专利名称：布丘氏菌属物种植酸酶变体的制作方法
技术领域：
本文提供的技术涉及改善的布丘氏菌属物种(Buttiauxella sp.)植酸酶变体，编 码植酸酶的核酸，含有核酸的载体、宿主细胞，以及生产植酸酶的方法。本发明涵盖的植酸 酶可用于多种用途，包括例如，淀粉液化的方法、醇发酵的方法和增强食品和动物饲料中的 磷酸盐消化的方法。背景植酸盐是磷在谷类植物和豆科植物中的主要储存形式。然而，单胃动物(例如， 猪、家禽和鱼)不能代谢或吸收植酸盐(或植酸)，从而排出并在强家畜生产的区域造成磷 污染。此外，在单胃动物中，植酸通过螯合金属物质，例如钙、铜和锌，还发挥抗营养剂的作用。为了提供足够的磷酸盐供这类动物的生长和健康，向其饮食中加入无机磷酸盐。 此类添加可以是昂贵的且进一步增加了污染问题。通过植酸酶的作用，通常水解植酸盐产生较小的肌醇_磷酸盐和无机磷酸盐。植 酸酶可用作动物饲料的添加剂，它们改善了动物对有机磷的利用度，并降低了环境的磷酸 盐污染(ffodzinski R J, Ullah A H. Adv Appl Microbiol. 42，263-302 (1996))。文献中已描述了多种真菌(WyssM.等人，Appl. Environ. Microbiol. 65 (2)， 367-373(1999) ；Berka R. M.等人，Appl. Environ. Microbiol. 64 (11)，4423-4427 (1998)； Lassen S.等人，Appl. Environ. Microbiol. 67 (10)，4701-4707 (2001))和细菌(Greiner R.等 A, Arch. Biochem. Biophys. 303 (1) , 107-113 (1993) ；Kerovuo ^ K, Appl. Environ. Microbiol. 64 (6), 2079-2085 (1998) ；Kim H. W.等人，Biotechnol. Lett. 25， 1231-1234(2003) ；Greiner R.等人，Arch. Biochem. Biophys. 341 (2)，201-206 (1997)； Yoon S. J.等人，Enzyme and microbial technol. 18，449-454 (1996) ；Zinin N. V.等人， FEMSMicrobiol. Lett. 236，283-290 (2004))来源的植酸酶。发明概述在第一个方面，本公开文本的实施方案提供了这样的植酸酶变体，所述变体具有 不同于野生型布丘氏菌属物种植酸酶(SEQ ID NO 1)的氨基酸序列，并具有一个或多个有 利的性质。此类性质包括但不限于有利的热稳定性、温度/活性谱；PH/活性谱；比活；和 PH/蛋白酶-敏感度。在其他方面，本公开文本的实施方案涉及这样的植酸酶变体，所述变体包括在选 自75、76和374的一个或多个位置上含有取代的植酸酶，其中，各位置对应野生型布丘氏菌 属物种植酸酶(SEQ ID NO 1)的氨基酸序列的位置。在另一个方面，本公开文本的实施方案提供编码如本文所公开的植酸酶变体的核酸，以及包括此类核酸的载体和宿主细胞。在其他实施方案中，序列用于生产植酸酶变体的 方法。此外，本公开文本的实施方案通常涉及植酸酶变体的用途，用于从任何植酸酶底 物中释放磷，特别是从植酸盐或植酸中释放无机磷酸盐。有利的，本公开文本的植酸酶变体 可用于工业用途，包括例如淀粉液化的方法，和增加食品和动物饲料中的磷酸盐消化的方 法。有利的，根据本公开文本的实施方案的植酸酶变体是有效的，用于醇发酵工艺和/或生产。在其他方面，本公开文本涉及包含如本文所述的植酸酶变体的酶组合物，其中酶 组合物用于商业应用，或在商业应用中使用。在一个实施方案中，酶组合物可以是动物饲料 组合物。在其它实施方案中，酶组合物可用于淀粉水解(如液化)工艺。在有利的实施方 案中，变体和/或酶组合物可用于醇发酵工艺。在进一步的实施方案中，包含本公开文本中 所包括的植酸酶的酶组合物将包含其它的酶，例如葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素 酶、半纤维素酶、脂肪酶、果胶酶、支链淀粉酶、葡萄糖氧化酶、β葡糖苷酶、漆酶、氧化酶、角 质酶、磷酸酶、其它植酸酶及其组合。在其他方面，本公开文本的实施方案涉及在宿主细胞中生产植酸酶变体方法，通 过用DNA构建体转化宿主细胞，在合适的培养基中培养转化的宿主细胞以允许所述所述植 酸酶的表达和生产植酸酶，其中所述构建体有利的包括在宿主细胞中具有转录活性的启动 子。方法还可以包括回收产生的植酸酶。在一个实施方案中，宿主细胞是细菌，或植物细 胞，或真菌细胞(例如，木霉属(Trichoderma)细胞，如里氏木霉(T.reesei))或酵母。在 本文描述的实施方案中，植酸酶变体的氨基酸序列与SEQ ID NO :1享有的最小百分比序列 同一性,例如，与SEQ ID NO :1至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98%的氨基酸序列同一性。在本公开文本的有利的实施方案中，植酸酶具有SEQ ID NO 2的序列。本发明的酶是权利要求和本文中定义的酶。本发明的酶还涵盖了在表达过程中共 翻译或翻译后加工的活性多肽，例如通过信号肽切割。翻译后切割还可以发生在C端。因 此，在优选的实施方案中，其有效的片段(也称为其功能片段)是通过天然的宿主或合适的 适当表达宿主生产的成熟多肽。因此，在一个方面，植酸酶的特征是它包括这样的氨基酸序列，所述序列是由全部 或部分编码本文定义变体的核苷酸序列表达的或可由全部或部分编码本文定义变体的核 苷酸序列表达的。通常，在一个方面，提供了植酸酶变体，与野生型布丘氏菌属物种(Buttiauxella sp.)植酸酶(SEQ ID NO 1)相比，所述变体具有至少约5°C的改善的热活性。在一个实施 方案中，与植酸酶SEQ ID NO :1相比，植酸酶的改善的热活性是至少约17°C。在另一个实 施方案中，改善的热活性的范围是从约17°C至约21°C。在另一个实施方案中，改善的热活 性的范围是从约17. 4°C至约20. 2°C。通常，在其他方面，提供了热稳定的植酸酶变体，其在缓冲液中在pH5. 5时暴露在 升高的温度下10分钟后，能够保留大于50%的活性，其中，升高的温度比野生型布丘氏菌 属物种植酸酶(SEQ ID NO 1)保留大于50%的活性时的温度高至少约5°C。在一个方面， 升高的温度是至少约20. 5°C或更高。在另一个方面，升高的温度的范围是从约20. 5°C至约27°C。在其他方面，升高的温度的范围是从约20. 2°C至约26. 8°C。通常，在另一个方面，提供的植酸酶变体具有植酸酶活性以及不同于野生型布丘 氏菌属物种植酸酶氨基酸序列(SEQ ID NO 1)的氨基酸序列，其中植酸酶变体的氨基酸序 列包括在对应SEQ ID N0:1的75、76、77、198、367或374位的一个或多个位置上的变异。 在一个实施方案中，植酸酶变体还包括一个或多个其它的变异，其中变异是92A、164E/S、 171I/V、192A或256A/E/P。在另一个实施方案中，在75、76、77、198、367或374位上一处或 多处的变异分别是75P、76R、77S、198R、367L或374P，且植酸酶变体还包括一个或多个其它 的变异，其中变异是92A、164E/S、171V、192A或256A/E/P。在另一个实施方案中，植酸酶变 体还包括一个或多个其它的变异，其中一个或多个其它变异的位置是26、37、89、134、160、 176、178、188、190、207、209、211、235、261、270、303 或 318。在另一个实施方案中，在位置 26、37、89、134、160、176、178、188、190、207、209、211、235、261、270、303 或 318 上的一个或 多个其它变异分别是 26E、037Y、089T、134I/V、160R、176K、178P、188N、190E、207E/T、209S、 211C、235V、261E、270K、303F或318D。在另一个实施方案中，植酸酶变体还包括一个或多个 其它的变异，其中一个或多个其它变异的位置是1、10、11、38、66、71、81、92、109、111、119、 120、121、141、142、152、155、193、214、239、245、248、255、268、277、283、285、287、288、293、 296、314、337、345、350、364、371、372、396、399、406 或 413。在另一个实施方案中，在位置 1、 10、11、38、66、71、81、92、109、111、119、120、121、141、142、152、155、193、214、239、245、248、 255、268、277、283、285、287、288、293、296、314、337、345、350、364、371、372、396、399、406 或 413 上的一个或多个其它变异分别是 1S、10I、11I、38S、66E、71K、81A、92E、109Q、111G、 119N、120L、121E、141R、142L、152M、155E、193Q、211C、214V、235V、239K、245D、248L、255A、 261E、268A/T、270K、277T、283D、285K、287D、288A、293G 或 296S。通常，在另一个方面，提供的植酸酶变体具有植酸酶活性以及不同于野生型布丘 氏菌属物种植酸酶氨基酸序列(SEQ ID NO 1)的氨基酸序列，其中植酸酶变体的氨基酸序 列与SEQ ID NO 1相比包括至少一个变异，其中植酸酶序列变异包括a)N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K198R, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374Pb)N37Y, G77S, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K198R, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374Pc) N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I，H160R, F164E, T171I，T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374Pd)N37Y, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256P, A261E, N270K, A374Pe)S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374Pf)N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374Pg)N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374Ph)S75P, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E,A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374Pi)S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, P367L, A374Pj)N37Y, A89T, D92A, T134I, F164E, T171I, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374Pk)N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P1)N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374Pm) N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I，F164E, T171V, T176K, A178P, K207E，A209S， A235V, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374Pη)Ν37Υ, S75P, Α89Τ, D92A, Τ134Ι, H160R, F164E, T171V, Τ176Κ, Α178Ρ, Κ207Ε, A209S, A235V, S248L, Q256Y, Α261Ε, Ν270Κ, Α374Ρο)Ν37Υ, Α89Τ, D92A, Τ134Ι, H160R, F164S, Τ171Ι, Τ176Κ, Α178Ρ, S188P, G192A, Κ207Ε, A209S, A235V, S248L, Q256E, Α261Ε, Ν270Κ, Α374Ρp)A89T, D92A, Τ134Ι, H160R, F164E, T171V, Τ176Κ, Α178Ρ, G192A, Κ207Ε, A209SA235V, S248L, Q256Y, Α261Ε, Ν270Κ, Α374Ρq)Ν37Υ, S75P, Α89Τ, D92A, Τ134Ι, H160R, F164S, T171V, Τ176Κ, Α178Ρ, S188P, Κ207Ε, A209S, S248L, Q256H, Α261Ε, Ν270Κ, Α374Ρr)Ν37Υ, S75P, Α89Τ, D92A, Τ134Ι, F164S, T171V, Τ176Κ, Α178Ρ, S188P, G192A, Κ207Ε, A209S, S248L, Q256A, Α261Ε, Ν270Κ, Α374Ρs)S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P ；或t)N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P.在一个实施方案中，植酸酶序列变异包括N37Y、S75P、Q76R、A89T、D92A、T134I、 H160R、F164E、T171I、T176K、A178P、S188P、G192A、K207E、A209S、A235V、S248L、Q256Y、 A261E、N270K、A374P。还提供了植酸酶，其与本文公开的植酸酶具有至少最小的百分比序列同一性和/ 或百分比同源性，其中最小百分比同一性和/或同源性是至少50%、至少60%、至少75%、 至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或 至少99%。通常，在一个方面，提供了植酸酶变体，其具有植酸酶活性以及不同于野生型布丘 氏菌属物种植酸酶氨基酸序列(SEQ ID NO 1)的氨基酸序列，其中植酸酶变体的氨基酸序 列与SEQ ID NO :1相比包括至少一个变异，其中变体具有在下列位置中至少任一处的变 异:70、193、197、221和407。在一个实施方案中，变体具有至少下列的变异:N70Y、H193R、 F197E、S221P 和 A407P。通常，在另一个方面，提供了编码本文公开的任何植酸酶的核酸。在另一个方面， 提供了包括编码本文公开的任何植酸酶的核酸的载体。在其他方面，提供了包括本文所述核酸和/或载体的宿主细胞。通常，在另一个方面，提供了在宿主细胞中生产植酸酶变体的方法，所述变体是根 据本文公开的变体，包括a)用DNA构建体转化宿主细胞，所述DNA构建体包括编码本文公开的任何植酸酶 变体的核酸，和b)在合适的培养基中培养转化的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真菌细胞、细菌细胞或植物细胞。在一个方面，提供了本文公开的方法制备的植酸酶。通常，在一个方面，包括本文公开的至少一种植酸酶的酶组合物还包括一种或多 种葡糖淀粉酶、α -淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖 酶、环糊精糖基转移酶(cyclodextrin glycotransferase)、脂肪酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角 质酶、另一种植酸酶或其任意的组合。在一个实施方案中，组合物还包括α-淀粉酶。通常，在另一个方面，提供了如本文所述的植酸酶，或如本文所述的酶组合物在淀 粉液化、糖化、发酵或同时糖化-发酵中的用途。在一个实施方案中，淀粉液化、糖化、发酵 或同时糖化-发酵是用于生产发酵醇。在另一个实施方案中，醇是乙醇或丁醇。在另一个 实施方案中，对底物进行淀粉液化、糖化、发酵或同时糖化-发酵。在一个实施方案中，底物 包括淀粉。在另一个实施方案中，底物包括谷物(grain)或谷类(cereal)。在其他实施方 案中，谷物或谷类是小麦、大麦、黑麦、燕麦、玉米、高粱、玉米蛋白粉(corn gluten meal)、 干酒糟及可溶物(Distillers Dried Grain Solubles, DDGS)、小麦麸、粗小麦粉、碎麦粉、 稻、燕麦壳、棕仁、柑桔渣或其组合。在一个实施方案中，稻包括米糠或稻壳。通常，在另一个方面，提供了如本文所述的至少一种植酸酶作为食品或饲料添加 剂的用途。在另一个方面，至少一种如本文公开的植酸酶作为含有干酒糟及可溶物(DDGS) 的食品或饲料添加剂的用途。通常，在其他方面，提供了生产食品或动物饲料的方法，包括将至少一种如本文公 开的植酸酶，或如本文公开的酶组合物，与另一种食品或饲料成分混合，形成所述食品或动 物饲料的步骤。通常，提供了生产食品或动物饲料的方法，包括将液体形式的至少一种如本文公 开的植酸酶，或如本文公开的酶组合物喷雾到所述食品或动物饲料上的步骤。在一个方面， 生产食品或动物饲料的方法包括将作为干产物的至少一种如本文公开的植酸酶，或如本文 公开的酶组合物与所述食品或动物饲料混合的步骤。在另一个方面，提供了生产动物饲料的方法，包括将至少一种如本文公开的植酸 酶，或如本文公开的酶组合物，与另一种食品或饲料成分混合，形成所述动物饲料的步骤。 在其他方面，提供了生产动物饲料的方法，包括将液体形式的至少一种如本文公开的植酸 酶，或如本文公开的酶组合物喷雾到所述动物饲料上的步骤。在另一个方面，提供了生产动 物饲料的方法，包括将作为干产物的至少一种如本文公开的植酸酶，或如本文公开的酶组 合物与所述动物饲料混合的步骤。通常，在另一个方面，提供了食品或动物饲料的组合物，包括i)至少一种如本文 公开的植酸酶，或如本文公开的酶组合物，和/或ii)通过如本文公开的方法生产的食品或 动物饲料。在其他方面，提供了动物饲料组合物，包括i)至少一种如本文公开的植酸酶，或如本文公开的酶组合物，和/或ii)通过如本文公开的方法生产的食品或动物饲料。在一个方面，提供了至少一种如本文公开的植酸酶，或如本文公开的酶组合物在 食品或动物饲料中的用途。在另一个方面，提供了至少一种如本文公开的植酸酶，或如本文 公开的酶组合物在动物饲料中的用途。通常，在另一个方面，提供了降低动物粪便中的磷水平的方法，特征是所述动物是 用至少一种如本文公开的植酸酶，或如本文公开的酶组合物，或通过本文公开的方法制备 的饲料，或如本文公开的组合物喂养，其中所述植酸酶的量可有效地转化所述动物饲料中 含有的植酸盐。通常，在一个方面，提供了至少一种如本文公开的植酸酶，或如本文公开的酶组合 物，或用通过本文公开的方法制备的饲料，或如本文公开的组合物的用途，用于生产动物饲 料，降低用所述植酸酶多肽喂养的动物粪便中的磷水平。附图简述
图1显示了野生型布丘氏菌属物种P1-29植酸酶(“BP-WT”)的氨基酸序列(SEQ ID NO :1)。图2显示了根据本公开文本的一种有利变体的氨基酸序列(SEQ IDNO 2)。图3显示了野生型布丘氏菌属物种P1-29的核酸序列(SEQ ID NO :3)。图4显示了图2所示的根据本公开文本的有利变体的核酸序列(SEQID NO 4)。图5代表根据本发明的三种酶(BP 110、BP-Ill和BP-112)的氨基酸序列，以及 BP-17的序列和wt序列。图6显示了源自布丘氏菌属的植酸酶、变体BP-17、BP 110、BP-111和BP-112、以 及Phyzyme XP、Natuphos和Ronozyme P对增加的胃蛋白酶浓度的抗性。数据相对于在不 含胃蛋白酶的条件下在PH 2孵育。A 所有的数据点；B:相同的数据但只显示超过70%的
回收。
图7显示了实施例11中使用的饲料加工设备(饲料制粒(pelleting))的示意图。
图8显示了I 据图。
图9显示了I 据图。
图10显示了ξ数据图。
图11显示了 ξ数据图。
图12显示了ξ数据图。
图13显示了ξ数据图。
图14显示了ξ数据图。
图15显示了 HPLC数据图。
图16显示了 HPLC数据图。
发明的详细描述
本文公开了布丘氏菌属物种植酸酶的变体，所述变体可用于工业应用，包括淀粉
液化的方法、醇发酵和增加食品和动物饲料中的磷酸盐消化。特别地，根据本公开文本的植 酸酶变体可非常有效的用于燃料乙醇生产工艺的淀粉液化步骤中的植酸盐降解。本公开文 本的变体包括在野生型布丘氏菌属物种植酸酶(SEQ ID NO :1)的氨基酸序列上的一个或多 个变异(包括取代、插入和缺失)。在有利的实施方案中，变体的氨基酸序列包括与SEQ IDNO 1的氨基酸序列相比至少一个变异，所述至少一个变异是位于选自75、76和374位的1 个、2个或3个位置上，其中各个位置对应于SEQID NO 1的氨基酸序列的位置。例如，在根据本公开文本的实施方案的植酸酶变体中的变异有利地选自对应于 SEQ ID NO 1 的 S75、Q76 和 A374。在本公开文本的有利的实施方案中，植酸酶变体的变异是取代，所述取代可选自 S75P、Q76R和A374P，其中各个位置对应于SEQ ID NO :1的氨基酸序列的位置。在其他有利的实施方案中，根据本公开文本的植酸酶变体包括其它的变异，位于 选自N37、G77、H160、F164、、T171、S188、G192、K198、A235、Q256 和 / 或 P367 的一个或多 个位置上，其中各个位置对应于SEQ IDN0 1的氨基酸序列的位置。在其他有利的实施方案中，根据本公开文本的植酸酶变体的变异是取代，所述取 代可位于选自N37Y、G77S、H160R、F164E、F164S、T171V、T171I、S188P、G192A、K198R、A235V、 Q256P、Q256A、Q256E和/或P367L的一个或多个位置上。在其他有利的实施方案中，根据本公开文本的植酸酶变体包括其它的变异，位于 选自A89、D92、T134、F164、T176、A178、K207、A209、S248、Q256、A26E 和 / 或 N270 的一个 或多个位置上。此外，在其他有利的实施方案中，根据本公开文本的植酸酶变体包括其它的变异， 位于选自A89T、D92A、T134I、F164S、T176K、A178P、K207E、A209S、S248L、Q256Y、A261E 和 /或N270K的一个或多个位置上。在其他有利的实施方案中，根据本公开文本的植酸酶变体包括SEQ IDN0 2的序 列。根据本公开文本的有利的植酸酶变体包括含有变异的序列，所述变异选自a)N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K198R, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374Pb)N37Y, G77S, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K198R, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374Pc) N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I，H160R, F164E, T171I，T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374Pd)N37Y, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256P, A261E, N270K, A374Pe)S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374Pf)N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374Pg)N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374Ph)S75P, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, S 188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374Pi)S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, P367L, A374P
j)N37Y, A89T, D92A, T134I, F164E, T171I, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374Pk)N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P1)N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374Pm) N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I，F164E, T171V, T176K, A178P, K207E，A209S， A235V, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374Pn)N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374Po)N37Y, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256E, A261E, N270K, A374Pp)A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374Pq)N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, K207E, A209S, S248L, Q256H, A261E, N270K, A374Pr)N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374Ps)S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374Pt)N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P.本公开文本的实施方案还包括序列a)至t)所述的任何植酸酶的变体，其具有植 酸酶活性以及这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与序列a)至t)所述的各植酸酶变体相 比，具有至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少 95%、至少96%、至少97%、至少98%和至少99%的百分比序列同一性和/或百分比同源性。本文中使用氨基酸的名称、三字母缩写或单字母缩写指代氨基酸。下表提供了标 准氨基酸及其缩写的列表。
丙氨酸AAla半胱氨酸CCys天冬氨酸DAsp谷氨酸EGlu苯丙氨酸FPhe
权利要求
1.与野生型布丘氏菌属物种(Buttiauxellasp.)植酸酶(SEQ ID NO 1)相比，具有 至少约5°C的改善的热活性的植酸酶变体。
2.权利要求1的植酸酶变体，其中与植酸酶SEQID NO :1相比，改善的热活性是至少 约 17°C。
3.权利要求1或权利要求2的植酸酶变体，其中改善的热活性的范围是从约17°C至约 21 °C。
4.权利要求1-3的任一项的植酸酶变体，其中改善的热活性的范围是从约17.4°C至约 20. 2V。
5.热稳定的植酸酶变体，其在pH5. 5在缓冲液中暴露在升高的温度下10分钟后，能 够保留大于50%的活性，其中，升高的温度是比野生型布丘氏菌属物种植酸酶(SEQ ID NO 1)保留大于50%的活性的温度高至少约5°C。
6.权利要求5的热稳定的植酸酶变体，其中升高的温度是至少约20.5°C或更高。
7.权利要求5或权利要求6的热稳定的植酸酶变体，其中升高的温度的范围是从约 20. 5°C至约 27"C。
8.权利要求5-7的任一项的热稳定的植酸酶变体，其中升高的温度的范围是从约 20. 2°C至约 26. 8"C。
9.植酸酶变体，其具有植酸酶活性以及不同于野生型布丘氏菌属物种植酸酶氨基酸序 列(SEQ ID NO 1)的氨基酸序列，其中植酸酶变体的氨基酸序列包含在对应SEQ ID NO 1 的75、76、77、198、367或374位的一个或多个位置上的变异。
10.权利要求9的植酸酶变体，其中植酸酶变体还包括一个或多个其它的变异，其中变 异是 92A、164E/S、171I/V、192A 或 256A/E/P。
11.权利要求9或权利要求10的植酸酶变体，其中在75、76、77、198、367或374位上一 处或多处的变异分别是75P、76R、77S、198R、367L或374P，且植酸酶变体还包括一个或多个 其它的变异，其中变异是92A、164E/S、171V、192A或256A/E/P。
12.权利要求9-11的任一项的植酸酶变体，其中植酸酶变体还包括一个或多个其它的 变异，其中一个或多个其它变异的位置是26、37、89、134、160、176、178、188、190、207、209、 211、235、261、270、303 或 318。
13.权利要求12的植酸酶变体，其中在位置26、37、89、134、160、176、178、188、190、 207、209、211、235、261、270、303或318上的一个或多个其它的变异分别是26E、037Y、089T、 134I/V、160R、176K、178P、188N、190E、207E/T、209S、211C、235V、261E、270K、303F 或 318D。
14.权利要求9-13的任一项的植酸酶变体，其中植酸酶变体还包括一个或多个其它 的变异，其中一个或多个其它变异的位置是1、10、11、38、66、71、81、92、109、111、119、120、 121、141、142、152、155、193、214、239、245、248、255、268、277、283、285、287、288、293、296、 314、337、345、350、364、371、372、396、399、406 或 413。
15.权利要求14的植酸酶变体，其中在位置1、10、11、38、66、71、81、92、109、111、119、 120、121、141、142、152、155、193、214、239、245、248、255、268、277、283、285、287、288、293、 296、314、337、345、350、364、371、372、396、399、406 或 413 上的一个或多个其它的变异分 别是 1S、10I、11I、38S、66E、71K、81A、92E、109Q、111G、119N、120L、121E、141R、142L、152M、 155E、193Q、211C、214V、235V、239K、245D、248L、255A、261E、268A/T、270K、277T、283D、285K、287D、288A、293G 或 296S。
16.植酸酶变体，其具有植酸酶活性以及不同于野生型布丘氏菌属物种植酸酶氨基酸 序列(SEQ ID NO 1)的氨基酸序列，其中植酸酶变体的氨基酸序列与SEQ ID N0:1相比包 括至少一个变异，且其中植酸酶序列变异包括a)N37Y,S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K198R, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374Pb)N37Y,G77S, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K198R, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374Pc)N37Y,S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374Pd)N37Y,A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256P, A261E, N270K, A374Pe)S75P,Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374Pf)N37Y,Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374Pg)N37Y,Q76R, A89T, D92A, T134I, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374Ph)S75P, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374Pi)S75P,Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, P367L, A374Pj)N37Y, A89T, D92A, T134I, F164E, T171I, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374Pk)N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P1)N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374Pm)N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374Pη)N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374Po)N37Y, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256E, A261E, N270K, A374Pρ) A89T，D92A, T134I，H160R，F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374Pq)N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, K207E, A209S, S248L, Q256H, A261E, N270K, A374Pr)N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E,A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374Ps)S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P ；或t)N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P。
17.权利要求16的植酸酶变体，其中植酸酶序列变异包括N37Y，S75P，Q76R，A89T， D92A，T134I，H160R，F164E，T171I，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L， Q256Y, A261E, N270K, A374P。
18.植酸酶，其与权利要求1-17的植酸酶具有至少最小的百分比序列同一性和/或百 分比同源性，其中最小百分比同一性和/或同源性是至少50%、至少60%、至少75%、至少 80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少 99%。
19.植酸酶变体，其具有植酸酶活性以及不同于野生型布丘氏菌属物种植酸酶氨基酸 序列(SEQ ID NO 1)的氨基酸序列，其中植酸酶变体的氨基酸序列与SEQ ID N0:1相比包 括至少一个变异，其中变体具有在下列位置中至少任一处的变异70、193、197、221和407。
20.权利要求19的植酸酶，其中变体具有至少下列的变异N70Y、H193R、F197E、S221P 和 A407P。
21.根据权利要求1-4的任一项的植酸酶变体，其中所述植酸酶包括权利要求5-8和/ 或权利要求9-15和/或权利要求16或17和/或权利要求18和/或权利要求19或20的 任何一个或多个特征。
22.根据权利要求5-8的任一项的植酸酶变体，其中所述植酸酶包括权利要求1-4和/ 或权利要求9-15和/或权利要求16或17和/或权利要求18和/或权利要求19或20的 任何一个或多个特征。
23.根据权利要求9-15的任一项的植酸酶变体，其中所述植酸酶包括权利要求1-4和 /或权利要求5-8和/或权利要求16或17和/或权利要求18和/或权利要求19或20的 任何一个或多个特征。
24.根据权利要求16-17的任一项的植酸酶变体，其中所述植酸酶包括权利要求1-4和 /或权利要求5-8和/或权利要求9-15和/或权利要求18和/或权利要求19或20的任 何一个或多个特征。
25.根据权利要求18的植酸酶变体，其中所述植酸酶包括权利要求1-4和/或权利要 求5-8和/或权利要求9-15和/或权利要求16-17和/或权利要求19或20的任何一个 或多个特征。
26.根据权利要求19-20的任一项的植酸酶变体，其中所述植酸酶包括权利要求1-4和 /或权利要求5-8和/或权利要求9-15和/或权利要求16或17和/或权利要求18的任 何一个或多个特征。
27.编码权利要求1-26的任一项的植酸酶的核酸。
28.包括权利要求27的核酸的载体。
29.包括权利要求27的核酸或权利要求28的载体的宿主细胞。
30.在宿主细胞中产生权利要求1-26的任一项的植酸酶变体的方法，其包括a)用DNA构建体转化宿主细胞，所述DNA构建体包括编码权利要求1_26的任一项的植 酸酶的核酸，和b)在合适的培养基中培养转化的宿主细胞。
31.权利要求19的方法，其中宿主细胞是真菌细胞、细菌细胞或植物细胞。
32.根据权利要求30或权利要求31的方法制备的植酸酶。
33.酶组合物，其包括权利要求1-26或权利要求32的任一项的至少一种植酸酶，另外 包括一种或多种葡糖淀粉酶、α -淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、半纤维 素酶、木聚糖酶、环糊精糖基转移酶、脂肪酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角质酶、另一种植酸酶或 其任意的组合。
34.权利要求33的酶组合物，其中包括α-淀粉酶。
35.根据权利要求1-26或权利要求32的植酸酶，或权利要求33或权利要求34的酶组 合物在淀粉液化、糖化、发酵或同时糖化-发酵中的用途。
36.权利要求35的用途，其中淀粉液化、糖化、发酵或同时糖化-发酵是用于生产发酵醇。
37.权利要求36的用途，其中醇是乙醇或丁醇。
38.权利要求35-37任一项的用途，其中对底物进行淀粉液化、糖化、发酵或同时糖 化-发酵。
39.权利要求38的用途，其中底物包括淀粉。
40.权利要求38或权利要求39的用途，其中底物包括谷物或谷类。
41.权利要求40的用途，其中谷物或谷类是小麦、大麦、黑麦、燕麦、玉米、高粱、玉米蛋 白粉、干酒糟及可溶物(DDGS)、小麦麸、粗小麦粉、碎麦粉、稻、燕麦壳、棕仁、柑桔渣或其组合。
42.权利要求41的用途，其中稻包括米糠或稻壳。
43.根据权利要求1-26或权利要求32的任一项的至少一种植酸酶作为食品或饲料添 加剂的用途。
44.根据权利要求1-26或权利要求32的任一项的至少一种植酸酶作为含有干酒糟及 可溶物(DDGS)的食品或饲料添加剂的用途。
45.生产食品或动物饲料的方法，包括将根据权利要求1-26或权利要求32的任一项的 至少一种植酸酶，或根据权利要求33或权利要求34的酶组合物，与另一种食品或饲料成分 混合，形成所述食品或动物饲料的步骤。
46.生产食品或动物饲料的方法，包括将液体形式的根据权利要求1-26或权利要求32 的任一项的至少一种植酸酶，或根据权利要求33或权利要求34的酶组合物喷雾到所述食 品或动物饲料上的步骤。
47.生产食品或动物饲料的方法，包括将作为干产物的根据权利要求1-26或权利要求 32的任一项的至少一种植酸酶，或根据权利要求33或权利要求34的酶组合物与所述食品 或动物饲料混合的步骤。
48.生产动物饲料的方法，包括将根据权利要求1-26或权利要求32的任一项的至少一 种植酸酶，或根据权利要求33或权利要求34的酶组合物，与另一种食品或饲料成分混合， 形成所述动物饲料的步骤。
49.生产动物饲料的方法，包括将液体形式的根据权利要求1-26或权利要求32的任一 项的至少一种植酸酶，或根据权利要求33或权利要求34的酶组合物喷雾到所述动物饲料 上的步骤。
50.生产动物饲料的方法，包括将作为干产物的根据权利要求1-26或权利要求32的任 一项的至少一种植酸酶，或根据权利要求33或权利要求34的酶组合物与所述动物饲料混 合的步骤。
51.食品或动物饲料的组合物，其包括i)根据权利要求1-26或权利要求32的任一项 的至少一种植酸酶，或根据权利要求33或权利要求34的酶组合物，和/或ii)通过根据权 利要求45-50的任一项的方法生产的食品或动物饲料。
52.动物饲料组合物，其包括i)根据权利要求1-26或权利要求32的任一项的至少一 种植酸酶，或根据权利要求33或权利要求34的酶组合物，和/或ii)通过根据权利要求 45-50的任一项的方法生产的食品或动物饲料。
53.根据权利要求1-26或权利要求32的任一项的至少一种植酸酶，或根据权利要求 33或权利要求34的酶组合物在食品或动物饲料中的用途。
54.根据权利要求1-26或权利要求32的任一项的至少一种植酸酶，或根据权利要求 33或权利要求34的酶组合物在动物饲料中的用途。
55.降低动物粪便中的磷水平的方法，特征是用根据权利要求1-26或权利要求32的 任一项的至少一种植酸酶，或根据权利要求33或权利要求34的酶组合物，或根据权利要求 45-50的任一项的方法制备的饲料，或根据权利要求51-52的任一项的组合物喂养动物，其 中所述植酸酶的量有效地转化所述动物饲料中含有的植酸盐。
56.根据权利要求1-26或权利要求32的任一项的至少一种植酸酶，或根据权利要求 33或权利要求34的酶组合物，或根据权利要求45-50的任一项的方法制备的饲料，或根据 权利要求51-52的任一项的组合物的用途，用于制备动物饲料，以降低用所述植酸酶多肽 喂养的动物粪便中的磷水平。
57.基本上如本文所述，并参考附图和/或序列表的植酸酶变体。
全文摘要
本发明提供了可用于工业应用的布丘氏菌属物种植酸酶的变体，所述应用包括淀粉液化的方法、醇发酵的方法和增强食品和动物饲料中的磷酸盐消化的方法。
文档编号A23K1/165GK102007211SQ200980113544
公开日2011年4月6日 申请日期2009年4月17日 优先权日2008年4月18日
发明者B·勒斯奈尔, J·舍蒂, 派兰格尔 K·舒尔策, M·佩普森, 伊萨克森 M·福斯科, O·肯施, S·达尔斯伽德 申请人:丹尼斯科美国公司