一种耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶及其编码基因的制作方法

专利名称：：一种耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶及其编码基因的制作方法
技术领域：
：本发明涉及P-l，3-l，4-葡聚糖酶及其编码基因与高效表达。
背景技术：
：葡聚糖是由葡萄糖通过不同糖苷键连接起来的一类聚合物，是自然界中含量最丰富的聚糖。P-l，3-l，4-D-葡聚糖是自然合成的多聚糖，与阿拉伯木聚糖、戊聚糖、纤维素、果胶等均属植物细胞壁中的可溶性结构性非淀粉多糖。大部分谷物都含P-l，3-l，4-D-葡聚糖，其中大麦中的含量最高为5_8%，主要存在于大麦乳细胞壁中。P-l，3-l，4-D-葡聚糖是由葡萄糖以P构型通过P-l，3-和|3_1，4-混合键形成的直链结构，大约含70%P-l，4-键和30%的P-l，3-键，它们的分子量和构型因大麦品种、自然环境、生长阶段等因素的不同而有所差异。按照水解13-葡聚糖的特异性可将葡聚糖酶主要分为特异性的13-1，3-l，4-D-葡聚糖酶或地衣多糖水解酶(EC3.2.1.73)、内切P-l，4-D-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)、P-l，3(4)-葡聚糖酶(EC3.2.1.6)禾PP-l，3-D-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)等四类。迄今，报道的微生物P-l，3-l，4-葡聚糖酶大多属于细菌产的糖苷水解酶16家族，包括细菌、真菌和瘤胃微生物。已有多种芽孢杆菌P-l，3-l，4-葡聚糖酶基因被克隆禾口表达，如芽胞杆菌B.amyloliquefaciens，B.circulans(KimJYetal.BiotechnolLett，2003，25:1445-1449)，B.licheniformisEGW039(Tengetal.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2006，72(4):705-712);类芽胞杆菌Paenibacilluspolymyxa(GosalbesMJetal.JBacteriol，1991，173(23):7705-7710)。这些葡聚糖酶都具有相似的核苷酸和氨基酸序列，且都有一个保守的氨基酸序列EIDIEF，其中两个谷氨酸参与酶的水解(HahnMetal.JBiolChem，1995，270:3081-3088)。也从一些非芽胞杆菌的细菌中克隆得到P-1，3-1，4-葡聚糖酶基因，如牛链球菌Str印tococcusbovis(EkinciMSetal.ApplEnvironMicrobiol,1997，63:3752-3756)，产琥珀酸丝状木干菌Fibrobactersuccinogenes(ChenJLetal.JBiolChem，2001，276:17895—17901)。近年来，也有一些报道研究真菌胞外P-l，3-l，4-葡聚糖酶的纯化和性质，如Orpinomycessp.PC_2、Cochlioboluscarbo皿m(G6rlachetal.ApplEnvironMicrobiol，1998，64(2):385-391)、Talaromycesemersonii(MurrayPGetal.EnzymeandMicrobialTechnology,2001，29(1)90-98)禾口Rhizopusmicrosporesvar.microsporus(Celestinoetal.BMCbiochemistry,2006，7:23)。但只有几种真菌P-1，3-1，4-葡聚糖酶基因克隆和表达的报道，这些真菌包括Orpinomycessp.PC-2(ChenHetal.JournalofBacteriology,1997，179:6028-6034)，Aspergillusjaponicas(GrishutinSGetal.CarbohydrRes，2006，341:218—229)禾口Bisporasp.MEY—1(Luoetal.JAgricFoodChem，2009，57(12):5535-5341)。近年来，一些专利介绍了不同来源的P-l，3-l，4-葡聚糖酶基因在不同的载体和宿主得到表达，如大肠杆菌、毕赤酵母等，但表达水平低。类芽孢杆菌PaenibacillusspF-40的P-l，3-l，4-葡聚糖酶在毕赤酵母中表达(专利200610112092.8)，发酵液粗酶活4553.7U/mL。淀粉液化芽胞杆菌B.amyloliquefaciens的P_1，3-1，4_葡聚糖酶在大肠杆菌中表达(专利200910031553.2)，LB培养基总酶活322.0U/mL，胞外酶活127.5U/mL。从国内外公布的专利分析，关于真菌P-l，3-l，4-葡聚糖酶基因的专利较少，在不同表达系统的葡聚糖酶活差别也较大。关于嗜热真菌的P-l，3-l，4-葡聚糖酶基因、克隆表达的报道和专利。因此克隆和表达具有高比活、热稳定性好和底物特异性强的嗜热真菌13-1，3-1，4-葡聚糖酶对于饲料、食品等行业具有重要的作用。种P-l，3-l，4-葡聚糖酶，来源于嗜热拟青霉
发明内容本发明的目的在于提供(Paecilomycesthermophila)。本发明提供的P-l，3-l，4-葡聚糖酶，是如下1)或2)或3)的蛋白质1)由序列表中序列2的第19-314位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；3)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有P-l，3-l，4-葡聚糖酶活性的由1)衍生的蛋白质。其中，序列表中的序列2由314个氨基酸组成，分子量约为34.54X103kDa。为了使l)或2)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中1)或2)的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1.标签的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述3)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述3)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围之内。上述蛋白的编码基因为如下1)_4)中任一所述的基因1)其编码序列是序列表中序列1的自5'末端第55-945位；2)其编码序列是序列表中序列1;3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且编码所述蛋白的基因；4)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。上述严格条件可为用O.IXSSPE(或O.IXSSC)，O.1%SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65t:下杂交并洗膜。序列表中序列1有945个碱基，可编码序列表中序列2所示的蛋白。其中序列表中序列1的自5'端第1-54位编码序列表中序列2所示的第1-18位的信号肽；序列1的自5'端第55-945位所示的DNA片段可编码序列表中序列2的第19-314位所示的氨基酸序列组成的蛋白质。扩增上述基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。含有上所述基因的重组载体也属于本发明的保护范围之内。上述重组载体可以是将上述的基因插入pPIC9K的多克隆位点得到的重组表达载体。具体地将，上述的基因是插入pPIC9K的SnaBI和AvrII限制性酶切位点之间的，使得核苷酸序列位于A0X1启动子的下游并受其调控。含有上述基因的表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围之内。上述重组菌具体是将上述的基因通过所述的重组表达载体导入毕赤酵母(Pichi即astoris)中，得到的转基因重组菌。上述毕赤酵母是GS115。本发明的另一目的在于提供上述蛋白的制备方法。本发明提供的方法是是将所述的重组菌进行发酵得到，所述发酵条件是取含有重组质粒的GS115菌株，接种于200mLBMGY培养基中，30°C，250rpm振荡过夜培养至0D6。。10.0左右，然后接种于发酵基本培养基于5L发酵罐中发酵。经过基础培养、甘油分批补料培养和甲醇诱导三个阶段，使重组P-l，3-l，4-葡聚糖酶得到高效表达。整个发酵过程温度控制在30°C，通过调整转速、通气量和补料速率控制溶氧>20%，发酵的三个阶段pH分别控制在4.0、5.0和6.0。实验证明本发明提供的方法可高效制备重组P-l，3-l，4-葡聚糖酶，重组毕赤酵母发酵液上清酶活最高达55，300U/mL，粗蛋白9.lg/L。本发明的P_1，3_1，4-葡聚糖酶最适反应温度为7(TC，最适pH值为7.0。本发明的P-l，3-l，4-葡聚糖酶具有表达水平高和耐热特性，可广泛应用于饲料、食品及啤酒工业等，在生产中具有很大的推广应用潜力。图1为本发明的耐热P-1，3-1，4-葡聚糖酶基因保守区PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图(列M:marker，列1:PCR扩增产物)。图2为本发明的耐热13-1，3-1，4_葡聚糖酶基因编码区PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图(列M:marker，列1:PCR扩增产物)。图3为本发明耐热P-l，3-l，4-葡聚糖酶发酵罐高密度发酵过程图蛋白含量參酶活)。图4为本发明耐热e-l，3-1,4-葡聚糖酶发酵罐高密度发酵过程SDS-PAGE图(列M:低分子量标准；列1，2，3，4，5分别为发酵24h，48h，60h，72h，84h样品，上样量1yL发酵液)。图5为本发明的耐热P-l，3-l，4-葡聚糖酶纯化过程图(列M:低分子量标准；列1:发酵液上清；列2:过QSFF柱样品；列3:过S-100纯化蛋白)。图6为耐热P-l，3-l，4-葡聚糖酶最适pH(其中B:Citric-Na2HP04缓冲液；參MES缓冲液；▲:磷酸缓冲液；▼:Glycine-NaOH缓冲液)。图7为本发明的耐热P-l，3-l，4-葡聚糖酶的最适温度。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。嗜热拟青霉(Paecilomycesthermophila)J18:中国农业大学，非专利文献是江正强等.嗜热拟青霉木糖苷酶的性质及其与木聚糖酶的协同作用，食品与发酵工业，2008(07):12-16。实施例1、P-l，3-l，4-葡聚糖酶基因的发现—、葡聚糖酶基因基因组保守区片断PCR扩增以嗜热拟青霉(Paecilomycesthermophila)J18(中科院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为CGMCC6885)的基因组DNA为模板，根据GeneBank报道的丝状真菌P_葡聚糖酶的氨基酸序列，利用在线软件BlockMaker(htto:〃blocks.fhcrc.org/blocks/blockmkr/makeblocks,html)搜索保守区，再利用在线引物设计软件CODEHOP(http:〃blocks,fhcrc.org/codehop.html)设计兼并引物PtLicl6CPl(正向)5'-CGGCGAGATCGACATCATHGARGGNGT-3'，PtLicl6CP2(反向)5'-GCCCAGTCGCCGCARAANGTNRTRTC-3'。PCR反应混合物(50iiL):水37.25iiL;10XExTaqbuffer,2.5iiL;2.5mmol/LdNTPs，4iiL;引物(10iimol/L)，各2.5iiL;DNA模板(50-100ng)，1iiL;ExTaq(5U/iiL)，0.25iiL。PCR反应条件94°C5min;6TC-55t:每个循环降落0.5°C，30s;72°Clmin，10个循环；94°C5min;55。C30s;72。Clmin，20个循环，72°C10min。PCR反应完毕后取5iiL进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示500bp左右有一特异条带(图1)，经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后连入pMD-18T载体，经热激法转化大肠杆菌JM109,菌落PCR鉴定重组子后测序。测序结果经NCBIBlast搜索比对，与其他真菌来源的P-l，3(4)-葡聚糖酶基因有较高的同源性。二、P-l，3-l，4-葡聚糖酶基因全长cDNA扩增根据克隆得到的DNA片段及阅读框分析，分别设计3'RACE和5'RACE引物，利用SMARTRACE方法(SMARTRACEcDNAAmplificationKit,Takara)扩增cDNA的3'禾P5'末端。3'RACE特异引物PtLicl6AGSP2:5'-CGATAACGACGGCTTCACGGGCAAT-3';5'RACE特异弓l物PtLicl6AGSPl:5'-CTTGGCAGCGGGCGTGTCCCAGTTC-3'，PtLicl6ANGSPl:5'-CGTAGATGCCGCCGCCAATGCTGTT-3'。琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目标片段连入pMD-18T载体，热激法转化大肠杆菌JM109,菌落PCR鉴定重组子后，分别测序。为了获得5'末端最大长度，其中对于5'RACE产物测序10个克隆，最后，根据测序结果拼接5'末端和3'末端，得到全长cDNA序列。基因序列经NCBIBlast搜索比对分析，其全长cDNA包含一945bp完整开放阅读框(0RF)(序列l)，编码314个氨基酸。和烟曲霉(Aspergillusfumigatus)内切P_1，3(4)-葡聚糖酶基因(EAL88240.1)同源性最高，相似度达69%。氨基酸序列与费希尔新萨托菌(Neosartoryafischeri)内切P-l，3(4)-葡聚糖酶(EAW23242)同源性最高，相似度达61%。经蛋白数据库比对分析，属于糖苷水解酶16家族。实施例2、重组P-l，3-l，4-葡聚糖酶基因的表达—、构建重组菌完整开放阅读框(0RF)编码蛋白序列经SignalP3.0分析，有一信号肽，可能切割位点在18和19位氨基酸之间(AAA-YH)。据此设计引物，去除原基因终止密码子，两对引物分别为PtLicl6ASnaBIF:5'-TACGTATATCATCTTGTTGACGACTACG-3'(含SnaBI酶切位点)；PtLicl6AAvrIIR:5'-CCTAGGTTAGGGTGCGTACACGCGGAG-3'(含AvrII酶切位点)，用上述引物，以嗜热拟青霉(Paecilomycesthermophila)J18的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳如图2，经凝胶试剂盒回收后经TA克隆连接入pMD-18T载体，热激法转化大肠杆菌JM109,经菌落PCR鉴定重组子，阳性重组质粒命名为pMD-18T-Glu。经pMD-18T-Glu质粒提取、SnaBI和AvrII双酶切后，回收目标带，连接由SnaBI和AvrII双酶切的表达载体pPIC9K(Invitrogen公司)，经PCR及测序验证后，阳性重组质粒命名为pPIC9K-Licl6A。测序结果表明，pPIC9K-Licl6A是序列表中序列1的自5'端第55-945位所示的DNA片段插入pPIC9K的SnaBI和AvrII酶切位点之间构成的重组表达载体。序列1的自5'端第55-945位所示的DNA片段可编码序列表中序列2的第19-314位所示的氨基酸序列组成的蛋白质。重组质粒pPIC9K-Licl6A采用Sacl线性化后电转化嗜甲醇毕赤酵母GS115,构成重组菌。将得到的重组菌涂布MD平板(1.34X酵母无氨基氮源YNB，4X10—5%生物素，2%葡萄糖)，从MD平板得到的His+转化子经灭菌水刮取后取100iiL涂布不同浓度的YPD-G418平板(1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%琼脂糖，不同浓度的6418)，3-5(1后挑取转化子，分别点种匪(l.34%酵母无氨基氮源YNB，4X10—5%生物素，0.5%甲醇)、MD板，然后分别按摇瓶培养诱导目标蛋白表达，每隔24小时取样，1000rpm离心10min，取上清按下述DNS法测定酶活，经筛选从YPD-G418(8mg/mL)平板得到含有重组质粒pPIC9K-Licl6A的GS115菌株，菌株表型Mut+His+。二、摇瓶培养将上述筛选酶活最高的菌株在BMGY培养基(1%酵母粉，2%蛋白胨，100mM、pH7.0的磷酸盐缓冲液，1.34%YNB，4X10—5%生物素，1%甘油)摇瓶培养16_18h，3000g离心5min，收集菌体，用B匪Y培养基(1%酵母粉，2%蛋白胨，100mM、pH7.0的磷酸盐缓冲液，1.34%YNB，4X10—5%生物素，0.5%甲醇)重悬菌体0D6。。至1.0左右，诱导目标蛋白表达。以上培养条件为500mL三角瓶装量100mL培养基，温度3(TC，转速250rpm。诱导96h，酶活可达1698U/mL上清液。酶活力通过DNS法(Miller,G丄1959.Useofdinitrosalicylicacidreagentfordeterminationofreducingsugars.Anal.Chem.31，426-428)测定将大麦葡聚糖底物配制成lg/100mL浓度，测定时在小试管中加入50L底物，然后加入100yLpH7.0、75mM的MES缓冲液，混匀使缓冲液浓度为50mM，底物浓度为0.25g/100ml。70。C预热3min，加入50iiL适当稀释的酶液，反应lOmin后加入200yLDNS试剂，煮沸15min后加入200iiL饱和酒石酸钾钠溶液，冷却后测定540nm吸光度值，以葡萄糖作为标准。l个酶活力(U)的单位定义为在上述条件下(pH7.0，温度7(TC)，每分钟生成lymol葡萄糖所需要的酶量。三、高密度发酵本步骤设置空载体对照按照实施例2步骤一获得重组菌的方法，将pPIC9K质粒线性化后电转化嗜甲醇毕赤酵母GS115，得到空载体对照pPIC9K/GS115。71、发酵罐高密度发酵表达采用5L的发酵罐(BIOTECH,上海保兴生物设备工程有限公司)。种子培养基BMGY;发酵基本培养基BSM(85%H3P04，26.7mL;CaS04，0.93g;K2S04，18.2g;MgS047H20，14.9g;K0H，4.13g;甘油，40.Og，加蒸馏水水至1L)。甘油分批补料培养基50g/100ml甘油高压灭菌后，加入PTM1(CuS04*7H20，6.Og;NaI，O.08g;MnS04H20，3.Og;Na2Mo042H20，0.2g;硼酸，O.02g;CoC12，0.5g;ZnC12，20.Og;FeS047H20，65.Og;生物素，O.2g;浓硫酸，5.OmL;加水至1L)12mL/L甘油。100%甲醇诱导培养基100%甲醇，加入PTMi12mL/L甲醇。发酵过程(1)种子培养从保藏的甘油管吸取0.2mL菌液接种200mLBMGY培养基，3(TC，250rpm过夜培养至0D6。。10.0左右。(2)分批培养装量2.OL(发酵基本培养基BSM)，发酵罐灭菌，28%浓氨水调pH4.O，加入PTM^.35mL/L起始发酵液(2L发酵基本培养基BSM)，接种量10%，转速700rpm，通气量1.Ovvm，发酵18-24h。(3)甘油分批补料培养待分批培养至甘油耗尽(根据DOspikes操作，30s内溶氧迅速上升至接近100%又迅速下降)，流加甘油分批补料培养基，流速18.4mL/h/L起始发酵液，始终监视DO，通过停止流加、调整转速和通气量等保持DO>20%。流加时间4小时，待0De。。220左右，停止流加。(4)100%甲醇诱导培养停止流加甘油后，根据DOspikes，饥饿30min左右，流加100%甲醇诱导培养基，在4h内使流速从3.6mL/h/L起始发酵液增加至10.9mL/h/L起始发酵液左右，监控溶氧(DO)>20%。发酵过程中取样分析细胞浓度及酶活(测定方法同步骤二)，结果显示，在72h达到最高酶活，发酵液上清酶活55，300U/mL，粗蛋白9.lg/L。蛋白浓度参照Lowry等(Lowry，0.H.，Rosebrough，N.J.，Farr，A.L，andRandall,R.J.Proteinmeasurementwiththefolinphenolreagent.JBiolChem，1951，193:265-275)的方法，以牛血清白蛋白作为标准蛋白)。而空载体对照无酶活，故未在图中显示。蛋白经Gelpro4.5凝胶分析软件分析，目标蛋白占胞外总蛋白的80%以上，发酵过程参数见图3、图4。四、重组P-l，3-l，4-葡聚糖酶纯化取步骤三中的发酵(72h放罐)上清液10mL，10000rpm/min离心10min，取上清10mL，用pH9.OTris-Cl平衡缓冲液交换三次，最终浓縮至lmL，上样经pH9.0、20mM的Tris-Cl平衡缓冲液平衡的Q-S印haroseFastFlow强阴离子交换柱(1X10cm)，200mMNaCl洗涤5-10个柱体积，300mMNaCl洗脱，流速lmL/min，收集有活性的部分，超滤浓縮至lmL，分两次上样经pH7.2、20mM磷酸缓冲液(含lOOmMNaCl)平衡的S印hacrylS-100HR(1X100cm)，用同样的磷酸缓冲液洗脱，流速0.3mL/min，电泳检测，收集目标蛋白。纯化蛋白经SDS-PAGE(XaemmliUK.CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4.Nature,1970，277:680-685)检测达至lj电泳纯(图5)。纯化结果见表2。其中酶活和蛋白含量的测定方法分别同步骤二和步骤三。表2重组蛋白纯化表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>a10mL发酵上清液实施例3、P-l，3-l，4-葡聚糖酶的性质—、P-l，3-l，4-葡聚糖酶最适pH将实施例2中纯化后的蛋白溶于不同pH值的4种50mM不同缓冲液体系中(Citric_Na2HP04，pH2.5-5.5;MES，pH5.0-6.5;磷酸缓冲液，pH6.5-8.5;Glycine-NaOH，pH8.5-11.0)，然后在7(TC条件下测定酶活力(酶活力测定方法同步骤二)，以酶活力最高点作为100%作图。结果表明重组P-l，3-l，4-葡聚糖酶的最适pH为7.0(图6)。二、e-l，3-1,4-葡聚糖酶最适反应温度将实施例2中纯化后的蛋白适当稀释于50mMpH7.0的MES缓冲液中，然后分别在40-10(TC不同温度下按照上述方法测定P-l，3-l，4-葡聚糖酶的酶活力(酶活力测定方法同步骤二)。以酶活力最高点作为100%作图。结果显示，P-l，3-l，4-葡聚糖酶的最适反应温度为70°C(图7)。权利要求一种蛋白，是如下1)或2)或3)的蛋白质1)由序列表中序列2的第19-314所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；3)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-1，3-1，4-葡聚糖酶活性的由1)衍生的蛋白质。2.权利要求l所述蛋白的编码基因。3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因1)其编码序列是序列表中序列1的自5'末端第55-945位；2)其编码序列是序列表中序列1;3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且编码权利要求1所述蛋白的基因；4)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的基因。4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是将权利要求2或3所述的基因插入pPIC9K的多克隆位点得到的重组表达载体。6.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、转基因细胞系或重组菌。7.如权利要求6所述的重组菌，其特征在于所述重组菌是将权利要求2或3所述的基因通过权利要求4或5所述的重组表达载体导入毕赤酵母中，得到的转基因重组菌。8.权利要求1所述蛋白的制备方法，是将权利要求6或7所述的重组菌进行发酵得到，所述发酵条件是温度是3(TC，溶氧〉20%。全文摘要本发明公开了一种β-1，3-1，4-葡聚糖酶及其编码基因。本发明提供的β-1，3-1，4-葡聚糖酶是如下1)或2)或3)的蛋白质1)由序列表中序列2的第19-314位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；3)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-1，3-1，4-葡聚糖酶活性的由1)衍生的蛋白质。将该蛋白的编码基因导入毕赤酵母后构成的重组毕赤酵母也属于本发明的保护范围。实验证明重组毕赤酵母发酵液上清酶活最高达55,300U/mL，粗蛋白9.1g/L。本发明的β-1，3-1，4-葡聚糖酶最适反应温度为70℃，最适pH值为7.0。该β-1，3-1，4-葡聚糖酶在生产中具有很大的推广应用潜力。文档编号C12N15/56GK101775385SQ20101011577公开日2010年7月14日申请日期2010年3月1日优先权日2010年3月1日发明者华承伟,唐艳斌,李一男,江正强,闫巧娟申请人:中国农业大学