具有硫醇基的d-型或l-型氨基酸衍生物的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明是关于侧链有硫醇基的D-型或L-体氨基酸衍生物的制造方法。此外，本 发明是关于在侧链有硫醇基的D-型或L-体氨基酸衍生物的制造方法所使用的中间体。
【背景技术】
[0002] 近年，生物医药的研究开发的进展，由合成肽及蛋白质进行构造及机能的解析之 例，及将肽及蛋白质作为医药使用之例正增加。肽及蛋白质是由氨基酸构成，构成蛋白质的 氨基酸除了侧链取代基是氢原子的情况外，α碳原子是不对称原子之故，有称为D-型 及L-体的镜像异构物存在。在生物体内存在的肽及蛋白质，由L-氨基酸所构成，所以要合 成在生物体内存在的肽及蛋白质，其原料需要是有光学活性的L-氨基酸。此外，近年来，在 蛋白质的构造解析上，期待提高蛋白质的结晶化效率，而使用消旋蛋白质的X射线结晶构 造解析受到注目。其中，消旋蛋白质就是作为仅由D-氨基酸所组成的蛋白质与仅由L-氨 基酸所组成的蛋白质的等量混合物的蛋白质。解析蛋白质的构造是理解蛋白质机能的重要 的知识。为了由这种消旋蛋白质的结晶化而进行构造解析起见，合成D-蛋白质及L-蛋白 质的双方的需要性提高。要将这种D-蛋白质及/或L-蛋白质制造并安定的供给，则有必 要将作为原料的光学活性D-氨基酸、L-氨基酸各分别大量以高效率制造。特别是，D-蛋白 质为天然不存在，只有由化学合成才有合成的可能，成为原料的D-氨基酸的工业生产是必 要不可欠的。
[0003] 此外，要合成高分子的蛋白质时，以固相合成等制造肽的方法，则能制造的肽的 长度有限，所以需要将所制造的肽连结起来。肽结合法而言，是采用名为自然化学接合法 NCL(Native Chemical Ligation)的方法。在NCL中，将N末端具有在侧链有硫醇基的氨基 酸的肽，与其他肽的C末端，利用硫醇基的反应性而结合。因而，在NCL中，主要是在侧链有 硫醇基的氨基酸的半胱氨酸作为结合部位而设计蛋白质合成。此外，在使用硫醇基的结合 反应后将构造改变为其他的氨基酸，而想出以丙氨酸等作为结合部位的方法等。但是，虽然 如此，可能作为结合部位的氨基酸仍旧是非常有限，这一点成为蛋白质合成的限制因素。
[0004] 因而，高分子的D-或L-蛋白质的制造上，要制造可作为NCL的结合部位的氨基酸 的话，需要制造在侧链经导入硫醇基的光学活性D-或L-氨基酸。但是，这种氨基酸的制造 方法而言，以D-或L-氨基酸作为原料，有尝试不要发生异构化而经由多数的复杂的步骤而 在侧链导入硫醇基的方法，但由这种方法要以高收量及高收率制造目的之氨基酸是非常困 难。并且，制造光学活性氨基酸的方法而言，亦存在有关使用立体选择性的酶的方法等的报 告（参照专利文献1，2)。但是，在这些中，没有特别述及在侧链有硫醇基等的所希望的取 代基的氨基酸的制造等。此外，酶有基质特异性，所以对于在β位有例如经保护的硫醇基 之容积大的取代基的氨基酸衍生物也不能说酶有效。随后高分子的D-或L-蛋白质的制造 上，可作为NCL的结合部位使用之光学活性β -硫代氨基酸衍生物，至今为止，还没有达到 以可使D-或L-蛋白质的工业生产的实施方案而制造的程度。
[0005] [先前技术文献]
[0006] [专利文献]
[0007] [专利文献1]日本专利特开平6-125786
[0008] [专利文献2]日本专利特开平11-69992
【发明内容】
[0009][发明要解决的课题]
[0010] 本发明的课题是提供在侧链有硫醇基的光学活性的D-型及/或L-型氨基酸，能 以简易的方法，以高收率制造的方法为课题。特别是，本发明人，为了要增加可作为由NCL 的结合部位的氨基酸的变化，将侧链有硫醇基的天然型或非天然型的各种D-或L-氨基酸， 以高收率制造作为课题。
[0011][解决课题的手段]
[0012] 本发明人为了要解决前述课题精心进行研究。根据光学活性D-或L-氨基酸作为 原料的以往方法，不对称碳原子的立体异构的调控非常困难。于是，本发明人刻意将有硫醇 基的氨基酸衍生物作为立体异构物混合存在的中间体组合物而制造之后，使用酶将α碳 原子的D-型与L-型分离，惊讶的是发现以比以往较少的步骤数的简易方法，以高收率，而 可制造在侧链有硫醇基的光学活性氨基酸衍生物。即，本发明人着眼于，在NCL法中，可使 用将用于肽结合反应的硫醇基在结合反应后除去的方法。本发明人想到，将在β位有硫醇 基的氨基酸衍生物（β-硫代氨基酸衍生物），不实施α及β碳原子的立体异构的调控，在 最后作为α碳原子以光学活性体精制所得者可用于NCL的结合部位。即，α及β碳原子 是不对称原子的β -硫代氨基酸衍生物的D-型或L-型，由在NCL反应后除去硫醇基，则可 变成只有α碳原子为不对称碳原子的α碳原子的光学活性D-型或L-型，而可合适当作 用于NCL结合部位的氨基酸而使用。
[0013] 再者，本发明人，为了要制造对天然型或非天然型的各种的氨基酸经导入硫醇基 的光学活性衍生物，精心检讨作为中间体的立体异构物混合存在的氨基酸衍生物组合物的 制造方法。其结果，本发明人发现，由使用芳族氨基酸或甘氨酸作为原料，对包括天然型氨 基酸的各种的氨基酸在侧链经导入硫醇基的非天然型氨基酸，可简易且以高收率制造成为 D-型或L-型氨基酸。
[0014] 即，本发明是提供在β位有经保护或未经保护的硫醇基的D-或L-非天然型氨基 酸衍生物的制造方法。该制造方法的特征在于，制造包括D-型及L-型之在β位有经保护 或未经保护的硫醇基的氨基酸衍生物，对所得的氨基酸衍生物使D-或L-氨基酸选择性水 解酶中的任一种酶反应，随后分离经水解的D-或L-氨基酸衍生物。
[0015] 此外，本发明的一实施实施方案中，提供在β位有经保护或未经保护的硫醇基的 D-或L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法，其特征是含有以下的步骤，
[0016] (I)对氨基酸衍生物，实施以下的反应，而制造含有D-型及L-型，在β位有经保 护或未经保护的硫醇基的氨基酸衍生物的步骤
[0017] (A)在该氨基酸衍生物的β碳原子导入保护或无保护的硫醇基的反应，
[0018] 以及，
[0019] (B)将结合在该氨基酸衍生物的α碳原子的氨基或羧基，转变为要成为D-或 L-氨基酸选择性水解酶的基质的取代基的反应，
[0020] 以及，
[0021] (II)对（I)所得的氨基酸衍生物，使D-或L-氨基酸选择性水解酶中的任一种酶 反应，随后分离经水解的D-或L-氨基酸衍生物的步骤。
[0022] 此外，本发明的一实施实施方案中，提供在β位有经保护或未经保护的硫醇基及 取代基R 1的D-或L-非天然型氨基酸衍生物[其中，R1是指构成氨基酸的侧链的取代基中， 结合在β碳原子的取代基部分而言（但，氢原子的情况除外）。]的制造方法。
[0023] 此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于前述"在β位有经保护或未经保护的 硫醇基及取代基R 1的D-或L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法"中，
[0024] 在前述步骤（I)中，前述反应（A)之前，包含作为步骤（P)之制造在β碳原子有 取代基R 1及脱离基L的氨基酸衍生物的步骤，
[0025] 前述反应（A)是与使前述脱离基L脱离氨基酸衍生物的β碳原子的反应一起实 施。
[0026] 此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于前述取代基R1是芳族取代基，前述步 骤（P)包含作为步骤（P-I)之对在β碳原子有取代基R 1的氨基酸衍生物，在β碳原子导 入脱离基L的步骤。
[0027] 此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于前述步骤（P)，包含作为步骤（Ρ-2) 之使甘氨酸与以R1CHO代表的醛化合物反应的步骤。
[0028] 此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于前述步骤（B)是，将结合在该氨基酸 衍生物的α碳原子的氨基变换为酰基氨基的反应，在前述步骤（II)中的D-或L-氨基酸 选择性水解酶是D-或L-氨基酰化酶（aminoacylase)。
[0029] 此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于在前述步骤（II)中，分离经水解的 D-或L-氨基酸衍生物的步骤，含有对经水解的D-或L-氨基酸衍生物导入脂溶性保护基的 步骤，由因脂溶性保护基的有无而产生的疏水性的差异，分离经导入脂溶性保护基的D-或 L-氨基酸衍生物的步骤。
[0030] 此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于在β位有经保护或未经保护的硫醇 基的D-非天然型氨基酸衍生物的制造方法，在前述步骤（II)中，使用D-氨基酸选择性水 解酶，随后分离经水解的D-氨基酸衍生物。
[0031] 此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于在β位有经保护或未经保护的硫醇 基的L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法，在前述步骤（II)中，使用L-氨基酸选择性水 解酶，随后分离经水解的L-氨基酸衍生物。
[0032] 此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于在前述步骤（A)中导入的硫醇基是 经从PMB (对甲氧基苄基）、Acm(乙酰氨基甲基）、苄基、Trt (三苯甲基）、二硫代、叔丁基选 出的保护基所保护的硫醇基。
[0033] 此外，本发明的一实施实施方案中，提供在β位有经保护或未经保护的硫醇基的 经光学拆分的D-非天然型氨基酸衍生物及L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法，该制造 方法含有以下步骤，
[0034] (I)对氨基酸衍生物，实施以下的反应，而制造含有D-型及L-型，在β位有经保 护或未经保护的硫醇基的氨基酸衍生物的步骤
[0035] (A)在该氨基酸衍生物的β碳原子导入经保护或未经保护的硫醇基的反应，
[0036] 以及，
[0037] (B)将结合在该氨基酸衍生物的α碳原子的氨基或羧基，变换为要成为D-或 L-氨基酸选择性水解酶的基质的取代基的反应，
[0038] (II)对于（I)所得的氨基酸衍生物，使D-氨基酸选择性水解酶反应，随后分离经 水解的D-氨基酸衍生物的步骤，
[0039] 以及，
[0040] (III)水解在（II)未经水解的L-氨基酸衍生物，随后获得经水解的L-氨基酸衍 生物的步骤。
[0041] 此外，本发明的一实施实施方案中，提供在β位有经保护或未经保护的硫醇基的 经光学拆分的D-非天然型氨基酸衍生物及L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法，该制造 方法包含以下的步骤，
[0042] (I)对氨基酸衍生物，实施以下的反应，制造包含D-型及L-型之在β位有经保护 或未经保护的硫醇基的氨基酸衍生物的步骤
[0043] (A)在该氨基酸衍生物的β碳原子导入经保护或未经保护的硫醇基的反应，
[0044] 以及，
[0045] (B)将结合在该氨基酸衍生物的α碳原子的氨基或羧基，变换为要成为D-或 L-氨基酸选择性水解酶的基质的取代基的反应，
[0046] (II)对于（I)所得的氨基酸衍生物，使L-氨基酸选择性水解酶反应，随后分离经 水解的L-氨基酸衍生物的步骤，
[0047] 以及，
[0048] (III)水解在（II)未经水解的D-氨基酸衍生物，随后获得经水解的D-氨基酸衍 生物的步骤。
[0049] 此外，本发明的一实施实施方案中，提供在β位有经保护或未经保护的硫醇基之 经光学拆分的D-非天然型氨基酸衍生物及L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法，
[0050] 前述步骤（B)是将在该氨基酸衍生物的α碳原子结合的氨基，变换为酰基氨基的 反应，
[0051] 在步骤（II)所述的"（I)所得的氨基酸衍生物"是包含以下的式所代表之关于α 碳原子的D-型及L-型的组合物
[0053][其中，R2代表氢原子或硫醇基的保护基，X代表经保护或未经保护的羧基，Acyl 表示酰基，R1表示构成氨基酸的侧链的取代基中，结合在β碳原子的取代基部分（但，氢原 子的情况除外）。]，
[0054] 前述步骤（II)中，D-或L-氨基酸选择性水解酶是D-或L-氨基酰化酶。
[0055] 此外，本发明的另外的实施实施方案，提供包含以下式所代表之关于氨基酸衍生 物的α碳原子的D-型及L-型的组合物
[0057] [其中，R2代表氢原子或硫醇基的保护基，X代表经保护或未经保护的羧基，Acyl 表示酰基，R1表示构成天然型氨基酸的侧链的取代基中，在β碳原子结合的取代基部分 (但，氢原子的情况除外）。]。此外，这种氨基酸衍生物亦可为前述式所代表的化合物的盐。
[0058] 此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于包含前述式所代表之关于氨基酸衍 生物的α碳原子的D-型及L-型的组合物中，前述取代基R 1是结合在由Arg、Asn、Asp、 6111、61]1、把8、1^11、1^8、]^1:、？116、1'印、及171'所成的群选出的氨基酸的0碳原子的取代 基部分（但，不是氢原子）。
[0059] 此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于包含前述式所代表之关于氨基酸衍 生物的α碳原子的D-型及L-型的组合物中，前述取代基R 2是硫醇基的保护基。
[0060] 此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于包含前述式所代表之关于氨基酸衍 生物的α碳原子的D-型及L-型的组合物中，前述取代基X是C00H。
[0061] 此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于包含前述式所代表之关于氨基酸衍 生物的α碳原子的D-型及L-型的组合物中，前述取代基R 1是结合在由Arg、Asn、Asp、 6111、61]1、把8、1^11、1^8、]^1:、？116、1'印、及171'所成之群选出的氨基酸的0碳原子的取代 基部分（但，不是氢原子），前述取代基R 2是硫醇基的保护基，前述取代基X是C00H。
[0062] 此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于包含前述式所代表之关于氨基酸衍 生物的α碳原子的D-型及L-型的组合物是前述D-型及L-型的等量混合物。
[0063] 此外，本发明的一实施实施方案中，提供在β位有经保护或未经保护的硫醇基及 取代基R1之D-或L-非天然型氨基酸衍生物[其中，R 1是指芳族取代基而言。]的制造方 法，而含有以下的步骤，
[0064] (I)对氨基酸衍生物，实施以下的步骤，制造含有D-型及L-型，在β位有经保护 或未经保护的硫醇基的氨基酸衍生物的步骤
[0065] (P-ι)对于在β碳原子有取代基R1的氨基酸衍生物，在该β碳原子导入脱离基 L，制造在β碳原子有取代基R1及脱离基L的氨基酸衍生物的步骤，
[0066] (A)由该氨基酸衍生物的β碳原子使前述脱离基L脱离，且，在该β碳原子导入 经保护或未经保护的硫醇基的步骤，
[0067]以及，
[0068] (B)将该氨基酸衍生物之α碳原子结合的氨基或羧基，变换成为D-或L-氨基酸 选择性水解酶的基质的取代基步骤，
[0069] 以及，
[0070] (II)对于（I)所得的氨基酸衍生物，使D-或L-氨基酸选择性水解酶反应，随后分 离经水解的D-或L-氨基酸衍生物的步骤。
[0071] 此外，本发明的一实施实施方案中，提供在β位有经保护或未经保护的硫醇基及 取代基R 1之D-或L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法[其中，R 1是指构成氨基酸的侧链 的取代基中，结合在β碳原子的取代基部分而言（但，除氢原子的情况）。]，而含有以下的 步骤，
[0072] (I)对氨基酸衍生物，实施以下的步骤，制造含有D-型及L-型之在β位有经保护 或未经保护的硫醇基的氨基酸衍生物的步骤
[0073] (Ρ-2)使甘氨酸与以R1CHO代表的醛化合物反应，制造在β碳原子有取代基R 1及 脱离基L的氨基酸衍生物的步骤，
[0074] (A)由该氨基酸衍生物的β碳原子使前述脱离基L脱离，且，在该β碳原子导入 经保护或未经保护的硫醇基的步骤，
[0075] 以及，
[0076] (B)将该氨基酸衍生物的α碳原子结合的氨基或羧基，变换成为D-或L-氨基酸 选择性水解酶的基质的取代基的步骤，
[0077] 以及，
[0078] (II)对于（I)所得的氨基酸衍生物，使D-或L-氨基酸选择性水解酶反应，随后分 离经水解的D-或L-氨基酸衍生物的步骤。
[0079] 此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于在β位有经保护或未经保护的硫醇 基之D-或L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法中，原料是使用包含关于α碳原子的D-型 及L-型的氨基酸衍生物，或，α碳原子不是不对称碳原子的氨基酸衍生物。
[0080] 此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于在β位有经保护或未经保护的硫醇 基之D-或L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法中，原料是使用关于α碳原子的D-体及 L-型的等量混合物之氨基酸衍生物，或，α碳原子不是不