专利名称：一种表达猪瘟病毒e0、e2基因的重组腺病毒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组腺病毒，尤其是一种能在同一腺病毒中表达猪瘟病毒EO基因和E2基因的重组腺病毒，属于生物技术领域。
背景技术：
猪瘟是一种传染性非常强的传染病，常给养猪业造成毁灭性损失。目前，免疫接种仍是猪瘟防治的主要措施，而且是根除猪瘟病和阻止野毒传向无猪瘟病猪群的必要手段。 猪瘟疫苗无论在过去、现在还是将来，对控制和消灭猪瘟病都具有极其重要的作用，各国学者对猪瘟疫苗的研制和开发一直没有放弃。传统的猪瘟疫苗有灭活疫苗和弱毒疫苗，其中灭活苗免疫效力低，保护期短，激发机体产生免疫力的速度慢，到目前为止，组织培养猪瘟毒的产量以及灭活疫苗所造成的病毒有效抗原的损失，仍是制造灭活疫苗的二大障碍；猪瘟弱毒疫苗的广泛应用，对于控制猪瘟的流行起到了关键作用，但是弱毒疫苗也存在下列不足首先近年来猪瘟的流行特点发生了很大的变化，呈现周期性、波浪形的地区性散发和温和性猪瘟病，发病后的临床症状有无名高热、症状不典型、持续性感染、出生仔猪先天性震颤和母猪繁殖性障碍，用传统疫苗免疫常常造成免疫失败，即使将剂量增加到750个兔体反应(国家规定150个兔体反应)也不能预防其感染，而且有蔓延的趋势，在妊娠早期接种疫苗还会发生疫苗毒通过胎盘感染胎儿，造成死胎或弱仔并成持续性带毒者，产生新的疫源；其次，弱毒疫苗已经沿用了近40年，猪瘟的流行形式发生了很大变化，说明猪瘟病毒的抗原性可能存在着变异，特别是近年来国内外应用单克隆抗体对C-株检测，发现有不同的反应模式，表明经过多年在不同细胞上的驯化，C-株已经产生变异，这种流行毒株的变化趋势国内外情况基本一致，流行毒往往逃避免疫，导致免疫失败的严重后果；第三，接种弱毒疫苗还会影响到国际贸易，欧盟已禁止使用猪瘟弱毒疫苗，而采用严格的卫生防疫制度， 扑杀猪瘟感染猪和血清学阳性猪来控制和消灭猪瘟，采用扑杀政策需要大量的人力、物力和巨额资金，发展中国家是难以承受的，这就促使人们研究和开发新型的猪瘟疫苗来防控本病。近年来，基因工程技术的迅猛发展，为新型猪瘟疫苗的研究和开发提供了工具，目前， 猪瘟基因工程疫苗的研制已经成为新的研究方向和热点。人-5型腺病毒载体与其他动物病毒载体相比，具有许多优点首先是安全，腺病毒毒性低，基本不致病或只引起轻微的症状，腺病毒重组后，毒力进一步降低，并且克服了逆转录病毒载体因随机整合可能导致插入突变的潜在风险；其次是宿主范围广，腺病毒可感染多种细胞包括分裂与非分裂细胞；第三是稳定，腺病毒粒子十分牢固，不易突变，并且容易大量制备并纯化，得到高滴度的病毒，在体外可获得IOllPfuAiL ；第四就是对于腺病毒基因组的结构和功能目前研究得比较清楚，基因操作方便；第五是插入外源基因容量大，在基因治疗构建重组疫苗中大多采用缺失El和E3区基因的腺病毒载体，通常复制缺陷型腺病毒可容纳约71Λ 81Λ的外源基因，比逆转录病毒和腺相关病毒的容量大很多；还有就是免疫途径简便，腺病毒可以在消化道和呼吸道增殖，疫苗接种简便，可口服或气雾吸入而不需注射，并且经口服后能产生局部黏膜免疫应答，在免疫方法上比其它疫苗好，容易推广使
非复制型腺病毒不仅更安全有效，而且以低剂量的方式产生抗原蛋白而不裂解细胞，故表达抗原的时间更持久，有利于激发长期的免疫反应。目前，已经有多种产品已经上市，例如“安柯瑞——重组人5型腺病毒注射液”；“重组人Y-干扰素腺病毒注射液 (ElOB) ”;“今又生(重组人p53腺病毒注射液)”;“人禽流感重组腺病毒疫苗临床前安全评价方法的研究”取得阶段性成果；“重组腺病毒-胸苷激酶基因制剂”；另外“猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒和疫苗”已经被南京农业大学申请专利。
发明内容
为解决猪瘟弱毒疫苗长期接种导致的病毒返祖、毒力增强的现象和弱毒疫苗株与野毒发生重组等问题，以及猪瘟病毒E0、E2基因融合串联表达存在的产量低和保护效果弱的问题，本发明提供一种能在同一腺病毒中表达猪瘟病毒E0、E2基因的重组腺病毒。本发明提供的是这样一种表达猪瘟病毒E0、E2基因的重组腺病毒，其特征在于在腺病毒的CMV启动子下游多克隆位点的Bgl II和KpnI酶切位点中插入猪瘟病毒EO基因， 在Bio I和^CbaI酶切位点中插入腺病毒CMV启动子和猪瘟病毒E2基因的CMV-E2片段。所述猪瘟病毒为常规的市购病毒，猪瘟病毒的EO基因在GenBank中的登录号为 AF058715. 1，猪瘟病毒的E2基因在GenBank中的登录号为AY775178. 2所述腺病毒为常规的市购人-5型非复制型腺病毒。所述在腺病毒中同时分别表达猪瘟病毒E0、E2基因的重组腺病毒，包括下列构建步骤A.从市购的猪瘟病毒和猪瘟病毒中分别扩增出EO和E2基因；B.将步骤A获得的猪瘟病毒EO基因通过BglII和KpnI酶切位点插入至腺病毒穿梭载体pAdTrack中，形成腺病毒穿梭载体pAdTrack-EO ；C.将步骤A获得的猪瘟病毒E2基因通过Kpn I和Not I酶切位点插入至腺病毒穿梭载体PAdTrack中，形成腺病毒穿梭载体pAdTrack-E2 ；D.将步骤C的腺病毒穿梭载体pAdTrack-E2按常规的PCR方法扩增出含有CMV启动子的CMV-E2基因，通过Biol I和)(ba I酶切位点插入至步骤B的腺病毒穿梭载体PAdTrack-EO中的Biol I和)(ba I酶切位点中，形成重组腺病毒穿梭载体 pAdTrack-E0-CMV-E2 ；E.将步骤D的重组腺病毒穿梭载体pAdTrack-E0-CMV-E2经RiieI酶切线性化后， 转化到含有腺病毒骨架载体pAd-easy-Ι的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中，形成重组腺病毒骨架载体 pAd-easy-E0-CMV_E2 ；F.将重组腺病毒骨架载体pAd-eaSy-E0-CMV-E2经I3acI线性化后，转染人胚胎肾细胞HEK293中，包装出重组腺病毒rAd-E0-CMV-E2。本发明具有下列优点和效果采用上述方案获得的重组腺病毒rAd-E0-CMV_E2，能在同一腺病毒中分别表达猪瘟病毒EO蛋白和猪瘟病毒E2蛋白，解决了 E0、E2基因融合串联表达产量低和保护效果弱的问题，本发明仅通过一次免疫接种就能够使免疫后的猪获得对猪瘟病毒的抗体，对猪瘟具有较强的抵抗能力，生产成本是常规疫苗的一半，大大降低了疫苗成本。本发明提供的重组腺病毒rAd-E0-CMV-E2属于非复制型病毒，在猪体内不繁殖，解决了弱毒疫苗长期接种导致的病毒返祖，毒力增强的现象。本发明提供的重组腺病毒rAd-E0-CMV-E2仅含有猪瘟病毒的主要保护基因，不含病毒的其它基因，因此，本发明提供的重组腺病毒与野毒株之间不会发生重组。采用上述方案构建获得的重组腺病毒制成的疫苗，免疫猪后对致死量100 倍TCID5tl的猪瘟病毒强毒攻击的保护效果为100%。既解决了猪瘟疫苗和猪瘟野毒同源重组后毒力返强的问题，也解决了弱毒疫苗生产成本高的问题。
图1为ELISA检测的猪瘟病毒抗体的水平。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步说明。实施例A.猪瘟病毒EO基因和E2基因的扩增(I)PCR扩增引物的设计在猪瘟病毒EO基因的上、下游引物中分别加入Bgl II和Kpn I限制性内切酶酶切位点，所述猪瘟病毒EO基因的上、下游引物分别设计为上游引物P1 5，-AAAAGATCTATGGAAAATATAACTCAATGG-3，下游引物P2 5，-CACGGTACCGTAAGGCGATAGGGCATAG-3，在猪瘟病毒E2基因的上、下游引物中分别加入Kpn I和NotI和限制性内切酶酶切位点，所述猪瘟病毒E2基因的上、下游引物分别设计为上游引物P1 5，-AAAGGTACCATGAGGGGACAGATCGTGC-3，下游引物P2 :5，-CCC GCGCCCGCACCAGCGGCGAGTTGTTCTG-3’(2)猪瘟病毒EO基因片段的体外扩增及扩增产物的回收与纯化将含有猪瘟病毒EO基因的pMDIS-T-EO质粒用双蒸水稀释100倍，取1 μ L为模板， 用猪瘟病毒EO基因的引物扩增编码EO蛋白的目的片段，其中PCR反应体系如下模板IyL10XPCR 缓冲液5 μ L2. 5mmol/L dNTP5μ LEO 基因上游引物(50ymol/L)2yLEO 基因下游引物(50ymol/L)2yLEx Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 1 μ L灭菌去离子水；34 μ L反应总体系为50 μ LPCR 反应条件95°C预变性 5min ；94°C lmin,54°C lmin，72°C lmin，共；35 个循环； 最后72°C延伸10min，4°C储存；将PCR产物置于8g/L琼脂糖凝胶，于60V电泳20min后切取目的条带大小的片段，回收猪瘟病毒EO基因的扩增产物；(3)猪瘟病毒E2基因片段的体外扩增及扩增产物的回收与纯化 将含有猪瘟病毒E2基因的pMD18-T-E2质粒用双蒸水稀释100倍，取1 μ L为模板，用猪瘟病毒E2基因的引物扩增编码E2蛋白的目的片段，其中PER反应体系如下
模板l u L
10×PER缓沖液5 u L
2．5mm01／L dNTP5 u L
E2基因上游引物(50 u mol／L)2 u L
E2基因下游引物(50 u mol／L)2 u L
Ex Taq DNA聚合酶(5u／u L) l u L
灭菌去离子水34 u L
反应总体系为50 u L
PER反应条件95℃预变性5min；94℃lmin，54℃lmin，72℃lmin 30see，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃储存；将PER产物置于8g／L琼脂糖凝胶，于60V电泳20min后切取目的条带大小的片段，回收猪瘟病毒E2基因的扩增产物；
B．腺病毒穿梭载体pAd／rack—E0的构建
(1)猪瘟病毒Eo基因的PER扩增产物的Bgl II和Kpn工双酶切
向1．5mL Eppendorf管中依次加入
E0基因PER产物15 u L
10×Buffer5 u L
Bgl II3 u L
Kpn工3 u L
H。024 u L
总体积为50M1，充分混匀后瞬时离心
以37℃水浴6h后，用8g／L琼脂糖凝胶电泳，切下含目的条带的凝胶回收；
(2)穿梭载体pAd／rack—CMV的Bgl II和Kpn工双酶切
向1．5mL Eppendorf管中依次加入
pAd／rack—CMV质粒l o u L
10×Buffer6 u L
Bgl II3 u L
Kpn工3 u L
H。038 u L
总体积为60 u L，充分混匀后，瞬时离心
以37℃水浴6h后，用8g／L琼脂糖凝胶电泳，切下含目的条带的凝胶回收；
(3)猪瘟病毒Eo基因与穿梭质粒载体pAd／rack—CMV的连接
连接反应体系
E0基因片段 4 u L
pAdTrack—CMV2 u L
10×Bufferl u L
T4DNA连接酶l u L
H。03 u L
总体积为lo u L，充分混匀后瞬时离心
16 °C水浴连接过夜；(4)猪瘟病毒EO基因和pAdTrack-CMV载体连接产物的转化和鉴定①DH5a感受态细胞的制备将_70°C甘油保种的DH5a接种于不含抗生素的LB琼脂培养基上，37°C培养过夜， 挑取长势良好的单菌落，接种于3mL新配置的不含抗生素的LB培养液中，370C 250r/min振荡培养过夜，约14h;取100 μ L培养物，按1 100比例接种于IOOmL新鲜LB培养液中， 300r/min剧烈振荡培养约3h，至OD6tltl为0. 6 ；无菌条件下转移细菌培养物至两个预冷的 50mL离心管中，冰浴IOmin ；4°C下1600r/min离心lOmin，弃上清，倒置离心管浙干液体，加入预冷的0. lmol/L CaCl2溶液10mL，悬浮菌体沉淀，置冰浴放置30min ；4°C下llOOr/min离心IOmin,弃上清，用2mL 0. lmol/L预冷的CaCl2 (含150mL/L甘油)重悬菌体，然后分装于预冷的灭菌Eppendorf管中，每管100 μ L，置_70°C冰箱保存备用；②重组质粒转化感受态细胞取一管感受态细胞置于冰水混合物上，待完全融化后，将10 μ L的连接产物加入管中，轻轻混勻；冰浴30min ；42°C水浴中热激90s ；冰浴^iin ；加入800 μ L LB培养基，37°C 下200 250r/min振荡培养Ih ；8000r/min离心lmin，弃部分上清，存留100 μ L左右的上清重悬沉淀；取100 μ L混合物均勻涂布于含卡那霉素(50 μ g/mL)的LB琼脂平板上，待完全吹干后，37°C培养过夜(12 16h)；挑取单菌落于3mL含50 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C培养过夜；碱裂解法提取质粒后进行酶切、PCR和测序鉴定；将猪瘟病毒EO基因插入至穿梭载体pAdTrack-CMV中构建的重组质粒命名为腺病毒穿梭载体PAdTrack-EO ；C.腺病毒穿梭载体pAdTrack-E2的构建及CMV-E2片段的获得(1)猪瘟病毒E2基因PCR扩增产物的Kpn I和Not I双酶切向1. 5mL Eppendorf管中依次加入E2 基因 PCR 产物 15 μ LIOXBuffer5μ LKpn I3 μ LNot I3μ LH2024 μ L总体积为50 μ L，充分混勻后瞬时离心以37°C水浴他后，用8g/L琼脂糖凝胶电泳，切下含目的条带的凝胶回收；(2)穿梭载体 pAcTTrack-CMV 的 Kpn I 和 Not I 双酶切向1. 5mL Eppendorf管中依次加入pAdTrack-CMV 质粒 IOyLIOXBuffer6μ LKpn I3 μ LNot I3μ LH2O38 μ L总体积为60 μ L，充分混勻后瞬时离心以37°C水浴他后，用8g/L琼脂糖凝胶电泳，切下含目的条带的凝胶回收；0104](3)猪瘟病毒E2基因与穿梭质粒载体pAdTrack-CMV的连接
0105]连接反应体系
0106]E2基因片段 4μ L
0107]pAdTrack-CMV 2μ L
0108]IOXBuffer1 μ L
0109]T4DNA 连接酶1 μ L
0110]H2O3μ L总体积为10 μ L，充分混勻后瞬时离心16 °C水浴连接过夜；(4)猪瘟病毒E2基因和pAdTrack-CMV载体连接产物的转化和鉴定①DH5a感受态细胞的制备同步骤B的(4)①；②重组质粒转化感受态细胞同步骤B的(4)②；将猪瘟病毒E2基因插入至穿梭载体pAdTrack-CMV中构建的重组质粒命名为为 腺病毒穿梭载体pAdTrack-E2 ；OCMV-E2基因的获得根据pAdTrack-E2载体中CMV启动子的序列设计扩增CMV-E2基因的引物上游引物P1 5，-AAACTCGAGTAGTTATTAATAGTAATCAAT-3，下游引物P2 5，-CACTCTAGAACCAGCGGCGAGTTGTTCTG-3，在CMV-E2基因的上、下游引物中分别加入)(ho I,XbaI和限制性内切酶酶切位点， 并在下游引物中引入终止密码子；D.重组腺病毒穿梭载体pAdTrack-E0-CMV_E2的构建(1) CMV-E2基因PCR产物的Xho I和Xba I双酶切向1. 5mL Eppendorf管中依次加入CMV-E2 片段 PCR 产物 15 μ LIOXBuffer5μ LXho I3μ LXba I3 μ LΗ2024 μ L总体积为50 μ L，充分混勻后瞬时离心以37°C水浴他后，用8g/L琼脂糖凝胶电泳，切下含目的条带的凝胶回收；(2)穿梭载体 pAdTrack-EO 的 Xho I 和 Xba I 双酶切向1. 5mL Eppendorf管中依次加入pAdTrack-EO 质粒 10 μ LIOXBuffer6μ LXho I3 μ LXba I3μ LH2O38 μ L
总体积为60 μ L，充分混勻后瞬时离心以37°C水浴他后，用8g/L琼脂糖凝胶电泳，切下含目的条带的凝胶回收；(3) CMV-E2基因与穿梭质粒载体pAdTrack_E0的连接连接反应体系CMV-E2 基因片段 4 μ LpAdTrack-EO2μ LIOXBuffer1 μ LT4DNA 连接酶1 μ LH2O3μ L总体积为10 μ L，充分混勻后瞬时离心16 °C水浴连接过夜；(4) CMV-E2片段和pAdTrack_EO载体连接产物的转化和鉴定①DH5a感受态细胞的制备同步骤B的(4)①；②重组质粒转化感受态细胞同步骤B的(4)②；将CMV-E2片段插入至穿梭载体pAdTrack-EO中构建的重组质粒命名为重组腺病毒穿梭载体 pAtTTrack-E0-CMV-E2 ；E.重组腺病毒骨架载体pAdEasy-E0-CMV_E2的构建(1)重组腺病毒穿梭载体pAdTrack-E0-CMV-E2的线性化用RiieI对穿梭载体pAdTrack-E0-CMV-E2酶切线性化，按如下所示分别加入各组分pAdTrack-E0-CMV-E2 25 μ LPmeI4μ L0. lg/L BSA10 μ LIOXBuffer 410 μ LH2O51 μ L总体积为100 μ L置37°C水浴中Mi后经琼脂糖凝胶电泳回收；(2)线性化的重组腺病毒穿梭载体pAdTrack-E0-CMV-E2转化到含有腺病毒骨架载体pAdEasy-Ι的大肠杆菌BJ5183感受态细胞同步骤B的(4)②；将重组后的腺病毒骨架载体命名为重组腺病毒骨架载体pAdEasy-E0-CMV-E2 ；F.重组腺病毒rAd-E0-CMV_E2的获得(1)重组腺病毒骨架载体pAdEaSy-E0-CMV-E2的线性化、回收和纯化用I^cI酶切使重组腺病毒骨架载体pAdEaSy-E0-CMV-E2线性化，酶切反应体系为pAdeasy-E0-CMV-E2 25 μ LPac I5μ L
0. lg/L BSA10 μ LIOXBuffer 410 μ LH2O50 μ L总体积为100 μ L，置37°C水浴中他。在酶切后的产物中，加入2. 5体积的无水乙醇和1/10体积的3mol/L NaAc,-20°C 沉淀lh，在4°C以12000r/min离心15min，弃去上清，加入70%乙醇洗一次，自然干燥后，加入 20 μ L H2O 溶解 DNA ；(2)重组腺病毒rAd-E0-CMV_E2的获得将线性化的重组腺病毒骨架载体pAdEasy-E0-CMV-E2转染至人胚胎肾细胞HEK 293细胞中，具体操作按LipOfectamineTM2000产品说明书进行；收获的病毒液命名为重组腺病毒 rAd-E0-CMV-E2 ；(3)重组腺病毒rAd-E0-CMV_E2的扩增及滴度测定按照噬斑法测定rAd-E0-CMV_E2在293细胞中传至15代时的病毒滴度。本发明获得的重组腺病毒rAd-E0-CMV_E2经过下列试验1. rAd-E0-CMV-E2免疫保护性试验(1)实验动物分组将25头猪随机分为5组，第一组为rAd-E0-CMV_E2免疫组，5头。第二组为猪瘟脾淋苗免疫组，5头。第三组为融合表达E0-E2基因的重组腺病毒rAd-E0-E2免疫组，5头。 第四组为非重组腺病毒免疫组，5头。第五组为空白对照组，5头。(2)免疫和攻毒重组腺病毒组和非重组腺病毒组的免疫剂量均为2. 4 X 109pfu (定量至2mL)，于颈部肌肉和腹部皮下多点注射；猪瘟兔化弱毒疫苗的免疫方法和剂量按照疫苗实际使用剂量进行免疫；空白对照用培养重组腺病毒的DMEM培养液免疫，2mL/头。所有试验猪在免疫后的20d时用100倍TCID5tl猪瘟强毒肌肉注射、点眼、滴鼻和口服攻击。(3)体温检测和临床观察所有试验猪从攻毒的第1天开始测量体温，以后每天测量体温，观察临床症状。(4)血清抗体的检测从免疫开始和免疫后的每个星期采集血液，收集血清，用于猪瘟抗体的检测，另一份加入抗凝剂，用于血液中猪瘟病毒的检测。(5)攻毒后血液中病毒存在的检测攻毒后隔天采集抗凝全血，用RT-PCR方法检测血液中的猪瘟病毒。(6)病理观察在攻毒后的14天，当所有存活猪的临床症状基本消失后，全部处死并进行剖检， 观察下颂淋巴结、肠系膜淋巴结、腹股沟浅淋巴结、肾脏、脾脏、膀胱以及心脏是否有病理变化。2.结果(1)体温和临床症状第一组(rAd-E0-CMV-E2免疫组)在免疫后没有出现任何临床症状，在攻毒后第4 天，5头免疫猪中1头猪体温达40°C以上，持续4 左右，第7天时左右体温恢复正常。致死保护率为100%。第二组(猪瘟脾淋苗免疫组)在攻毒后的第4天，5头免疫猪中1头猪体温达40°C 以上，持续7 左右，食欲稍微下降，在第8天体温和食欲恢复正常。致死保护率为100%。第三组(融合表达E0-E2基因的重组腺病毒rAd-E0_E2免疫组)在免疫后没有出现任何临床症状，在攻毒后第4天，5头免疫猪中2头猪体温达40°C以上，持续7 左右，第 8天时左右体温恢复正常。致死保护率为100%。第四组(非重组腺病毒免疫组)和第五组(空白对照组)的所有试验猪在攻毒后第1 2天体温升至40°C以上，病猪便秘；第3天食欲减退，精神沉郁，有些病猪发生呕吐， 很少采食，仅少量饮水，精神高度沉郁，四肢软弱无力，行动缓慢，摇摆不稳，普遍拉稀，两眼无神，有多量黏液脓性分泌物，腹下、耳和四肢内侧有出血点；第4天病猪伏卧不起，全身震颤，四肢呈游泳状划动，体温一直稽留在41°C左右。第5天开始陆续死亡，至第7天全部死亡，死前体温下降。死亡率为100%。体温及死亡情况见表1。(2)抗猪瘟病毒和抗猪瘟病毒抗体的检测用中国兽药监察所提供的猪瘟ELISA抗体检测试剂盒对所有试验猪的抗体水平进行检测。rAd-E0-CMV-E2免疫组的抗体呈上升趋势，在攻毒前抗体OD63tl值分别达到 0. 696，攻毒后所有试验组的抗体水平都呈明显的上升趋势。rAd-E0-E2免疫组的抗体水平也呈上升趋势，但在攻毒前抗体OD63tl值分别达到0. 595。猪瘟兔化弱毒苗免疫组的抗体水平在攻毒前的OD63tl最高值为0. 713。非重组腺病毒对照组和空白对照组在攻毒前一直没有检测到抗体水平，但是在攻毒后临死前能检测到猪瘟抗体水平。图1。表1不同疫苗免疫组CSFV强毒攻击后体温情况
权利要求
1.一种表达猪瘟病毒E0、E2基因的重组腺病毒，其特征在于在腺病毒的CMV启动子下游多克隆位点的Bgl II和Kpn I酶切位点中插入猪瘟病毒EO基因，在Bio I和)(baI酶切位点中插入腺病毒CMV启动子和猪瘟病毒E2基因的CMV-E2片段。
2.如权利要求1所述的表达猪瘟病毒E0、E2基因的重组腺病毒，其特征在于所述猪瘟病毒为常规的市购病毒，猪瘟病毒的EO基因在GenBank中的登录号为AF058715. 1，猪瘟病毒的E2基因在GenBank中的登录号为AY775178. 2
3.如权利要求1所述的表达猪瘟病毒E0、E2基因的重组腺病毒，其特征在于所述腺病毒为常规的市购人-5型非复制型腺病毒。
4.一种如权利要求1所述的表达猪瘟病毒E0、E2基因的重组腺病毒的构建方法，其特征在于包括下列构建步骤A.从市购的猪瘟病毒和猪瘟病毒中分别扩增出EO和E2基因；B.将步骤A获得的猪瘟病毒EO基因通过BglII和Kpn I酶切位点插入至腺病毒穿梭载体pAdTrack中，形成腺病毒穿梭载体pAdTrack-EO ；C.将步骤A获得的猪瘟病毒E2基因通过KpnI和Not I酶切位点插入至腺病毒穿梭载体pAdTrack中，形成腺病毒穿梭载体pAdTrack-E2 ；D.将步骤C的腺病毒穿梭载体pAdTraCk-E2按常规的PCR方法扩增出含有CMV 启动子的CMV-E2基因，通过Biol I和)(ba I酶切位点插入至步骤B的腺病毒穿梭载体pAdTrack-EO中的Biol I和)(ba I酶切位点中，形成重组腺病毒穿梭载体 pAdTrack-E0-CMV-E2 ；E.将步骤D的重组腺病毒穿梭载体pAdTrack-E0-CMV-E2经RiieI酶切线性化后，转化到含有腺病毒骨架载体pAd-easy-Ι的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中，形成重组腺病毒骨架载体 pAd-easy-E0-CMV-E2 ；F.将重组腺病毒骨架载体pAd-eaSy-E0-CMV-E2经I^cI线性化后，转染人胚胎肾细胞 HEK293中，包装出重组腺病毒rAd-E0-CMV-E2。
全文摘要
本发明提供一种表达猪瘟病毒E0、E2基因的重组腺病毒，其特征在于在腺病毒的CMV启动子下游多克隆位点的Bgl II和Kpn I酶切位点中插入猪瘟病毒E0基因，在XhoI和Xba I酶切位点中插入腺病毒CMV启动子和猪瘟病毒E2基因的CMV-E2片段。它解决了E0、E2基因融合串联表达产量低和保护效果弱的问题，仅通过一次免疫接种就能够使免疫后的猪获得对猪瘟病毒的抗体，且生产成本是常规疫苗的一半，本重组腺病毒属于非复制型病毒，在猪体内不繁殖，解决了弱毒疫苗长期接种导致的病毒返祖，毒力增强的现象。本重组腺病毒仅含有猪瘟病毒的主要保护基因，不含病毒的其它基因，因此，与野毒株之间不会发生重组。用本重组腺病毒制成的疫苗，免疫猪后对致死量100倍TCID50的猪瘟病毒强毒攻击的保护效果为100％。
文档编号C12N7/01GK102181404SQ201110000978
公开日2011年9月14日 申请日期2011年1月5日 优先权日2011年1月5日
发明者孙永科, 杨玉艾 申请人:孙永科