专利名称：一种制备β-葡聚糖酶的方法及其专用菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种制备β -葡聚糖酶的方法及其专用菌株。
背景技术：
葡聚糖是由葡萄糖通过不同糖苷键连接起来的一类聚合物，是自然界中含量最丰 富的聚糖。葡聚糖以β-葡聚糖最具生理活性。其中由β-1，3-和β-1，4-混合糖苷键连 接起来的直链聚糖为β-1，3-1，4-葡聚糖。大部分谷物都含β-1，3-1，4-葡聚糖，其中大 麦中的含量最高为5-8%，主要存在于大麦胚乳细胞壁中。内切 β -1，3-1，4_D-葡聚糖酶(endo-β -1，3-1，4-D_glucanase ；EC 3. 2. 1. 73)简 称β-葡聚糖酶(β-glucanase)是一种水解酶，能水解β _葡聚糖分子中的β_1，3_和 β-1，4-糖苷键，使之降解为小分子。葡聚糖酶有两种主要来源微生物和植物。微 生物来源最多的为芽孢杆菌属，包括枯草芽孢杆菌、淀粉芽孢杆菌、浸麻芽孢杆菌、多粘芽 孢杆菌、地衣芽孢杆菌及短小芽孢杆菌等。非芽孢杆菌属来源的多数为瘤胃微生物以及一 些真菌。葡聚糖酶的植物来源主要为大麦、小麦、黑麦和高粱等谷类经济作物。葡 聚糖酶在提高果汁、啤酒、油的榨取产量、焙烤食品和动物饲料的营养方面均具有重要的作 用。微生物来源的葡聚糖酶具有活性高、成本低、来源稳定、提取方便等显著特点，具有 广阔的应用前景。β -葡聚糖酶的研究始于二十世纪六十年代，到七十、八十年代已被广泛应用于 啤酒工业，用来缩短麦汁和啤酒过滤时间。九十年代后国内外尤其是北美、欧洲等国家将 β“葡聚糖酶作为一种新型饲料酶添加到饲料中。β“葡聚糖酶研究中存在的主要问题是 酶的热稳定性较差，发酵产酶水平偏低。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种制备葡聚糖酶的方法。本发明所提供的制备葡聚糖酶的方法，包括如下步骤发酵枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)TT-68 CGMCC No. 3340，得到 β-葡聚糖酶。上述方法中，所述发酵使用的培养基的组成如下由碳源、氮源、无机盐和水组 成；所述碳源为如下物质中的至少一种蔗渣、麦麸、稻草、玉米芯、玉米杆、燕麦粉、大 麦粉、白酒酒糟、啤酒酒糟；所述氮源为如下物质中的至少一种酵母提取物和胰蛋白胨的混合物、酵母提取 物、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨、酪蛋白、豆粕粉和尿素；所述无机盐为如下物质中的至少一种ΚΗ2Ρ04、MgSO4. 7Η20和CaCl2。上述方法中，所述培养基为如下1)或2)所示1)所述氮源为酵母提取物和胰蛋白胨；所述碳源为如下物质中的至少一种 蔗渣、麦麸、稻草、玉米芯、玉米杆、燕麦粉、大麦粉、白酒酒糟、啤酒酒糟；所述无机盐为KH2PO4^MgSO4. 7H20 和 CaCl2 ；2)所述氮源为如下物质中的至少一种酵母提取物和胰蛋白胨的等质量比混合物、酵母提取物、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨、酪蛋白、豆粕粉、尿素；所述碳源为燕 麦粉；所述无机盐为KH2P04、MgSO4. 7H20和CaCl2。上述方法中，所述碳源在所述培养基中的浓度为5g/L_50g/L或15g/L_25g/L或 15g/L-40g/L 或 15g/L-35g/L，具体为 5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/ L、45g/L或50g/L ；所述氮源在所述培养基中的浓度为5g/L-30g/L，具体为5g/L、10g/L或 30g/L ；所述KH2PO4在培养基中的浓度为3g/L-7g/L，具体为3g/L、5g/L或7g/L ；所述 MgSO4. 7H20在培养基中的浓度为0. 2g/L-0. 4g/L，具体为0. 2g/L、0. 3g/L或0. 4g/L ；所述 CaCl2在培养基中的浓度为0. 2g/L-0. 4g/L，具体为0. 2g/L、0. 3g/L或0. 4g/L。上述方法中，所述1)所示培养基为如下I或II所示I、所述氮源为酵母提取物和胰蛋白胨；所述碳源为如下物质中的至少一种 蔗渣、麦麸、稻草、玉米芯、玉米杆、燕麦粉、大麦粉、白酒酒糟、啤酒酒糟；所述无机盐为 KH2PO4^MgSO4. 7H20 和 CaCl2 ；所述酵母提取物在培养基中的浓度为4_6g/L，具体为4g/L、5g/L或6g/L ；所述胰 蛋白胨在培养基中的浓度为4-6g/L，具体为4g/L、5g/L或6g/L ；所述碳源在培养基中的浓 度为9g/-llg/L，具体为9g/L、10g/L或llg/L ；所述KH2PO4在培养基中的浓度为3g/L_7g/ L，具体为3g/L、5g/L或7g/L ；所述MgSO4. 7H20在培养基中的浓度为0. 2g/L_0. 4g/L，具体为 0. 2g/L、0. 3g/L或0. 4g/L ；所述CaCl2在培养基中的浓度为0. 2g/L_0. 4g/L，具体为0. 2g/ L、0.3g/L 或 0. 4g/L ；II、所述氮源为酵母提取物和胰蛋白胨；所述碳源为燕麦粉；所述无机盐为 KH2PO4^MgSO4. 7H20 和 CaCl2 ；所述酵母提取物在培养基中的浓度为4_6g/L，具体为4g/L、5g/L或6g/L ；所述胰 蛋白胨在培养基中的浓度为4-6g/L，具体为4g/L、5g/L或6g/L ；所述燕麦粉在培养基中 的浓度为 5g/L-50g/L，具体为 5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/ L、50g/L ；所述KH2PO4在培养基中的浓度为3g/L-7g/L，具体为3g/L、5g/L或7g/L ；所述 MgSO4. 7H20在培养基中的浓度为0. 2g/L-0. 4g/L，具体为0. 2g/L、0. 3g/L或0. 4g/L ；所述 CaCl2在培养基中的浓度为0. 2g/L-0. 4g/L，具体为0. 2g/L、0. 3g/L或0. 4g/L ；上述方法中，所述2)所示培养基为如下III、IV、V、VI或Vn所示III、所述氮源为如下物质中的至少一种酵母提取物和胰蛋白胨的等质量比混合 物、酵母提取物、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨、酪蛋白、豆粕粉、尿素；所述碳源为燕 麦粉；所述无机盐为ΚΗ2Ρ04、MgSO4. 7Η20和CaCl2 ；所述燕麦粉在培养基中的浓度为15g/L_25g/L，具体为15g/L、20g/L或25g/L ；所 述氮源在培养基中的浓度为9g/L-llg/L，具体为9g/L、10g/L或llg/L ；所述KH2PO4在培养 基中的浓度为3g/L-7g/L，具体为3g/L、5g/L或7g/L ；所述MgSO4. 7H20在培养基中的浓度为 0. 2g/L-0. 4g/L，具体为0. 2g/L、0. 3g/L或0. 4g/L ；所述CaCl2在培养基中的浓度为0. 2g/ L-0. 4g/L，具体为 0. 2g/L、0. 3g/L 或 0. 4g/L ；IV、所述氮源为大豆蛋白胨；所述碳源为燕麦粉；所述无机盐为KH2P04、MgS04. 7H20和 CaCL2 ；所述燕麦粉在培养基中的浓度为15g/L-25g/L，具体为15g/L、20g/L或25g/L ；所 述大豆蛋白胨在培养基中的浓度为5g/L-15g/L，具体为5g/L、10g/L或15g/L ；所述KH2PO4 在培养基中的浓度为3g/L-7g/L，具体为3g/L、5g/L或7g/L ；所述MgSO4. 7H20在培养基中的 浓度为0. 2g/L-0. 4g/L，具体为0. 2g/L、0. 3g/L或0. 4g/L ；所述CaCl2在培养基中的浓度为 0. 2g/L-0. 4g/L，具体为 0. 2g/L、0. 3g/L 或 0. 4g/L ；培养基的pH 为 4-8，具体为 4,4. 5、5、5· 5、6、6· 5、7、7· 5 或 8 ；V、所述氮源为大豆蛋白胨；所述碳源为燕麦粉；所述无机盐为KH2P04、MgS04. 7H20 禾口 CaCl2 ；所述燕麦粉在培养基中的浓度为20g/L;所述大豆蛋白胨在培养基中的浓度为 10g/L ；所述KH2PO4在培养基中的浓度为5g/L ；所述MgSO4. 7H20在培养基中的浓度为0. 3g/ L ；所述CaCl2在培养基中的浓度为0. 3g/L ；培养基的pH为5 ；VI、所述氮源为大豆蛋白胨；所述碳源为燕麦粉；所述无机盐为KH2P04、MgS04. 7H20 禾口 CaCl2 ；所述燕麦粉在培养基中的浓度为20g/L;所述大豆蛋白胨在培养基中的浓度为 20g/L ；所述KH2PO4在培养基中的浓度为5g/L ；所述MgSO4. 7H20在培养基中的浓度为0. 3g/ L ；所述CaCl2在培养基中的浓度为0. 3g/L ；培养基的pH为5 ；ΥΠ、所述氮源为大豆蛋白胨；所述碳源为燕麦粉；所述无机盐为KH2P04、MgS04. 7H20 禾口 CaCl2 ；所述燕麦粉在培养基中的浓度为15g/L_25g/L，具体为15g/L、20g/L或25g/L ；所 述大豆蛋白胨在培养基中的浓度为5g/L-15g/L，具体为5g/L、10g/L或15g/L ；所述KH2PO4 在培养基中的浓度为3g/L-7g/L，具体为3g/L、5g/L或7g/L ；所述MgSO4. 7H20在培养基中的 浓度为0. 2g/L-0. 4g/L，具体为0. 2g/L、0. 3g/L或0. 4g/L ；所述CaCl2在培养基中的浓度为 0. 2g/L-0. 4g/L，具体为 0. 2g/L、0. 3g/L 或 0. 4g/L ；培养基的pH为4. 5-5. 5，具体为4. 5、5或5. 5。上述方法中，所述发酵的条件包括温度为40°C-55°C，具体为40°C、50°C或55°C。上述方法中，所述发酵的条件包括通气量为lVVm-2VVm和发酵容器内的压力为 0. 4-0. 8MPa ；所述通气量具体为 lvvm、1. 2vvm、1. 5vvm 或 2vvm。通气量为每分钟内通过单位体积培养基的空气体积(V/V · min, vvm)。上述方法中，所述发酵的条件包括接种量为-3% (体积百分比)，具体为 1%、2%或 3%。接种时，使用处于对数生长中后期的菌进行接种，此时种子培养液的0D600值为 10. 5。上述方法中，所述发酵包括如下1)或2)所述条件1)以200rpm的转速振荡，旋 转半径为12mm ；2)以300rpm-600rpm的速度搅拌，旋转半径为100mm，搅拌的速度具体为 300rpm、450rpm、500rpm 或 600rpmo枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TT-68，保藏编号为CGMCC No. 3340也属于本 发明的保护范围。
实验证明，本发明菌株具有很高的产葡聚糖酶的能力。用本发明方法通 过摇瓶发酵培养，产酶水平为430-3000U/mL ；进行5L发酵罐扩大培养30h，酶活可达到 2500-5000U/mlo本发明来源的(燕麦粉、大豆蛋白胨)广泛，价格便宜，降低了生产成本。 因此，本发明方法生产β -葡聚糖酶的水平高，发酵周期短，生产成本低，具有较好的工业 化应用前景。
图1为不同碳源对枯草芽孢杆菌ΤΤ-68摇瓶发酵产β -葡聚糖酶的影响。图2为燕麦粉浓度对枯草芽孢杆菌ΤΤ-68摇瓶发酵产β -葡聚糖酶的影响。图3为不同氮源对枯草芽孢杆菌ΤΤ-68摇瓶发酵产β -葡聚糖酶的影响。图4为初始ρΗ对枯草芽孢杆菌ΤΤ-68摇瓶发酵产β -葡聚糖酶的影响。图5为培养时间对枯草芽孢杆菌ΤΤ-68摇瓶发酵产β -葡聚糖酶的影响。图6为培养时间对枯草芽孢杆菌ΤΤ-68在5L发酵罐中产β -葡聚糖酶的影响。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。主要原料及试剂大麦β-葡聚糖购自SIGMA公司；酵母提取物、胰蛋白胨，购 自英国OXOID公司；琼脂、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨、酪蛋白、豆粕粉购自北京康明威培 养基技术有限责任公司；KH2P04、MgSO4. 7H20、CaCl2, NaOH、苯酚、Na2S03、CuSO4. 5H20、酒石 酸钾、Na2CO3、脱氧胆酸钠、三氯乙酸分析纯，购自北京化工厂；3，5-二硝基水杨酸购自上 海远帆制剂厂；白酒酒糟、玉米芯、甘蔗渣、小麦秸秆等植物纤维质材料经粉碎后过筛，取 0. 18-0. 3mm 备用。实施例1、菌的分离和鉴定一、菌的分离本发明提供的枯草芽孢杆菌TT-68是从土壤腐叶中筛选得到的。分离培养基按照以下方法进行配置燕麦粉(0. 18-0. 3mm) 10g，酵母提取物5g，胰 蛋白胨 5g, KH2PO4 5g，MgSO4. 7H20 0. 3g，CaCl2 0. 3g，琼脂 20g，加水到 1L，自然 ρΗ。初筛培养基燕麦粉(0. 18-0. 3mm) IOg,酵母提取物5g，胰蛋白胨5g，KH2P045g, MgSO4. 7H20 0. 3g，CaCl2 0. 3g，刚果红 0. 05g，琼脂 20g，加水到 1L，自然 ρΗ。发酵培养基燕麦粉(0. 18_0.3!11111)1(^，酵母提取物58，胰蛋白胨58，KH2P045g, MgSO4. 7H20 0. 3g，CaCl2 0. 3g，加水到 1L，自然 ρΗ。新鲜土样稀释后涂布于分离培养基中，在50°C恒温培养箱中培养。待分离培养基 中有菌落长出，将菌株接种到初筛培养基中，凡在菌落周围能使刚果红褪色形成透明圈的 菌株，接种到发酵培养基中，培养条件50°C，200rpm，培养36h。发酵结束后取ImL发酵液于 1.5ml离心管中，离心(12000rpm，10min)，取上清，测定β-葡聚糖酶酶活。选取酶活较高 菌株ΤΤ-68作为出发菌株进行后续研究。二、菌的鉴定细菌学特征为菌落呈浅黄色，圆形或近圆形，边缘较整齐，中央隆起，干燥褶皱，不透明，不产生色素，有明显芽孢气味，菌落直径5mm，显微镜检为短杆状，长3. 5-5 μ m，宽 0. 6-0. 8 μ m，端生芽孢。生理生化特征为革兰氏阳性、好氧、化能异养菌，V-P反应、接触酶、葡萄糖发酵、硝酸盐还原呈阳性，甲基红反应呈阴性，其生长能水解淀粉、明胶。综合以上特征，证明本发明得到的菌株TT-68为枯草芽孢杆菌。本发明的菌株为 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TT-68，该菌株已于2009年10月15日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 3340。实施例2、摇瓶发酵制备β -葡聚糖酶的条件—、发酵培养基中碳源的筛选1、菌种活化将保藏的菌种ΤΤ-68在平板活化培养基上进行活化。活化培养基按照以下方法进行配置燕麦粉(0. 18-0. 3mm) IOg,酵母提取物5g，胰 蛋白胨 5g, KH2PO4 5g，MgSO4. 7H20 0. 3g，CaCl2 0. 3g，琼脂 20g，加水到 1L，自然 pH。2、种子液制备将活化后的新鲜菌株接种到种子培养基中，50°C恒温空气浴往复式摇床上以 200r/min振荡培养(旋转半径为12mm)，至培养体系的0D600值为10. 5 (即菌处于对数生 长中后期)。种子培养基按照以下方法进行配制燕麦粉(0. 18-0. 3mm) IOg,酵母提取物5g，胰 蛋白胨 5g，KH2PO4 5g，MgSO4. 7H20 0. 3g，CaCl2 0. 3g，加水到 1L，自然 pH。3、摇瓶液体发酵产β -葡聚糖酶在250mL三角瓶中装入50mL发酵培养基，接种量2% (体积百分比)，在50°C恒温 空气浴往复式摇床上以200r/min振荡培养36h。取发酵液12000r/min离心lOmin，吸取上 清液即得粗酶液，进行葡聚糖酶酶活测定。发酵培养基按照以下方法进行配制碳源(0. 18-0. 3mm) IOg,酵母提取物5g，胰蛋 白胨5g，KH2PO4 5g，MgSO4. 7H20 0. 3g，CaCl2 0. 3g，加水到1L，自然pH。实验根据碳源种类 不同，设9种培养基，其碳源分别是蔗渣、麦麸、稻草、玉米芯、玉米杆、燕麦粉、大麦粉、白酒 酒糟、啤酒酒糟。麦秆、玉米杆、麦麸、玉米芯均购自河南新乡；甘蔗渣购自广西龙州南华；稻草购 自辽宁盘锦；啤酒酒糟购自燕京啤酒厂；白酒酒糟购自沈阳瑞金泉酒厂；燕麦粉、大麦粉为 用购自北京超市发的燕麦和大麦粉碎制得。酶活测定方法采用DNS法(3，5- 二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后被还原成 棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和棕红色物的颜色深浅呈一定比例关 系。在540nm波长下测定棕红色物质的吸光度值，便可求出样品中还原糖的含量)。参照 文献(Miller, G. L. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination ofreducing sugars [J]. Analytical Chemistry. 1959,31 426-428.)中所述。具体方法如 下取50 μ L稀释的酶液，加入到150 μ L 1% (50mM,pH 6. 0柠檬酸缓冲液配制)大麦葡聚 糖底物中，60°C水浴反应IOmin后加入200 μ L DNS试剂(1 % 3，5- 二硝基水杨酸，1 % NaOH, 0. 2%苯酚，使用蒸馏水配制作为储存液，使用前加入0. 05%的无水亚硫酸钠)，煮沸15min后加入200 μ L饱和酒石酸钾钠溶液，冷却后测定540nm吸光度值，以葡萄糖作为标准。在 上述条件下，每分钟生成1 μ mol葡萄糖所需要的酶量为1个酶活性单位(U)。实验重复三次，碳源对TT-68产β -葡聚糖酶活性影响如图1所示，以燕麦粉为碳 源培养基产酶最高，可达430U/ml粗酶液。蛋白质含量的检测方法参照文献(Lowry，0. H.，Rosebrough, N. J.，Farr, A. L. andRandall, R. J. 1951. Protein measurement with the folin phenol reagent[J]. Journal ofBiological Chemistry. 193，265-275.)中所述。采用 Lowry 法(磷钼酸和磷钨 酸在碱性条件下，易被蛋白质中含有代酚基的酪氨酸还原产生深蓝色的复合物。在一定范 围内，蛋白含量和深蓝色复合物的颜色深浅呈一定比例关系。在750nm波长下测定深蓝色 物质的吸光度值，便可求出样品中蛋白含量)。CTC原液的配制在含有0. 2% CuSO4. 5H20和0. 2%酒石酸钾混合溶液中缓慢加入 等体积的20%的Na2CO3溶液迅速搅拌。在200yL稀释的酶液中加入20yL 0. 15 %脱氧胆酸钠，静置IOmin后加入 2 0 μ L72%的三氯乙酸，IOOOOrpm离心lOmin，去掉上清液。在沉淀中加入200 μ L蒸馏水， 振荡溶解沉淀后加入200 μ L CTC溶液(将如下溶液和CTC原液等体积混合得到蒸馏水、 0.8Μ NaOHUO% SDS)静置lOmin。最后加入100 μ L 20%福林酚试剂，静置30min，在750nm 下测定吸光值。二、发酵培养基中碳源浓度的筛选1、菌种活化与实施例2中一、发酵培养基中碳源的筛选中所述一致。2、种子液的制备与实施例2中一、发酵培养基中碳源的筛选中所述一致。3、摇瓶液体发酵生产β -葡聚糖酶方法与实施例2中一、发酵培养基中碳源的筛 选中所述一致，不同之处在于所述用的发酵培养基不同，其余步骤完全相同。本步骤的发酵培养基按照以下方法进行配制燕麦粉5_50g，酵母提取物5g，胰蛋 白胨5g，KH2PO4 5g，MgSO4. 7H20 0. 3g，CaCl2 0. 3g，加水到1L，自然pH。本实验根据碳源浓 度不同，设10种培养基，燕麦粉浓度(g/L)分别为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50。实验设三次重复。按照实施例2中一、发酵培养基中碳源的筛选中的酶活测定方 法进行葡聚糖酶酶活测定以及蛋白含量测定。燕麦粉浓度对ΤΤ-68产葡聚糖酶活 性的影响如图2所示，以燕麦粉浓度为20g/L时培养产酶最高，可达1010U/ml粗酶液。三、发酵培养基中氮源的筛选1、菌种活化与实施例2中一、发酵培养基中碳源的筛选中所述一致。2、种子液的制备与实施例2中一、发酵培养基中碳源的筛选中所述一致。3、摇瓶液体发酵生产β -葡聚糖酶方法与实施例2中一、发酵培养基中碳源的筛 选中所述一致，不同之处在于所述用的发酵培养基不同，其余步骤完全相同。本步骤的发酵培养基按照以下方法进行配制燕麦粉20g，氮源10g，KH2PO4 5g， MgSO4. 7H20 0. 3g，CaCl2 0. 3g，加水到1L，自然pH。本实验根据氮源种类不同，设7种培养 基，其氮源分别是胰蛋白胨、酵母提取物、酵母提取物胰蛋白胨=1 1(即酵母提取物 5g，胰蛋白胨5g)、豆粕粉、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨、尿素。实验设三次重复。按照实施例2中一、发酵培养基中碳源的筛选中的酶活测定方 法进行葡聚糖酶酶活测定以及蛋白含量测定。氮源对ΤΤ-68产葡聚糖酶活性的影响如图3所示，以大豆蛋白胨为氮源时培养产酶最高，可达1470U/ml粗酶液。四、发酵培养基初始pH的筛选
1、菌种活化与实施例2中一、发酵培养基中碳源的筛选中所述一致。2、种子液的制备与实施例2中一、发酵培养基中碳源的筛选中所述一致。3、摇瓶液体发酵生产β -葡聚糖酶方法与实施例2中一、发酵培养基中碳源的筛 选中所述一致，不同之处在于所述用的发酵培养基及其初始PH不同，其余步骤完全相同。本步骤的发酵培养基按照以下方法进行配制燕麦粉20g，大豆蛋白胨10g，KH2PO4 5g，MgSO4. 7H20 0. 3g，CaCl2 0. 3g，加水到1L。本实验根据初始pH不同，设9种培养基，初 始 PH 分别为 4,4. 5、5、5· 5、6、6· 5、7、7· 5、8。实验设三次重复。按照实施例2中一、发酵培养基中碳源的筛选中的酶活测定方 法进行β-葡聚糖酶酶活测定以及蛋白含量测定。初始PH对ΤΤ-68产β-葡聚糖酶活性 的影响如图4所示，以初始pH为5时培养产酶最高，可达1550U/ml粗酶液。将容器内的所 有物质记作发酵液。五、发酵培养时间的筛选1、菌种活化与实施例2中一、发酵培养基中碳源的筛选中所述一致。2、种子液的制备与实施例2中一、发酵培养基中碳源的筛选中所述一致。3、摇瓶液体发酵生产β -葡聚糖酶方法与实施例2中四、发酵培养基初始pH的 筛选中所述一致，不同之处在于发酵时间不同，其余步骤完全相同。本步骤的发酵培养基按照以下方法进行配制燕麦粉20g，大豆蛋白胨10g，KH2PO4 5g，MgSO4. 7H20 0. 3g，CaCl2 0. 3g，加水到1L，初始pH为5。本实验根据培养时间(h)分别 为12、24、36、48、60、72、84、96。实验设三次重复。按照实验一中的酶活测定方法进行β _葡聚糖酶酶活测定以及 蛋白含量测定。培养时间对ΤΤ-68产β -葡聚糖酶活性的影响如图5所示，以培养72h时 发酵产酶最高，可达3000U/ml粗酶液。72h时，产生的酶蛋白最多，为0. 83mg/ml粗酶液。实施例3、发酵罐发酵制备β -葡聚糖酶的条件1、菌种活化与实施例2中一、发酵培养基中碳源的筛选中菌种活化方法一致。2、种子液的制备与实施例2中一、发酵培养基中碳源的筛选中种子液的制备一致。3、发酵罐液体发酵生产β -葡聚糖酶在5L发酵罐(培养基为2.5L)中接入(体积百分比)的种子液，在50°C培养， 通气量是1.2vvm，搅拌速率是500rpm (搅拌半径为100mm)，发酵周期为30h，实验设三次重 复。本实验根据培养时间(h)分别为18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30。发酵培养基为如下燕麦粉20g,大豆蛋白胨20g, KH2PO4 5g，MgS04. 7Η200· 3g， CaCl2 0. 3g，加水到 1L, pH5。实验设三次重复。按照实施例2中一、发酵培养基中碳源的筛选中的酶活测定方 法进行葡聚糖酶酶活测定以及蛋白含量测定。培养时间对ΤΤ-68产葡聚糖酶活性 的影响如图6所示，以培养29h时发酵产酶最高，可达2470U/ml粗酶液。28h时，产生的酶 蛋白最多，为0. 78mg/ml粗酶液。实施例4、发酵罐制备β-葡聚糖酶
1、菌种活化与实施例2的菌种活化方法相同。2、种子液的制备实施例2的种子液制备方法相同。3、发酵罐液体发酵生产β-葡聚糖酶在5L发酵罐(培养基为2.5L)中接入1%、2%、3% (体积百分比)的种子液，在不 同温度下(40、50、55°C)下培养，通气量是1、1.5和2vvm，搅拌速率是300、450和600rpm, 搅拌半径为IOOmm ；发酵周期为30h，实验设三次重复。不同接种量、温度、通气量以及搅拌 速率的处理设置见表1。发酵培养基为如下I所示
I、按照如下方法配制燕麦粉20g，大豆蛋白胨10g, KH2PO4 5g，MgSO4. 7Η200· 3g， CaCl2 0. 3g，加水到 1L, pH5。按照实施例2中一、发酵培养基中碳源的筛选中的酶活测定方法进行β -葡聚糖 酶酶活测定以及蛋白含量测定。不同条件对TT-685L发酵罐发酵产β -葡聚糖酶活性的影响见表1。嗜热的枯草 芽孢杆菌ΤΤ-68在5L发酵罐中30h产β -葡聚糖酶活性可以达到2500-5000U/ml粗酶液。表1不同发酵条件对嗜热枯草芽孢杆菌TT-68在5L发酵罐中产β -葡聚糖酶的 影响
权利要求
一种制备β-葡聚糖酶的方法，包括如下步骤发酵枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)TT-68 CGMCC No.3340，得到β-葡聚糖酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵使用的培养基的组成如下由碳 源、氮源、无机盐和水组成；所述碳源为如下物质中的至少一种蔗渣、麦麸、稻草、玉米芯、玉米杆、燕麦粉、大麦 粉、白酒酒糟、啤酒酒糟；所述氮源为如下物质中的至少一种酵母提取物和胰蛋白胨的混合物、酵母提取物、胰 蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨、酪蛋白、豆粕粉和尿素；所述无机盐为如下物质中的至少一种ΚΗ2Ρ04、MgSO4. 7Η20和CaCl2。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述培养基为如下1)或2)所示1)所述氮源为酵母提取物和胰蛋白胨；所述碳源为如下物质中的至少一种蔗渣、 麦麸、稻草、玉米芯、玉米杆、燕麦粉、大麦粉、白酒酒糟、啤酒酒糟；所述无机盐为kh2PO4、 MgSO4. 7H20 和 CaCl2 ；2)所述氮源为如下物质中的至少一种酵母提取物和胰蛋白胨的混合物、酵母提取 物、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨、酪蛋白、豆粕粉、尿素；所述碳源为燕麦粉；所述无 机盐为 KH2P04、MgSO4. 7H20 和 CaCl2。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述碳源在所述培养基中的浓 度为 5g/L-50g/L 或 15g/L-25g/L 或 15g/L_40g/ 或 15g/L_35g/L，具体为 5g/L、10g/L、15g/ L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L或50g/L ；所述氮源在所述培养基中的浓度为 5g/L-30g/L,具体为 5g/L、10g/L 或 30g/L ；所述KH2PO4在培养基中的浓度为3g/L-7g/L，具体为3g/L、5g/L或7g/L ；所述 MgSO4. 7H20在培养基中的浓度为0. 2g/L-0. 4g/L，具体为0. 2g/L、0. 3g/L或0. 4g/L ；所述 CaCl2在培养基中的浓度为0. 2g/L-0. 4g/L，具体为0. 2g/L、0. 3g/L或0. 4g/L。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述1)所示培养基为如下I或II所示I、所述氮源为酵母提取物和胰蛋白胨；所述碳源为如下物质中的至少一种蔗渣、 麦麸、稻草、玉米芯、玉米杆、燕麦粉、大麦粉、白酒酒糟、啤酒酒糟；所述无机盐为kh2PO4、 MgSO4. 7H20 和 CaCl2 ；所述酵母提取物在培养基中的浓度为4-6g/L，具体为4g/L、5g/L或6g/L ；所述胰蛋白 胨在培养基中的浓度为4-6g/L，具体为4g/L、5g/L或6g/L ；所述碳源在培养基中的浓度为 9g/-l lg/L，具体为9g/L、10g/L或1 lg/L ；所述KH2PO4在培养基中的浓度为3g/L-7g/L，具体 为3g/L、5g/L或7g/L ；所述MgSO4. 7H20在培养基中的浓度为0. 2g/L_0. 4g/L，具体为0. 2g/ L、0. 3g/L 或 0. 4g/L ；所述 CaCl2 在培养基中的浓度为 0. 2g/L_0. 4g/L，具体为 0. 2g/L、0. 3g/ L 或 0. 4g/L ；II、所述氮源为酵母提取物和胰蛋白胨；所述碳源为燕麦粉；所述无机盐为ΚΗ2Ρ04、 MgSO4. 7H20 和 CaCl2 ；所述酵母提取物在培养基中的浓度为4-6g/L，具体为4g/L、5g/L或6g/L ；所述胰蛋白 胨在培养基中的浓度为4-6g/L，具体为4g/L、5g/L或6g/L ；所述燕麦粉在培养基中的浓度 为 5g/L-50g/L，具体为 5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L ；所述KH2PO4在培养基中的浓度为3g/L-7g/L，具体为3g/L、5g/L或7g/L ；所述MgSO4. 7H20 在培养基中的浓度为0. 2g/L-0. 4g/L，具体为0. 2g/L、0. 3g/L或0. 4g/L ；所述CaCl2在培养 基中的浓度为 0. 2g/L-0. 4g/L，具体为 0. 2g/L、0. 3g/L 或 0. 4g/L ；所述2)所示培养基为如下111、1乂、乂、/1或￥11所示III、所述氮源为如下物质中的至少一种酵母提取物和胰蛋白胨的混合物、酵母提取 物、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨、酪蛋白、豆粕粉、尿素；所述碳源为燕麦粉；所述无 机盐为 KH2P04、MgSO4. 7H20 和 CaCl2 ；所述燕麦粉在培养基中的浓度为15g/L-25g/L，具体为15g/L、20g/L或25g/L;所述氮 源在培养基中的浓度为9g/L-llg/L，具体为9g/L、10g/L或llg/L ；所述KH2PO4在培养基 中的浓度为3g/L-7g/L，具体为3g/L、5g/L或7g/L ；所 述MgSO4. 7H20在培养基中的浓度为 0. 2g/L-0. 4g/L，具体为0. 2g/L、0. 3g/L或0. 4g/L ；所述CaCl2在培养基中的浓度为0. 2g/ L-0. 4g/L，具体为 0. 2g/L、0. 3g/L 或 0. 4g/L ；IV、所述氮源为大豆蛋白胨；所述碳源为燕麦粉；所述无机盐为KH2P04、MgSO4.7H20和 CaCl2 ；所述燕麦粉在培养基中的浓度为15g/L-25g/L，具体为15g/L、20g/L或25 g/L;所述大 豆蛋白胨在培养基中的浓度为5g/L-15g/L，具体为5g/L、10g/L或15g/L ；所述KH2PO4在培 养基中的浓度为3g/L-7g/L，具体为3g/L、5g/L或7g/L ；所述MgSO4. 7H20在培养基中的浓 度为0. 2g/L-0. 4g/L，具体为0. 2g/L、0. 3g/L或0. 4g/L ；所述CaCl2在培养基中的浓度为 0. 2g/L-0. 4g/L，具体为 0. 2g/L、0. 3g/L 或 0. 4g/L ；培养基的 PH 为 4-8，具体为 4,4. 5、5、5· 5、6、6· 5、7、7· 5 或 8 ；V、所述氮源为大豆蛋白胨；所述碳源为燕麦粉；所述无机盐为KH2P04、MgSO4.7H20和 CaCl2 ；所述燕麦粉在培养基中的浓度为20g/L ；所述大豆蛋白胨在培养基中的浓度为10g/L ； 所述KH2PO4在培养基中的浓度为5g/L ；所述MgSO4. 7H20在培养基中的浓度为0. 3g/L ；所述 CaCl2在培养基中的浓度为0. 3g/L ；培养基的PH为5;VI、所述氮源为大豆蛋白胨；所述碳源为燕麦粉；所述无机盐为KH2P04、MgSO4.7H20和 CaCl2 ；所述燕麦粉在培养基中的浓度为20g/L ；所述大豆蛋白胨在培养基中的浓度为20g/L ； 所述KH2PO4在培养基中的浓度为5g/L ；所述MgSO4. 7H20在培养基中的浓度为0. 3g/L ；所述 CaCl2在培养基中的浓度为0. 3g/L ；培养基的pH为5 ；VII、所述氮源为大豆蛋白胨；所述碳源为燕麦粉；所述无机盐为ΚΗ2Ρ04、MgSO4.7Η20和 CaCl2 ；所述燕麦粉在培养基中的浓度为15g/L-25g/L，具体为15g/L、20g/L或25g/L;所述大 豆蛋白胨在培养基中的浓度为5g/L-15g/L，具体为5g/L、10g/L或15g/L ；所述KH2PO4在培 养基中的浓度为3g/L-7g/L，具体为3g/L、5g/L或7g/L ；所述MgSO4. 7H20在培养基中的浓 度为0. 2g/L-0. 4g/L，具体为0. 2g/L、0. 3g/L或0. 4g/L ；所述CaCl2在培养基中的浓度为 0. 2g/L-0. 4g/L，具体为 0. 2g/L、0. 3g/L 或 0. 4g/L ；培养基的PH为4. 5-5. 5，具体为4. 5、5或5. 5。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述发酵的条件包括温度为 40°C -55°C，具体为 40°C、50°C或 55°C。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述发酵的条件包括通气量为 lvvm-2vvm和发酵容器内的压力为0. 4-0. 8MPa ；所述通气量具体为lvvm、l. 2vvm、l. 5vvm或 2vvm0
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述发酵的条件包括接种量为 1% -3% (体积百分比)，具体为1%、2%或3%。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述发酵包括如下1)或2 ) 所述条件1)以200rpm的转速振荡，旋转半径为12mm，培养时间为12小时-96小时或 48小时-84小时或60小时-84小时，具体为12、24、36、48、60、72、84或96小时；2)以 300rpm-600rpm的速度搅拌，旋转半径为100mm，搅拌的速度具体为300rpm、450rpm、500rpm 或600rpm,培养时间为18小时-30小时或24小时-30小时或27小时-30小时，具体为18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 小时。
10.枯草芽孢杆菌(Bacillussubtil is) TT-68，保藏编号为 CGMCC No. 3340。
全文摘要
本发明公开了一种制备β-葡聚糖酶的方法及其专用菌株。该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TT-68，保藏编号为CGMCC No.3340。实验证明，本发明菌株具有很高的产β-葡聚糖酶的能力。用本发明方法通过摇瓶发酵培养，产酶水平为430-3000U/mL；进行5L发酵罐扩大培养30h，酶活可达到2500-5000U/ml。因此，本发明方法生产β-葡聚糖酶的水平高，发酵周期短，生产成本低，具有较好的工业化应用前景。
文档编号C12N9/24GK101845423SQ20101019740
公开日2010年9月29日 申请日期2010年6月10日 优先权日2010年6月10日
发明者唐艳斌, 杜雪丹, 江正强, 闫巧娟 申请人:中国农业大学