专利名称：一种β-葡聚糖酶的高效制备方法
技术领域：
本发明涉及一种β -葡聚糖酶基因工程菌的构建及β -葡聚糖酶的高效制备方法，属于基因工程和酶工程技术领域。
背景技术：
β -葡聚糖酶(β-1，3-1，4-葡聚糖酶(EC 3. 2. 1. 73))可以催化β -葡聚糖的水解反应。β-葡聚糖酶在食品、酿造、造纸和日化等许多方面有着广泛的应用，其研究越来越受到重视。在啤酒生产中，因麦芽含有β-葡聚糖，造成麦汁粘度过大致使过滤困难，延长糖化醪过滤时间，降低麦汁得率，影响啤酒质量的稳定性。葡聚糖酶能将麦芽中的葡聚糖水解为葡萄糖和低聚糖，摧毁细胞壁，使细胞内容物大量地释放出来，提高麦汁得率， 降低醪液粘度而缩短糖化醪过滤时间，所获麦汁特别清亮，使制得的啤酒色泽浅，泡沫勻而持久。因此，将葡聚糖酶用于啤酒糖化和发酵过程，可降低成本，提高糖化过滤设备的效能，有利于啤酒的质量提高及稳定。在农作物品种的改良和病原菌的生物防治方面，多种植物的病原真菌细胞壁的主要成份都是β-1，3-葡聚糖和几丁质，β-葡聚糖酶的水解活性能够抑制真菌的生长与增殖。因此β-1，3-葡聚糖酶是植物抗真菌病的重要抗性物质之一。在以大麦麦芽为原料的麦类饲料加工过程中，添加β-葡聚糖酶有效消除β-葡聚糖引起的单胃动物消化道黏度增加，提高饲料的可消化性、促进动物对营养的吸收，提高饲料的生物转化率，改善畜禽生产性能，同时减少排泄物对环境的污染。β -葡聚糖酶生产菌株主要有绿色木霉和解淀粉芽孢杆菌两种，其发酵水平一般在1，000 IU/mL发酵液左右(1 IU定义为1 min水解大麦β -葡聚糖产生1 μ mol还原糖 (以葡萄糖计)所需的酶量，下同)。采用基因工程手段是迅速提高葡聚糖酶生产水平的有效途径，目前国内外已有绿色木霉、解淀粉芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌等多种微生物葡聚糖酶编码基因的报道。利用基因重组微生物表达葡聚糖酶也有许多成功的报道，但大多以大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母为表达宿主，Seiss M等对芽孢梭菌的β-葡聚糖酶基因进行了基因克隆和序列分析；Chie Kohchi和Akio Tohe从假丝酵母中克隆到β -葡聚糖酶基因，并在酿酒酵母中进行了表达研究；高雯等实现了绿色木霉LTR. 2 β -1，3-葡聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达；陈惠等通过PCR方法将已克隆的内切葡聚糖酶基因信号肽编码序列去除，然后与表达载体PHIS1525连接后转化大肠杆菌DH5ci，筛选出阳性转化子DH5a-pHIS1525-G7并提取质粒进一步转化巨大芽孢杆菌WH320原生质体，获得基因工程菌WH320-pHIS1525-G7 ；李永仙等构建的重组大肠杆菌表达来源于解淀粉芽孢杆菌的β-葡聚糖酶，发酵水平达到1883 IU/mL，而且表达产物成功分泌到细胞外，这是到目前为止有文献报道的葡聚糖酶分泌表达的最高水平。由于大肠杆菌不适于作为宿主大规模表达异源蛋白，而芽孢杆菌是大规模生产工业酶制剂的常用系统，因此研究芽孢杆菌系统分泌表达β -葡聚糖酶方法具有很大的应用前景。本发明公开了高效表达葡聚糖酶的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌的构建方法及其高效制备技术。
发明内容
本发明的目的之一是提供了一种产葡聚糖酶的菌株解淀粉芽孢杆菌/ pUB-PQQ-知以/。本发明的目的之二是提供了一种用于芽孢杆菌表达系统的人工杂合启动子的构建方法。本发明的目的之三是提供了一种在人工杂合启动子介导下通过解淀粉芽孢杆菌发酵高效制备β-葡聚糖酶的技术。本发明提供一种人工杂合启动子构建方法和β-葡聚糖酶基因的密码子优化方法，以及在该启动子介导下利用解淀粉芽孢杆菌高效制备β-葡聚糖酶的技术。根据解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶的密码子偏爱性，将β-葡聚糖酶的部分氨基酸密码子进行人工替换，人工合成优化后的β-葡聚糖酶DNA序列；将来源于地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶启动子和来源于解淀粉芽孢杆菌的中温α-淀粉酶启动子片段进行不同方式的组合，人工合成转录效率较高的杂合启动子；将人工合成的葡聚糖酶置于杂合启动子下游构建重组表达载体，然后导入解淀粉芽孢杆菌宿主菌种，通过庆大霉素抗性平板筛选阳性克隆；将重组菌分别在摇瓶、30L发酵罐、600L发酵罐和8吨发酵罐中发酵生产制备β -葡聚糖酶。为实现本发明的技术目的，本发明采取以下技术方案
一种产β-葡聚糖酶的菌株，分类命名为解淀粉芽孢杆菌/pUB-PQQ-如·以/，已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO =M 2010344。所述菌株CCTCC NO =M 2010344，其所含有的经密码子优化并人工合成的β -葡聚糖酶基因如·以/，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 1。由于不同微生物密码子的使用频率不同，且存在着明显的倾向性，并且细胞内对应的、RNA量与密码子的使用频率成正比，tRNA的丰度也是与密码子的偏好性相联系的。含量丰富的tRNA所识别的密码子要比稀少tRNA所识别的密码子使用频率要高。根据这个原则，优化了来源于地衣芽孢杆菌的β-葡聚糖酶编码基因密码子，所述菌株CCTCC NO =M 2010344，其所述的人工合成的β-葡聚糖酶基因如·Μ/，人工合成及克隆的步骤如下
(1)选择解淀粉芽孢杆菌能够高效分泌表达的中温α-淀粉酶基因为参照物，通过生物信息学软件分析中温α-淀粉酶基因的密码子偏爱性；
(2)获得解淀粉芽孢杆菌的β-葡聚糖酶氨基酸序列GenBank No: ΑΒΥ71827. 1，根据密码子简并特性由氨基酸序列推测出DNA序列，并以步骤(1)的中温α-淀粉酶基因密码子偏爱性信息为依据，优化葡聚糖酶基因密码子在不改变氨基酸序列的前提下分别将β -葡聚糖酶编码基因中编码谷氨酸Glu、谷氨酰胺Glru半胱氨酸Cys、丝氨酸kr的密码子GAG，CAA, UGU，UCU对应分别替换为GAA，CAG, UGC, UCA ； β -葡聚糖酶基因共有13个碱基被置换，密码子优化后得到β -葡聚糖酶基因bglAI ；
步骤(1)和步骤(2)所述的解淀粉芽孢杆菌是feciBm amyloliquefaciens ；
(3)以人工合成的知以/基因为模板，设计引物PCR扩增该基因，将该基因克隆到pMD-T easy载体中，获得重组质粒pMD-如·以/。
PCR扩增所用的引物为
F 5' -CCATGGATGTTTTATCGTATGAAACGA-3‘， R 5' -TTATTTTTTTGTATAGCGCACCC-3‘，
其中在上游引物F的5'端加上AfcoI限制酶识别位点。PCR产物使用试剂盒纯化回收， PCR产物克隆按照T载体说明书进行(Takara公司提供)。上述β-葡聚糖酶编码基因密码子优化和克隆方法的步骤(2)中所述的碱基置换，没有改变β-葡聚糖酶的氨基酸序列。碱基置换包含至少一个碱基的置换，但不仅限于 1个或几个碱基的置换，较佳是5 10个碱基的置换，更佳的是1(Γ13个碱基的置换。上述β-葡聚糖酶编码基因密码子优化和克隆方法中，所述的人工合成的β-葡聚糖酶编码基因包含有自身的分泌信号肽序列。所述菌株CCTCC NO =M 2010344，其pUB-PQQ-^·^/所包含的杂合启动子PQQ的构
建方法，
杂合启动子PQQ构建方法，按如下步骤进行
(1)根据文献报道(牛丹丹等.微生物学报.2006,46(4): 576-580)，获得地衣芽孢杆菌14580的高温α -淀粉酶基因的启动子Pa _^，长度为180 bp ；
启动子VamyL序列为SEQ ID NO: 4 ；
(2)根据文献报道(刘洋等.工业微生物.2009，39(1):11-15)，获得解淀粉芽孢杆菌的中温α-淀粉酶基因的启动子Pa j^，长度为200 bp ；启动子序列为SEQ ID NO: 5 ；
(3)分别取步骤(1)中VamyL上游100bp序列，和步骤(2)中 a_下游100 bp,人工合成杂合启动子PQQ ；杂合启动子PQQ的核苷酸序列为SEQ ID NO: 6 ；
(4)设计引物，以人工合成的PQQ启动子DNA为模板，PCR扩增该DNA片段，将扩增产物克隆到pMD-T easy载体中，获得重组载体pMD_PQQ ；
所述PCR引物为
Pf 5' - AGCTTGAAGAAGTGAAGAAG-3‘
Pr 5' -CCATGGTTTTGACACTCCTTATTTGA-3 ‘，其中在下游引物 Pr 的 5 ‘端加上AfcoI 限制酶识别位点。上述选取VamyL上游100 bp序列，但不仅限于该片段长度，上游5(T200 bp 长度的DNA序列与VainyQ下游5(T200 bp长度的DNA序列进行杂合都能构建出有同样效果的杂合启动子；选取下游100 bp的DNA序列，但不仅限于该片段长度，VamyQ下游 50^200 bp长度的DNA序列与VernyL上游50 200 bp长度的DNA序列组合都能构建出具有同样效果的杂合启动子。所述菌株CCTCC NO =M 2010344,即pUB_PQQ_如·以/的构建方法，按照如下步骤进行
(1)将重组质粒pMD-Zw^/用限制酶和AfcoI进行双酶切，36 38°C反应过夜，然后将酶切产物纯化回收获得如·以/基因片段；
(2)将重组载体pMD-PQQ用限制酶及和AfcoI进行双酶切，36 38°C反应过夜；然后将酶切产物纯化获得PQQ启动子片段；
(3)将质粒pUBllO(佟小雪等.生物技术.2009，19(5) 11-13)用和及进行双酶切，36 38°C反应过夜；然后将酶切产物纯化，再将该酶切产物与步骤(1)和(2)的酶切产物混合，用T4 DNA连接酶在3飞。C反应1Γ16 h，得连接产物；
(4)将连接产物电转化枯草芽孢杆菌感受态细胞，涂布含卡那霉素15μ g/mL的培养基平板，35 37°C培养过夜，挑选阳性克隆，并进行培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，得按正确方向插入目的基因的重组表达质粒，命名为pUB-PQQ-如·以/ ；
所述的枯草芽孢杆菌为feciBm subtilis 1A717 (佟小雪等.生物技术.2009， 19(5) 11-13)；
(5)培养步骤(4)获得的阳性克隆，提取重组表达质粒，将该质粒用电转化方法转入解淀粉芽孢杆菌中，转化后的菌液涂布浓度为5 μ g/mL卡那霉素抗性选择培养基平板，37°C 培养14-16 h，筛选到含有重组质粒pUB-PQQ-/^^/的重组解淀粉芽孢杆菌；
所述的解淀粉芽孢杆菌为feciBM amyloliquefaciens (刘洋等.工业微生物. 2009，39(1) 11-15)。步骤(4)和步骤(5)中，所述的电转化方法是一致的，电转化所用的培养基如下 生长培养基每升含10 g胰蛋白陈、5 g酵母浸提物、5 g氯化钠、0.5 mol/L山梨醇。复苏培养基每升含10 g胰蛋白陈、5 g酵母浸提物、5 g氯化钠、0. 7 mol/L甘露选择培养基每升含10 g胰蛋白脉、5 g酵母浸提物、5 g氯化钠、5 g β-葡聚糖、 15 g琼脂粉、5 mg卡那霉素。EP缓冲液每升含91. 1 g山梨醇、91. 1 g甘露醇、100 mL 100%甘油。电转化方法如下
①在100 mL生长培养基中接入1 mL过夜培养的种子液。②37°C剧烈振荡培养至0D_为0. 6左右。φ 4°C离心收集细胞，用适量10%甘油洗涤细胞3次，并最终将细胞悬浮于400 μ L 10%甘油中。④每40 μ L分装于1.5 mL Eppendorf管中，直接用于下一步转化实验或者_70°C 保藏备用。 混合40 μ L感受态细胞和2 μ L质粒，于1.6 kV，5 ms条件下进行电击。 迅速加入1 mL复苏培养基，然后37°C剧烈振荡1 h。 将细胞涂布于选择培养基上。通过筛选得到含有重组表达质粒pUB-PQQ-/^^/ 的解淀粉芽孢杆菌。利用所述的重组解淀粉芽孢杆菌pUB-PQQ-如·以/发酵制备β -葡聚糖酶的方法，步骤如下
(1)将在4°C保藏的含有pUB-PQQ-如·以/的重组解淀粉芽孢杆菌接种于种子培养基中， 37200 r/min，培养M h，获得的种子培养液；
其中所述的种子培养基成分0. 5%酵母膏，1%蛋白胨，1%氯化钠；
(2)按照69TlO%的体积比将步骤(1)中获得的种子培养液转接于装有15 20L发酵培养基的发酵罐中，培养条件为37 42°C，200 r/min，发酵84 h；
或将步骤(1)中获得的种子培养液按0. 2%的体积比接种量接种于含600L发酵培养基的发酵罐中，培养条件为37°C，200 r/min，培养时间M 36 h；
其中所述的发酵培养基成分棉籽粉2. 5% 4%，乳糖2% 4%，磷酸二氢钾40 60 mmol/ LJ ρΗ6· 5 ；
(3)将步骤(2)获得的发酵液作为种子按1%体积比接种量转接于装有6吨发酵培养基的8吨发酵罐中，培养条件为37、2°C，200 r/min，培养时间76、6 h，其中所述的发酵培养基组分与步骤(2)相同；
(4)步骤(2)或(3)的获得的β-葡聚糖酶发酵液酶活达到2，800 3，200 IU/mL (1 IU 定义为1 min水解大麦β-葡聚糖产生1 ymol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量，下同)， 收集发酵液通过陶瓷膜微滤和超滤膜超滤后获得β-葡聚糖酶浓缩液；
所述的陶瓷膜，其材质为柱状氧化铝材质，其孔径为0.45 μ m，通过回流阀压力调节过滤速度，流速控制0. 4^0. 8 L/min，该设备可从市场购买；
所述的超滤膜为卷式超滤膜，其材质为聚醚砜，截留分子量为10 KD，超滤的温度通过调节冷却水的循环速度来进行控制，该设备可从市场购买获得；
上述发酵制备β-葡聚糖酶方法中所用的培养基组分均可从生化试剂公司购买获得。本发明的有益效果根据上述发酵制备葡聚糖酶方法，获得的浓缩酶液中蛋白浓度达到3g/mL，β-葡聚糖酶的酶活达到了 ll，200 15，000IU/mL。生物材料样品保藏一种产β-葡聚糖酶的菌株，分类命名为解淀粉芽孢杆菌/pUB-PQQ-bglAI Bacillus amyloliquefaciens/pUB-PQQ-bglAI,已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO =M 2010344，保藏日期2010年12月13日。
图1重组质粒pMD - bglAI物理图谱。图2重组质粒pMD-PQQ物理图谱。图3重组表达质粒pUB-PQQ-^·^/物理图谱。
具体实施例方式实施例1重组质粒pMD-如·以/的构建
用DNAMAN软件分别分析解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶基因的密码子偏爱性和 β-葡聚糖酶氨基酸序列；将β-葡聚糖酶基因中编码谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gin)、半胱氨酸(Cys)、丝氨酸(Ser)的密码子GAG, CAA, UGU, UCU分别替换为GAA，CAG, UGC, UCA。 在不改变安静酸序列的前提下，共有13个碱基被置换，将密码子优化后的DNA序列递交上海生工公司进行合成全长732 bp的如·以/基因；以如·以/基因为模板，用引物F: 5' -CCATGGATGTTTTATCGTATGAAACGA-3‘，
R: 5' -TTATTTTTTTGTATAGCGCACCC-3‘进行 PCR 扩增 bglAI 片段，扩增条件是 94°C， 3min;94°C，50 s，55°C，90 s，72°C，60 s，30 个循环；72°C，10 min ;PCR产物经回收纯化后， 与克隆载体PMD-T easy (大连宝生物公司)混合，4 16°C过夜连接，连接体系为20 yL的反应体系中含2 X Buffer 5 μ L，PCR产物4 μ L, pMD-T easy质粒1 μ L，用双蒸水补足 20μ L ；将连接混合物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布于LB平板(氨苄青霉素浓度100 yg/mL)，37°C培养纩10 h，挑取单菌落培养，小量提取质粒后进行酶切电泳验证，获得含有重组质粒阳性克隆；大肠杆菌感受态细胞的制备和转化等参照Sambrook J, Russell Dff.分子克隆实验指南进行。实施例2重组质粒pMD-PQQ的构建
根据文献报道，获得地衣芽孢杆菌14580的ISObp的高温α -淀粉酶基因启动子和解淀粉芽孢杆菌的200 bp长度的中温α-淀粉酶基因启动子分别取Pa 对上游 100 bp序列和下游100 bp，按照上下顺序由上海生工公司合成全长200 bp的杂合启动子PQQ ；设计引物，以PQQ为模板，用引物
Pf 5' - AGCTTGAAGAAGTGAAGAAG-3‘，
Pr 5 ‘ -CCATGGTTTTGACACTCCTTATTTGA-3 ‘(下划线为 AfcoI 酶切位点)PCR 扩增 PQQ 片段，扩增条件是 94°C，3min ;94°C，50 s，55°C，90 s，72°C，60 s，30 个循环；72°C，10 min ； PCR产物经回收纯化后，与克隆载体pMD-T easy (大连宝生物公司)混合，4 16°C过夜连接， 连接体系为20 μ L的反应体系中含2XBuffer 5 μ L，PCR产物4 μ L，pMD-T easy质粒 1 μ L，用双蒸水补足20 μ L ；将连接混合物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布于LB平板(氨苄青霉素浓度100 yg/mL)，37°C培养8-10 h，挑取单菌落培养，小量提取质粒后进行酶切电泳验证，获得含有重组质粒PMD-PQQ阳性克隆；大肠杆菌感受态细胞的制备和转化等参照Sambrook J, Russell DW分子克隆实验指南进行。实施例3重组质粒pUB-PQQ-勒·以/的构建
将重组质粒PMD-Zw^/用限制酶和Afco I进行双酶切，36 38 °C反应过夜，然后将酶切产物纯化回收获得力穿以/基因片段；将重组载体pMD-PQQ用限制酶汉3 HI和AfcoI进行双酶切，36 38°C反应过夜；然后将酶切产物纯化获得PQQ启动子片段；用和及双酶切质粒PUB110，36 38°C反应过夜；然后将酶切产物纯化；分别将回收纯化后的bglAI片段、PQQ片段和PUBl 10进行混合，用T4 DNA连接酶在;T5°C反应1Γ16 h，得连接反应物；将连接产物电转化枯草芽孢杆菌feciBM subtilis 1A717感受态细胞，涂布选择培养基平板(含卡那霉素5 μ g/mL)，35 37°C培养过夜，挑选阳性克隆，并进行培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，可得目的基因按正确方向连接的重组表达质粒，命名为pUB-PQQ-如·以/。 电转化的步骤如下①在100 mL生长培养基中接入1 mL过夜培养的种子液；②37°C剧烈振荡培养至OD6tltl为0. 6左右；③4°C离心收集细胞，用适量10%甘油洗涤细胞3次，并最终将细胞悬浮于400 μ 1 10%甘油中；④每40 μ 1分装于1. 5 mLEppendorf管中，直接用于下一步转化实验或者_70°C保藏备用；⑤混合40 μ L感受态细胞和2 μ L质粒，于1.6 kV， 5 ms条件下进行电击；⑥迅速加入1 mL复苏培养基，然后37°C剧烈振荡1 h ；⑦将细胞涂布于选择培养基上。电转化所用到的培养组成如下生长培养基每升含10 g胰蛋白陈、 5 g酵母浸提物、5 g氯化钠、0.5 mol/L山梨醇；复苏培养基每升含10 g胰蛋白陈、5 g酵母浸提物、5 g氯化钠、0.7 mol/L甘露醇；选择培养基每升含10 g胰蛋白脉、5 g酵母浸提物、5 g氯化钠、5 g β-葡聚糖、15 g琼脂粉、5 mg卡那霉素。
实施例4分泌表达β -葡聚糖酶的重组解淀粉芽孢杆菌构建
从含有pUB-PQQ-如·以/重组质粒的枯草芽孢杆菌中提取质粒，将该质粒用电转化方法转入解淀粉芽孢杆菌中，转化后的菌液涂布选择培养基平板(5 μ g/mL卡那霉素)，37°C培养14-16 h，筛选到含有重组质粒pUB-PQQ-/^^/的重组解淀粉芽孢杆菌。电转化方法和所用的培养基组分均与实施例3中枯草芽孢杆菌转化方法相同。
实施例5重组解淀粉芽孢杆菌发酵制备β -葡聚糖酶
将在4°C保藏的含有pUB-PQQ-如·以/的重组解淀粉芽孢杆菌接种于种子培养基(0. 5% 酵母膏，1%蛋白胨，1%氯化钠)中，37°C，200 r/min，培养M h ；将培养的种子液按0. 2%的体积比接种量接种于含600 L发酵培养基的发酵罐中，培养条件为37°C，200 r/min，培养时间M 36 h，发酵培养基成分棉籽粉2. 5 4 %，乳糖2 4%，磷酸二氢钾40 60 mmol/L，调 PH6. 5 ；将上述培养的发酵液作为种子按1%体积比接种量转接于装有6吨发酵培养基的8 吨发酵罐中，培养条件为37 42°C，200 r/min，培养时间76、6 h，其中发酵培养基组分同前；发酵结束，β -葡聚糖酶发酵液酶活达到2，800^3, 200 IU/mL,收集8吨发酵罐中的发酵液，通过0. 45 μ m陶瓷膜微滤和截留分子量为10 KD超滤膜超滤后获得β -葡聚糖酶浓缩液，测定浓缩液的酶活，浓缩酶液中蛋白浓度达到3 g/mL, β-葡聚糖酶的酶活达到了 11，200 15，000 IU/mL。
权利要求
1.一种产β-葡聚糖酶的菌株，分类命名为解淀粉芽孢杆菌/PUB-PQQ-如·以/，已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO =M 2010344。
2.根据权利要求1所述菌株CCTCCNO =M 2010344，其特征在于所含有的经密码子优化并人工合成的β-葡聚糖酶基因如·以/，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 1。
3.根据权利要求2所述菌株CCTCCNO =M 2010344，其特征在于所述的人工合成的 β -葡聚糖酶基因bglAI,人工合成及克隆的步骤如下(1)选择解淀粉芽孢杆菌能够高效分泌表达的中温α-淀粉酶基因为参照物，通过生物信息学软件分析中温α-淀粉酶基因的密码子偏爱性；(2)获得解淀粉芽孢杆菌的β-葡聚糖酶氨基酸序列GenBank No: ΑΒΥ71827. 1，根据密码子简并特性由氨基酸序列推测出DNA序列，并以步骤(1)的中温α-淀粉酶基因密码子偏爱性信息为依据，优化葡聚糖酶基因密码子在不改变氨基酸序列的前提下分别将β -葡聚糖酶编码基因中编码谷氨酸Glu、谷氨酰胺Glru半胱氨酸Cys、丝氨酸Ser的密码子GAG，CAA, UGU，UCU对应分别替换为GAA，CAG, UGC, UCA ； β -葡聚糖酶基因共有13个碱基被置换，密码子优化后得到β -葡聚糖酶基因bglAI ；步骤(1)和步骤(2)所述的解淀粉芽孢杆菌是feciBm amyloliquefaciens ；(3)以人工合成的知以/基因为模板，设计引物PCR扩增该基因，将该基因克隆到pMD-T easy载体中，获得重组质粒；PCR扩增所用的引物为F 5' -CCATGGATGTTTTATCGTATGAAACGA-3‘，R 5' -TTATTTTTTTGTATAGCGCACCC-3‘，其中在上游引物F的5'端加上AfcoI限制酶识别位点。
4.根据权利要求1所述菌株CCTCCNO =M 2010344，其特征在于pUB-PQQ-/^^/所包含的杂合启动子PQQ的构建方法，杂合启动子PQQ构建方法，按如下步骤进行(1)获取地衣芽孢杆菌14580的高温α-淀粉酶基因的启动子Pamyi，长度为180 bp ； 启动子VamyL序列为SEQ ID NO: 4 ；(2)获取解淀粉芽孢杆菌的中温α-淀粉酶基因的启动子Pa j^，长度为200bp ；启动子 Pafflj^ 序列为 SEQ ID NO: 5 ；(3)分别取步骤(1)中VamyL上游IOObp序列，和步骤(2)中下游100bp，人工合成杂合启动子PQQ ；杂合启动子PQQ的核苷酸序列为SEQ ID NO: 6 ；(4)设计引物，以人工合成的PQQ启动子DNA为模板，PCR扩增该DNA片段，将扩增产物克隆到pMD-T easy载体中，获得重组载体pMD_PQQ ；所述PCR引物为Pf 5' - AGCTTGAAGAAGTGAAGAAG-3‘Pr 5' -CCATGGTTTTGACACTCCTTATTTGA-3 ‘，其中在下游引物 Pr 的 5 ‘端加上AfcoI 限制酶识别位点。
5.根据权利要求1所述菌株CCTCCNO =M 2010344，即pUB-PQQ-如·以/的构建方法，其特征在于按照如下步骤进行(1)将重组质粒pMD-知以/用限制酶和AfcoI进行双酶切，36 38°C反应过夜，然后将酶切产物纯化回收获得如·以/基因片段；(2)将重组载体pMD-PQQ用限制酶及和AfcoI进行双酶切，36 38°C反应过夜；然后将酶切产物纯化获得PQQ启动子片段；(3)将质粒pUBllO用和及进行双酶切，36 38°C反应过夜；然后将酶切产物纯化，再将该酶切产物与步骤(1)和(2)的酶切产物混合，用T4 DNA连接酶在3飞。C反应 1Γ16 h，得连接产物；(4)将连接产物电转化枯草芽孢杆菌感受态细胞，涂布含卡那霉素15μ g/mL的培养基平板，35 37°C培养过夜，挑选阳性克隆，并进行培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，得按正确方向插入目的基因的重组表达质粒，命名为pUB-PQQ-如·以/ ；所述的枯草芽孢杆菌为feciB^s subtilis 1A717 ；(5)培养步骤(4)获得的阳性克隆，提取重组表达质粒，将该质粒用电转化方法转入解淀粉芽孢杆菌中，转化后的菌液涂布浓度为5 μ g/mL卡那霉素抗性选择培养基平板，37°C 培养14-16 h，筛选到含有重组质粒pUB-PQQ-/^^/的重组解淀粉芽孢杆菌；所述的解淀粉芽孢杆菌为feciB^s amyIoliquefaciens ；步骤(4)和步骤(5)中，所述的电转化方法是一致的，电转化所用的培养基如下生长培养基每升含10 g胰蛋白陈、5 g酵母浸提物、5 g氯化钠、0.5 mol/L山梨醇；复苏培养基每升含10 g胰蛋白陈、5 g酵母浸提物、5 g氯化钠、0.7 mol/L甘露醇；选择培养基每升含10 g胰蛋白脉、5 g酵母浸提物、5 g氯化钠、5 g β-葡聚糖、15 g琼脂粉、5 mg卡那霉素;EP缓冲液每升含91. 1 g山梨醇、91. 1 g甘露醇、100 mL 100%甘油；电转化方法如下①在100mL生长培养基中接入1 mL过夜培养的种子液；②37°C剧烈振荡培养至OD600为0.6 ；③4°C离心收集细胞，用适量10%甘油洗涤细胞3次，并最终将细胞悬浮于400μ L 10% 甘油中；④每40μ L分装于1.5 mL Eppendorf 管中，直接用于下一步转化实验或者-70°C保藏⑤混合40μ L感受态细胞和2 μ L质粒，于1. 6 kV，5 ms条件下进行电击；⑥迅速加入1mL复苏培养基，然后37°C剧烈振荡1 h ； 将细胞涂布于选择培养基上，通过筛选得到含有重组表达质粒pUB-PQQ-^·^/的解淀粉芽孢杆菌。
6.利用权利要求1所述的重组解淀粉芽孢杆菌pUB-PQQ-^·^/发酵制备β-葡聚糖酶的方法，其特征在于，步骤如下(1)将在4°C保藏的含有pUB-PQQ-如·以/的重组解淀粉芽孢杆菌接种于种子培养基中， 37200 r/min，培养M h，获得种子培养液；其中所述的种子培养基成分0. 5%酵母膏，1%蛋白胨，1%氯化钠；(2)按照69TlO%的体积比将步骤(1)中获得的种子培养液转接于装有15 20L发酵培养基的发酵罐中，培养条件为37 42°C，200 r/min，发酵84 h；或将步骤(1)中获得的种子培养液按0. 2%的体积比接种量接种于含600L发酵培养基的发酵罐中，培养条件为37°C，200 r/min，培养时间对 36 h ；其中所述的发酵培养基成分棉籽粉2.5% 4%，乳糖2% 4%，磷酸二氢钾40 60 mmol/ LJ ρΗ6· 5 ；(3)将步骤(2)获得的发酵液作为种子按1%体积比接种量转接于装有6吨发酵培养基的8吨发酵罐中，培养条件为37、2°C，200 r/min，培养时间76、6 h，其中所述的发酵培养基组分与步骤(2)相同；(4)步骤(2)或(3)的获得的β-葡聚糖酶发酵液酶活达到2，800 3，200 IU/mL，收集发酵液通过陶瓷膜微滤和超滤膜超滤后获得β-葡聚糖酶浓缩液；所述的陶瓷膜，其材质为柱状氧化铝材质，其孔径为0.45 μ m，通过回流阀压力调节过滤速度，流速控制0. 4^0. 8 L/min，该设备可从市场购买；所述的超滤膜为卷式超滤膜，其材质为聚醚砜，截留分子量为10 KD，超滤的温度通过调节冷却水的循环速度来进行控制，该设备可从市场购买获得；获得的β-葡聚糖酶浓缩液中蛋白浓度达到3 g/mL, β-葡聚糖酶的酶活达到 11，200 15，000 IU/mL。
全文摘要
一种β-葡聚糖酶的高效制备方法，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明涉及一种β-葡聚糖酶基因工程菌pUB-PQQ-bglAI，保藏编号CCTCCNOM2010344。将β-葡聚糖酶的部分氨基酸密码子进行人工替换，人工合成β-葡聚糖酶基因bglAI；将来源于地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶启动子和来源于解淀粉芽孢杆菌的中温α-淀粉酶启动子片段进行组合成杂合启动子PQQ；构建重组表达载体，然后导入解淀粉芽孢杆菌宿主菌中，得到重组菌pUB-PQQ-bglAI。分别在摇瓶、30L发酵罐、600L发酵罐和8吨发酵罐中发酵生产β-葡聚糖酶，发酵液酶活达到2,800~3,200IU/mL，收集发酵液超滤微滤，获得蛋白浓度3g/mL的β-葡聚糖酶浓缩液，酶活达到11,200~~15,000IU/mL。
文档编号C12N15/56GK102168059SQ201110001750
公开日2011年8月31日 申请日期2011年1月6日 优先权日2011年1月6日
发明者王正祥 申请人:江苏锐阳生物科技有限公司