专利名称：蛋白Mip在对贝氏柯克斯体的免疫保护中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白Mip在对贝氏柯克斯体的免疫保护中的应用。
背景技术：
贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)为专性吞噬细胞内寄生的革兰阴性小杆菌。 该菌对外界环境抵抗力很强，对人和动物有极强的感染力，可通过气溶胶扩散经呼吸道进 入体内导致人及动物发生感染并导致Q热。Q热是一种呈世界性分布的人兽共患病，在我国分布广泛。人类Q热临床表现多 样。急性Q热表现为发热、头痛、肌肉酸痛，常伴有肺炎、肝炎等；慢性Q热表现为心内膜炎、 肉芽肿性肝炎、骨髓炎等。近年来Q热性脑膜炎、肾小球肾炎、孕妇流产等亦有报道。虽然 抗生素治疗对Q热有效，但由于Q热能以气溶胶的形式传播，一旦流行难以控制。另外慢性 Q热需要较长的疗程(可长达12个月)，且易复发。因此采用有效的疫苗作预防接种是防 止Q热发生和流行的最有效手段。在过去几十年中，Q热疫苗的研制主要集中在灭活疫苗和化学提取的亚单位疫苗 上。灭活疫苗和化学提取的亚单位疫苗均需要鸡胚大量繁殖贝氏柯克斯体进行制备，但是 鸡胚繁殖量低，提取纯化贝氏柯克斯体的防护要求高，工艺复杂，成本昂贵，因此难以大量 制备和推广使用。随着对不同组织来源树突状细胞研究的深入，人们发现体内DCs主要分为髓系 DCs和淋巴系DC树突状细胞两大类。前者与单核细胞、粒细胞有共同的祖细胞，而后者与T 细胞、B细胞有共同的前体细胞。研究者在人胎肝、脐血、骨髓、脾脏、人外周血以及小鼠的 骨髓和外周血中分离出髓系前体，在体外合适的培养条件及刺激因素下获得了具有典型形 态、表型及功能的树突状细胞。髓系树突状细胞的分化发育分为4个阶段前体阶段、未成 熟期、迁移期和成熟期。正常情况下绝大多数体内髓系树突状细胞(主要位于非淋巴组织) 处于非成熟状态，未成熟的树突状细胞表达低水平的协同刺激分子和粘附分子，体外激发 混合淋巴细胞反应(mixed lympho2cyte reaction, MLR)的能力较弱，但具有极强的摄取 和加工处理抗原的能力。在外源性抗原、炎症刺激因素等共同影响下，它们能从非淋巴组织 进入次级淋巴组织并逐渐成熟。在迁移过程中存在迁移期树突状细胞，这类树突状细胞主 要存在于输入淋巴管、外周血、肝脏血液及淋巴组织，经过淋巴和血液循环，从输入淋巴管 进入淋巴结。进人次级淋巴组织后，在适当的刺激因素下，树突状细胞逐渐成熟。成熟的树 突状细胞表达高水平MHC-I、MHC-II类分子、协同刺激分子(⑶80、⑶86)、粘附分子(C040、 ⑶44、CM4)、整合素及特征性标记(CDla、⑶11c、⑶83)等，并能分泌IL-12、IL-U IL-6、 IL-8、TNF- α等细胞因子，能分泌Thl型细胞因子，因而它们能有效地将抗原提呈给初始T 细胞并使之激活，促进细胞介导的免疫应答。现有研究中一般按照如下方法体外培养获得未成熟期的髓系树突状细胞从小鼠 股骨骨髓分离出骨髓细胞，用RPMI1640全培养基培养骨髓细胞，培养7天，得到未成熟期的 树突状细胞。
RPMI1640全培养基按照如下方法制备将小牛血清、链霉素、青霉素、细胞因子 GM-CSF、细胞因子IL-4和RPMI1640细胞培养基混合，小牛血清、链霉素、青霉素、细胞因子 GM-CSF、细胞因子IL-4和RPMI1640细胞培养基的配比为10mg小牛血清100 μ g链霉 素100U青霉素20ng GM-CSF 10ngIL-4 lmlRPMI1640细胞培养基，得到的混合物 即为RPMI1640全培养基。
发明内容
本发明的一个目的是提供SEQ ID NO :1所示蛋白的新用途。本发明所提供的EQ ID NO 1所示蛋白的新用途是SEQ ID NO=I所示蛋白在制备 Q热疫苗中的应用或SEQ ID NO :1所示蛋白在制备针对Q热的保护性抗原中的应用。上述应用中，所述Q热是由贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)引起的。实际应用中，SEQ ID NO :1所示蛋白可以与佐剂混合，制成Q热疫苗，还可用SEQ ID NO :1所示蛋刺激白抗原呈递细胞(树突状细胞)，将刺激后的树突状细胞作为Q热疫
田ο本发明的另一个目的是提供一种制备针对Q热的保护性抗原的方法。本发明所提供的制备针对Q热的保护性抗原的方法，包括如下步骤用SEQ ID NO :1所示蛋白刺激离体的未成熟期的树突状细胞，刺激后的树突状细胞即为针对Q热的保 护性抗原。上述方法中，所述刺激的方法包括如下步骤将所述SEQ ID NO 1所示蛋白、所述 树突状细胞和用于培养树突状细胞的细胞培养基共同孵育。上述任一所述方法中，所述树突状细胞与所述SEQ ID NO :1所示蛋白的配比为 5 X IO5 个10ug。上述任一所述方法中，所述共同孵育的时间为Mh。上述任一所述方法中，所述共同孵育在温度为37°C、二氧化碳体积浓度为5%的 条件下进行。上述任一所述方法中，所述用于培养树突状细胞的细胞培养基按照如下方法制 备将小牛血清、链霉素、青霉素、细胞因子GM-CSF、细胞因子IL-4和RPMI1640细胞培养基 混合，小牛血清、链霉素、青霉素、细胞因子GM-CSF、细胞因子IL-4和RPMI1640细胞培养基 的配比为10mg小牛血清IOOyg链霉素100U青霉素20ng细胞因子GM-CSF IOng 细胞因子IL-4 Iml RPMI1640细胞培养基，得到的混合物即为所述用于培养树突状细胞 的细胞培养基。上述任一所述方法中，所述Q热是由贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)引起的。由上述任一所述方法得到的针对Q热的保护性抗原也属于本发明的保护范围。本发明的最后一个目的是提供一种制备Q热疫苗的方法。本发明所提供的制备Q热疫苗的方法，包括如下步骤将SEQ ID NO :1所示蛋白与 佐剂混合，得到Q热疫苗。由上述方法得到的Q热疫苗也属于本发明的保护范围。本发明证明贝氏柯克斯体重组膜蛋白Mip可以作为一种抗原蛋白，能够刺激机体 产生免疫应答对抗贝氏柯克斯体毒株攻击，为具有Q热疫苗功能的保护性抗原。通过基因工程方法制备蛋白Mip，操作简便，成本低，产量高。用蛋白Mip作为Q热疫苗，克服了现有 技术中疫苗制备困难的缺陷。本发明属于艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治科技重大专项中内容，项目名 称传染病病原体诊断和组合检测技术研究；课题编号2008ZX10004-002。本发明对国家利 益或公共利益具有重大意义，迫切需要采取专利方式予以保护。
图1为蛋白电泳检测。图2为蛋白抗原Mip的免疫保护效果评价(实时荧光定量PCR检测免疫小鼠体内 贝氏柯克斯体拷贝数。图3为检测刺激后的树突状细胞的分子表达。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。贝氏柯克斯体新桥株(Coxiella burnetii)Xinqiao strain 在文献"Wen，B.， S. Yu, G. Yu, Q. Li, and X. Zhang. 1991. Analysis of proteins andlipopoIysaccharides from Chinese isolates of Coxiella burnetii with monoclonalantibodies. Acta Virol 35 :538-544. ”中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获 得。实施例1、抗原蛋白Mip的制备载体pET_32a(+)购自Novagen公司，产品目录号为69015。大肠杆菌BL21购自 Novagen公司，产品目录号为69450。蛋白Mip的编码基因制备以贝氏柯克斯体新桥株(Coxiella burnetii)的基 因组DNA为模板，用引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；用限制性内切酶BamHI和 XhoI酶切PCR扩增产物，回收目的基因片段；用限制性内切酶BamHI和B10I酶切载体 pET-32a(+)，回收载体大片段；将目的基因片段和载体大片段连接，得到重组载体；PCR扩 增的条件94°C预变性 5min，95°C 30sec、55°C 30sec、72°C 1. 5min，循环；35 次，72°C 延伸 7min。5， ATAGGATCCATGAAACGATTGATTTTACC 3， (BamHI)；5’ ATACTCGAGCTTTTTTACAGAAATTAAATTT 3， (XhoI) 重组菌的制备将重组载体转入出发菌大肠杆菌BL21中，得到重组菌。验证将 重组菌接入含有安苄抗性(Amp+)的固体LB平板培养基中，抗性筛选，挑取单性克隆；将单 克隆接入LB液体培养基中，培养，提取质粒，进行测序，结果在载体pET-3h (+)的BamHI和 BioI酶切位点间插入的基因序列如SEQ ID NO :2所示，表明构建的载体正确。表明构建的 载体正确。该基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO :1所示，将该蛋白记作Mip。蛋白表达将阳性重组菌接入安苄抗性(Amp+)LB液体培养基中，37°C震摇过夜，次 日按1 100接种新鲜安苄抗性(Amp+)LB液体培养基，37°C震摇至OD6tltl = 0. 4，加入诱导 剂IPTG，浓度为0. 4mM，于37°C继续震摇4小时，得到发酵液。
蛋白纯化取诱导表达的发酵液100ml，8000rpm/min离心5min，集菌，弃上清。用 30ml裂解缓冲液重悬菌体，以25%振幅超声破碎(超3s，停9s) 1小时。取出超声裂解物， 以12000rpm离心20min，弃掉沉淀，收集上清液。向上清液中加入IOml回收缓冲液后混勻， Ih后以12000rpm离心20min，弃掉沉淀，收集上清液。将上清液与^il Ni-NTA混合，室温 200rpm振荡混勻4h，使目的蛋白与Ni-NTA完全结合。吸掉上清，依次加入含6M OM(6M、 5M、4M、3M、2M、1M、0M)尿素的复性缓冲液逐级复性；每次加入复性缓冲液后混勻，室温静置 作用4h。待加入含OM尿素的复性缓冲液作用4h后，倒入纯化空柱中，加入IOml洗涤缓冲 液洗涤，并控制流速为3ml/min。待液体流净，加入洗脱缓冲液，共洗脱4次，每次0. 5ml，将 每次收集的洗脱液合并，即得到目的蛋白溶液。每1升裂解缓冲液按照如下方法制备将50mmol NaH2PO4 · H2O、300mmol NaCl、 IOmmol咪唑和水混合，用NaOH调节pH至8. 0，用水定容至1L，得到裂解缓冲液。0. lmol/L Tris-Cl 缓冲液配制将 12. llgTris、800mL ddH20 禾口 49mL HCl 混合，滴 加浓盐酸调PH至8. 0，用ddH20定溶至IOOOmL,得到0. lmol/L Tris-Cl缓冲液。每1升回收缓冲液按照如下方法制备将IOOmmol NaH2PO4 ·Η20、0. IL Tris-Cl缓 冲液(即IOmmol Tris)、8mol尿素和水混合，用NaOH调节pH至8. 0，用水定容至1L，得到 回收缓冲液。复性缓冲液制备每1升含6M尿素复性缓冲液按照如下方法制备将500mmol NaCl,0. 2L Tris-Cl 缓冲液、6mol尿素、0. 2L甘油和水混合，调节pH至7. 4，用水定容至1升，得到含6M尿素复 性缓冲液。每1升无尿素复性缓冲液按照如下方法制备将500mmOl NaCl,0. 2L Tris-Cl缓 冲液、0. 2L甘油和水混合，调节pH至7. 4，用水定容至1升，得到无尿素复性缓冲液。5M-1M尿素复性缓冲液由6M尿素复性缓冲液和无尿素复性缓冲液不同体积配比 得到。每1 升洗涤缓冲液组成将 50mmol NaH2PO4 'H2O^OOmmol NaCl、20mmol 咪唑和水 混合，用NaOH调节pH至8. 0，用水定容至1L，得到洗涤缓冲液。每1 升洗脱缓冲液组成将 50mmol NaH2PO4 · H20、300mmol NaCl、250mmol 咪唑、 0. 3L甘油和水混合，用NaOH调节pH至8. 0，用水定容至1L，得到洗脱缓冲液。每1升LB液体培养基组成将IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物、IOg氯化钠和水混 合，用水定容至1L，得到LB液体培养基。将得到的蛋白溶液进行电泳检测，结果如图1所示。Mip蛋白的分子量大小为 25+17 = 42KD，与预期一致。同时以转入空载体pET_32a(+)的BL21(DE3)作为对照重组菌。发酵该对照重组 菌得到的蛋白为载体pET-32a(+)上的标签蛋白TrxA，其大小为17KD。表明制备的蛋白正确。实施例2、抗原蛋白Mip的应用一、制备针对Q热的保护性抗原1、未成熟期的树突状细胞的制备BALB/c小鼠购自购自军事医学科学院实验动物中心。
从BALB/c小鼠股骨骨髓分离出骨髓细胞取BALB/c小鼠股骨，用眼科剪剪掉两侧 股骨头，将吸满ImlPBS缓冲液的注射器针头插入骨腔中，并缓慢推动注射器冲洗，从骨腔 中冲洗出单一骨髓细胞悬液。用RPMI1640全培养基调整骨髓细胞数至IX 106/ml，并转入六孔培养板 (9. 6X6cm2)，在温度为37°C、二氧化碳体积浓度为5%的条件下培养，于培养第3，5天每孔 分别更换:3mlRPMI1640全培养基，如此培养7天，得到未成熟期的树突状细胞。RPMI 1640全培养基按照如下方法制备将小牛血清、链霉素、青霉素、细胞因子 GM-CSF、细胞因子IL-4和RPMI1640细胞培养基混合，小牛血清、链霉素、青霉素、细胞因子 GM-CSF、细胞因子IL-4和RPMI1640细胞培养基的配比为10mg小牛血清100 μ g链霉 素100U青霉素20ng GM-CSF IOng IL-4 lmlRPMI1640细胞培养基，得到的混合物 即为RPMI1640全培养基。RPMI1640细胞培养基购自Hyclone，产品目录号为SH30809. 01。小牛血清购自 Hyclone，产品目录号为SH30087. 02。链霉素购自Sigma，产品目录号为3810_74_0。青霉素 购自Sigma，产品目录号为69-52-3。细胞因子GM-CSF购自P印rol^ech公司，产品目录号为 315-03-20。细胞因子IL-4购自P印rol^ech公司，产品目录号为214-14-20。2、用抗原蛋白Mip刺激未成熟期的树突状细胞将5X IO5个未成熟期的树突状细胞用RPMI1640全培养基按照每孔Iml接种于六 孔板，分别于不同孔内加入IOug的MipUOug TrxA、2ug大肠杆菌脂多糖LPS、25ul蛋白洗 脱缓冲液，同时设置未加任何物质的细胞培养孔，将其置37°C、5% CO2孵育Mh，得到刺激 后的树突状细胞。将接受不同抗原刺激M小时后的树突状细胞按5X 106cellS/ml重悬于 PBS缓冲液，得到细胞悬液，用此细胞悬液进行接种。每1升磷酸盐缓冲液(PBS)按照如下方法制备将8g NaCl,0. 2g KCl、 3. 53gNa2HP04. 12H20、0. 24g KH2PO4 和水混合，用水定容至 1 升。大肠杆菌脂多糖LPS购自Sigma，产品目录号为L2880。3、检测刺激后的树突状细胞的分子表达情况将刺激后的树突状细胞分别用不同标记的单抗染色FITC-抗⑶11c，PE-抗 CDllb, PE/Cy5-抗 CD40、CD80、CD86 及 MHC-II，包括同型对照 FITC-Hamster IgG, PE-Rat IgG2b, PE/Cy5-Rat IgG2a, Hamster IgG及IgG2b。染色前加入Fc受体阻断剂孵育。染色 后细胞经FACScalibur流式细胞仪分析，树突状细胞至少收集10000个。最后用CellQuest 软件分析数据。Mock表示未接受任何抗原刺激的树突状细胞，ElutionbufTer表示接受蛋 白洗脱缓冲液刺激的树突状细胞。FITC-标记的抗 CDllc (N418)BioLegend 公司117305
FITC-标记的 Hamster IgGBioLegend 公司402006
PE-标记的抗 CDllb (Ml/70)BioLegend 公司101207
PE-标记的 Rat IgG2bBioLegend 公司400607
PE/Cy5-标记的抗 CD40 (1C10)BioLegend 公司124617
PE/Cy5_ 标记的 Rat IgG2aBioLegend 公司400509
PE/Cy5-标记的 Hamster IgGBioLegend 公司400909
PE/Cy5-标记的 IgG2bBioLegend 公司400315
PE/Cy5_ 标记的抗 CD80(16_10A1) BioLegend 公司 104711PE/Cy5_ 标记的抗 CD86 (GL-I)BioLegend 公司 105015E/Cy5-标记的抗 MHC-II(M5/114. 15. 2) BioLegend 公司 107611Fc 受体阻断剂 anti_CDl6/32(93)BioLegend 公司 101；314结果如图3所示。结果显示Mip刺激后的树突状细胞、TrxA刺激后的树突状细 胞细胞、LPS刺激后的树突状细胞均表达较高水平的MHC-II和共刺激因子CD40，CD80， CD86，无统计学差异；Mock组和Elution buffer组均表达较低水平的MHC-II和共刺激因 子⑶40，⑶80，⑶86。表明，Mip，TrxA, LPS抗原的刺激能促进树突状细胞的成熟与活化。二、免疫保护抗原激活树突状细胞的保护性评价实验组免疫将Mip抗原刺激的树突状细胞接种BALB/c小鼠，接种量为5X IO5个/只， 接种方式为腹腔接种。攻毒从接种当天计起(接种当天记作第O天)，14天后，用贝氏柯克斯体 (Coxiellaburnetii)对免疫小鼠进行攻毒，攻毒剂量为IXlO6拷贝数/只。保护性检测从攻毒当天计起(攻毒当天记作第O天)，攻毒7天后处死小鼠，取 IOmg脾组织提取DNA，采用实时荧光定量PCR检测其脾脏中贝氏柯克斯体载量。PCR引物如下Fp (5，-CGGCTGAATTTAAGCGATTTA TTTT-3，)Rp(5， -CGTAACCACACACGCATCTCA-3，)TaqMan MGB2probe(5'-CCGAACC2CATTGCAA-3，)同时设如下对照组各对照组除了接种的树突状细胞不同外，其余均与实验组相 同。TrxA对照组接种用pET32A载体上的标签蛋白TrxA刺激后的树突状细胞。LPS对照组接种大肠杆菌脂多糖LPS刺激后的树突状细胞。阴性对照组(Ctrl)接种未经任何抗原刺激的树突状细胞。实验设3次重复，结果数据以1± s表示。对定量PCR结果运用SAS9. 1软件进行单 因素多水平方差分析及两两比较。结果如表1和图2。表1、检测结果
权利要求
1.SEQ ID NO :1所示蛋白在制备Q热疫苗中的应用或SEQ ID NO :1所示蛋白在制备针 对Q热的保护性抗原中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述Q热是由贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)引起的。
3.一种制备针对Q热的保护性抗原的方法，包括如下步骤用SEQ ID NO :1所示蛋白 刺激离体的未成熟期的树突状细胞，刺激后的树突状细胞即为针对Q热的保护性抗原。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述刺激的方法包括如下步骤将所述 SEQ ID NO :1所示蛋白、所述树突状细胞和用于培养树突状细胞的细胞培养基共同孵育。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述树突状细胞与所述SEQIDNO=I 所示蛋白的配比为5X IO5个IOug;和/或，所述共同孵育的时间为Mh。
6.根据权利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于所述共同孵育在温度为37°C、二 氧化碳体积浓度为5%的条件下进行。
7.根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于所述用于培养树突状细胞的 细胞培养基按照如下方法制备将小牛血清、链霉素、青霉素、细胞因子GM-CSF、细胞因子 IL-4和RPMI1640细胞培养基混合，小牛血清、链霉素、青霉素、细胞因子GM-CSF、细胞因 子IL-4和RPMI1640细胞培养基的配比为10mg小牛血清IOOyg链霉素100U青霉 素20ng细胞因子GM-CSF IOng细胞因子IL-4 Iml RPMI1640细胞培养基，得到的混 合物即为所述用于培养树突状细胞的细胞培养基。
8.根据权利要求3-7中任一所述的方法，其特征在于所述Q热是由贝氏柯克斯体 (Coxiella burnetii)弓丨起的。
9.一种制备Q热疫苗的方法，包括如下步骤将SEQ ID NO :1所示蛋白与佐剂混合，得 到Q热疫苗。
10.由权利要求3-8中任一所述方法得到的针对Q热的保护性抗原；由权利要求9所 述方法得到的Q热疫苗。
全文摘要
本发明公开了蛋白Mip在对贝氏柯克斯体的免疫保护中的应用。该应用为SEQ IDNO1所示蛋白在制备Q热疫苗中的应用。本发明证明贝氏柯克斯体重组膜蛋白Mip可以作为一种抗原蛋白，能够刺激机体产生免疫应答对抗贝氏柯克斯体毒株攻击，为具有Q热疫苗功能的保护性抗原。通过基因工程方法制备蛋白Mip，操作简便，成本低，产量高。用蛋白Mip作为Q热疫苗，克服了现有技术中疫苗制备困难的缺陷。
文档编号C12N5/0784GK102139100SQ20111000142
公开日2011年8月3日 申请日期2011年1月5日 优先权日2011年1月5日
发明者温博海, 熊小路, 王锡乐 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所