 进行流式细胞仪分析。如表1和表2显示，与随机诱骗核酸相比，AP-I阳性诱骗核酸、Smad阳性诱骗核 酸、ASCES102A和ASCES102B药物处理的细胞，无论是TGF- β 1还是TGF- β 2诱导细胞均被 明显阻滞于S期，特别是对TGF-β 2诱导细胞阻滞效应最为明显。与AP-I和Smad的阳性 诱骗核酸相比，ASCES102A和ASCES102B药物对细胞的阻滞效应得到明显的增强。相比较 而言，虽没有统计学差异，ASCES102B药物对细胞的阻滞效应强于ASCES102A。
表1诱骗核酸对TGF-β 1诱导的细胞细胞周期的影响
权利要求
1.一种具有治疗作用的核酸，其特征在于，所述核酸为包含既能与AP-I高亲和结合的 AP-I顺式作用元件，又能与Smad高亲和结合的Smad顺式作用元件的双链诱骗寡核苷酸。
2.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于，包括核心序列TGACXTCAGACA或 CAGACATGACXTCA或GTCTAGACTGACXTCA或其功能等价物，其中所述核苷酸序列中，X代表G 或者缺失。
3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核心序列为TGACGTCAGACA或 TGACTCAGACA或其功能等价物；序列CAGACATGACGTCA或CAGACATGACTCA或其功能等价物； GTCTAGACTGACGTCA 或 GTCTAGACTGACTCA 或其功能等价物。
4.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸序列如下ASCES101A序列2 ； ASCES101B 序歹Ij 3 ；ASCES101C 序列 4 ；ASCES101D 序列 5 ；ASCES102A 序列 7 和序列 8 ； ASCES102B 序列 9 ；ASCES103A 序列 11 和序列 12 ；ASCES103B 序列 13。
5.权利要求1-3所述的任何一项核酸在制备抗AP-I和Smad转录活性的药物中的应用。
6.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗AP-I和Smad转录活性的药物是治 疗AP-I和Smad异常表达或活化引起的瘢痕化和组织纤维化相关疾病的药物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物是治疗纤维化疾病、异常伤口愈 合、异常骨生成、免疫/炎症相关疾病或抗青光眼滤过性手术后抗愈合的药物。
8.一种含有权利要求1所述的核酸的药物组合物。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，含有药物可接受的载体。
10.一种权利要求1所述的核酸的制备方法，其特征在于，使用DNA合成仪合成。
全文摘要
本发明涉及医药领域，特别是涉及一种新型双功能抗瘢痕和组织纤维化寡聚核苷酸药物，所述核酸为包含既能与AP-1高亲和结合的AP-1顺式作用的元件，又能与Smad高亲和结合的Smad顺式作用的元件。
文档编号C12N15/113GK102146411SQ201110001699
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月6日 优先权日2011年1月6日
发明者徐祥, 梁华平, 袁洪峰, 邢伟, 郭韡, 黄宏 申请人:中国人民解放军第三军医大学第三附属医院