专利名称：具有抑制血小板凝集功能的微小纤溶酶原突变体及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种具有抑制血小板凝集功能的微小纤溶酶原突变体，本发明还涉及该微小纤溶酶原突变体的制备方法以及在制备预防和治疗血栓性疾病药物和眼科疾病药物方面的用途。
背景技术：
人纤溶酶原(Plasminogen，Plg)是人体纤溶系统的关键成分之一，经纤溶酶原激活剂(PA)激活，转变为纤溶酶(Plasmin，Plm)后，不仅发挥纤溶作用，溶解血栓，而且参与体内一系列与蛋白质水解有关的生理、病理过程。天然的Glu-Plg是具有多个结构域的糖蛋白，由N端多肽(NTP)、5个同源的三角区(K1-K5)、丝氨酸酶活性中心区(SP)组成， 经PA激活后，在Arg560-Val561特异性裂解，形成由二硫键维系的活性双链纤溶酶。人微小纤溶酶原(Microplasminogen，mPlg)是纤溶酶原被弹性蛋白酶在531-791位氨基酸间降解的261个氨基酸组成的多肽，含6个二硫键，不包括Plg的N端、五个同源三角区 (Kl-肪)，但保留了丝氨酸蛋白酶活性中心区(SP)，可被纤溶酶原激活剂激活后形成微小纤溶酶原，具有纤溶酶的纤溶活性。微小纤溶酶原分子量较小，较易制备晶体，且保留了纤溶酶原的活性区，因此适合作为临床使用的溶栓药物。近年来，研究表明，人纤溶酶可作为玻璃体切割手术的一种有效的辅助药物，应用纤溶和抗凝药物在分子水平上改变玻璃体的组成，可促成玻璃体后脱离的形成，成为当今眼科疾病临床研究的热点。在凝血过程中，血小板粘附和聚集是一个重要步骤，而含R⑶序列的整合素受体配基(纤维蛋白原)同其受体(GP IIbIIIa)的作用，又是血小板粘附所必不可少的，而纤维蛋白原通过其Y链C端的R⑶序列与GP nbllla等受体相互识别并发挥其功能的。在发现具有RGD序列的去整合素能与血小板糖蛋白GP IIbIIIa结合、有效抑制血小板聚集后， 为了更好的研究RGD序列的活性构象，人们合成了各种含RGD序列的小肽，如RGDS、RGDff, GRGDS等。它们均具有抑制纤维蛋白原与血小板的结合和抑制血栓形成等作用。但其抑制活性比含同样序列的天然蛋白要低的多，且半衰期较短。随后又有各种环化的R⑶肽被相继合成，通过不同形式的环化后，可以提高其抑制活性。这可能是由于线状肽中的天冬氨酸 (Asp)容易被降解，而环化肽的刚性保证了天冬氨酸(Asp)的稳定性；环化可以束缚含RGD 序列的片段，以形成局域构象，同时RGD残基形成一个突出的环状loop，这使它能够更容易插入到整合素GP IIbIIIa,所以具有比较强的抑制血小板聚集作用。研究表明与R⑶相比，K⑶具有同样抑制血小板凝集功能，并且对GP IIbIIIa具有更好的专一性。RGD或KGD序列可与纤维蛋白原竞争结合与血小板聚集相关的膜受体GP II bill a，而血小板活化后依靠其膜受体GP lib IIIa与纤维蛋白结合是血栓形成的最后共同通路，因而，含RGD/KGD肽类具有比其它药物更强的抗血栓功能。基于RGD/KGD序列的许多化学模拟物，如 Lamifiban、Lefradafiban、Orbofiban、Xenmilofiban、Integrilin 等均能封闭GP lib IIIa受体，与溶栓药物合用，血栓再形成发生率显著降低。
实验表明，人微小纤溶酶原具有强烈而快速的纤溶活性，在体内和体外都能有效的溶解血栓，具有很好的应用前景，但却没有抗血小板凝集的功能，所以如果能通过一些手段引入这种性质，使其同时具有溶纤和抑制血小板凝集功能，将更有利于开发和利用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抑制血小板凝集功能的微小纤溶酶原突变体，同时本发明还提供该微小纤溶酶原突变体的制备方法以及在制备预防和治疗血栓性疾病药物和眼科疾病药物方面的用途。为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案
本发明所述的具有抑制血小板凝集功能的微小纤溶酶原突变体的氨基酸序列是 KLYDYCK⑶WPCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTA AHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRT ECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYIL QGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN。上述微小纤溶酶原突变体的制备方法是将微小纤溶酶序列的7-10位的D (天冬氨酸)-V (缬氨酸)-P (脯氨酸)-Q (谷氨酰胺)序列替换为K (赖氨酸)-G (甘氨酸)-D (天冬氨酸)-W (色氨酸)-P (脯氨酸)序列，K-G-D两边的半胱氨基可以形成二硫键，替换后的序列形成突出的Loop结构，并使K-G-D序列置于Loop结构的顶端。上述的微小纤溶酶原是指从人纤溶酶原的Arg530-Lys531之间的肽键被限制性降解，生成含261个氨基酸残基的微小纤溶酶原，该微小纤溶酶原的氨基酸序列为
KLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRWGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAA HCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTE CFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQ⑶SGGPLVCFEKDKYILQ GVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN。经验证表明，上述制备的的微小纤溶酶原突变体同时具有溶解纤溶蛋白和抑制血小板凝集的双重功能，能够在制备预防和治疗血栓性疾病药物方面以及制备预防和治疗眼科疾病药物方面中应用。将本发明的微小纤溶酶原突变体的DNA片段与表达载体重组，形成重组表达质粒。本发明不限于特定的表达载体，只要它能够与所述DNA片段重组，形成适宜表达的质粒即可。上述重组表达载体可按常规方法导入适宜宿主细胞。本发明不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。在优选实施方案中，本发明使用毕赤酵母菌株如GS115，KM71等。所述表达载体可以是常规的酵母表达载体，如商业PIC系列载体。本发明的具有抑制血小板凝集功能的微小纤溶酶原突变体DNA与pPICZaA相连接，在毕赤酵母GS115中实现了高效表达。通过盐析、凝胶过滤和离子交换纯化，得到了纯度很高的同时具备溶栓活性和抑制血小板凝集两种功能的微小纤溶酶原突变体。本发明的优点在于采用上述制备方法得到的具备溶栓活性和抑制血小板凝集两种功能的微小纤溶酶原突变体，在制备预防和治疗血栓性疾病药物方面以及制备预防和治疗眼科疾病药物方面中更有利于开发和应用。
图1是本发明微小纤溶酶原突变体的氨基酸序列。图2是微小纤溶酶原的氨基酸序列。图3是本发明微小纤溶酶原突变体的核苷酸序列。图4显示微小纤溶酶原三级结构。图5显示本发明微小纤溶酶原突变体的三级结构预测结果。图6显示了本发明的微小纤溶酶原突变体在毕赤酵母中表达的SDS-PAGE电泳照片。其中 1 :Marker ；2/3 :KGD_mPlg。图7显示了微小纤溶酶原突变体纯化的SDS-PAGE结果。图8显示了微小纤溶酶原突变体和微小纤溶酶原纤维平板法溶栓活性测定结果。 其中1 微小纤溶酶原；2 微小纤溶酶原突变体。图9显示了微小纤溶酶原突变体和微小纤溶酶原的抗ADP诱导的血小板聚集试验结果。
具体实施例方式下面结合附图对本发明做进一步的详细说明。本发明的微小纤溶酶原突变体，在合成微小纤溶酶原突变体基因时将含KGD序列的多肽编码序列融合在微小纤溶酶原基因中。根据微小纤溶酶原的结构特点和作用方式，设计具有溶解血栓和抑制血小板聚集的双功能微小纤溶酶原突变体分子，并利用基因工程手段生产，所得产品除了具有高效、特异溶解血栓功能外，还具有抗血小板聚集的新特性，并且制备工艺简便、安全。从微小纤溶酶原的三维结构上看，7-10位氨基酸位于分子结构的外部，呈一个突出的Loop状，远离己知的活性中心。在该位置上引入KGD序列既能使KGD较好的发挥抗凝功能，又对微小纤溶酶原的活性没有影响，很好的保持微小纤溶酶原突变体的溶栓活性。本发明的微小纤溶酶原突变体，是将微小纤溶酶原N末端的7-10位D-V-P-Q序列替换为K-G-D-W-P。在该位置上引入KGD序列不仅保持了微小纤溶酶原的溶栓活性，同时具有较好的抑制血小板凝集的功能。1、突变位点的选择
由于KGD序列在处于loop位置时抑制血小板凝集能力最强，并为了最大限度的不破坏微小纤溶酶原有的纤溶酶活性，按照以下原则选择突变位点处于loop位置、远离微小纤溶酶活性中心、尽量少的改变氨基酸。最后选取7-10位作为突变位点，将D-V-P-Q序列替换为K-G-D-W-P，微小纤溶酶原突变体的氨基酸序列见图1，微小纤溶酶原的氨基酸序列见图2。将上述设计好的突变体的氨基酸序列提交SWISS-MODEL服务器，以微小纤溶酶原三级结构为模板，按照同源建模方式，对微小纤溶酶原突变体进行三级结构的预测并进行分析。预测结果显示，微小纤溶酶原突变体三级结构没有大的改变，符合预期要求(参见图 4和图5)。2、溶栓/抑制血小板凝集的双功能分子的合成与表达载体构建CN 102154253 A
说明书
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根据密码子表设计微小纤溶酶原突变体的核苷酸序列，用重叠引物延伸PCR法合成微小纤溶酶原突变体DNA。设计了 16段平均60bp左右的片段，该长度可以保证化学合成的准确率和高产率，两个相邻片段之间的重叠区域为13 bp左右，Tm值在40°C 45°C之间，并在 5’-端依次加上酶切位点损ο I，3’-端加上终止密码子TAA和酶切位点Λ^ I。在进行循环PCR合成全长微小纤溶酶原突变体基因时，两个临近的片段互为引物进行第一轮PCR扩增，再以两个临近的PCR产物为模板，以这两个PCR产物的最外侧的两个DNA片段为引物进行下一轮扩增，以此类推，最后通过5轮PCR合成全长微小纤溶酶原突变体DNA (如图3)。 PCR产物经ZAo I / Λ^ I双酶切连接进表达载体pPICZaA中，并转化大肠杆菌DH5a，提取质粒测序。3、微小纤溶酶原突变体的表达与纯化 (1)微小纤溶酶原突变体的表达
经测序，序列正确的表达载体用Mc I线性化进行线性化，通过电转化法使重组表达载体转入毕赤酵母宿主菌GS115 (his4)。固体YPDZ培养平板(含kocin浓度分别为100 Ug/ml,200 yg/ml,300 μ g/ml的YPD平板)梯度筛选后获得的转化子，并进行PCR鉴定。挑取鉴定后的GS115阳性转化子分别接种于BMGY液体培养基中，于28 °C，200 r/min摇床上振荡培养至0D600为2-6，3000 r/min离心5 min回收菌体后按1 5 (BMGY BMMY)重悬于BMMY液体培养基(pH为6. 0)中至0D600约为1. 0，然后于沘"C，200 r/min 摇床上振荡培养5 d，每天流加1.0 %的甲醇来诱导表达。( 2)微小纤溶酶原突变体的纯化
取筛选出的高表达转化子在优化条件下进行诱导表达，收集到的培养液上清用0. 45 μπι滤器过滤后，用40%的硫酸铵沉淀后，离心后目的蛋白用柠檬酸缓冲液溶解沉淀。将浓缩液进行kphacryl 100凝胶过滤层析，用pH6. 0的0. 025mol/L柠檬酸缓冲液洗脱，按吸收峰收集各组分，检测活性、SDS-PAGE分析。凝胶过滤得到的纯化产物，再用SP Sepharose FF离子交换层析柱进行纯化。层析柱先用PH6. 0的0. 025mol/L柠檬酸缓冲液平衡后，上样，目的蛋白挂在柱上后，用上述柠檬酸缓冲液洗至基线平后，再淋洗10个柱体积，然后用含lm0l/LNaCl、pH6. 0的0. 025mol/ L枸椽酸缓冲液洗脱，收集含目的蛋白的洗脱峰，流速为lmL/min。(3)分子筛脱盐、冻干
用Superdex G-25柱(Φ IOmmX 400mm)脱盐，缓冲液为Buffer C，收集活性峰待分析测定，其SDS-PAGE分析结果如图7，纯度达95%以上。加3%的赋形剂甘露醇，以0. 22 μ m的膜滤过除菌，分装，冻干，4°C冰箱保存。4、微小纤溶酶原突变体活性测定 (1)纤维平板法纤溶活性测定
取 2 %琼脂溶液(pH7. 4，含 0. lSmoVLNaCUOmmolA^ris^Cl) 5ml，铺板前加入 Iml 含10单位凝血酶溶液，在45°C 50°C水浴中与0. 4%纤维蛋白原溶液(pH7. 4，含0. 15mol/ LNaCl，50mmOl/LTriS*Cl) 5ml，混合后倒入无菌培养皿中，室温凝固。在平板上打直径3mm 的小孔，每孔加10//L通过尿激酶激活的微小纤溶酶原突变体，置37°C保温18h，取出观察结果。(2)抗血小板聚集活性的测定
6血小板聚集实验使用富血浆血小板(PRP)和贫血浆血小板(PPP)进行测定。取新鲜的鼠血以9 :l(v :v)加入3. 8%的柠檬酸钠做抗凝剂，缓慢颠倒混均。SOOrpm离心10分钟，小心吸取上层富含血小板的悬液，即为PRP(Platelet Rich Plasma)。剩余部分再以3000rpm 离心10分钟，吸出上层液体，即为PPP (Platelet Pool Plasma)。将300ul的PRP按100 1的比例与待测样品或对照缓冲液混合，在37°C保温3分钟，用PPP调节零点，加入诱导剂 ADP (终浓度Kfomol/L)，记录3分钟内的聚集波形，血小板聚集的抑制率=(对照的最大聚集一样品的最大聚集率)/对照的最大聚集率。5、结果分析
采用纤维蛋白溶圈法(平板法)测定结果如图8，无论野生型微小纤溶酶原还是其突变体都具有明显的纤溶酶活性，从溶圈大小看不出明显差异。从图9可以看出野生型微小纤溶酶原几乎没有抑制ADP诱导的血小板聚集的生物活性，而微小纤溶酶原突变体则明显具有抑制血小板聚集的功能。
权利要求
1.一种具有抑制血小板凝集功能的微小纤溶酶原突变体，其特征在于所述微小纤溶酶原突变体的氨基酸序列是KLYDYCKGDWPCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSffPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEffVLTA AHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRT ECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYIL QGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN。
2.根据权利要求1所述的微小纤溶酶原突变体的制备方法，其特征在于它是将微小纤溶酶原序列的7-10位的D-V-P-Q序列替换为K-G-D-W-P序列，替换后的序列形成突出的 Loop结构，并使K-G-D序列置于Loop结构的顶端。
3.根据权利要求1所述的微小纤溶酶原突变体作为制备预防和治疗血栓性疾病药物方面的应用。
4.根据权利要求1所述的微小纤溶酶原突变体作为制备预防和治疗眼科疾病药物方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种具有抑制血小板凝集功能的微小纤溶酶原突变体，其氨基酸序列是KLYDYCKGDWPCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN，其制备方法是将微小纤溶酶原序列的7-10位的D-V-P-Q序列替换为K-G-D-W-P序列，替换后的序列形成突出的Loop结构，并使K-G-D序列置于Loop结构的顶端；同时提供了该微小纤溶酶原突变体作为制备预防和治疗血栓性疾病及眼科疾病药物方面的应用。
文档编号C12N9/68GK102154253SQ201110001748
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月6日 优先权日2011年1月6日
发明者卢萍, 张守涛, 方惠敏 申请人:郑州大学