专利名称：溶组织内阿米巴半乳糖/乙酰氨基半乳糖多肽片段及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，涉及溶组织内阿米巴半乳糖/乙酰氨基半乳糖多肽片段，具体涉及一种溶组织内阿米巴150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端的多肽片段及其制备方法和应用。
背景技术：
溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica,Ε. h)是引起阿米巴性结肠炎和肠外脓肿的病原体，具有侵入宿主组织或器官、适应宿主免疫反应和表达致病因子的能力。全世界约有五千多万人感染溶组织内阿米巴，每年有10万患者死于阿米巴病(amoebiasis)，为仅次于疟疾的第二种致死性原虫病。我国的平均感染率为0.949%，感染人数估计为1069万 (1992年数据)。溶组织内阿米巴的感染性包囊经口摄入，通过胃和小肠，在回肠末端或结肠脱囊为滋养体。滋养体通过它表面的半乳糖/乙酰氨基半乳糖(Gal/GalNAc)可抑制性凝集素等粘附于肠上皮细胞，然后释放阿米巴穿孔素和半胱氨酸蛋白酶等致病因子，通过接触依赖性细胞溶解作用使细胞坏死，滋养体也可诱导与之接触的细胞发生凋亡。同时肠上皮细胞在此过程中分泌的细胞因子和趋化因子可吸引中性粒细胞和巨噬细胞到达感染部位，中性粒细胞与滋养体作用，释放炎性介质进一步破坏临近的肠上皮细胞；而滋养体释放的半胱氨酸蛋白酶可溶解细胞外基质，使滋养体穿越粘膜层，侵入粘膜下层，在粘膜下层中纵向延伸，形成特征性的口小底大烧瓶状溃疡。滋养体亦可侵入周围血管，随血液循环进入其他组织引起肠外脓肿。诊断阿米巴感染的传统方法是从粪便中检出溶组织内阿米巴滋养体或包囊，但是此方法的检出率不高，对于阿米巴肝脓肿病例也不易从脓液中检出滋养体。而血清学检验对于诊断侵袭性阿米巴病具有其高敏感性和无创伤性的特点，而且大多数无症状包囊携带者和阿米巴结肠炎患者血清中存在抗溶组织内阿米巴抗体。因此血清学诊断是重要的阿米巴病实验室诊断方法之一。已有不少文献报道重组溶组织内阿米巴抗原用于血清学诊断， 其中滋养体表面重要的粘附和致病分子Gal/GalNAc可抑制性凝集素重组蛋白是目前最有前景的诊断用重组蛋白之一。研究证实，溶组织内阿米巴滋养体表面存在两种不同分子量的Gal/GalNAc可抑制性凝集素，一种分子量为260kDa，另一种分子量为150kDa。分子量为150kDa的Gal/ GalNAc可抑制性凝集素与260kDaGal/GalNAC可抑制性凝集素通过非共价键连接。分子量 260kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素是由170 kDa的跨膜重链亚单位和31 kDa /35 kDa 的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定嵌入双层表膜的轻链亚单位，由二硫键连接组成的异二聚体。分子量为150kDa Gal/GalNAc可抑制性凝集素又被称为Gal/GalNAc可抑制性凝集素的中间亚单位(intermediate subunit，Igl)。Igl由两个独立的基因编码(igll和 igl2)，编码的蛋白含有1，101个氨基酸与260 kDa Gal/GalNAc可抑制性凝集素的氨基酸有81%的一致性，富含半胱氨酸，并有GPI锚定的膜蛋白氨基和羧基末端疏水信号序列的特征，是具CXXC和CXC重复序列的阿米巴基因家族中的一员，与滋养体的吸附和细胞毒性有关[1，3，6]。Igl能被免疫系统识别，在蛋白免疫印迹中阿米巴感染者的血清能够识别纯化的Igl ；天然的Igl不仅能够被阿米巴病患者的血清识别，而且能够被无症状的包囊携带者血清识别。而抗Igl的鼠单克隆抗体能够抑制滋养体粘附哺乳动物细胞、对哺乳动物细胞的细胞毒作用以及吞噬红细胞作用，但中间亚单位在整个凝集素中的作用仍然不清楚。全长Igl的重组蛋白虽然已经制备成功并可以被阿米巴患者血清识别，但由于全长Igl分子量比较大，表达量低，因而大量制备比较困难。此外，全长Igl蛋白中部分氨基酸序列已被证实不含有被病人血清识别的抗原表位，所以以全长Igi蛋白作为血清诊断抗原容易出现交叉反应。因而，仅含有阿米巴患者血清的识别抗原表位的Igi蛋白片段不仅可以提高特异性和敏感性，而且由于分子量减小，有利于表达和制备，适于临床诊断的应用。
发明内容
本发明的目的在于针对阿米巴病的诊断的不足，提供溶组织内阿米巴半乳糖/乙酰氨基半乳糖多肽片段，尤其是一种溶组织内阿米巴150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端的多肽片段及其制备方法和在诊断中的应用。本发明通过基因工程手段，从溶组织内阿米巴中提取其150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端编码基因，构建表达载体，在大肠杆菌中诱导表达重组150kDa的 Gal/GalNAc可抑制性凝集素蛋白的C末端多肽片段，该多肽片段可用于阿米巴病的血清学诊断。本发明所述的150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端编码基因如SEQ ID No 1所示。所述的150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端编码基因其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。本发明提供了所述的重组150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端多肽片段的制备方法，其特征在于，其包括步骤
(1)从培养的溶组织内阿米巴滋养体中提取总RNA，通过RT-PCR合成cDNA；
(2)合成引物:
EH150-S749-XH0 :5’ - CCCTCGAGACTGAACAAAGGCTAAAAGA-3’ EH150-AS1088-XH0 :5’ -CCCTCGAGTTAAATGCCTTTAGCTCCATT-3 ‘
(3)以cDNA为模板，通过PCR获得150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端编码基因片段；
(4)将编码基因克隆入原核表达载体中，转化宿主菌，培养所得重组工程菌，然后诱导其表达目的蛋白；
(5)采用缓冲液对150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端多肽片段的包涵体进行洗涤，将其提纯后，采用谷胱甘肽还原系统对其复性，从而获得重组150kDa的Gal/ GalNAc可抑制性凝集素的C末端多肽片段。本发明步骤(1)中，所分离总RNA来源于溶组织内阿米巴滋养体。本发明步骤(3)中，所述的150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端编码基因如SEQ ID No 1所示；所述的150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端编码基因其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。本发明中，表达载体不限于特定的表达载体，只要它能够与所述cDNA基因重组， 形成适宜表达质粒。本发明的实施例中优选表达载体为原核表达载体，尤其是pET19b。本发明中，宿主细胞不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。本发明的实施例中优选宿主细胞为大肠杆菌BL21 Star (DE3)pLysS。本发明方法中，培养宿主细胞的培养基是LB液体培养基，培养温度是20 37°C， 培养时间3 16小时。本发明方法中，菌体达到合适的浓度后用IPTG诱导表达，诱导条件为IPTG浓度为0. 1 ImM，诱导温度为20 37°C，诱导时间为2 16小时。本发明方法中，重组150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端多肽片段的最终产物用过下述方法纯化将150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端多肽片段表达工程菌在37°C诱导3小时后，离心收集菌体，置于冰上超声裂解，然后加入溶菌酶30°C 振摇30分钟，离心，收集包涵体蛋白沉淀，以Novagen公司的refolding kit对包涵体蛋白进行提纯与复性后，HOOOrmp离心20分钟，收集上清，冰箱保存。本发明中，采用Dolt bolt法检测重组150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的 C末端多肽片段与阿米巴病患者血清的反应性。本发明中，采用ELISA方法比较重组150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C 末端的多肽片段、重组150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素和溶组织内阿米巴粗抗原的血清学诊断的敏感性与特异性。本发明具有如下优点本发明从培养的溶组织内阿米巴滋养体中提取总RNAJf 增出重组150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端的多肽片段的编码基因，从而构建表达载体。转入大肠杆菌诱导后，重组重组150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C 末端的多肽片段以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达，经过简单的洗涤后，可以获得高纯度的蛋白。以谷胱甘肽还原系统对其进行复性后，可获得具有生物学活性的可溶性重组重组150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端的多肽片段，可用于阿米巴病的血清学免疫诊断，克服阿米巴病诊断中粪检溶组织内阿米巴的包囊和滋养体的漏检与误诊，大大提高阿米巴病诊断特异性和敏感性。表1. E.h粗抗原、Igl重组蛋白片段与正常人、阿米巴感染者、无关病人血清 ELISA结果。表 1
■ It感醱邊栽悉粉 m袁塵 象￡ ! τ镛#镇1^ ·- K 私·I AC ] Α Λ ACFPfT| j Gla Wk J —JliJJ ； 科 明 I n-'j [ am—7-i-r—ΜΦ I ； IOi ； 滅.29m ι mm 博买η
图1 150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素C末端基因PCR扩增产物凝胶电泳。图2 150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素C末端基因与表达质粒连接后的历ii/ III单酶切鉴定电泳图。
图3 150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素C末端氨基酸序列与全长150kDa的 Gal/GalNAc可抑制性凝集素(AAK92361. 1)氨基酸序列对比。图4重组150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素C末端多肽片段10%SDS_聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，
其中M 低分子量标准蛋白质；1 未加入IPTG的3h培养细菌裂解液；2 =IPTG诱导3h 后的细菌裂解液；3: C-末端多肽片段包涵体；4: C-末端多肽片段包涵体透析、复性后蛋白。图5重组150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素C末端多肽片段特异性的Dolt blotting 检测，
其中1 与阿米巴感染者血清反应；2 与正常人血清反应；3 与恶性疟原虫病人血清反应。图6溶组织内阿米巴滋养体粗抗原与患者血清的ELISA结果。图7重组150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素与患者血清的ELISA结果。图8重组150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素C末端多肽片段与患者血清的 ELISA结果。图9重组150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素与溶组织内阿米巴粗抗原相关性。图10重组150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素C末端多肽片段与溶组织内阿米巴粗抗原相关性。
具体实施例方式实施例1溶组织内阿米巴的培养
溶组织内阿米巴HM-I IMSS株以含15%成牛血清、100U/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素的BI-S-33培养基无菌培养。阿米巴滋养体培养在6ml的有盖玻璃培养管中，盖紧管盖，并呈5°的角度放置在36. 5 ！细胞培养箱中。
实施例2 PCR反应扩增igll C-末端基因
按照试剂盒说明，使用Rneasy Total RNA试剂盒提取无菌培养的溶组织内阿米巴 HM-I IMSS 株总 RNA。使用 GeneAmp RNA PCR Kit 进行 RT-PCR，获得 cDNA。以 cDNA 为模板， 用引物 EH150-S749-XH0 (5，- CCCTCGAGACTGAACAAAGGCTAAAAGA-3，)和 EH150-AS1088-XH0 (5‘ -CCCTCGAGTTAAATGCCTTTAGCTCCATT- 3)扩增 C-末端基因。PCR 执行程序94°C 2min ； 94°C 15sec，55°C 30sec,72°C lmin，共 30 个循环；72°C 3min。反应结束后各取 PCR 产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，C-末端基因大小为IlOObp (如图1所示)。
实施例3 构建pET19b-Ehl50-C质粒
以QIAquick PCR Purification Kit提纯PCR扩增产物后，再以Xho I酶切PCR扩增产物。经0. 8%琼脂糖凝胶电泳后，用QIAEXII Agaose Gel Extraction Kit提纯DNA。以 TAKARA DNA Ligation Kit将载体pET19b与Igl基因的C-末端基因片段，16°C连接过夜。 将连接产物转化JM109感受态细胞，37°C培养过夜，提取质粒后，0. 8%琼脂糖凝胶电泳结果显示重组基因片段都与质粒连接成功，重组质粒大小为6. Skb,(如图2所示)，测序鉴定证实目的基因插入位点及插入片段大小均正确。采用Vector NTI 10软件，推定氨基酸序列，并与全长Igl蛋白氨基酸序列(AAK92361. 1)进行比对，结果显示C末端多肽片段为全长Igl 蛋白的749位至1088位之间的氨基酸多肽序列片段(如图3所示)。
实施例4重组蛋白的表达和纯化
将重组质粒pET19b-Ehl50-C转入BL21 (DE3) pLysS感受态细胞后，涂布于LB琼脂板 (含氨苄青100mg/ml，氯霉素34mg/ml)，37°C温箱中培养过夜。挑选单一菌落入800ml LB 培养液(含氨苄青50mg/ml，氯霉素34mg/ml)中，37°C 220rmp振摇，培养至0D600约为0. 5 时，加入ImM的IPTG，37°C诱导3小时，4°C 8000rpm离心10分钟，弃上清，收集细菌沉淀。 经10%的SDS-PAGE检测，IPTG诱导的菌液在分子量大约53kDa。重组Igl蛋白C-末端以包涵体的形式表达。细菌沉淀中，加入40ml IB wash buffer和40ml IM PMSF，冰上超声后，加入溶菌酶(终浓度为200mg/ml)混勻后，30°C IOOrmp振摇30分钟后，再次冰上超声， 离心IOOOOrmp 10分钟；弃上清，加入40ml IB wash buffer重新悬浮后，IOOOOrmp离心 10分钟，重复该步骤，直至沉淀的颜色一致。经10%的SDS-PAGE检测重组Igl蛋白C-末端蛋白的包涵体纯度可达到95%以上(如图4所示)。实施例5斑点印迹(Dot Blotting)
将Igl全长、C-末端重组蛋白各分别加样于硝酸纤维素膜上，室温干燥，以5%脱脂奶一 PBS于湿盒中封闭lh。分别与阿米巴感染者混合血清(1:200稀释)、正常人的对照血清(1:200稀释)、恶性疟原虫病人血清(1:200稀释)在湿盒中孵育lh。以PBS (含0. 05% Tween)洗膜后，与HRP标记的山羊抗人IgG (1:300稀释)湿盒中孵育Ih后以PBS (含0. 05% Tween)洗膜。使用Konica Immunostaining HRP-1000显色，结果显示Igl全长重组蛋白、 C-末端重组蛋白能与阿米巴感染者血清反应，与正常人血清和恶性疟原虫病人的血清不发生反应。(如图5所示)
实施例6重组蛋白敏感性与特异性检测
96孔酶标板每孔加入含Img溶组织内阿米巴HM-I IMSS株滋养体粗抗原或者IOOng Gal/GalNAc可抑制性凝集素中间亚单位全长或重组C末端蛋白的Coating Buffer 100ml, 4 °C湿盒中过夜。PBS (含0. 05% Tween20)洗板后每孔加入含3%脱脂奶的PBS 400ml，湿盒中室温封闭lh。每孔中分别加入100ml健康人或病人血清(1:400稀释)，阴性对照为健康人血清(1:400稀释)湿盒中室温孵育lh。PBS (含0.05% Tween20)洗板后每孔中加入 IOOrnl辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG (1:1000稀释)100ml，湿盒中室温孵育lh。PBS (含0.05% Tween20)洗板后加入显色液200ml/孔，室温下避光反应30min，最后每孔加入 2M H2S04 50ml终止显色反应。酶标仪490nm测定吸光度。0D490读数高于健康阴性对照组人群平均OD值3个标准差以上为阳性。将标本信息及ELISA结果等输入计算机，建立数据库。应用统计软件STATA 7.0进行统计分析。所有统计结果均以P<0. 05作为差别有统计学意义的标准。ELISA检测结果显示，Igl全长重组蛋白和C-末端重组蛋白与20名健康人、59名溶组织内阿米巴感染者(包括29名阿米巴结肠炎患者(AC)、21名阿米巴肝脓肿患者(ALA)、 9名无症状阿米巴包囊携带者(ACP))、9名恶性疟原虫感染者(Pf)、6名刚地弓形虫感染者(Tg),3名蓝氏贾第鞭毛虫感染者(Gla)和20名人芽囊原虫感染者(Bh)血清的反应性，并与阿米巴粗抗原比较，结果如表1所示。阿米巴粗抗原与59名E. h感染者的血清反应均为阳性，敏感性为100% ；58例阴性对照(包括20名健康人和38名其他原虫感染者)中只有1 例弓形虫感染者血清与阿米巴粗抗原反应阳性，特异性为98% (如图6所示)。以Igl全长重组蛋白作为抗原时，它与21名阿米巴肝脓肿患者和9名无症状包囊携带者血清反应为阳性，29名结肠炎患者中有1例血清反应为阴性，敏感性为98% ；58例阴性对照中仅有1名人芽囊原虫感染者血清与全长Igl反应为阳性，特异性为98%(如图7所示)。用C-末端重组蛋白作为抗原与血清反应的实验中，三者与阿米巴病人血清反应0D490的读数(平均值士标准差)为2. 00士 1.081。C-末端作为抗原，59名阿米巴感染者中只有一名阿米巴肝脓肿患者与它的反应为阴性，敏感性98%;阴性对照中只有一名蓝氏贾第鞭毛虫感染者血清与它的反应为阳性，特异性也是98% (如图8所示)。 敏感性和特异性较高的Igl全长、C-末端重组蛋白ELISA的OD读数分别与阿米巴粗抗原的ELISA结果相比较。两者与粗抗原都存在线形相关性，Igl全长r=0. 8804， Ρ<0· 0001 (如图 9 所示)；C-末端 r=0. 7969，Ρ<0· 0001 (如图 10 所示)。
权利要求
1.溶组织内阿米巴半乳糖/乙酰氨基半乳糖多肽片段，其特征在于，所述的多肽片段为溶组织内阿米巴150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端的多肽片段，150kDa的 Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端编码基因如SEQ ID No :1所示；所述的150kDa的Gal/ GalNAc可抑制性凝集素的C末端编码基因其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。
2.权利要求1的溶组织内阿米巴半乳糖/乙酰氨基半乳糖多肽片段的制备方法，其特征在于，其包括步骤(1)从培养的溶组织内阿米巴滋养体中提取总RNA，通过RT-PCR合成cDNA；(2)合成引物:EH150-S749-XH0 :5’ - CCCTCGAGACTGAACAAAGGCTAAAAGA-3’EH150-AS1088-XH0 :5’ -CCCTCGAGTTAAATGCCTTTAGCTCCATT-3 ‘ ；(3)以cDNA为模板，通过PCR获得150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端编码基因片段；(4)将编码基因克隆入原核表达载体中，转化宿主菌，培养所得重组工程菌，然后诱导其表达目的蛋白；(5)采用缓冲液对150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端多肽片段的包涵体进行洗涤，将其提纯后，采用谷胱甘肽还原系统对其复性，获得重组150kDa的Gal/GalNAc 可抑制性凝集素的C末端多肽片段。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所分离的总RNA来源于溶组织内阿米巴滋养体。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，150kDa的Gal/GalNAc 可抑制性凝集素的C末端编码基因如SEQ ID No 1所示。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，150kDa的Gal/GalNAc 可抑制性凝集素的C末端编码基因，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的表达载体不限于特定的表达载体， 只要它能够与所述cDNA基因重组，形成适宜表达质粒。
7.根据权利要求2或5所述的方法，其特征在于，所述的表达载体为原核表达载体。
8.根据权利要求2或5所述的方法，其特征在于，所述的表达载体为pET19b。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。
10.根据权利要求2或8所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞为大肠杆菌BL21 Star (DE3)pLysS0
11.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，培养宿主细胞的培养基是LB液体培养基，培养温度是20 37°C，培养时间3 16小时。
12.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，菌体达到合适的浓度后用IPTG诱导表达，诱导条件为IPTG浓度为0. 1 ImM，诱导温度为20 37°C，诱导时间为2 16小时。
13.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述重组150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端多肽片段的最终产物通过下述方法纯化将150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端多肽片段表达工程菌在37°C诱导3小时后，离心收集菌体，置于冰上超声裂解，然后加入溶菌酶30°C振摇30分钟，离心，收集包涵体蛋白沉淀，以Novagen公司的refolding kit对包涵体蛋白进行提纯与复性后，HOOOrmp离心20分钟，收集上清，冰箱保存。
14.权利要求1的溶组织内阿米巴半乳糖/乙酰氨基半乳糖多肽片段在制备与阿米巴病患者血清反应制剂中的用途。
15.权利要求1的溶组织内阿米巴半乳糖/乙酰氨基半乳糖多肽片段在制备溶组织内阿米巴粗抗原的血清诊断制剂中的用途。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，涉及溶组织内阿米巴半乳糖/乙酰氨基半乳糖多肽片段及其制备方法和应用。本发明从培养的溶组织内阿米巴滋养体中提取总RNA，扩增出重组150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端的多肽片段的编码基因，构建表达载体，转入大肠杆菌诱导后，重组150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端的多肽片段以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达，经洗涤后，获得高纯度的蛋白。以谷胱甘肽还原系统对其进行复性后，可获得具有生物学活性的可溶性重组重组150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端的多肽片段，可用于阿米巴病的血清学免疫诊断，克服阿米巴病诊断中粪检溶组织内阿米巴的包囊和滋养体的漏检与误诊，明显提高阿米巴病诊断特异性和敏感性。
文档编号C12N15/09GK102167747SQ20111000109
公开日2011年8月31日 申请日期2011年1月5日 优先权日2011年1月5日
发明者付永锋, 橘裕司, 程训佳 申请人:复旦大学