专利名称：：新木榄二硫醇、其衍生物及其制备方法和在制备治疗糖尿病药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，更具体而言，涉及一种从红树林植物木榄(&wgM&ragywwo^r/^a)中分离得到的化合物新木榄二硫醇(bruguiesulfbrol)及其衍生物，本发明还涉及该化合物及其衍生物的制备方法，以及经过生物活性测试可作为蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)抑制剂和胰岛素增敏剂，从而它们可用于制备治疗n-型糖尿病、肥胖症及其它由此引起的并发症的药物。
背景技术：
：糖尿病(diabetesmellitus)是一组由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合症，因胰岛素分泌绝对或相对不足以及耙组织细胞对胰岛素敏感性降低，引起糖、蛋白、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱。临床以高血糖为主要共同标志，久病可引起多个系统损害，病情严重时可发生急性代谢紊乱如酮症酸中毒等。在糖尿病人中发生冠心病、缺铁性或出血性脑血管病、失明、肢端坏疽等严重并发症均明显高于非糖尿病人群。因此，糖尿病及其并发症已成为严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。目前一般将糖尿病分为两类，I型糖尿病(胰岛素依赖型糖尿病，IDDM)与II型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病，NIDDM)。糖尿病中90%以上是11型糖尿病。WHO预计，由于人口老龄化、肥胖、不健康的饮食以及缺乏运动的生活方式，到2025年，糖尿病患者的数目将由1995年的1.35亿上升为3亿。I型糖尿病人由于第6对染色体短臂上的HLA-D基因决定了遗传易感性，对环境因素，特别是病毒感染或化学毒性物质刺激的反应异常，直接或间接通过自身免疫反应，引起胰岛B细胞破坏，以致胰岛素不足。临床特点是引起病急、多食、多尿、多饮、体重减轻等症状较明显，有发生酮症中毒的倾向，必须依赖胰岛素治疗维持生命。II型糖尿病也有很强的遗传性和环境因素，并呈显著的异质性，发病机制多样而复杂，各病人间存在较大差异。总的来说可概括为胰岛素分泌的相对不足和胰岛素抵抗。对II型糖尿病人，尤其是肥胖性糖尿病患者的一系列研究证实，胰岛素抵抗是II型糖尿病发生、发展过程中的关键因素。在研究脂肪细胞和肌肉细胞内胰岛素信号传导途径的基础上，设计开发胰岛素增敏剂，以改善胰岛素抵抗状态，是目前II型糖尿病新药研究的重点，也是其主要方向之一。II型糖尿病的特点是胰岛素敏感组织如骨骼肌、肝、脂肪组织对胰岛素作用的抵抗。虽然其具体机制尚不清楚，但胰岛素信号在其传导通路中的减弱甚至阻断必定是直接因素。胰岛素通过与其受体胞外a亚单位结合激活受体胞内f3亚单位内在的酪氨酸激酶活性，导致调节结构域中关键的酪氨酸残基自身磷酸化，从而完全激活胰岛素受体酪氨酸激酶活性，'胰岛素受体酪氨酸激酶再通过磷酸化其底物将信号传递下去。随着对细胞内胰岛素作用通路中可逆性酪氨酸磷酸化认识的加深，蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTPases)在平衡该通路中相关蛋白酪氨酸磷酸化水平中的作用越来越受到重视。PTPases可能作用于该通路中多个环节，例如将自身磷酸化活化的胰岛素受体(IR)去磷酸化，从而降低受体激酶活性；或将诸如胰岛素受体底物l(IRS-1)、胰岛素受体底物2(IRS-2)、Shc等胰岛素受体的底物中蛋白酪氨酸残基致病磷酸化，从而负调控胰岛素作用受体后通路。特定PTPases和胰岛素通路中酪氨酸激酶间酶活性的不平衡可能是引起II型糖尿病胰岛素抵抗的原因。因此，通过寻找选择性作用于该通路中PTPases的抑制剂抑制其活性，加强和延长胰岛素信号，成为越来越受重视的治疗II型糖尿病的新途径。PTPases包括一大族跨膜(受体型)和胞内(非受体型)酶，参与调控一系列重要生命过程。虽然多种PTPases在胰岛素敏感的组织中有表达，如跨膜的CD45和LAR-PTPase等；胞内的SHPTP-1、SHPTP-2、PTP1B、PTP1C等，但只有几种PTPases可能在胰岛素通路中受体或受体后环节影响正常胰岛素作用。目前的研究主要集中在LAR-PTPase、SHPTP-2、PTP1:B。PTP1B是最早被纯化和确定生物学特性的PTPase，全长大约50KD。早期研究证明能在体外有效地将胰岛素受体去磷酸化；将来源于人胎盘的PTP1B显微注射入非洲蟾蜍卵母细胞中，将减少胰岛素诱导的卵母细胞成熟及S6肽磷酸化水平。随后发现PTP1B在所有胰岛素敏感组织中高表达；用渗透休克的方法给予PTP1B抗体后，小鼠KRC-7肝细胞经胰岛素刺激时DNA合成和PI3激酶活性水平显著升高，IR自身磷酸化水平、IR激酶活性水平和IRS-1酪氨酸磷酸化水平也显著升高。最近有研究表明，PTP1B直接与激活状态的IR相互作用；在体外实验中也对IRS-1显示最高的选择性活性；大鼠成纤维细胞中PTP1B的高表达能明显降低配体诱导的IR磷酸化水平；用腺病毒介导基因转染的方法，在胰岛素靶向组织骨骼肌和肝组织的模型细胞L6肌细胞和Fao细胞中高表达PTP1B,明显抑制胰岛素诱导的IR和IRS-1的酪氨酸磷酸化，并从而显著抑制IRS-1和PI3激酶P85亚单位复合物的形成以及Akt、MAPK的磷酸化水平，而且胰岛素诱导的糖原合成也被抑制[EgawaK.etal.J.Biol.Chem.276(13):10207-10211]。用同样的方法在另一胰岛素靶向组织脂肪组织的模型细胞3T3-L1细胞中高表达PTP1B，同样明显抑制胰岛素诱导的IR、IRS-1和PI3激酶的酪氨酸石粦酸4匕，P42和P44MAPK^舞酸化水平也明显降4氐，而Akt^粦酸化水平和活性不受影响[VenableC.L.etal.J.Biol.Chem.275(24):18318-18326]。PTP1B的高表达对基本的、中等的及最大量胰岛素诱导的葡萄糖转运无影响，对转运的ECs。胰岛素浓度无影响。这些研究证明PTP1B能够负调控胰岛素信号转导通路并主要作用于胰岛素受体。更重要的实验证据来自PTP1B基因敲除小鼠。Elchebly等报道，运用同源重组的方法产生的PTP1B基因敲除的小鼠生长正常，有生殖力，对胰岛素敏感性显著增强，而且这一增强作用与肝脏和骨骼肌中胰岛素受体及胰岛素受体底物l磷酸化水平的增强相关[ElcheblyM.，etal.Science,283,1544-1548]。令人惊奇的是，PTP1B基因敲除的小鼠对食物诱导的体重增加和胰岛素抵抗也有抵抗作用。Klaman等运用大致相同的方法产生的PTP1B基因敲除的小鼠也得到同样的结果，而且发现PTP1B基因敲除的小鼠之所以对食物诱导的体重增加有抵抗作用，是由于脂肪细胞体积的减少，而脂肪细胞的数量并不改变。PTP1B基因敲除的小鼠基本代谢水平和总体能量消耗升高[KlamanL.D.,etal.MolecularandCellularBiology,20(15):5479-5489]。这些实验更加有力地证明了PTPIB在胰岛素敏感性、能量消耗和脂肪储存方面的重要作用，从而更加明确了它是治疗II型糖尿病和肥胖症的一个潜在药物作用靶点。PTP1B选择性抑制剂的研究取得了一定的进展，但大多局限于一些肽类或非肽类化合物，例如基于PTP1B去磷酸化的底物序列设计的抑制剂EEDE(F2PMP)M(Ki=7.2nM)、Glu-F2PMP-F2PMP(IC50=40nM),虽然这些肽类抑制剂具有较强的抑制活性及较高的选择性，但它们是肽类磷酸化合物的事实使其很难成为药物候选化合物。最近，一系列非肽类非磷酸化合物类PTPIB抑制剂被报道，它们具有一定的选择性，更重要的是，其中一些化合物对降低ob/ob小鼠血浆中葡萄糖和胰岛素水平有显著作用。这是第一例药理学的直接证据，证明PTPIB抑制剂具有抗糖尿病活性[Malamas,M.S.，etal.J.Med.Chem.,2000,43，1293-1310]。这些无疑为我们寻找新的小分子非肽类有机化合物作为高效、高选择性PTPIB抑制剂提供了机遇。本发明是从红树林植物木榄(万n/gw/eragyw"oWw'za)中分离得到化合物新木榄二硫醇并合成了其衍生物，经多次药理试验研究表明，该化合物及其衍生物具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶IB的显著活性及明显增敏胰岛素通路信号分子和GLUT4对胰岛素信号的响应，经文献检索，未见该类化合物此方面活性的报道。
发明内容因此，本发明的目的是提供一种从红树林植物木榄中分离得到的化合物新木榄二硫醇及其衍生物。本发明的另一目的是提供上述新木榄二硫醇及其衍生物的制备方法。本发明的还一目的是提供上述新木榄二硫醇及其衍生物在制备治疗n-型糖尿病、肥胖症及其它由此引起的并发症的药物中应用。本发明所述的化合物新木榄二硫醇及其衍生物具有如下的化学结构式其中，R为氢、C1C6的烷基或C2C6的烷酰基；当R为氢时，所述化合物即为新木榄二^e克醇；上述C1C6的烷基是指含有1~6个碳原子的直链或支链的烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或己基等；优选含有1~4个碳原子的直链或支链的烷基，更优选曱基。上述烷酰基是指含有26个碳原子的直链或支链的烷酰基，例如乙酰基、丙酰基或丁酰基等；优选含有24个碳原子的直链或支链的烷酰基；更优选乙酰基。新木榄二硫醇或其衍生物中4位碳的绝对构型可以是R型、S型或R和S的混合构型。本发明提供了新木榄二硫醇及其衍生物的制备方法，步骤如下1)红树林植物木榄，取其茎叶阴干后粉碎，用醇渗漉提取，得到提取浸膏；其中，所述的醇为甲醇或乙醇；2)将提取浸膏分散于水，水的混悬液依次以石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取，得到石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取部位；3)对乙酸乙酯萃取部位经100~200目硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯、石油醚/丙酮或氯仿/甲醇梯度洗脱，洗脱液经薄层层析检测，展开剂氯仿/曱醇卯:IO，将Rf值在0.4-0.6间的洗脱液合并浓缩即得I组分；4)步骤3)中的I组分再经200~300目硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯、石油醚/丙酮或氯仿/曱醇梯度洗脱，洗脱液经薄层层析检测，展开剂石油醚/丙酮50:50,将Rf值在0.40.6间的洗脱液合并、减压浓缩即得II组分；5)步骤4)中的II组分再经SephadexLH-20凝胶柱层析，用氯仿/甲醇或MeOH洗脱，洗脱液经薄层层析检测，展开剂石油醚/丙酮50:50，将Rf值在0.5的洗脱液合并、减压浓缩，即得到本发明化合物新木榄二碌u醇；进一步的，该化合物通过烷基化反应、酰化反应、酯化反应、或成醚反应，得到其相应的衍生物。本发明化合物经过生物活性测试，其对蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B的抑制具有显著的活性，其ICso值为17.16|iM,可作为蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)抑制剂和胰岛素增敏剂，可用于治疗II-型糖尿病、肥胖症及其它由此引起的并发症。图1不同浓度下新木榄二硫醇对PTP1B抑制曲线；图2新木榄二硫醇对AKT活性的影响；(GADPH代表Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,三磷酸甘油搭脱氢酶，作为westernblot的内参。)图3A没有胰岛素刺激前的GLUT4上膜(左图是细胞核染料染出的细胞核的图，右图是GLUT4上膜的情况)；图3B加入胰岛素刺激的GLUT4上膜(左图是细胞核染料染出的细胞核的图，右图是GLUT4上膜的情况)；图3C加入胰岛素刺激的新木榄二硫醇10浓度下的GLUT4上膜(左图是细胞核染料染出的细胞核的图，右图是GLUT4上膜的情况)；图4为新木榄二硫醇对GLUT4活性的影响。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但本发明不限此。NMR用Bruker-AMX400核磁共振仪测定；EI-MS及HR-EI-MS用Finnigan-MAT-95质谱仪测定；柱层析硅胶(100200目，200300目)、薄层硅胶板均为青岛海洋化工有限公司或烟台化工研究所实验厂生产；SephadexLH-20为E.Merk公司生产；所使用的试剂均为上海振兴化工一厂产品。含hPTPlB的催化区cDNA的质粒来自于Chernoff和E.coliBL21(DE3),购自Novagen公司;DMSO购自Fisher公司;SephacylS-200HighResolution和DEAESepharoseFastFlow树脂购自AmershamBioscience公司；緩冲液IxPBS(140mMNaCl，2.7mMKCl，10mMNa2HP04,1.8mMKH2P04，pH7.4)、NaCl、KCl、Na2HP04、KH2P04均购自中国医药(集团)上海化学试剂公司；pNPP购自Sigma公司。透明和黑色96孔板购自Corning公司；microplatespectrophotometer购自BIO-RAD公司；待测化合物新木榄二硫醇；溶解对硝基苯磷酸的緩沖液0.1M甘氨酸，pH9.8，内含有1mMMgCl2和1mMZnCl2，MgCl2、ZnCl2、NaOH、Tween20和甘氨酸购自中国医药(集团)上海化学试剂公司。GLUT4质粒来自Dr.YousukeEbina,UniversityofTokushima,Japan;F-12HammediumwithGlutamax和FBS购自Gibco乂>司；Penicillin-Streptomycin和Geneticin购自Sigma乂^司；Lipofectamine2000购自Invitrogen公司；CHO细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库；PVDF膜购自Invitrogen公司；Anti-phospho-AKT(Ser473)，anti-myc，anti隱HRP抗体购自CellSignaling公司；INCellAnalyzer1000购自GE公司。如无特殊说明，以下实施例中涉及到的液/液之间比值均为体积百分比。实施例1:新木榄二硫醇的提取与分离红树林植物木榄1.4Kg，取其茎叶阴干后粉碎，以工业曱醇渗漉提取，得到提取浸膏129.0g。将提取浸膏分散于水，水的混悬液依次以石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取，得到石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取部位。乙酸乙酯萃取部位8.7g经200目硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯100:0—90:10—70:30—50:50—30:70—0:100及氯仿/曱醇90:10—70:30—50:50—0:100梯度洗脱，250ml/份，共得50份，薄层层析检测，展开剂氯仿/甲醇90:10,其中第2331份Rf值在0.40.6之间，合并后减压浓缩，即为I组分；I组分l.Og又经300目硅胶柱层析，以石油醚/丙酮90:10—80:20—70:30—60:40—50:50梯度洗脱，10ml/份，共100份，薄层层析检测，展开剂石油醚/丙酮50:50,其中第3751份Rf值在0.4~0.6之间，合并后减压浓缩，即为II组分；II组分860mg经SephadexLH-20柱层析，用MeOH洗脱，5ml/份，共30份，薄层层析检测，展开剂石油醚/丙酮50:50,其中第2224份Rf值在0.5,合并后减压浓缩，即得本发明化合物新木榄二硫醇20mg。EI-MSw/z:154[M]+;HREI-MSm/z:153.9780[Mf(C3H6S203,理论值153.9758)。'HNMR(CD3OD，400MHz)5(ppm):4.82(m，H-4)，3.90(dd，/=4.2，11.7Hz，H-3)，3.76(dd，J-6.0，12.9Hz，H画5)，3.62(dd，J=0.9,5.7，12.0Hz，H-3),3.42(dd，J-0.6，4.5,12.9Hz,H-5)，氢谱中的CD3OD标准峰在53.29。l3CNMR(CD3OD,75MHz)5(ppm):70.3(C-4)，66.2(C-5)，45.6(C-3),碳谱中CD30D标准峰在549.5。实施例2:新木榄二硫醇衍生物的制备1、新木榄二硫醇甲基化物(R为曱基)的制备称取新木榄二硫醇样品5.0mg于10mL圓底烧瓶中，加入溶有3mgCH2N2的乙醚溶液2mL,室温反应18h，减压除去乙醚和CH2N2，得新木榄二硫醇的甲基化物(R=CH3)。2、新木榄二硫醇乙酰化物(R为乙酰基)的制备称取新木榄二石克醇样品5.0mg于25mL圓底烧弁瓦中，加入无水吡啶和乙酸酐各1.5mL，室温反应18h，减压除去吡啶和乙酸酐，得新木榄二硫醇的乙酰化物(R-Ac:)。试—险性实施例1:新木揽二硫醇对蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B抑制活性实验1、试剂的准备1.1溶解pNPP的緩沖液0.1M甘氨酸，pH9.8,内含有1mMMgCl2和1mMZnCl2。用无菌的超纯净双蒸水配制。1.2配制终止反应的Stop-buffer:3MNaOH，用无菌的超纯净双蒸水配制。1.310xhPTPlB(人源蛋白酪氨酸磷酸酶1B)催化区酶蛋白(24.7一)纯化得到的人源蛋白酪氨酸磷酸酶1B催化区酶蛋白经透析、浓缩后12000rpm离心10min，用Bradford法测定浓度为24.7fiM。1.4hPTPlB酶反应用緩冲液MOmMNaCl,2.7mMKCl，10mMNa2HPO4，1.8mMKH2P04，调pH到7.4。用无菌的超纯净双蒸水配制。1.510xpNPP(26852685iLiMpNPP，用pNPP的溶解緩冲液配制。2、实验设计:终点法<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>flL2.1化合物新木榄二碌u醇活性测定实验测试原理对硝基苯磷酸(p-Nitrophenylphosphate,pNPP)是碱性磷酸酶的可溶性底物，在人源蛋白酪氨酸磷酸酶IB(hPTPlB)的催化下，它脱去一个磷酸根，生成黄色可溶产物对硝基苯酚(p-Nitrophenol),该产物在405nM处有光吸收，通过^r测405nM处光吸收的增加可以-险测-粦酸酶的活性。hPTPlB酶反应緩冲液79pL、10xpNPP(2685)10^L、化合物新木榄二硫醇1JUL和10xhPTPlB(24.7)10|tiL在室温混匀，在30。C反应1小时后加入50|nL终止反应的Stop-buffer终止反应，然后测其在405nM的光吸收。2.2对照实验酶反应(不加DMSO):hPTPlB酶反应緩沖液80|iL、10xpNPP(2685pM)10pL和lOxhPTPlB(24.7)10iiiL在室温混匀,在30。C反应1小时后加入50终止反应的Stop-buffer终止反应，然后测其在405nM的光吸收。不加酶反应hPTPlB酶反应緩沖液90pL和10xpNPP(2685|iM)10|iL在室温混匀，在30。C反应1小时后加入50终止反应的Stop-buffer终止反应，然后测其在405nM的光吸收。酶反应(力。DMSO):hPTPlB酶反应緩冲液79^L、IO化PTPIB(24.7)10pL、DMSO1和10xpNPP(2685)10在室温混勻，在30。C反应1小时后加入50终止反应的Stop-buffer终止反应，然后测其在405nM的光吸收。2.3ICso值测定实验将待检测化合物新木榄二硫醇稀释成不同浓度，依2.1进行反应所有实验均设置复孔。结杲示于下列表1及图1中。表1中第1歹'J(样品及化合物浓度)为对照实验和测定的化合物新木榄二硫醇的浓度；第2、3列(A4。5值l，A柳值2)为反应所测得的A柳值(复孔)；第4列(平均值)为2、3列A4Q5值所得平均值；第5列(扣除本底)是由第4列平均值减去"不加酶反应"的A柳平均值所得；第6列(抑制率(未扣除DMSO影响))是将扣除本底后加化合物的A405值除以酶反应的A405值后得到相对的酶活比，以"酶反应，，作为100%的酶活，则用1减去这个相对的酶活比得到抑制率；第7列(抑制率(扣除DMSO影响)是将扣除本底后加化合物的八4()5值除以DMSO对照的A4Q5值后得到相对的酶活比，以"DMSO对照，，作为100%的酶活，则用1减去这个相对的酶活比得到扣除DMSO影响的抑制率。根据在化合物反应体系中的浓度及其对应的A柳值(扣除DMSO影响)作S型曲线图1,据图1求得其ICso值(使用数据处理软件Origin6,1)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>结果表明，新木榄二硫醇具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B的显著活性，其IC5o值为17.16nM。试验性实施例2:细胞水平上的新木榄二硫醇的活性测试测试原理胰岛素和细胞膜上的胰岛素受体结合后，胰岛素受体发生自磷酸化，启动下游信号传导。在信号传递过程中，AKT被磷酸化后活化，从细胞质转移到细胞膜上，然后再回到细胞质，磷酸化下游信号分子。最后，信号传到了GLUT4(葡萄糖转运蛋白4)，GLUT4被活化。活化的GLUT4进行葡萄糖的转运，从细胞质转移到细胞膜上。通过^r测细胞膜上的磷酸化的AKT量和GLUT4上膜的量的变化可以评价化合物在细胞内的活性及对细胞内胰岛素通路的影响。1、试剂的准备所有的试剂都用Milli-Q水配置并过滤(0.22pm)灭菌。F-12HammediumwithGlutamax用Milli-Q水配置，加入1.8mg/L的NaHC03,再调pH为7.5。SDS-laoding緩冲液(1L):62.5mMTris-HCl(pH6.8)，2%w/vSDS,10%甘油，50mMDTT,0.01%考马斯亮蓝。TBST:2.42gTrisbase,8gNaCl，pH7.6，0.1%v/vTween20。封闭液5g脱脂奶粉加入100mLTBST中。2、实验过程2.1检测AKT的活性检测AKT的活性时使用的一抗是鼠源anti-phospho-AKT(Ser473)抗体，2抗是兔抗鼠的anti-HRP抗体。CHO细胞培养在12孔板里，培养液是F12无血清培养基，内加入终浓度为10%的FBS和50U/ml的Penicillin-Streptomycin,培养条件为37°C,5%C02。当细胞长到80%铺层时加入化合物新木榄二硫醇，使终浓度为10|xmol/L和50pmol/L。化合物新木榄二硫醇和细胞孵育过夜。然后吸去培养基，用PBS洗3遍细胞(0.5mL/孔)，再加入F12无血清培养基，让细胞进行胰岛素饥饿1小时。吸去培养基，用PBS洗细胞3遍(0.5mL/孔)。吸去PBS，加入配在无血清F12培养基中终浓度为1)ug/L的胰岛素刺激细胞5分钟，吸走月夷岛素，用PBS洗3遍(0.5mL/孔)，加入SDS-loading緩沖液(50pg/孔)裂解细胞，在冰上迅速刮下细胞，将裂解的细胞放入1.5mL的EP管中，98度加热10分钟，再在冰上冷却。细胞裂解物在4度12000rpm离心10分钟，吸上清进行蛋白SDS-PAGE(10%SDS-PAGE)电泳，每孔上样15pL。电泳完后，在4度进行电转膜(转到PVDF膜上)，电转1小时。电转好的PVDF膜在封闭液中室温封闭1小时，再和相应的一'抗(anti-phospho-AKT(Ser473)，1:1000稀释度)在4度反应过夜。然后，用TBST緩冲液洗膜，每次在室温洗15mL，5分钟，洗3次。吸去TBST，再将PVDF膜和2抗(1:8000稀释度)在室温反应1小时。接着用TBST緩冲液洗PVDF膜，每次在室温洗15mL,5分钟，洗3次。显影用的底物是ECL-PLUS.2.2检测GLUT4上膜稳转Pegfpnl-GLUT4-myc的CHO细胞系培养在黑色96孔板里，培养液是F培养液是F12无血清培养基，内加入终浓度为10%的FBS和50U/ml的Penicillin-Streptomycin,培养条件为37°C，50/。CO2。当细胞长到80%铺层时吸去培养基。加入溶解在F12无血清培养基中的化合物新木榄二硫醇(100pL/孔，终浓度为10|iimol/L)。化合物新木榄二硫醇和细胞孵育过夜。吸去培养基，用配在F12无血清培养基中的胰岛素(80nm/L,100iuL/孔)刺激5分钟。吸去培养基，用PBS洗3遍细胞(100nL/孔，5min/次)。用曱醛(3.7%)室温固定15分钟。吸去曱醛，用PBS洗细胞3遍(100iliL/孔，5min/次)。加入一抗，抗c-myc的抗体(1:1000稀释度)，50^L/孔，4度反应过夜。吸去一抗，用PBS洗细胞3遍(100fiL/孔，5min/次)。加入Cy5-conjugated二抗(10pg/ml)室温反应1小时，80pL/孔。吸去二抗，用PBS洗细胞3遍(100nL/孔，5min/次)。组后每孔中剩下100inLPBS。上膜的GLUT4的量通过用INCellAnalyzer1000仪器定量Cy5的荧光强度得到(575nm激发光，620nm吸收光)。2.3对照实马全检测AKT的活性时使用的同样处理的CHO细胞，不加待测化合物新木榄二硫醇。检测GLUT4上膜时使用的同样处理的稳转GFP-GLUT4的CHO细胞，不加待测化合物新木榄二石克醇。所有实验均设置复孔。3、实验结果3.1检测AKT的活性其结果示于图2中。结果表明，新木榄二硫醇明显增敏细胞内的胰岛素通路信号分子对胰岛素信号的响应。根据westernblot的结果，发现在胰岛素刺激后，细胞中磷酸化的AKT量明显比未加化合物的对照组细胞增加。3.2检测GLUT4上膜其结果示于图3A、3B、3C和图4中。结果表明，新木榄二硫醇明显增敏GLUT4对胰岛素信号的响应。根据westernblot的结果，发现在胰岛素刺激后，细胞膜上磷酸化的GLUT4(细胞膜上红色荧光所表示的)的量明显比未加化合物的对照纟且细月包i曾力口。权利要求1.一种化学结构式如下的新木榄二硫醇或其衍生物id="icf0001"file="A2006101483490002C1.gif"wi="42"he="24"top="42"left="80"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>其中，R为氢、C1～C6的烷基或C2～C6的烷酰基。2、根据权利要求1所述的新木榄二硫醇或其衍生物，其特征在于，R为氬、C1C4的烷基或C24的烷酰基。3、根据权利要求1或2所述的新木榄二硫醇或其衍生物，其特征在于，R为氢、曱基或乙酰基-4、根据权利要求1所述的新木榄二硫醇或其衍生物，其特征在于，其4位碳的绝对构型为R型、S型或R和S的混合构型。5、一种权利要求1所述的新木榄二硫醇或其衍生物的制备方法，该方法包括如下步骤1)红树林植物木榄，取其茎叶阴干后粉碎，用醇渗漉提取，得到提取浸膏；其中，所述的醇为甲醇或乙醇；2)将提取浸膏分散于水，水的混悬液依次以石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取，得到石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取部位；3)对乙酸乙酯萃取部位经100200目硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯、石油醚/丙酮或氯仿/曱醇梯度洗脱，洗脱液经薄层层析检测，展开剂氯仿/曱醇按体积比90:10，将Rf值在0.40.6间的洗脱液合并浓缩即得I组分；4)步骤3)中的I组分再经200~300目硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯、石油醚/丙酮或氯仿Z曱醇梯度洗脱，洗脱液经薄层层析检测，展开剂石油醚/丙酮4姿体积比50:50，将Rf值在0.40.6间的洗脱液合并、减压浓缩即得n组分；5)步骤4)中的II组分再经SephadexLH-20凝胶柱层析，用氯仿/曱醇或MeOH洗脱，洗脱液经薄层层析;险测，展开剂石油醚/丙酮按体积比50:50，将Rf值在0.5的洗脱液合并、减压浓缩，即得到化合物新木榄二碌u醇；6)化合物新木榄二硫醇通过烷基化反应、酰化反应、酯化反应、或成醚反应，得到其相应的衍生物。6、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的新木榄二硫醇与CH2N2反应，得到新木榄二硫醇的曱基化物。7、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的新木榄二硫醇与乙酸酐反应，得到新木榄二硫醇的乙酰化物。8、权利要求1至4任意一项所述新木榄二硫醇及其衍生物在制备治疗II-型糖尿病、肥胖症及其它由此引起的并发症的药物中的应用。全文摘要本发明涉及医药
技术领域：
，涉及一种从红树林植物木榄中分离得到的化合物新木榄二硫醇(bruguiesulfurol)、其衍生物及其制备方法和在制备治疗II型糖尿病药物中的应用。本发明的新木榄二硫醇、其衍生物结构式如下所示，当R为氢时，即为新木榄二硫醇。该化合物及其衍生物经过生物活性测试可作为蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)抑制剂和胰岛素增敏剂，它们可用于制备治疗II-型糖尿病、肥胖症及其它由此引起的并发症的药物。文档编号C07D339/04GK101210009SQ200610148349公开日2008年7月2日申请日期2006年12月29日优先权日2006年12月29日发明者刘海利,旭沈,棋王,郭跃伟申请人:中国科学院上海药物研究所