专利名称：一种产碱假单胞菌及其制备l-薄荷醇的方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种产碱假单胞菌(^PsGudomoims alcaligenes)以及制备1_薄荷醇 (即(-)_薄荷醇，化学名为(1民25，51 )-2-异丙基-5-甲基环己醇)的方法。
背景技术：
天然薄荷醇主要为1-薄荷醇，薄荷醇具有特征的薄荷香气和强烈的清凉作用， 气味更加新鲜轻快；薄荷醇具有更强的生理活性，它具有杀菌止痒、兴奋镇痛、镇静、防腐杀菌、治疗疼痛等功效，因此具有更大的医疗价值。薄荷醇的这些性质，使它比其他构型的薄荷醇具有更高的工业价值。由于人们对于生活质量的日益关注，对厂薄荷醇的需求量也日益增长。但是，天然提取的1-薄荷醇过度依赖人工栽培的薄荷植物，受地域、气候的影响，越来越难以满足生产与生活的需要。人们通过合成的手段制备薄荷醇来满足需求，由于化学法制备的产品是由薄荷醇的8种异构体组成的，分别为厂薄荷醇((1R，2S, 5R)-2-异丙基-5-甲基-环己醇)、7-异薄荷醇((1R，2S, 5S)-2-异丙基-5-甲基-环己醇)、1~新异薄荷醇 ((IS, 2S, 5S) -2-异丙基-5-甲基-环己醇)、1-新薄荷醇((1R, 2R, 5S) -2-异丙基-5-甲基-环己醇)、薄荷醇((1S，2R，5S) -2-异丙基-5-甲基-环己醇)、异薄荷醇 ((IS, 2R, 5R) -2-异丙基-5-甲基-环己醇)、d_新异薄荷醇((1R, 2R, 5R) -2-异丙基-5-甲基-环己醇)、 /_新薄荷醇((lS，2S，5R)-2-异丙基-5-甲基-环己醇)。其中厂薄荷醇的含量较低，严重影响使用效果，从8种薄荷醇异构体的混合物中分离出的1-薄荷醇产品， 价格低廉比天然来源的低，各项品质相当，因此工业化过程的一个主要环节就是分离I-薄荷醇。化学制备技术、生物制备技术与天然原料提取技术，是目前制备I-薄荷醇研究的3个主要方面。化学制备技术目前在工业上应用的，主要是日本高砂公司利用发明的手性催化剂(S)-BINAP-Rh催化烯丙胺不对称异构化合成得到1-薄荷醇，该技术目前年产1000吨厂薄荷醇。从天然植物来源提取工艺是将薄荷草经蒸气蒸馏制得薄荷原油。 经反复结晶得到I-薄荷醇，过程复杂，能耗高，生产率低。生物催化法制备I-薄荷醇的研究中，主要涉及到两种拆分反应，一种是利用微生物或酶催化的酯化或转酯化反应，另一种是利用微生物或酶催化的水解反应。杨立荣等开发了一种利用苏云金芽孢杆菌立体选择性水解薄荷醇异构体酯化的混合物的方法，以制备7-薄荷醇，最高转化率达到74%， 选择性d. e. =90. 1%(杨立荣，孟彦.一种苏云金芽孢杆菌以及L-薄荷醇的制备方法 CN101671639A [P] 2009. 8. 13)。利用不对称水解制备薄荷醇的方法中，由于薄荷醇与薄荷醇异构体酯化的混合物极性差别不大，分离过程需要通过硅胶柱层析等繁琐昂贵的过程(许建和，郑高伟。枯草芽孢杆菌酯酶及其用于生产7-薄荷醇的应用CN 101338287A [P] 2008. 7. 25)
上述的生物方法分离薄荷醇的研究虽然取得了一些进展，但普遍存在产物的光学纯度不高，转化率低、生物催化剂种类少和生物催化剂成本高等缺点，并且分离纯化过程不易实现，制约了工业化的应用。如果利用高选择性的微生物催化剂，则可大大降低原料成本，提高产品纯度，目前尚未见有关于利用产碱假单胞菌(/^Wi/OMWM alcaligenes)对m 荷醇异构体酯化物的混合物进行拆分的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种产碱假单胞菌及其制备I-薄荷醇的方法和应用。为实现上述目的，发明人首次分离纯化到一株能够产选择性转酯化I-薄荷醇酯化物的新菌株。经过16S rDNA和生理生化鉴定，该菌株为产碱假单胞菌属(/^洲而^^浙 a/ca/i^^M)，命名为产碱假单胞菌 LMg^/^ei/t/offloaas alcaligenes LM99)。该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2010年12月3日，保藏号为CGMCC No. 4405。产碱假单胞菌CGMCC No. 4405可用于作为通过分离薄荷醇异构体酯化的混合物来制备薄荷醇的催化剂。利用产碱假单胞菌CGMCC No. 4405制备1_薄荷醇的方法包括如下步骤
(1)将保藏号为CGMCCNo. 4405的产碱假单胞菌加入到培养基中进行发酵培养；
(2)按以下第一方案、第二方案或第三方案对薄荷醇异构体酯化物的混合物进行催化， 得到反应液，所述薄荷醇异构体酯化物的混合物含有薄荷醇酯化物，且含有异薄荷醇酯化物、新异薄荷醇酯化物、新薄荷醇酯化物、薄荷醇酯化物、异薄荷醇酯化物、 d-新异薄荷醇酯化物、新薄荷醇酯化物中的任一种或任几种
第一方案将所述薄荷醇异构体酯化物的混合物加入到步骤(1)得到的发酵液中，反应后得到反应液；
第二方案将步骤(1)得到的发酵液离心得到上清液，将所述薄荷醇异构体酯化物的混合物加入所述上清液中，反应后得到反应液；
方案B第三方案将步骤(1)得到的发酵液进行脱水处理得到发酵液的固体制剂，后将该发酵液的固体制剂与薄荷醇异构体酯化物的混合物一起加入到ρΗ为5 10的缓冲溶液中进行反应，得到反应液；
(3)将所述反应液进行分离得到1-薄荷醇。进一步地，本发明在步骤(2)中，所述的薄荷醇异构体酯化物的混合物是指薄荷醇异构体混合物中的各薄荷醇异构体与脂肪族羧酸或芳香族羧酸形成的酯的混合物。进一步地，本发明在步骤(2)的第三方案中，所述缓冲溶液为磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷_盐酸缓冲液；所述发酵液的固体制剂相对于缓冲溶液的质量浓度为Ig/广100g/L。进一步地，本发明在步骤(2)中，所述发酵培养的培养基的成分为酪蛋白广IOg/ L、吐温-80广15g/L、酵母膏广8g/L、硫酸铵(TlOg/L、磷酸氢二钾广6g/L、氯化钙0 0. 5g/ L和无水硫酸镁(Tlg/L ；培养基的ρΗ为5 10 ；所述产碱假单胞菌相对于培养基的接种量为 1% 10% (体积)；发酵时间为12 48小时；发酵温度为15 50°C。进一步地，本发明在步骤(3)中，所述分离是指对所述反应液先进行减压蒸发、后用有机溶剂萃取得到1-薄荷醇。本发明方法相对于化学制备方法、生物制备方法和传统的天然原料提取方法，具有以下优点
(1) 采用传统从天然薄荷植物中提取7-薄荷醇的方法，不仅生产过程效率比较低、能耗大，而且容易受到薄荷植物种植产量的影响；而化学制备方法由于催化剂本身昂贵易失活，且需要使用大量的有机溶剂与助剂，在生产成本与环境成本上都较高；而相比之下，本发明采用产碱假单胞菌LM99 (.Pseudomonas alcaligenes LM99)，选择性水解薄荷醇异构体酯化物的混合物中的I-薄荷醇酯化物，不仅具有较高选择性和转化率的优点，而且可以从工艺上大量减少有机溶剂的使用，对环境友好。(2)工业化的拆分制备薄荷醇方法中，都是采用薄荷醇异构体的混合物作为初始原料，而现今大部分方法都采用将d-薄荷醇与1-薄荷醇这一对对映异构体首先从薄荷醇异构体的混合物中分离出来再进行拆分。而本发明直接采用化学法合成得到的薄荷醇异构体混合物作为底物，经过简单的酯化反应，不再需要预先分离过程，方法简单，在设备投资与操作费用方面优势明显。 (3)本发明利用筛选的微生物制备薄荷醇，可以自行发酵制备，质量稳定，存储稳定，运输方便，能大大降低原料成本，极具广大应用前景。(4)本发明采用预先减压蒸发的方法将薄荷醇的酯化物与I-薄荷醇分离，大大简化了分离过程，能够直接制备高纯度的1-薄荷醇，降低了分离的能耗，具备工业化前景。(5 )采用本发明的产碱假单胞菌/^eWiZoffloa3lS alcaligenes LM99进行不对称催化反应，生成I-薄荷醇纯度在95%以上，转化率高可达90% ；且未反应的底物可以直接回收， 重新外消旋化成为底物薄荷醇异构体酯化的混合物，提高了底物利用率。生物材料样品的保藏信息
保藏的生物材料样品产碱假单胞菌LM99 (.Pseudomonas alcaligenes LM99)； 保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)； 保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所 (邮编100101)； 保藏日期2010年12月3日； 保藏登记号CGMCC No. 4405。
图1是产碱假单胞菌LM99催化反应的反应液的气象色谱图，图中共有8个峰信号，由左向右依次为1-薄荷醇，1-异薄荷丙酸酯，d-异薄荷丙酸酯，dl-新薄荷丙酸酯， 1-薄荷丙酸酯，d-薄荷丙酸酯，1-新异薄荷丙酸酯，d-新异薄荷丙酸酯；8个信号峰的出峰时间依次为16. 440分钟、22. 323分钟、22. 665分钟、24. 323分钟、24. 757分钟、25. 323分钟、27. 540分钟、27. 790分钟。图2是不同反应时间下转化率和产物非对映体过量值的变化曲线。
具体实施例方式在实施例中，在对薄荷醇异构体酯化物的混合物进行催化过程中，对反应液进行底物转化率、产物非对映体过量值(d. e.p)的测定方法具体如下(其中，所述底物为薄荷醇异构体酯化物的混合物)在反应过程中，5mL反应液与5ml乙酸乙酯振荡萃取，然后离心(10000 X g，5min)得到乙酸乙酯相，进行手性气相色谱分析。该手性气相色谱分析的体系如下 检测仪器GC-950气相色谱仪； 手性气相柱CP-CYCLODEXTRIN β -2，3，6-Μ-19 (50mX0. 25mmX0. 25 μ m)；
检测条件柱温130°C，检测器和进样器温度分别为260°C与250°C，载气(N2) 25mL/ min，空气 3mL/min，氧气 7mL/min。
计算公式
底物转化率(%)=(初始底物浓度-剩余底物浓度)/初始底物浓度X100% ； d. e. s=c X d. e. J (l_c) X 100% d. e. p (%) = [ (Ae-As) / (As+Ae) ] X 100%
其中，c为底物转化率，d. e. p为产物非对映体过量值，其中As、Ak分别为气相色谱所测样品中(7)_薄荷醇和非(乃_薄荷醇的峰面积之和。实施例1 菌种的筛选及鉴定
本实施例在杭州地区采集土壤，进行产碱假单胞菌LM99 (.Pseudomonas alcaligenes LM99)的筛选。方法如下
富集培养培养基成分为(g/L)蛋白胨5. 0，酵母膏3. 0，1-薄荷醇丙酸酯10. 0，硫酸铵4.0，磷酸氢二钾10，硫酸镁0.2，pH为7.0。121°C灭菌20min。称取新鲜土样Ig加入到装有50ml富集培养基的250mL摇瓶中，置于30°C、200r/min摇床中培养。按1%的接种量， 每隔一天进行一次转接，重复三次。初筛平板培养基成分为(g/L)酵母膏1. 0，硫酸铵2. 0，磷酸氢二钾2. 0，氯化钠 2. 0，硫酸镁0.5,7-薄荷醇丙酸酯20. 0，琼脂20. 0，ρΗ为7. 0。120°C灭菌20min。采用划线法，将富集菌液在平板培养基上均勻划线，30°C培养广2天。将有水解透明圈的菌体标记， 置于4°C冰箱保存。复筛摇瓶培养基成分为(g/L):蛋白胨5. 0，葡萄糖5. 0，酵母膏5. 0，橄榄油50. 0， 硫酸铵5. 0，磷酸氢二钾2. 0，氯化钠1. 0，硫酸镁0. 2，pH为7. 0。120灭菌20min。将初筛获得的单菌落接入20mL复筛培养基中，30 0C，200rpm下生长24小时后，取新鲜发酵液5ml， 加入薄荷醇异构体酯化物的混合物，薄荷醇异构体酯化物的混合物浓度为20g/L，30°C振荡反应24小时，加入乙酸乙酯振荡萃取水解产物，用于手性气相色谱进行分析，将底物选择性较高的和产物非对映体过量值均较高的菌株保藏备用。菌种鉴定16S rDNA鉴定和生理生化鉴定。经过筛选，编号为LM99的菌株，其非对映体对量值最高，且具有相对较好的转化率，气相谱图见图1。从图1可知，产物7-薄荷醇出峰位置在16.440min。对菌株LM99作 16S rDNA PCR测序分析和生理生化实验(见表1)，测序结果如SEQ No. 1所示，由测序分析和生理生化实验的结果可确定所筛选出的菌株为产碱假单胞菌属，该菌株命名为产碱假单 Ifelii LM99 {Pseudomonas alcaligenes LM99)。表1产碱假单胞菌LM99 (.Pseudomonas alcaligenes LM99)的生理生化实验结果
权利要求
1.一种产碱假单胞菌，其特征是其保藏号为CGMCC No. 4405。
2.—种权利要求1的产碱假单胞菌的应用，其特征是用于作为通过分离薄荷醇异构体酯化物的混合物来制备I-薄荷醇的催化剂。
3.一种利用权利要求1的产碱假单胞菌制备薄荷醇的方法，其特征是，包括如下步骤(1)将保藏号为CGMCCNo. 4405的产碱假单胞菌加入到培养基中进行发酵培养；(2)按以下第一方案、第二方案或第三方案对薄荷醇异构体酯化物的混合物进行催化， 得到反应液，所述薄荷醇异构体酯化物的混合物含有薄荷醇酯化物，且含有异薄荷醇酯化物、新异薄荷醇酯化物、新薄荷醇酯化物、薄荷醇酯化物、异薄荷醇酯化物、 d-新异薄荷醇酯化物、新薄荷醇酯化物中的任一种或任几种第一方案将所述薄荷醇异构体酯化物的混合物加入到步骤(1)得到的发酵液中，反应后得到反应液；第二方案将步骤(1)得到的发酵液离心得到上清液，将所述薄荷醇异构体酯化物的混合物加入所述上清液中，反应后得到反应液；第三方案将步骤(1)得到的发酵液进行脱水处理得到发酵液的固体制剂，后将该发酵液的固体制剂与薄荷醇异构体酯化物的混合物一起加入到ρΗ为5 10的缓冲溶液中进行反应，得到反应液；(3)将所述反应液进行分离得到1-薄荷醇。
4.根据权利要求3所述的制备薄荷醇的方法，其特征在于所述薄荷醇异构体酯化物的混合物是指薄荷醇异构体混合物中的各薄荷醇异构体与脂肪族羧酸或芳香族羧酸形成的酯的混合物。
5.根据权利要求3所述的制备1-薄荷醇的方法，其特征在于在步骤(2)的第三方案中，所述缓冲溶液为磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液；所述发酵液的固体制剂相对于缓冲溶液的质量浓度为lg/L 100g/L。
6.根据权利要求3所述的制备1-薄荷醇的方法，其特征在于在步骤(3)中，所述分离是指对所述反应液先进行减压蒸发、后用有机溶剂萃取得到1-薄荷醇。
7.根据权利要求3所述的制备薄荷醇的方法，其特征在于在步骤(1)中，所述发酵培养的培养基的成分为酪蛋白广10g/L、吐温-80广15g/L、酵母膏广8g/L、硫酸铵(TlOg/ L、磷酸氢二钾广6g/L、氯化钙(TO. 5g/L和无水硫酸镁(Tlg/L ；培养基的ρΗ为5 10 ；所述产碱假单胞菌相对于培养基的接种量为19Γ10% (体积)；发酵时间为12 48小时；发酵温度为15 50°C。
全文摘要
本发明公开一种产碱假单胞菌及其制备l-薄荷醇的方法和应用。其制备l-薄荷醇的方法包括如下步骤(1)将产碱假单胞菌加入到培养基中发酵培养；(2)将发酵液处理，将底物进行转化反应，得到反应液，底物指薄荷醇异构体酯化物的混合物；薄荷醇异构体酯化物的混合物含有l-薄荷醇酯化物，且含有l-异薄荷醇酯化物、l-新异薄荷醇酯化物、l-新薄荷醇酯化物、d-薄荷醇酯化物、d-异薄荷醇酯化物、d-新异薄荷醇酯化物、d-新薄荷醇酯化物中的任一种或任几种；(3)将反应液减压蒸发，分离反应底物与产物，萃取得到l-薄荷醇。
文档编号C12P41/00GK102154166SQ20111000084
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月5日 优先权日2011年1月5日
发明者吴坚平, 李牧, 杨立荣 申请人:浙江大学