涉及编码蛋白酪氨酸磷酸酶的基因的耐旱植物以及相关的构建体和方法

专利名称：涉及编码蛋白酪氨酸磷酸酶的基因的耐旱植物以及相关的构建体和方法
技术领域：
本发明领域涉及植物育种和基因学，并且具体地讲涉及用于赋予植物抗旱性的 重组DNA构建体。
背景技术：
非生物胁迫是世界范围内农作物损失的主要因素，它引起主要农作物平均超过 50% 的产量损失(Boyer，J.S. (1982) Science 218 443-448 ； Bray，E.A.等人(2000)， In Biochemistry and Molecular Biology of Plants, Buchannan, B.B.等人编辑，Amer.Soc. Plant Biol.,第1158-1249页)。在不同的非生物胁迫中，干旱是世界范围内限制农作物 产量的主要因素。植物在不同发育阶段暴露于水限制环境下似乎启动多个生理和发育变 化。理解干旱胁迫的基本生物化学和分子机制，转导和耐受性是生物学中的主要挑战。 已经公布了非生物胁迫响应和干旱胁迫耐受性的遗传调节机制的回顾(Valliyodan，B.和 Nguyen, H.T., (2006) Curr.Opin.Plant Biol.9 189-195； Wang, W.等人(2003) Planta 218 1-14) ； Vinocur，B.和 Altman, A. (2005) Curr.Opin.Biotechnol. 16 123-132; Chaves, M.M.禾Π Oliveira, Μ.Μ. (2004) J.Exp.Bot.55 2365-2384; Shinozaki, K.等 人(2003) Curr.Opin.Plant Biol.6 410-417; Yamaguchi-Shinozaki, K.禾Π Shinozaki, K. (2005) Trends Plant Sci.10 88-94)。通过差异和/或差减分析已经完成了较早的对非生物胁迫分子方面的 研究工作(Bray，E.A. (1993) Plant Physiol.103 1035-1040 ； Shinozaki，K.和 Yamaguchi-Shinozaki，K. (1997) Plant Physiol. 115 327-334; Zhu, J._K.等人(1997) Crit. Rev.Plant Sci.16 253-277 ； Thomashow, M.F. (1999) Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol. Biol.50: 571-599)。其他方法包括选择候选基因并分析此类基因或其活性产物在胁迫下 的表达，或者通过在确切定义的胁迫体系中的功能互补(Xiong，L.和Zhu，J-K. (2001) PhysiologiaPlantaram 112 152-166)。此外，已经使用涉及鉴定并分离调控基因的突变 的正向和反向基因研究提供用于在胁迫或暴露条件下的基因表达中观察到的改变的证据 (Xiong, L.和 Zhu，J.-K. (2001) Physiologia Plantaram 112 152-166)。可利用激活标记来鉴定能影响性状的基因。已经在模型植物拟南芥属中使用该 方法(Weigel，D.等人(2000) Plant Physiol. 122 1003-1013)。插入转录增强子元件能够 显著激活和/或提高附近内源基因的表达。可使用该方法选择涉及在农学上重要的表型 (包括胁迫耐受性)中涉及的基因。发明概述本发明包括
在一个实施方案中，在基因组中包含重组DNA构建体的植物，该重组DNA构 建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所 述多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ IDNO : 15、17、19、21、 23、 25、 27、 28、 29、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 40、 41、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49和50进行比较时具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组 DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的耐旱性。在另一个实施方案中，在基因组中包含重组DNA构建体的植物，该重组DNA 构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽， 所述多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ IDNO 15、17、19、21、 23、 25、 27、 28、 29、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 40、 41、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49和50进行比较时具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组 DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。任选地，在水限制 条件下与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时，所述植物表现出所述至少一种 农学特性的改变。在另一个实施方案中，本发明包括本发明的任何植物，其中所述植物是玉米植 物或大豆植物。在另一个实施方案中，增加植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)将重组 DNA构建体弓I入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一 种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有的氨基酸序列基于 Clustal V 比对方法在与 SEQID NO 15、17、19、21、23、25、27、28、29、33、34、 35、36、37、38、40、41、43、44、45、46、47、48、49 和 50 进行比较时具有至少 50% 的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述 转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；并且(c)获得源自步骤(b)的所述 转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体，并 且在与不包含所述DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的耐旱性。在另一个实施方案中，评估植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)将重组 DNA构建体弓I入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一 种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有的氨基酸序列基于 Clustal V 比对方法在与 SEQID NO 15、17、19、21、23、25、27、28、29、33、34、 35、36、37、38、40、41、43、44、45、46、47、48、49 和 50 进行比较时具有至少 50% 的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述 转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(c)获得源自该转基因植物的子代 植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(d)评价该子代植物 在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时的耐旱性。在另一个实施方案中，测定植物至少一种农学特征改变的方法，所述方法包 括(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可 操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有 的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO 15、17、19、21、23、25、27、 28、29、33、34、35、36、37、38、40、41、43、44、45、46、47、48、49 和 50 进行比较时具有至少50%的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从可再生的植物细胞再生出转 基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(C)获得源自 该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及 (d)测定该子代植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一 种农学特性的改变。任选地，所述测定步骤(d)包括测定所述转基因植物在水限制条件 下与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时是否表现出至少一种农学特性的 改变。在另一个实施方案中，本发明包括本发明的任何方法，其中所述植物是玉米植 物或大豆植物。在另一个实施方案中，本发明包括分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包 括(a)编码具有蛋白酪氨酸磷酸酶活性的多肽的核苷酸序列，或者(b)所述核苷酸序列 的全长互补序列，其中所述多肽的氨基酸序列在与SEQ ID NO: 25、37、40或41进行比 较时具有至少90%的序列同一性，或者在与SEQ ID NO: 21或39进行比较时具有至少 93%的序列同一性，或者所述氨基酸序列包含SEQ ID NO : 17、34、43或44 ；其中所述 全长互补序列和所述核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且是100%互补的。所述多肽 可包含 SEQ ID NO: 17、21、25、34、36、37、40、41、43 或 44 的氨基酸序列。所述 核苷酸序列可包含SEQ IDNO : 16、20、24、39或42的核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明涉及包含任何本发明的分离的多核苷酸的重组 DNA构建体，所述分离的多核苷酸可操作地连接至少一种调控序列，并且涉及包含重组 DNA构建体的细胞、植物、和种子。附图简述和序列表根据以下的发明详述和附图以及序列表，可更全面地理解本发明，以下的发明 详述和附图以及序列表形成本申请的一部分。图 1A-1C 给出了如 SEQIDNO 15、17、19、21、23、25、27、28、29、40、
43、45和46所示的蛋白酪氨酸磷酸酶的氨基酸序列的比对。在框中包括了在给定位点 与SEQ ID NO: 15的残基相同的残基。给出了共有序列，其中如果残基在所有序列中相 同，它被示出，否则示出句号。图2给出


图1A-1C中给出的每对序列的序列同一性百分比和趋异值。图 3 给出了如 SEQ ID NO 33，34、35、36、37、38、41、44、47、48、49 禾口 50所示的潜在细胞质蛋白酪氨酸磷酸酶的每对序列的序列同一性百分比和趋异值。图4A-4B示出对用PHP30853转化的单个Gaspe Flint来源的玉米品系的评估。图5A-5B示出对用PHP30853转化的Gaspe Flint来源的玉米品系的综合评估。SEQ ID NO 1是用于制备拟南芥属种群的pHSbarENDs2活化标记载体的核苷 酸序列。SEQ ID NO 2 是Gateway 供体载体 pDONR /Zeo 的核苷酸序列。attPl 位
点位于核苷酸570-801 ； attP2位点位于核苷酸2754-2985 (互补链)。SEQ ID NO 3是Gateway 供体载体pDONR 221的核苷酸序列。attPl位点 位于核苷酸570-801 ； attP2位点位于核苷酸2754-2985 (互补链)。SEQIDNO: 4是pBC-yellow的核苷酸序列，pBC-yellow是用于拟南芥属的目的载体。attRl位点位于核苷酸11276-11399(互补链)；attR2位点位于核苷酸 9695-9819 (互补链)。 SEQ ID NO 5是PHP27840的核苷酸序列，PHP27840是用于大豆的目的载体。
attRl位点位于核苷酸7310-7434 ； attR2位点位于核苷酸8890-9014。 SEQ ID NO 6 是 PHP23236 的核苷酸序列，PHP23236 是用于 GaspeFlint 来
源的玉米品系的目的载体。attRl位点位于核苷酸2006-2130 ； attR2位点位于核苷酸
2899-3023。SEQ ID NO 7 是 PHP10523 的核苷酸序列(Komari 等人，Plant J.10
165-174(1996) ； NCBI 通用标识符 59797027)。SEQ ID NO 8是PHP23235的核苷酸序列，PHP23235是用于构建目的载体 PHP23236的载体，用于Gaspe Flint来源的品系。SEQ ID NO 9是PHP28647的核苷酸序列，PHP28647是用于玉米自交来源品 系的目的载体。attRl位点位于核苷酸2289-2413 ； attR2位点位于核苷酸3869-3993。SEQ ID NO 10是attBl位点的核苷酸序列。SEQ ID NO 11是attB2位点的核苷酸序列。SEQ ID NO 12是At3g44620_5，attB正向引物的核苷酸序列，包含attBl序 列，用于扩增一部分At3g44620蛋白编码区。SEQ ID NO 13是At3g44620_3，attB反向引物的核苷酸序列，包含attB2序 列，用于扩增一部分At3g44620蛋白编码区。SEQ ID NO 14对应于编码拟南芥属蛋白酪氨酸磷酸酶蛋白的核苷酸序列(基 因座 At3g44620)。SEQ ID NO 15 对应于 NCBI GI No.79432726，它是由 SEQ ID NO 14 编码的
拟南芥属蛋白酪氨酸磷酸酶的氨基酸序列。^ 1编石马g白酪氨,||磷的CDNA植物克隆命名*SEQ ID NO:SEQ ID NO:(核苷酸)(氨基酸)玉米cielc.pk001.nl3 (FIS)1617大豆重叠群1819sll.pk0004.cl2 ( FIS ) &GI No. 17401417大豆sdrlf.pk003.cl (FIS)2021大豆嵌合基因2223SEQ ID NO: 18 的 nt 6-26 &SEQ ID N0:20 的 nt 3-707糖用甜菜ebslc.pk003.kl4 (FIS)2425野苋菜easlc.pk002.d7 (FIS)3940葡萄重叠群4243vmblna.pk001.i3 (FIS)；vdblc.pk011.h24 (EST)*将完整的cDNA插入序列称为“全长插入序列”(“FIS”)。SEQIDNO 26对应于NCBI GI Νο.29367340，它是编码来自大米的蛋白酪氨酸
磷酸酶样蛋白的cDNA片段的核苷酸序列。SEQ ID NO 27 对应于 NCBI GI Νο.29367341，它是由 SEQ ID NO 26 编码的
大米蛋白酪氨酸磷酸酶样蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO 28 是在美国专利公布 US20040214272 的 SEQ IDNO 366863 中示
出的氨基酸序列，它对应于玉米蛋白酪氨酸磷酸酶样蛋白。SEQ ID NO 29 是在美国专利公布 US20040031072-A1 的 SEQ IDNO 277487
中示出的氨基酸序列，它对应于大豆蛋白酪氨酸磷酸酶样蛋白。SEQ ID NO 30是VC062引物的核苷酸序列，它包含Τ3启动子和attBl位点， 用于扩增克隆进Bluescript IISK⑴载体(Stratagene)的cDNA插入序列。SEQ ID NO 31是VC063引物的核苷酸序列，它包含T7启动子和attB2位点， 用于扩增克隆进Bluescript IISK⑴载体(Stratagene)的cDNA插入序列。SEQ ID NO 32是入门克隆PHP33257的核苷酸序列，并且包含来自cDNA克隆 cielc.pk001.nl3的玉米蛋白酪氨酸磷酸酶的编码区。SEQ ID NO 33 对应于 SEQ ID NO 15 的氨基酸 63-239。SEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NO
34对应于SEQ ID NO 35对应于SEQ ID NO 36对应于SEQ ID NO
17的氨基酸89-274。 19的氨基酸59-240。 21的氨基酸54-235。
SEQ ID NO 37 对应于 SEQ ID NO 25 的氨基酸 77-255。SEQ ID NO 38 对应于 SEQ ID NO 27 的氨基酸 84-268。SEQ ID NO 41 对应于 SEQ ID NO 40 的氨基酸 41-219。SEQ ID NO 44 对应于 SEQ ID NO 43 的氨基酸 65-246。SEQ ID NO 45对应于NCBI GI No.225436307,它是葡萄蛋白酪氨酸磷酸酶样 蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO 46对应于来自美国专利公开7214786的SEQ IDNO 112865，它是 小麦蛋白酪氨酸磷酸酶样蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO 47 对应于 SEQ ID NO 45 的氨基酸 65-246。SEQ ID NO 48 对应于 SEQ ID NO 46 的氨基酸 81-265。SEQ ID NO 49 对应于 SEQ ID NO 28 的氨基酸 89-274。SEQ ID NO 50 对应于 SEQ ID NO 29 的氨基酸 59-240。序列描述以及关联的序列表遵循如37 C.F.R. § 1.821-1.825中所列出的管理专利 申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开的规则。序列表包含核苷酸序列字符的单字母码以及氨基酸的三字母码，如遵照 IUPAC-IUBMB 标准所定义的，该标准在 Nucleic Acids Res. 13 3021-3030(1985)以及在 Biochemical J.219 (No.2) 345-373(1984)中有所描述，这两篇文献以引用的方式并入本 文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R. § 1.822中列出的规则。 发明详述
本文中所列出的每篇参考文献的公开内容的全文均以引用的方式并入本文。 如本文所用的并在所附权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数 除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株该类 “一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物，
如本文所用
蛋白酪氨酸磷酸酶(“PTP”或“PTPase”)属于一类从蛋白的磷酸化的酪氨 酸残基上除去磷酸基团的酶。包括蛋白酪氨酸磷酸酶的植物蛋白磷酸酶已经由Luan(2003 Annual Rev.Plant Biol.54 63-92)描述。除非另外指明，“拟南芥属”和“拟南芥”本文互换使用。“表达序列标签”(“EST”)是得自cDNA文库的DNA序列，并且因此是已 经被转录的序列。EST通常通过cDNA插入序列单程测序获取。将完整的cDNA插入序 列称为“全长插入序列”(“FIS”)。 “重叠群”序列是由选自但不限于EST、FIS和 PCR序列的两个或更多个序列装配成的序列。将编码完整或功能性蛋白的序列称为“完 全基因序列”(“CGS”)，该序列可得自FIS或重叠群。“农学特性”是可测量的参数，包括但不限于绿度、产量、生长速率、生物 量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮 量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种 子游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、 种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高、穗长、在低温胁迫下的早期幼苗活力和幼苗出苗率。“转基因”指其基因组因异源核酸(如重组DNA构建体)的存在而发生改变的 任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以 及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本文所用的术语“转 基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重 组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组 或染色体外基因组)改变。“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还 包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质粒)中的细胞器DNA。“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植株 的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞种子、悬浮培养物、胚、分生区 域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。“子代”包括植物的任何后续世代。“转基因植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。例如异源多核苷 酸被稳定地整合进基因组中，使得该多核苷酸传递至连续的世代。异源多核苷酸可单独 地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。针对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种， 则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用 并且是任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链RNA或DNA聚合 物。核苷酸(通常以它们的5'-单磷酸形式存在)通过如下它们的单个字母名称来指 代“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧 胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，
“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)， “K”表示G或T，“H”表示 A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸。“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨 基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基 酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多 肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基 化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的Y羧化、羟化和ADP-核糖基化。“信使RNA(mRNA) ”指无内含子并且可通过细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”指与mRNA模板互补并且利用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。 cDNA可为单链的或者可用DNA聚合成酶I的Klenow片段转化成双链形式。“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽；即已经去除了存在于初级翻译产物中 的任何前肽或原肽的多肽。“前体”蛋白质指mRNA的翻译初级产物；即具有仍然存在的前肽和原肽。前 肽和原肽可为并且不限于细胞内定位信号。“分离的”指物质，例如核酸和/或蛋白质，该物质基本上不含在天然存在的环 境中通常伴随该物质或与其反应的组分，或者说是该物质被从所述组分移出。分离的多核苷酸可从它们天然存在的宿主细胞中纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于 获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。“重组体”指(例如)通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片 段来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。“重组体”也包括指已经通过引入异 源核酸而进行了修饰的细胞或载体，或源于经这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖由天然 发生的事件(如自发突变、自然转化/转导/转座)对细胞或载体的改变，例如没有蓄意 人为干扰而发生的那些。“重组DNA构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因 此，重组DNA构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以 不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。术语“入门克隆”和“入门载体”本文可互换使用。“调控序列”指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编 码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。 调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。术语
“调控序列”和“调控元件”在本文中可互换使用。“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。“植物启动子功能”是能够控制植物细胞中的转录的启动子，无论其是否来源 于植物细胞。“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必 须专一地在一种组织或器官中表达，而是也可在一种特定细胞中表达的启动子。“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。术语“可操作地连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的 功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调节核酸片段的转录时，该启动 子与该核酸片段进行了可操作地连接。“表达”指功能产物的产生。因此，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(如 生成mRNA或功能RNA的转录)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。“表型”意指细胞或生物体的可检测的特征。有关将核酸片段(例如重组DNA构建体)插入细胞内的“导入”是指“转染” 或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中 核酸片段可整合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内，转变成自主 的复制子或瞬时表达(如转染的mRNA)。“转化细胞”是将核酸片段(如重组DNA构建体)导入其中的任何细胞。本文所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。“稳定转化”指将核酸片段导入宿主生物体的基因组中，导致基因稳定遗传。 一旦稳定转化，核酸片段稳定地整合进宿主生物体和任何连续世代的基因组中。“瞬时转化”指将核酸片段导入宿主生物体的核中或包含DNA的细胞器中，引 起基因表达而没有基因稳定遗传。“等位基因”是占据染色体上给定位点的基因的几种供选择形式的其中一种。 当二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因不 同，则该植物在该基因座处是杂合的。如果转基因存在于二倍体植物中一对同源染色体 中的其中之一上，则该植物在该基因座处是半合子的。“叶绿体转运肽”是与蛋白协同翻译并将蛋白导向叶绿体或在其中制备蛋白 的细胞中存在的其它质体类型。“叶绿体转运序列”指编码叶绿体转运肽的核苷酸 序列。“信号肽”是一种与蛋白协同翻译并将蛋白导向分泌器官体系的氨基酸序列 (Chrispeels, M. (1991) Ann.Rev.PlantPhys.Plant Mol.Biol.42 21-53)。如果将所述蛋白导 向液泡，可另外加上液泡靶向信号(同上)，或者如果将所述蛋白导向内质网，可加上内 质网驻留信号(同上)。如果将蛋白导向细胞核，将移除任何存在的信号肽并用以核定位 信号替代(Raikhel (1992)Plant Phys. 100 : 1627-1632)。 “线粒体信号肽”是引导前体蛋 白进入线粒体的氨基酸序列(Zhang 和 Glaser (2002) Trends Plant Sci 7 14-21)。序列比对和同一性百分比可用设计用于检测同源序列的多种比较方法来测 定，这些方法包括但不限于LASERGENE 生物信息计算包(DNASTAR Inc.， Madison, WI)的Megalign 程序。除非另外说明，本文提供的序列的多重比对用 Clustal V 比对方法(Higgins 和 Sharp, 1989，CABIOS.5 151-153)采用默认参数(空位 罚分=10，空位长度罚分=10)执行。用Clustal V方法进行成对比对和蛋白质序列的 同一性百分比计算的默认参数为KTUPLE = 1、空位罚分(GAP PENALTY) = 3、窗口 (WINDOW) = 5并且DIAGONALS SAVED = 5。而对于核酸，这些参数为KTUPLE = 2，空位罚分=5，窗口 = 4并且DIAGONALS SAVED = 4。用Clustal V程序比对序列 后，可通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“同一性百分比”和“趋异”值。 除非另外说明，本文提供的和申明的同一性百分比和趋异度是以该方式计算。本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中 有更全面的描述Sambrook, J., Fritsch, E.F.禾口 Maniatis, T., Molecular Cloning A Laboratory Manual ； Cold Spring HarborLaboratory Press Cold Spring Harbor, 1989 (下文 称为 “Sambrook”)。现在转向实施方案实施方案包括分离的多核苷酸和多肽、用于提供耐旱性的重组DNA构建体、包 含这些重组DNA构建体的组合物(例如植物或种子)，以及利用这些重组DNA构建体的 方法。分离的多核苷酸和多肽本发明包括如下分离的多核苷酸和多肽分离的多核苷酸，其包括(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽具有的氨基酸序 列基于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO: 17、21、25、34、36、37、40、41、43 或 44 进行比较时具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、 71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,或100%的序列同一性；或者(ii)⑴的核酸序列的全 长互补序列，其中所述全长互补序列和ω的核酸序列由相同数目的核苷酸组成并且是100%互补的。任一上述分离的多核苷酸可用于本发明的任何重组DNA构建体(包括抑 制DNA构建体)。所述多肽优选地是蛋白酪氨酸磷酸酶。分离的多肽，所述多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO: 17、21、25、34、36、37、40、41、43 或 44 进行比较时具有至少 50 %、51%、 52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、 64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、 76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%, 95%、96%、97%、98%、99%、或 100 %的序列同一性。所述多肽优选地是蛋白酪氨酸磷酸酶。分离的多核苷酸，其包括(i)基于Clustal V比对方法在与SEQ IDNO 16、 20、24、39 或 42 进行比较时具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、 69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,或100%的序列同一性的核酸序列；或 (ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。任一上述分离的多核苷酸可用于本发明的任何重组 DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。分离的多核苷酸优选地编码蛋白酪氨酸磷酸酶。重组DNA构津体和抑制DNA构津体在一个方面，本发明包括重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。在一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列 (如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括ω核酸序列， 所述核酸序列编码的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO: 17、21、25、 34、36、37、40、41、43 或 44 进行比较时具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、 67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100% 的序列同一性；或 (ii) G)的核酸序列的全长互补序列。在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列 (如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括ω核酸序列， 所述核酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO : 16、20、24、39或42进行比较 时具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 56 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%, 98%, 99%或100%的序列同一性；或(ii) (i)的核酸序列的全长互补序列。在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序 列(如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码蛋白酪氨酸 磷酸酶。蛋白酪氨酸磷酸酶可来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、烟豆(Glycine tabacina)、野大豆(Glycine soja)禾口 短绒野大豆 (Glycinetomentella)。在另一方面，本发明包括抑制DNA构建体。抑制DNA构建体可包含至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)， 该调控序列可操作地连接至(a)以下序列的全部或部分ω编码多肽的核酸序列， 所述多肽具有的氨基酸序列基于ClustalV比对方法在与SEQ IDNO 17、21、25、34、 36、37、40、41、43 或 44进行比较时具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、 68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、
8081 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,或 100% 的序列同一性，或者(ii) (a) (i)的核酸序列的全长互补序列；或者(b)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的区 域，所述区域具有的核酸序列基于Clustal V比对方法在与所述区域所来源的有义链或反 义链的全部或部分进行比较时具有至少50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、 69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、
8182 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%的序列同一性，并且其中所述所关 注的靶基因编码蛋白酪氨酸磷酸酶；或(C)以下序列的全部或部分(i)核酸序列，所述 核酸序列基于ClustalV比对方法在与SEQ ID NO : 16、20、24、39或42进行比较时具有 至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 56%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%%, 9、68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%, 99%或100%的序列同一性，或(ii) (c) (i)的核酸序列的全长互补序列。抑制DNA 构建体可包含共抑制构建体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制构建体、茎环抑 制构建体、产生双链RNA的构建体、RNAi构建体或小RNA构建体(如，siRNA构建体 或miRNA构建体)。应当理解(正如本领域技术人员将会理解的)，本发明不仅仅涵盖这些具体的示 例性序列。导致给定位点处产生化学上等价的氨基酸但不影响所编码多肽的功能特性的 核酸片段中的改变是本领域众所周知的。因此，氨基酸丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的 密码子可被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨 酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一 个带负电荷的残基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基替换为另一个 带正电荷的残基(例如，赖氨酸替换精氨酸)的改变也可预期产生功能上等价的产物。导 致多肽分子的N-末端和C-末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变多肽的活性。 所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定所编码的产物的生物活性 的保留。“抑制DNA构建体”是在转化或稳定整合进植物基因组时，导致该植物中的靶基因“沉默”的重组DNA构建体。对该植物来说，该靶基因可为内源性的或是转基因 的。如本文针对靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表达的mRNA或蛋白质/ 酶的水平上的抑制，和/或在酶活性或蛋白质功能性的水平上的抑制。本文中可交换使 用的术语“抑制”、“抑制性”以及“沉默”包括降低、减少、减退、减小、抑制、消 除或防止。“沉默”或“基因沉默”不确定机理并且包括但不限于反义、共抑制、病 毒_抑制、发夹抑制、茎_环抑制、基于RNAi的方法以及基于小RNAi的方法。抑制DNA构建体可包含源自所关注的靶基因的区域并且可包含所关注的靶基 因的有义链(或反义链)的核酸序列的全部或部分。取决于所要利用的方法，该区域可 与所关注基因的有义链(或反义链)的全部或部分100%相同或者具有少于100%同一性 的同一性(如，具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、 71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、 83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%, 96%, 97%, 98%,或 99%的同一性)。抑制DNA构建体是本领域所熟知的，一旦选定所关注的靶基因就很容易构建， 并且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒-抑制构建体、发夹抑制构建体、 茎-环抑制构建体、产生双链RNA的构建体，以及更通常的是，RNAi (RNA干扰)构建 体和小RNA构建体，例如SiRNA(短干扰RNA)构建体和miRNA(微RNA)构建体。“反义抑制”指产生能够抑制靶基因或基因产物表达的反义RNA转录物。“反 义RNA”指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补，并阻断分离的靶核酸片段表达 的RNA转录物(美国专利号5,107,065)。反义RNA可与特定基因转录物的任何部分， 即5'非编码序列、3'非编码序列、内含子或编码序列互补。“共抑制”指产生能够抑制靶基因或基因产物表达的有义RNA转录物。“有 义” RNA指包括mRNA并且可在细胞内或体外翻译成蛋白质的RNA转录物。此前，已 通过着眼于以有义方向过表达与内源mRNA具有同源性的核酸序列(其导致与过表达的 序列具有同源性的所有RNA减少)设计出了植物中的共抑制构建体(参见Vaucheret等 人，Plant J., 16: 651-659(1998)；以及 Gura，Nature 404 804-808(2000))。另一种变型描述了将植物病毒序列用于引导对近端mRNA编码序列的抑制(于 1998年8月20日公开的PCT公开WO 98/36083)。RNA干扰是指由短干扰性RNA(SiRNA)介导的动物中序列特异性转录后基因沉 默的过程(Fire等人，Nature 391 806 1998)。在植物中的对应过程通常称为转录后基因 沉默(PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中也称为阻抑作用(quelling)。据信转录后基因 沉默过程是用于防止外来基因表达的进化保守性细胞防御机制，并且通常由不同植物区 系和门所共有(Fire 等人，Trends Genet. 15 358 (1999))。小RNA在控制基因表达中起重要作用。很多发育过程(包括开花)的调节是由 小RNA控制的。现在有可能通过使用在植物中产生小RNA的转基因构建体来以工程手 段改变植物基因的基因表达。小RNA似乎是通过与互补RNA或DNA靶序列碱基配对来行使功能的。当与 RNA结合时，小RNA或者引发靶序列的RNA裂解或者引发翻译抑制。当与DNA靶序列结合时，据信小RNA可介导靶序列的DNA甲基化。无论具体机制是什么，这些事件 的后果是基因表达受到抑制。微RNA (miRNA)是长度为约19至约24个核苷酸(nt)的已经在动物和植物中鉴 定出的非编码 RNACLagos-Quintana 等人，Science2M 853-858 2001, Lagos-Quintana 等人，Curr.Biol.12 735-739(2002) ； Lau 等人，Science 294 858-862(2001) ； Lee 和 Ambros, Science294 862-864(2001) ； Llave 等人，Plant Cell 14 1605-1619(2002)； Mourelatos 等人，Genes.Dev.16: 720-728 (2002) ； Park 等人，Curr.Biol.12 1484-1495(2002) ； Reinhart 等人，Genes.Dev.16 1616-1626(2002))。它们是由大小为 大约70至200nt的较长的前体转录物加工生成的，并且这些前体转录物能够形成稳定的 发夹结构。微RNA(miRNA)看起来通过与位于由这些基因产生的转录物中的互补序列结合 来调节靶基因。看起来有可能miRNA可进入至少两条靶基因调控途径(1)翻译抑制； 和(2) RNA裂解。进入RNA裂解途径的微RNA类似于在动物中的RNA干涉作用(RNAi) 和植物中的转录后基因沉默(PTGS)期间生成的21-25nt的短干涉RNA(SiRNA)，并且可 能掺入了 RNA诱导沉默复合物(RISC)，该复合物与RNAi相似或相同。调控序列本发明的重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)可包含至少一种调控序列。调控序列可为启动子。多种启动子可用于本发明的重组DNA构建体中。可根据所需结果来选择启动 子，并且可包括用于在宿主生物体中表达的组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型 启动子或其他启动子。一般将引起基因在多数细胞类型中在多数情况下表达的启动子称为“组成型启 动子”。虽然候选基因当通过组成型启动子驱动表达时可预测其效应，但候选基因在35S 或UBI启动子控制下的高水平、组成型表达可具有多重效应。使用组织特异和/或胁迫 特异启动子可消除不需要的效应但保留耐旱性的能力。在拟南芥属中已经观察到了该效 应(Kasuga 等人(1999) Nature Biotechnol. 17 287-91)；适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括(例如)Rsyn7启动子的核心启动子和 在WO 99/43838和美国专利6,072,050中公开的其他组成型启动子；CaMV 35S核心启 动子(Odell 等人，Nature 313 810-812(1985))；稻肌动蛋白(McElroy 等人，Plant Cell 2 163-171(1990))；泛素启动子(Christensen 等人，Plant Mol.Biol.12 619-632(1989) 和 Christensen 等人，Plant Mol.Biol. 18 675-689(1992)) ； pEMU(Last 等人，Theor.Appl. Genet.81 581-588(1991)) ； MAS (Velten 等人，EMBO J.3 2723-2730(1984)) ； ALS 启动子(美国专利5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如在美国专利5,608,149、 5,608,144, 5,604,121, 5,569,597, 5,466,785, 5,399,680, 5,268,463, 5,608,142 禾P 6,177,611中公开的那些启动子。在选择启动子用于本发明方法时，可能有利的是使用组织特异性启动子或发育 调节启动子。组织特异性启动子或发育调节启动子是这样的DNA序列，其调节DNA序列选择性地在对雄穗发育、结籽或两者重要的植物细胞/组织中表达，并限制这种DNA序列 只在植物的雄穗发育或种子成熟期间表达。任何引起所需时空表达的可鉴定启动子均可 用于本发明的方法中。种子或胚特异性的并且可用于本发明的启动子包括大豆Kunitz胰蛋白酶抑制 剂(Kti3，Jofuku 和 Goldberg，Plant Cell 1 1079-1093 (1989))、patatin (马铃薯块茎) (Rocha-Sosa, Μ.等人，1989，EMBOJ.8 23-29)、convicilin、豌豆球蛋白和豆球蛋 白(豌豆子叶)(Rerie，W.G.等人，1991，Mol.Gen.Genet.259 149-157 ； Newbigin, E.J.等人，1990，Planta 180 461-470 ； Higgins, T.J.V.等人，1988，Plant.Mol. Biol.ll 683-695)、玉米蛋白(玉米胚乳)(Schemthaner，J.P.等人，1988，EMBO J.7 1249_1255)、菜豆蛋白(菜豆子叶)(Segupta-Gopalan，C.等人，I985，Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.82 3320-3324)、植物血球凝集素(菜豆子叶)(Voelker，Τ.等人，1987， EMBO J.6 3571-3577)、B-伴球蛋白和大豆球蛋白(大豆子叶)(Chen，Z_L等人， 1988，EMBOJ.7 297-302)、谷蛋白(稻胚乳)、大麦醇溶蛋白(大麦胚乳)(Marris， C.等人，1988，Plant Mol.Biol. 10 359-366)、麦谷蛋白和麦醇溶蛋白(小麦胚乳) (Colot, V.等人，1987，EMBO J.6 3559-3564)和甘薯贮藏蛋白(sporamin)(甘薯块 根)(Hattori，Τ.等人，1990，Plant Mol.Biol. 14 595-604) 可操作地连接至嵌合基 因构建体异源编码区的种子特异性基因的启动子在转基因植物中保持它们的时空表达 模式。这样的实施例包括在拟南芥和甘蓝型油菜(Brassica napus)种子中表达脑啡肽 的拟南芥属2S种子储藏蛋白基因启动子(Vanderkerckhove等人，Bio/Technology 7 L929-932(1989))、表达荧光素酶的菜豆凝集素和β -菜豆蛋白启动子(Riggs等人，Plant Sci.63 47-57(1989))，以及表达氯霉素乙酰转移酶的小麦谷蛋白启动子(Colot等人， EMBO J6 3559-3564(1987))。可诱导启动子响应内源性或外源性刺激的存在，例如，通过化合物(化学诱导 剂)，或响应环境、激素、化学信号和/或发育信号而选择性表达可操纵连接的DNA序 列。可诱导的或受调控的启动子包括(例如)受光、热、胁迫、水涝或干旱、植物激素、 创伤或诸如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂之类的化学品调控的启动子。用于本发明的启动子包括以下启动子1)胁迫诱导型RD29A启动子(Kasuga等 人，1999，Nature Biotechnol.l7 287-91) ； 2)大麦启动子 B22E; B22E 的表达是发育 中的玉米籽粒中的柄所特异性的(“Primary Structure of a Novel Barley Gene Differentially Expressed inlmmature Aleurone Layers(在未成熟糊粉层中差异表达的新大麦基因的一级结 构)”。Klemsdal, S.S.等人，Mol.Gen.Genet.228(1/2) 9-16(1991))；和 3)玉米启 动子，Zag2 ( “ Identification and molecularcharacterization of ZAG1, the maize homolog of the Arabidopsis floralhomeotic gene AGAMOUS " , Schmidt, R.J.等人，Plant Cell 5 (7) 729-737 (1993) ； "Structural characterization, chromosomal localizationand phylogenetic evaluation of two pairs of AGAMOUS-Iike MADS-boxgenes from maize”， Theissen 等人， Gene 156(2) 155-166(1995) ； NCBI GenBank 登录号 X8O2O6))。Zag2 转录物可在授粉 前5天至授粉后(DAP)7至8天被检测到，并且引导Ciml在发育中的雌花序的心皮中表 达，Ciml对发育中的玉米籽粒的籽仁而言是特异性的。Ciml转录物在授粉前4至5天至 授粉后6至8天被检测到。其他可用的启动子包括可源自其表达与发育中的雌小花母系相关的基因的任何启动子。用于调控本发明的核苷酸序列在植物中表达的启动子是茎特异性启动子。这种 茎特异性启动子包括苜蓿S2A启动子(GenBank登录号EF030816 ； Abrahams等人， Plant Mol.Biol.27 513-528(1995))和 S2B 启动子(GenBank 登录号EF030817)等等， 这些文献以引用的方式并入本文。启动子可以整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元 件组成，或者甚至包括合成的DNA片段。用于本发明的启动子可包括以下启动子RIP2、mLIP15、ZmCORU Rabl7、 CaMV 35S、RD29A、B22E、Zag2、SAM 合成酶、泛素、CaMV19S、nos、Adh>
蔗糖合成酶、R-等位基因、维管组织优选启动子S2A(Genbank登录号EF030816)和 S2B(Genbank登录号EF030817)及来自玉米的组成型启动子GOS2。其他启动子包括根优 选的启动子，例如玉米NAS2启动子、玉米Cyclo启动子(US 2006/0156439，公开于2006 年7月13日)、玉米ROOTMET2启动子(W005063998，公开于2005年7月14日)、 CRlBIO 启动子(W006055487，公开于 2006 年 5 月 26 日)、CRWAQ81 (W005035770, 公开于2005年4月21日)和玉米ZRP2.47启动子(NCBI登录号U38790 ； GI No. 1063664)、本发明的重组DNA构建体也可包括其他调控序列，包括但不限于翻译前导序 列、内含子和多腺苷酸化识别序列。在本发明的另一个实施方案中，本发明的重组DNA 构建体还包括增强子或沉默子。内含子序列可加至5’非翻译区、蛋白编码区或3’非翻译区以增加积聚在 胞浆中的成熟信息的量。已经显示，在植物和动物两者的表达构建体的转录单位中 包含可剪接内含子可使基因表达在mRNA和蛋白质水平上均增强高达1000倍。参 见 Buchman 和 Berg, Mol.Cell Biol.8 4395-4405(1988) ； Callis 等人，Genes Dev.l 1183-1200(1987)。任何植物都可以选择用来鉴定将用于本发明重组DNA构建体的调控序列和蛋 白酪氨酸磷酸酶基因。适用于分离基因和调控序列的靶植物的实例应该包括但不限于苜 蓿、苹果、杏、拟南芥属、洋蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆类、甜菜、黑 莓、蓝莓、西兰花、抱子甘蓝、卷心菜、卡诺拉、香瓜、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、 芹菜、樱桃、菊苣、芫荽、柑桔类、克莱门氏小柑橘类、三叶草、椰子、咖啡、玉米、 棉、蔓越莓、黄瓜、花旗松、茄子、菊苣、茅菜、桉树、茴香、无花果、大蒜、葫芦、 葡萄、柚子树、白兰瓜、豆薯、猕猴桃、生菜、韭葱、柠檬、酸橙、火炬松、亚麻子、 芒果、甜瓜、蘑菇、油桃、坚果、燕麦、油棕、油菜、秋葵、橄榄树、洋葱、橙、观赏 植物、棕榈、木瓜树、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃树、花生、梨树、胡椒、柿树、松 树、菠萝、大蕉、李树、石榴树、白杨、马铃薯、南瓜、温柏、辐射松、红菊苣、萝
卜、油菜、树莓、稻、黑麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、 向日葵、甘薯、枫香树、柑橘、茶、烟草、蕃茄、黑小麦、草皮草、芜菁、葡萄树、西 瓜、小麦、薯蓣和西葫芦。组合物本发明的组合物是其基因组中包含本发明的任何重组DNA构建体(包括任何抑制DNA构建体)(例如上面所讨论的任何一种构建体)的植物。组合物也包括任何植物 的子代，以及获取自植物或其子代的任何种子，其中所述子代或种子在其基因组中包含 重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)。子代包括通过植物的自花授粉或异型杂交而 获得的连续世代。子代也包括杂交种和自交系。在杂交种子繁殖的农作物中，成熟的转基因植物可自花授粉而产生纯合的自交 系植物。该自交系植物产生含有新导入的重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的种 子。这些种子可生长而产生将会表现出改变的农学特性(例如，任选地在水限制条件下 农学特性增加)的植物，或者可用于育种程序以产生杂交种子，这些杂交种子可生长而 产生将会表现出如改变的农学特性的植物。所述种子可为玉米种子。植物可为单子叶植物或双子叶植物，例如玉米或大豆植物，如玉米杂种植物或 玉米自交系植物。植物还可为向日葵、高梁、卡诺拉(canola)、小麦、苜蓿、棉花、水 稻、大麦或黍。重组DNA构建体可稳定地整合进植物的基因组中。实施方案尤其包括但不限于以下实施方案1.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米或大豆植物)，所述重组 DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多 肽，所述多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO: 15、17、19、 21、 23、 25、 27、 28、 29、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 40、 41、 43、 44、 45、 46、 47、 48、49 和 50 进行比较时具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、 82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%的序列同一性，并且其中所述植物在与不 包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的耐旱性。在与该对照植物 比较时，该植物还可表现出至少一种农学特性的改变。2.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米或大豆植物)，该重组 DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码蛋 白酪氨酸磷酸酶，并且其中在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时，所述植 物表现出增加的耐旱性。在与该对照植物比较时，该植物还可表现出至少一种农学特性 的改变。3.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(在例如玉米或大豆植物)，该重组 DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码蛋 白酪氨酸磷酸酶，并且其中在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，所 述植物表现出至少一种农学特性的改变。4.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米或大豆植物)，所述重组 DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多 肽，所述多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO: 15、17、19、 21、 23、 25、 27、 28、 29、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 40、 41、 43、 44、 45、 46、 47、 48、49 和 50 进行比较时具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%,58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%的序列同一性，并且其中所述植物在与不 包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。5.在基因组中包含抑制DNA构建体的植物(例如玉米或大豆植物)，所述抑 制DNA构建体包含至少一种可操作地连接至源自所关注的靶基因的有义链或反义链的 全部或部分的区域的调控元件，所述区域具有的核酸序列基于Clustal V比对方法在与所 述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分进行比较时具有至少50%、51%, 52%, 53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、 65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、 77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%的序列 同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码蛋白酪氨酸磷酸酶，并且其中在与不包含所 述抑制DNA构建体的对照植物进行比较时，所述植物表现出至少一种农学特性的改变。6.在基因组中包含抑制DNA构建体的植物(例如玉米或大豆植物)，所述抑 制DNA构建体包含至少一个可操作地连接以下序列的全部或部分的调控元件(a)编码 多肽的核酸序列，所述多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO 15、 17、 19、 21、 23、 25、 27、 28、 29、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 40、 41、 43、 44、 45、46、47、48、49 和 50 进行比较时具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、 68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%的序列同一性，或者(b) (a) 的核酸序列的全长互补序列，并且其中在与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物进行 比较时，所述植物表现出至少一种农学特性的改变。7.上述实施方案1-6中的植物的任何子代、上述实施方案1-6中的植物的任何种 子、上述实施方案1-6中的植物的子代的任何种子以及来自上述实施方案1-6中的植物以 及它们的子代的细胞。在上述实施方案1-7或本发明的任一其他实施方案中的任一项中，蛋白酪氨酸 磷酸酶可来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zeamays)、大豆(Glycine max)、烟豆 (Glycine tabacina)、里予大豆(Glycinesoja)或短绒里予大豆(Glycine tomentella)。在上述实施方案1-7或本发明的任一其他实施方案中的任一项中，重组DNA构 建体(或抑制DNA构建体)可包含至少一种在植物中有功能的启动子作为调控序列。在上述实施方案1-7或本发明的任一其他实施方案中的任一项中，至少一种农 学特性的改变是增加或减少。在任一前述的实施方案1-7或本发明的任一其他实施方案中，至少一种农学特 性可选自绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产 量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织中的含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸 含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、 耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高、穗长、在低温胁迫下 的早期幼苗活力和幼苗出苗率。例如，至少一种农学特性的改变可为产量、绿度或生物 量的增加。在任一上述实施方案1-7或本发明的任一其他实施方案中，在与不包含所述重 组DNA构建体(或所述抑制DNA构建体)的对照植物在水限制条件下进行比较时，植物 可表现出至少一种农学特性的改变。“干旱”指植物可利用的水不足，尤其是当时间延长时，能够引起植物损伤或 阻止其正常发育(例如限制植物生长或种子产量)。“耐旱性”指植物在干旱条件下存活较长时间并且基本上不表现出生理或物理 退化的特性。植物的“耐旱性增加”相对于参比植物或对照植物进行测量，它是植物在干旱 条件下存活较长时间，并且相对于在相似干旱条件下生长的参比或对照植物基本上不表 现出相同程度的生理或物理退化的特性。通常当转基因植物在其基因组中包含重组DNA 构建体或抑制DNA构建体时，它相对于参比或对照植物表现出增加的耐旱性，所述参比 或对照植物在其基因组中不包含重组DNA构建体或抑制DNA构建体。本领域的普通技术人员熟悉模拟干旱条件并评价植物耐旱性的规程，所述植物 已经遭受了模拟的或天然存在的干旱条件。例如，技术人员可通过向植物提供比正常需 求较少的水或在一定时期内不提供水来模拟干旱条件，并且技术人员可通过寻找在生理 和/或物理条件上的差异来评价耐旱性，包括但不限于活力、生长、大小、或根长、或 具体地讲叶片颜色或叶片面积大小。用于评价耐旱性的其他技术包括测量叶绿素荧光、 光合作用速率和换气速率。干旱胁迫实验可涉及慢性胁迫(即缓慢干燥)和/或可涉及两种急性胁迫(即突 然除去水)，它们由一天或两次恢复分开。慢性胁迫可持续8-10天。急性胁迫可持续 3-5天。在对转基因植物和相应对照植物进行干旱胁迫以及良好灌溉处理期间可测量以下
变量变量“％面积也§_慢性开始-急性2”是介于慢性胁迫第一天和第二次急性胁 迫那一天之间的、通过远可见光谱成像测定的总面积百分比变化的量度变量“％面积也§_慢性开始-慢性结束”是介于慢性胁迫第一天和慢性胁迫最 后一天之间的、通过远可见光谱成像测定的总面积百分比变化的量度变量“％面积也§_慢性开始收获”是介于慢性胁迫第一天和收获那一天之间 的、通过远可见光谱成像测定的总面积百分比变化的量度变量“％面积chgjg性开始-恢复24小时”是介于慢性胁迫第一天和恢复24 小时(急性胁迫2之后24小时)之间的、通过远可见光谱成像测定的总面积百分比变化
的量度变量“psii_急性1”是在第一次急性胁迫末期的光系统II(PSII)效率的量度。 它提供对PSII天线吸光效率的评估，并且直接涉及叶片内部的二氧化碳同化。变量“psii_急性2”是在第二次急性胁迫末期的光系统II(PSII)效率的量度。它提供对PSII天线吸光效率的评估，并且直接涉及叶片内部的二氧化碳同化。变量“fv/fm_急性1”是在第一次急性胁迫末期的最佳量子产率(Fv/Fm)的量 度_(最大和最小荧光之间的可变荧光差值/最大荧光)变量“fv/fm_急性2”是在第二次急性胁迫末期的最佳量子产率(Fv/Fm)的量 度_(最大和最小荧光之间的可变荧光差值/最大荧光)变量“叶片卷曲_收获”是在收获日的顶部图像对侧面图像的比率的量度。变量“叶片卷曲_恢复24小时”是恢复24小时顶部图像对侧面图像的比率的量度。变量“比生长速率(SGR) ”指植物总表面积经过单独一天的变化(通过Lemna Tec Instrument 测量)(Y (t) = Y0*ert)。Y (t) = Y0*ert 等同于在 Y/ Δ t 中的 ％变化，其 中的单个术语如下所述Y(t)=在t时的总表面积；YO=初始总表面积(估计的)；r = 比生长速率天―1，并且t=种植后的天数(“DAP” )变量“苗干重”是将苗置于104°C烘箱96小时后的苗重量的量度变量“苗鲜重”是从植物切除后立即称重的苗重量的量度下文实例描述一些用于模拟干旱条件和/或评价耐旱性的代表性规程和技术。也可通过在田间测试中比较植物在模拟的或天然存在的干旱条件下(例如通过 测量与非干旱条件下相比，在干旱条件下基本等同的产量，或测量与对照或参比植物相 比，在干旱条件下更少的产量损失)保持足够产量(至少75%、76%, 77%、78%, 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%产量)的能力来评价 耐旱性。在评估或测量其中利用了对照或参照植物的本发明任何实施方案(如，如本文 描述的组合物或方法)中的转基因植物的农学特性或表型时，本领域的普通技术人员将 很容易认识到要利用的合适对照植物。例如，通过如下非限制性示例来说明1.转化的植物的子代，该植物对于重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)来说 是半合子的，使得该子代分离成包含或不包含该DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植 株包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代将通常相对于不包含该重组 DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代来进行测量(即，不包含该重组DNA构建体 (或抑制DNA构建体)的子代是对照或参照植株)。2.重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)基因掺入至自交系中，例如在玉米 中，或基因掺入进变体中，例如在大豆中基因掺入品系将通常相对于亲本自交系或变 种品系进行测量(即，亲本自交系或变种品系是对照或参照植物)。3.双杂交系，其中第一杂交系由两个亲本自交系产生，而第二杂交系由相同的 两个亲本自交系产生，不同的是其中一个亲本自交系含有重组DNA构建体(或抑制DNA 构建体)第二杂交系通常将相对于第一杂交系进行测量(即第一杂交系为对照植物或参 照植物)。4.包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植株该植株可相对于这 样的对照植株进行评估或测量，该对照植株不包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建 体)，但具有与该植株相当的遗传背景(例如，与包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植株相比较，核遗传物质具有至少90%、91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%的序列同一性)。存在许多可用于分析、比较和表征植 物遗传背景的基于实验室的技术；其中这些技术是同工酶电泳、限制性片段长度多态性 (RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、任何引物聚合成酶链反应(AP-PCR)、DNA扩 增指纹(DAF)、序列特异扩增区域(SCAR)、扩增片段长度多态性(AFLP )和也称为 微卫星的简单序列重复(SSR)。此外，本领域的普通技术人员将容易认识到，评估或测量转基因植物的农学特 性或表型时合适的对照或参照植物将不包括先前已经针对所需的农学特性或表型，通过 诱变或转化而选择的植物。方法方法包括但不限于用于提高植物耐旱性的方法、用于评价植物耐旱性的方 法、用于改变植物农学特性的方法、用于测定植物农学特性改变的方法、和用于制备种 子的方法。所述植物可为单子叶或双子叶植物，例如玉米或大豆植物。植物还可为向日 葵、高梁、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦或黍。所述种子可为玉米或大豆种 子，例如玉米杂交种子或玉米自交系种子。方法包括但不限于如下方法用于转化细胞的方法包括用本发明的任何分离的多核苷酸转化细胞。也包括通 过这种方法转化的细胞。在具体实施方案中，所述细胞是真核细胞，例如酵母、昆虫或 植物细胞，或原核，例如细菌。生产转基因植物的方法包括用本发明的任何分离的多核苷酸或重组DNA构建体 来转化植物细胞并从转化过的植物细胞中再生转基因植物。本发明也涉及由该方法制备 的转基因植物，以及从该转基因植物中获取的转基因种子。用于从细胞或细胞培养基中分离本发明的多肽的方法，其中所述细胞包含重组 DNA构建体，所述DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的本发明的多核苷 酸，并且其中所述转化过的宿主细胞在适于重组DNA构建体表达的条件下生长。改变本发明多肽在宿主细胞中的表达水平的方法包括(a)用本发明的重组 DNA构建体来转化宿主细胞；以及(b)使转化过的细胞在适于表达所述重组DNA构建体 的条件下生长，其中重组DNA构建体的表达导致转化过的宿主细胞中产生的本发明多肽 水平的改变。增加植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生 的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(例如在植物 中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有的氨基酸 序列基于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO 15、17、19、21、23、25、27、28、29、 33、34、35、36、37、38、40、41、43、44、45、46、47、48、49 和 50 进行比较时具有 至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 56%, 62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、 74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%, 99%或100%的序列同一性；和(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与 不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的耐旱性。所述方法可进 一步包括(C)获得源自该转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重 组DNA构建体并且在与不包含该重组DNA构建体的对照植物比较时表现出增加的耐旱 性。增加植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)将抑制DNA构建体引入到可再 生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如在植物中有功能 的启动子)，所述调控序列可操作地连接以下序列的全部或部分(i)编码多肽的核酸序 列，所述多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO: 15、17、19、 21、 23、 25、 27、 28、 29、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 40、 41、 43、 44、 45、 46、 47、 48、49 和 50 进行比较时具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100% 的序列同一性，或者(ii) (a) (i)的核酸序 列的全长互补序列；和(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物， 其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体并且在与不包含该抑制DNA构 建体的对照植物进行比较时表现出增加的耐旱性。所述方法可进一步包括(C)获得源自 该转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含抑制DNA构建体并且在 与不包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时表现出增加的耐旱性。增加植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)将抑制DNA构建体引入到可再生 的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如在植物中有功能的 启动子)，所述调控序列可操作地连接源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或 部分的区域，所述区域的核酸序列基于Clustal V比对方法在与所述区域所来源的有义链 或反义链的全部或部分比较时具有至少50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、 69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%的序列同一性，并且其中所述所关 注的靶基因编码蛋白酪氨酸磷酸酶；和(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生 出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体并且在与不包含 该抑制DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的耐旱性。所述方法可进一步包括 (C)获得源自该转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含抑制DNA 构建体并且在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时表现出增加的耐旱性。评价植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生 的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(例如在植物 中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有的氨基酸 序列基于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO 15、17、19、21、23、25、27、28、29、 33、34、35、36、37、38、40、41、43、44、45、46、47、48、49 和 50 进行比较时具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 56%,
626364656667686970 717273747576777879808182 838485868788899091929394 95969798%,99%或100%的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生
出转基因植物，其中所述转基因植物在基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)评 价该转基因植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时的耐旱性。该方法 可进一步包括(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中 包含该重组DNA构建体；以及(e)评价该子代植物在与不包含该重组DNA构建体的对 照植物进行比较时的耐旱性。评价植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)将抑制DNA构建体引入到可再 生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如在植物中有功能 的启动子)，所述调控序列可操作地连接以下序列的全部或部分(i)编码多肽的核酸序 列，所述多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO: 15、17、19、 21、 23、 25、 27、 28、 29、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 40、 41、 43、 44、 45、 46、 47、 48、49 和 50 进行比较时具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、 82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%的序列同一性，或者(ii) (a) (i)的核酸序 列的全长互补序列；(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生转基因植物，其 中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(c)评价该转基因植物在与 不包含该抑制DNA构建体的对照植物进行比较时的耐旱性；该方法可进一步包括(d) 获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建 体；以及(e)评价该子代植物在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物进行比较时的耐 旱性。评价植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)将抑制DNA构建体引入到可再生 的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动 子)，该调控序列可操作地连接至来源于所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部 分的区域，所述区域具有的核酸序列基于Clustal V比对方法在与所述区域所来源的有义 链或反义链的全部或部分进行比较时具有至少50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、 68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%的序列同一性，并且其中所 述所关注的靶基因编码蛋白酪氨酸磷酸酶；(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞 再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(c) 评价该转基因植物在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物进行比较时的耐旱性；该方 法可进一步包括(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(e)评价该子代植物在与不包含该抑制DNA构建体的 对照植物进行比较时的耐旱性。评价植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生 的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(例如在植物 中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有的氨基酸 序列基于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO 15、17、19、21、23、25、27、28、29、 33、34、35、36、37、38、40、41、43、44、45、46、47、48、49 和 50 进行比较时具有 至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 56%, 62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、 74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%, 99%或100%的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生 出转基因植物，其中所述转基因植物在基因组中包含所述重组DNA构建体；(C)获得源 自所述转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体； 以及(d)评价该子代植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时的耐旱 性。评估植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)将抑制DNA构建体引入到可再 生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如在植物中有功能 的启动子)，所述调控序列可操作地连接以下序列的全部或部分(i)编码多肽的核酸序 列，所述多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO: 15、17、19、 21、 23、 25、 27、 28、 29、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 40、 41、 43、 44、 45、 46、 47、 48、49 和 50 进行比较时具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%的序列同一性，或者(ii) (a) (i)的核酸序 列的全长互补序列；(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其 中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的 子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(d)评价该子代 植物在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物进行比较时的耐旱性。评价植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)将抑制DNA构建体引入到可再生 的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动 子)，该调控序列可操作地连接至来源于所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部 分的区域，所述区域具有的核酸序列基于Clustal V比对方法在与所述区域所来源的有义 链或反义链的全部或部分进行比较时具有至少50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、 68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码蛋白酪氨酸磷酸酶；(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞 再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；(C)获得 源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体； 以及(d)评价该子代植物在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物进行比较时的耐旱 性。测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体引入到 可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(例 如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有 的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO 15、17、19、21、23、25、27、 28、29、33、34、35、36、37、38、40、41、43、44、45、46、47、48、49 和 50 进行 比较时具有至少 50%、51%、52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、 72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96%, 97%, 98%, 99%或100%的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的 植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在基因组中包含所述重组DNA构建 体；以及(C)测定所述转基因植物任选地在水限制条件下与不包含所述重组DNA构建体 的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。该方法可进一步包括(d)获 得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建 体；以及(e)测定所述子代植物任选地在水限制条件下与不包含所述重组DNA构建体的 对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括(a)将抑制DNA构建体引入到 可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如在植物中有 功能的启动子)，所述调控序列可操作地连接以下序列的全部或部分(i)编码多肽的核 酸序列，所述多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO: 15、17、 19、 21、 23、 25、 27、 28、 29、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 40、 41、 43、 44、 45、 46、 47、48、49 和 50 进行比较时具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80
81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%的序列同一性，或者(ii) (i)的核酸 序列的全长互补序列；(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物， 其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(c)测定所述转基因植物 任选地在水限制条件下与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少 一种农学特性的改变。该方法可进一步包括(d)获得源自该转基因植物的子代植物， 其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(e)测定所述子代植物任选 地在水限制条件下与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种 农学特性的改变。测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如在植物中有功 能的启动子)，所述调控序列可操作地连接源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全 部或部分的区域，所述区域具有的核酸序列基于Clustal V比对方法在与所述区域所来源 的有义链或反义链的全部或部分进行比较时具有至少50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、 67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%的序列同一性，并且 其中所述所关注的靶基因编码蛋白酪氨酸磷酸酶；(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植 物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以 及(C)测定所述转基因植物任选地在水限制条件下与不包含所述抑制DNA构建体的对照 植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。该方法可进一步包括(d)获得源自 该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及 (e)测定所述子代植物任选地在水限制条件下与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物 比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。 测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体引入到 可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(例 如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有 的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO 15、17、19、21、23、25、27、 28、29、33、34、35、36、37、38、40、41、43、44、45、46、47、48、49 和 50 进行 比较时具有至少 50%、51%、52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%,
605662 %、63 64656667 6869 %、70 %、71727374 %、75 76777879 8081 %、82 %、83848586 %、87 88899091 9293 %、94 %、9596%,97%,98%,99%或100%的序列同-一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的
植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在基因组中包含所述重组DNA构建 体；(C)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组 DNA构建体；以及(d)测定所述子代植物任选地在水限制条件下与不包含所述重组DNA 构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。 测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括(a)将抑制DNA构建体引入到 可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如在植物中有 功能的启动子)，所述调控序列可操作地连接以下序列的全部或部分(i)编码多肽的核 酸序列，所述多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO: 15、17、 19、 21、 23、 25、 27、 28、 29、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 40、 41、 43、 44、 45、 46、 47、48、49 和 50 进行比较时具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、 69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%的序列同一性，或者(ii)⑴的核酸序列的全长互补序列；(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物， 其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；(C)获得源自所述转基因植物 的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(d)测定所述 子代植物任选地在水限制条件下与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表 现出至少一种农学特性的改变。测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括(a)将抑制DNA构建体引入到 可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如在植物中有功 能的启动子)，所述调控序列可操作地连接源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全 部或部分的区域，所述区域具有的核酸序列基于Clustal V比对方法在与所述区域所来源 的有义链或反义链的全部或部分进行比较时具有至少50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、 67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 %或 100% 的序列同一性，并 且其中所述所关注的靶基因编码蛋白酪氨酸磷酸酶；(b)在步骤(a)之后，从该可再生 的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建 体；(C)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制 DNA构建体；以及(d)测定所述子代植物任选地在水限制条件下与不包含所述抑制DNA 构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。产生种子(例如可作为提供耐旱性的产品销售的种子)的方法，该方法包括任一 上述的方法，并且还包括从所述子代植物获得种子，其中所述种子在其基因组中包含所 述重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)。在任一前述方法或本发明方法的任一其他实施方案中，在所述导入步骤中所述 可再生的植物细胞可包括愈伤组织细胞、胚胎愈伤组织细胞、配子细胞、分生细胞或未 成熟胚芽细胞。可再生的植物细胞可来自近交系玉米植物。在任意上述方法或本发明方法的任意其他实施方案中，所述再生步骤可包括以 下步骤ω在包含促进胚发生的激素的培养基中培育所述转化的植物细胞直至观察到愈 伤组织；Gi)将所述步骤ω的转化的植物细胞转移至包含促进组织机体形成的激素的第 一培养基；以及Gii)在第二培养基上传代培养步骤(ω后的所述转化的植物细胞，以允 许嫩芽伸长、根发育或这两者同时发生。在任一上述方法或本发明方法的任一其他实施方案中，至少一种农学特性优选 选自绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种 子产量、总植物氮含量、果实氮含量、种子氮含量、营养组织中的氮含量、总植物游离 氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织中的氨基酸含量、 总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织中的蛋白质含量、耐 旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植物高度、穗高、穗长、在低温胁迫下的 早期幼苗活力和幼苗出苗率。至少一种农学特性的改变可为产量、绿度或生物量的增 加。在任一上述方法或本发明的任一其他方法中，在与不包含所述重组DNA构建体(或所述抑制DNA构建体)的对照植物在水限制条件下进行比较时，植物可表现出至少 一种农学特性的改变。在任一前述方法或本发明方法的任何其他实施方案中，存在供选择的替代方案 用于将包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸的重组DNA构建体导入可再生的 植物细胞中。例如，可将调控序列(例如一种或多种增强子、任选地作为转位因子的部 件)引入到可再生的植物细胞中，然后筛选其中将所述调控序列可操作地连接至编码本 发明多肽的内源基因的事件。将本发明的重组DNA构建体导入植物可通过任何合适的技术来进行，这些技术 包括但不限于引导DNA摄取、化学处理、电穿孔、微注射、细胞融合、感染、载体介导 的DNA转移、轰击或农杆菌Agrobacterium介导的转化。植物转化和再生的技术已经在 国际专利公布W02009/006276中进行了描述，其内容以引用方式并入本文。含有编码所关注蛋白质的外来的外源性分离的核酸片段的植物的发育或再生是 本领域所熟知的。可将再生的植物进行自花授粉以产生纯合的转基因植物。或者，将得 自再生植物的花粉与农学上重要的品系的产生种子的植株进行杂交。相反，将来自这些 重要品系的植物用于给再生植物授粉。利用本领域技术人员所熟知的方法培育含有所需 多肽的本发明的转基因植物。
实施例本发明将在下面的实施例中进一步说明，其中份数和百分比是以重量计并且度 数是摄氏度，除非另外说明。应该理解，尽管这些实施例说明了本发明的实施方案，但 仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实施例，本领域的技术人员可以确定 本发明的基本特征，并在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明做出多种改 变和修饰，以使其适用于多种用法和条件。因此，除了那些本文所示和描述的那些之 外，根据前文所述，本发明的各种修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见的。 这些修改形式也旨在属于附加的权利要求书的范围内。实施例1泡丨备H有激活标记基因白射以南芥属种群构建18.5kb 的 T-DNA 基二元构建体，pHSbarENDs2 (SEQ ID NO 1)包含四个
来源于花椰菜花叶病毒35S启动子的四个多聚增强子元件(对应于序列-341至-64，如 Odell等人Nature 313 810-812所述(1985))。该构建体也包含允许质粒救援的载体序 列(pUC9)和多接头、再动员T-DNA的转座子序列(Ds)、以及允许草胺磷选择转基因植 物的bar基因。原则上，仅将从右边界(RB)至左边界(LB)包含的10.8kb片段转移到寄 主植物基因组中。因为增强子元件位于靠近RB处，它们可诱导T-DNA整合后的基因组 位点顺式激活。通过整个植株的农杆菌转化制备拟南芥属激活标记种群。将pHSbarENDS2构建 体转化到根癌农杆菌菌株C58中，在25°C下在LB中培养至OD600 1.0。然后离心沉 淀细胞，并重悬在相等体积的5%蔗糖/0.05% Silwet L-77 (OSI Specialties，Inc)中。在
早期抽薹时，培育拟南芥生态型Col-O的土壤使用农杆菌悬浮液进行顶部灌溉。一周后， 相同植株再次用在蔗糖/Silwet中的相同农杆菌菌株进行顶部灌溉。然后将该植物的种子设为标准。所得Tl种子在土壤中播种，通过喷洒草胺磷(FINALE 丨AgrEvo ； Bayer Environmental Science)选择转基因幼苗。选择了总计100,000个草胺磷抗性Tl幼苗。分 开保存来自每个品系的T2种子。实施例2筛诜以鉴定耐旱件增加的品系定量的干旱筛选将来自96,000个单独的Tl激活标记品系的九个草胺磷抗性T2 植物每个播种在单个罐中，在Scotts Metro-Mix 200土壤上生长。每个浅箱配置8个 方形罐。每个方形罐装满土壤至顶部。以3X3的阵列在每个罐(或小隔间)中播种以 制备9个草胺磷抗性幼苗。土壤浇水至饱和，然后植物在标准条件下生长(即，16小时光照，8小时黑暗的 循环；22°C; 60%的相对湿度)。不提供附加的水。在可见的干旱胁迫症状出现时拍摄植物的数字图像。每天拍摄图像一次(在每 天的相同时间)，直至植物变干。通常收集连续四天的数据。使用颜色分析鉴定潜在的耐旱性品系。可使用颜色分析测量进入黄色区的叶片 面积百分比的增加。使用色调、饱和度和强度数据(“HSI”)，黄色区由色调35至45 组成。叶片面积的保持也被用作鉴定潜在耐旱性品系的另一个标准，因为拟南芥属叶 片在干旱胁迫期间萎蔫。叶片面积的保持可用莲座型叶丛面积随时间的减少来测量。叶片面积根据使用LemnaTec成像系统获取的绿色像素数目进行测量。激活标记 和对照(例如野生型)植物在浅箱中并列生长，浅箱包含72株植物(9株/罐)。当萎蔫 开始时，拍摄图像多日以监控萎蔫过程。基于连续四天获取的绿色像素数，从这些数据 中测定激活标记植物和伴随的对照植物的萎蔫特征图。该特征图选自发生最大程度萎蔫 的四天中的一系列测量结果。耐旱能力通过激活标记植物与对照植物相比的抗萎蔫倾向 来测量。使用LemnaTec HTSBonitUV软件分析CCD图像。根据绿色像素数目获取对拟
南芥属植物的叶片面积的评估。对每张图像的数据进行平均化以获取对激活标记植物和 对照植物的绿色像素值的平均值和标准偏差的评估。噪声函数的参数通过对平均像素数 平方偏差的线性回归获得，使用同一批中的所有图像数据。平均像素数数据的误差估计 使用噪声函数的拟合参数进行计算。激活标记植物和野生型植物的平均像素数相加以获 取每张图像的总叶片面积的评估。具有最大萎蔫的四天间隔通过选择对应于植物生长最 大差异的间隔获得。激活标记植物和野生型植物的单个萎蔫响应通过归一化使用间隔第 一天的绿色像素数值的数据获得。激活标记植物与野生型植物相比的耐旱性通过相加经 过两天至四天的激活标记植物和野生型植物间的萎蔫响应的加权差值来评分；加权数通 过传递数据误差进行评估。耐旱性评分为正，对应于激活标记植物与野生型植物相比萎 蔫更慢。激活标记植物和野生型植物之间的萎蔫响应的差异显著性从平方偏差的加权和 获取。将在与整个浅箱的平均值进行比较时具有黄色积聚显著延迟和/或莲座型叶丛 面积显著保持的品系命名为Phase 1 hits。在相同分析条件下进行Phase 1 hits的重复试样 再筛选。当Phase 2平行测定的其中一个或全部显示与整个浅箱的平均值有显著差异时(评分大于0.9)，则认为该品系是经验证的耐旱性品系。实施例3鉴定激活标记基因使用下述两个标准程序中的一个或两个鉴定侧接导致耐旱性的T-DNA插入序列 的基因(1)热不对称交错(TAIL)PCR(Liu 等人，(1995)，Plant J.8 457-63)；以及 (2) SAIFF PCR(Siebert 等人，(1995)Nucleic Acias Res.23 1087-1088)。至于复杂的多 聚T-DNA插入序列，TAIL PCR和SAIFF PCR可能均不足以鉴定候选基因。在这些情 况下，可使用包括反式PCR、质粒拯救和/或基因组文库构建在内的其他程序。成功的结果是其中单个TAIL或SAIFF PCR片段包含T-DNA边界序列和拟南芥 属基因组序列。一旦获取侧接T-DNA插入序列的基因组序列标记，通过与公开可用的拟南芥属 基因组的序列比对来鉴定候选基因。具体地讲，最靠近35S增强子元件/T-DNA RB的注释基因是激活的基因的候选基因。为了验证鉴定的基因真的靠近T-DNA并排除TAIL/SAIFF片段是嵌合伪克隆的 可能性，用一个T-DNA中的寡核苷酸和一个候选基因特异性的寡核苷酸进行对基因组 DNA的诊断PCR。将提供PCR产品的基因组DNA样本理解为表示T-DNA插入序列。 该分析也验证了其中一种以上的插入事件发生在相同品系中的情况，例如，在TAIL和/ 或SAIFF PCR分析中鉴定是否有多个不同基因组片段。实施例4A鄉·还分析了显示耐旱性的激活标记品系(Νο.116089)。提取来自该品系的DNA， 并且在突变品系中侧接T-DNA插入序列的基因通过SAIFFPCR (Siebert等人，Nucleic Acids Res.23 1087-1088 (1995))进行鉴定。鉴定一个PCR扩增的片段，它包含T-DNA 边界序列和拟南芥属基因组序列。获取侧接T-DNA插入序列的基因组序列，并且通过与 完全拟南芥属基因组的序列比对鉴定候选基因。就给定的T-DNA整合事件而言，最靠近 35S增强子元件/T-DNA RB的注释基因是品系中的活化候选基因。在品系116089的情 况下，T-DNA插入基因At3g44610中。将在整合位点的35S增强子导向At3g44620 (SEQ ID NO 14)，编码蛋白酪氨酸磷酸酶(SEQ ID NO 15; NCBI GI No.79432726)。实施例4B候选耐旱性基因表达水平的测定功能性的激活标记等位基因将导致在其中它正常表达的组织中的候选基因上 调、在其中它通常不表达该基因的组织中异常表达、或者两种情况都发生。比较在同源突变品系和野生型品系中的候选基因的表达水平。使用标准RT-PCR 程序如QuantiTect Reverse Transcription试剂盒，购自Qiagen 。使用肌动蛋白基因的 RT-PCR作为对照物以显示来自突变品系和野生型的样本的扩增和载入是相似的。最优化各个基因的测定条件。在成熟的莲座型叶中检查表达水平。如果激活标 记等位基因导致在其他组织(例如根)中的异常表达，通过该检测分析法它不被检出。同 样地，阳性结果是有用的，但是阴性结果不排除基因不需要进行进一步的分析。
实施例5肖維·她44620(舶_麵_ )可将候选基因转化到拟南芥属中并在35S启动子作用下过表达。如果在转基因 品系中观察到与亲本激活标记品系相同或相似的表型，则将该候选基因认为是拟南芥属 中验证过的“前导基因”。用以下方法测试候选拟南芥属蛋白酪氨酸磷酸酶基因(At3g44620; SEQ ID NO 14)赋予耐旱性的能力。用紧接Invitrogen Gateway Cl转化插入序列上游的1.3-kb的35S启动子构建 16.8-kb 的 T-DNA 基二元载体，称为 pBC_yellow(SEQ IDNO 4)。该载体也包含 RD29a
启动子，该启动子驱动基因表达ZS-YellowdNVITROGEN )，它赋予转化过的种子黄色荧光。通过RT-PCR扩增At3g44620cDNA蛋白编码区的534个核苷酸的片段，使用以 下引物(l)At3g44620-5，attB 正向引物(SEQ ID NO 12) TTAAACAAGTTTGTACA AAAAAGCAGGCTCAACAATGGCGACTCCTCCTCCGACG(2)At3g44620-3，attB 反向引物(SEQ ID NO 13) TTAAACCACTTTGTACA AGAAAGCTGGGTTCAACTTTGCGCAGTGATACT将通过以上引物扩增的534个核苷酸的片段命名为AAt3g44620，它编码由SEQ ID NO 15的氨基酸63-239组成的截短的蛋白酪氨酸磷酸酶。该截短蛋白的177个氨基 酸的序列如SEQ ID NO 33所示，并且它缺失全长拟南芥属蛋白酪氨酸磷酸酶(SEQ ID NO 15)的氨基末端的62个氨基酸。正向引物包含attBl 序列(ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT ； SEQ ID
NO 10)和共有的Kozak序列(CAACA)邻近蛋白编码区的21个核苷酸(以位于SEQ ID NO 14的核苷酸216的ATG密码子开头)。反向引物包含attB2 序列(ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT ； SEQ ID NO 11)，该序列邻近SEQ ID NO : 14蛋白编码区的反向互补序列的后21个核苷酸(以 终止密码子的反向互补序列开头)。使用Invitrogen Gateway CLONASETM 技术，用 pDONRTM/Zeo (SEQ ID
NO 2)进行BP重组反应。这种方法将细菌致死ccdB基因以及氯霉素抗性基因(CAM) 从pDONRTM/Zeo移除并定向地克隆了该在旁侧具有attBl和attB2位点的PCR产物而得 到入门克隆(entry clone)PHP30192。该入门克隆与目的载体一起用于随后的LR重组反 应如下。用紧接INVITROGEN GATEWAY Cl转化插入序列上游的1.3_kb35S 启动子构建称为pBC_yellow(SEQ ID NO 4)的16.8-kb T-DNA基的二元载体 (目的载体)，所述插入序列包含ccdB细菌致死基因以及侧接attRl和attR2序 列的氯霉素抗性基因(CAM)。 该载体也包含RD29a启动子，该启动子驱动 基因表达ZS-Yell0W (INVITROGEN )，它赋予转化过的种子黄色荧光。使用 Invitrogen Gate way 技术，对包含定向克隆PCR产物和pBC-yellow的PHP30192入门克隆进行LR重组反应。这允许迅速地定向克隆在pBC-yellow中的35S启动子后的候选 基因以制备35S启动子A At3g44620表达构建体，pBOYellow-A At3g44620。申请人:然后使用如实施例1所述的相同农杆菌介导转化程序，将35S启动子 A At3g44620表达构建体导入野生型拟南芥属生态型Col_0。转基因T1种子通过黄色荧 光进行选择，并且将T1种子紧邻着野生型种子种植并在水限制条件下生长。生长条件和 成像分析如实施例2所述。发现来自激活标记的初始耐旱性表型可在用其中AAt3g44620 通过35S启动子直接表达的构建体转化过的野生型拟南芥属植物中重现。通过实施例2 的方法测定的耐旱性评分是4.3。实施例6cdna f^^ffen^n CDNA ^M^AmmmmcDNA文库可通过许多可用的方法中的任一种制备。将扩增的DNA插入序列 或质粒DNA在引物标记法测序反应(dye-primer sequencingreaction)中进行测序，以产 生部分cDNA序列(表达序列标记或“EST” ；参见Adams等人，1991，Science 252 1651-1656)。用改进的转座规程来产生全长插入序列(FIS)数据。将确认的模板通过基于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) Tyl转座因子(Devine 和 Boeke，1994，Nucleic Acids Res.22 3765-3772)的 Primer Island 转座试剂盒(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)进行转座。随后将转座的DNA用于通过电穿孔 转化 DH10B 电-感受态细胞(Gibco BRL/Life Technologies, Rockville, MD)。转座因 子含有另外的可选标记(称为 DHFR; Fling 和 Richards，1983，Nucleic Acids Res. 11 5147-5158)，使得能在琼脂平板上仅双重筛选含有整合的转座子的那些亚克隆。从每 次转座反应随机地选择多个亚克隆，通过碱性裂解制备质粒DNA，并用对转座子内的结 合位点特异性的独特引物从转座事件位点向外进行测序(ABI PRISM dye-terminator ReadyReaction mix)。收集序列数据(ABIPrism Collections)并用 Phred和 Phrap(Ewing，等人，1998， Genome Res.8 175-185 ； Ewing 禾口 Green，1998，Genome Res.8 186-194)进行装配。 通过Consed序列编辑器(Gordon等人，1998，Genome Res.8 195-202)检查装配序列。在一些克隆中，cDNA片段可对应基因的3’ -端的一部分并且不会涵盖整个开 放阅读框。为了获得上游信息，使用两种不同规程中的一者。这两种方法中的第一种 方法导致产生含有所需基因序列的部分的DNA片段，而第二种方法导致产生含有整个开 放阅读框的片段。这两种方法均使用两轮PCR扩增以从一个或多个文库获得片段。有 时基于以前的知识(特定的基因应该存在于某些组织中)选择文库，有时则进行随机地 选择。获得相同基因的反应可平行地在若干文库中进行，或者在文库池中进行。文库 池通常用3至5个不同的文库制备并且使其归一化而成为一致的稀释度。在第一轮扩增 中，两种方法均使用载体特异性的(正向)引物，同时还使用基因特异性的(反向)引 物，该正向引物对应位于克隆5’ -端处的载体的一部分。一第一种方法使用与已知基 因序列的一部分互补的序列，而第二种方法使用与3’ -非翻译区(也称为UTR)的一 部分互补的基因特异性引物。在第二轮扩增中，两种方法均使用套式引物组。按照生 产商的说明书，用市售试剂盒将所得DNA片段连接进pBLUESCRIPT 载体中。该试剂盒选自可得自包括 Invitrogen (Carlsbad, CA)、Promega Biotech (Madison, WI)和 Gibco-BRL (Gaithersburg，MD)在内的一些供应商的许多试剂盒。如上所述，将质粒 DNA通过碱性裂解方法分离并进行测序和用Phred/Phrap进行装配。实施例7cDNA克降的鉴定编码受关注的多肽的cDNA克隆能通过BLAST (Basic LocalAlignment Search Tool ； Altschul等人(1993)J.Biol.215 403-410 ；还可参见国立卫生研究院国家医学图
书馆的国家生物技术信息中心的万维网址上对BLAST算法的解释)进行鉴定，寻找与 BLAST "nr"数据库中所包含氨基酸序列(包括所有非冗余GenBank CDS翻译序列、源 自3-维结构Brookhaven蛋白质数据库(Protein Data Bank)、SWISS-PROT蛋白质序列数 据库的最新的主要版本、EMBL和DDBJ数据库的序列)的相似性。在所有的阅读框中翻 译来自克隆的DNA并用NCBI提供的BLASTX算法(Gish和States，1993，Nat.Genet.3 266-272)比较与‘‘nr”数据库中包含的所有可公开获得的蛋白质序列的相似性。采用国 家生物技术信息中心(NCBI)提供的BLASTP算法，分析cDNA序列编码的多肽与包含在 “nr”数据库中的所有可公开获得的氨基酸序列的相似性。为方便起见，通过BLAST计 算仅仅偶然观察到cDNA序列与所搜索的数据库中所包含序列的匹配的P值(概率)或E 值(期望值)，在本文报导为“pLog”值，它代表所报导的P值或E值的负对数。一因 此，pLog值越大，cDNA编码的序列和BLAST的“匹配”代表同源蛋白的可能性就越 大。EST序列能与如上所述的Genbank数据库进行比较。通过使用BLASTn算法 (Altschul等人，Nucleic Acids Res.25 3389-3402 (1997))对杜邦专利数据库比较具有序
列同源共有区域或重叠区域的核苷酸序列，可找到含更5'端或3'端序列的EST。在两 个或更多个核酸片段之间存在共有或重叠序列时，该序列可装配成单一的连续核苷酸序 列，从而使最初的片段在5'或3'初始方向上延伸。一旦确定了最5'的EST后，可以 如上所述，通过全长插入序列来确定其完整的序列。可用tBLASTn算法，通过将已知基 因(来自专有来源或公开数据库的已知基因)的氨基酸序列对EST数据库进行比较，可找 到属于不同物种的同源基因。tBLASTn算法对所有6个阅读框都翻译了的核苷酸数据库 进行氨基酸查询的搜索。该搜索允许不同物种之间的核苷酸密码子使用的差异，并且允 许密码子简并。实施例8表征编码蛋白酪氨酸磷酸酶的cDNA克隆制备提供来自玉米、大豆、糖用甜菜、野苋菜(Amanmthusretroflexus)和葡萄的
不同组织的mRNA的cDNA文库，并且鉴定编码蛋白酪氨酸磷酸酶的cDNA克隆。下面 描述了该文库的特征。MJl来自玉米、大豆、糖用甜菜、野苋菜和葡萄的cDNA文库
权利要求
1.在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连 接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有的氨基酸 序列基于 Clustal V 比对方法在与 SEQID NO: 15、17、19、21、23、25、27、28、29、 33、34、35、36、37、38、40、41、43、44、45、46、47、48、49 和 50 进行比较时具有 至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物 进行比较时表现出增加的耐旱性。
2.在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连 接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有的氨基酸 序列基于 Clustal V 比对方法在与 SEQIDNO 15、17、19、21、23、25、27、28、29、 33、34、35、36、37、38、40、41、43、44、45、46、47、48、49 和 50 进行比较时具有 至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物 进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。
3.权利要求2的植物，其中所述至少一种农学特性为选自下列的至少一种绿度、 产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植 物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、 种子游离氨基酸含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱 性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高、穗长、在低温胁迫下的早 期幼苗活力和幼苗出苗率。
4.权利要求2或权利要求3的植物，其中在水限制条件下与未包含所述重组DNA构 建体的所述对照植物比较时，所述植物表现出所述至少一种农学特性的所述改变。
5.权利要求1至4中任一项的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
6.增加植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可 操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有 的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO 15、17、19、21、23、25、27、 28、29、33、34、35、36、37、38、40、41、43、44、45、46、47、48、49 和 50 进行比 较时具有至少50%的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因 植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(C)获得源自步骤(b)的所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组 中包含所述重组DNA构建体并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较 时表现出增加的耐旱性。
7.评价植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可 操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有 的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO 15、17、19、21、23、25、27、 28、29、33、34、35、36、37、38、40、41、43、44、45、46、47、48、49 和 50 进行比 较时具有至少50%的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(C)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述 重组DNA构建体；以及(d)评价所述子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时的耐旱性。
8.测定植物的至少一种农学特性改变的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可 操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有 的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO 15、17、19、21、23、25、27、 28、29、33、34、35、36、37、38、40、41、43、44、45、46、47、48、49 和 50 进行比 较时具有至少50%的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因 植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(C)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述 重组DNA构建体；以及(d)测定所述子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现 出至少一种农学特性的改变。
9.权利要求8的方法，其中所述测定步骤(d)包括测定所述转基因植物在水限制条 件下与不包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改 变。
10.权利要求8或权利要求9的方法，其中所述至少一种农学特性为选自下列的至少 一种绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种 子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离 氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白 质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高、穗长、在低 温胁迫下的早期幼苗活力和幼苗出苗率。
11.权利要求6至10中任一项的方法，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
12.分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含(a)编码具有蛋白酪氨酸磷酸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于ClustalV比对 方法，成对比对的默认参数KTUPLE = 1，空位罚分=3，窗口 =5，并且DIAGONALS SAVED = 5，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ IDNO 25、37、40或41进行比较时 具有至少90%的序列同一性，或者在与SEQ ID NO: 21或39进行比较时具有至少93% 的序列同一性，或者所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 17、34、43或44 ；或者(b)所述(a)的核苷酸序列的全长互补序列。
13.权利要求12的多核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQIDNO: 17、21、 25、 34、 36、 37、 40、 41、 43 或 44。
14.权利要求12的多核苷酸，其中所述核苷酸序列包含SEQIDNO : 16、20、24、39 或42。
15.包含重组DNA构建体的植物或种子，其中所述重组DNA构建体包含权利要求12至14中任一项的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接至少一种调控序列。
全文摘要
本发明涉及分离的多核苷酸和多肽，以及用于提供耐旱性的重组DNA构建体、包含这些重组DNA构建体的组合物(例如植物或种子)，以及利用这些重组DNA构建体的方法。所述重组DNA构建体包含可操作地连接至植物中有功能的启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码蛋白酪氨酸磷酸酶。
文档编号A01H5/10GK102016014SQ200980114283
公开日2011年4月13日 申请日期2009年4月22日 优先权日2008年4月23日
发明者H·萨凯, J·马伦, R·W·威廉斯, S·M·艾伦, S·V·廷盖, S·卢克, S·西瓦桑卡 申请人:先锋高级育种国际公司, 纳幕尔杜邦公司