专利名称：体细胞植物胚胎的分散方法和装置的制作方法
体细胞植物胚胎的分散方法和装置
背景技术：
问题领域的一般性介绍植物中体细胞胚胎发生是由作为植物组织细胞的初始外植体形成体细胞胚胎的 过程。所形成的体细胞胚胎是提供初始外植体的植物的相同基因副本。体细胞胚胎发生过 程从而提供了对于具有商业利益的选定基因型的增殖获得大量基因相同植物的工具，用于 保护濒危物种或出于研究目的繁育基因统一的植物材料。该问题相关程序的生理背景为了从针叶树体细胞胚胎来生产植物，应用多步骤程序以满足以下且示于
图1的 不同发展阶段的生理需要。体细胞胚胎发生启动是在含有固化培养介质的植物生长调节剂 上，由初始外植体的体细胞胚胎通常是未成熟合子胚的诱导开始的。体细胞胚胎通常在相 同组成的培养介质上继续形成，并且形成增殖胚胎发生培养形式。在增殖阶段，出现几个关 键特征，其通常被认为对体细胞胚胎发生过程有益(i)通过无限制增殖未成熟合子胚进 行基因型相同的繁殖体的大量繁殖；(ii)增殖低温储存证实了克隆胚胎实质上的永久储 存，即建立克隆银行；(iii)未成熟合子胚的转基因改良允许大规模繁殖基因改良繁殖体。 在程序的下一步，增殖体细胞胚胎经受生长介质，其触发胚胎发育以进展到成熟阶段。从增 殖到成熟的转换只发生在培养的部分增殖胚胎中。在来自顽拗型针叶树种基因型中更频繁 地遇到低转换率，但这在所有的针叶树种以及其它植物中常见。需要人力收集随转换率下 降而增加的胚胎，由此存在污染和其它不准确的成本和风险。从增殖到成熟的低转换率是 体细胞胚胎发生程序的大规模商业应用的主要瓶颈。对于萌发而言，成熟体细胞胚胎在许 多不同的步骤中经历不同的培养阶段，以诱导根和芽的形成；干燥、蔗糖处理、红光诱导和 蓝光刺激。此后，将认为适当发育的发芽胚胎转移到堆肥材料，并逐步转移到体外环境中， 在此期间蔗糖含量降低。发芽期间对植物的不同处理需要对各个芽和植物进行反复手工处 理，对整体程序而言增加了可观的成本。用于从体细胞胚生产植物的现有技术需要在几个步骤中进行手工处理，使得程序 费时、昂贵和不准确。对于针叶树种，采用的标准程序包括需要手工处理的几个步骤。一般的程序概述 于图 1(参见例如von Arnold S. Clapham D. Spruceembryogenesis. 2008. Methods MoI Biol. 2008 ；427 31-47 ；Belmonte M F, Donald G, Reid D Μ, Yeung E C and Stasolla C. 2005. Alterations of theglutathione redox state improve apical meristem structure and somatic embryoquality in white spruce (Picea glauca). J Exp Bot, Vol. 56，No. 419，pp.2355-2364)。有四个步骤依靠手工处理以从成熟体细胞胚胎获得小植物，如
图1所示。第一手 工相互作用[1]是在将成熟胚胎与未成熟胚胎隔离(120)后，在无菌条件下将其水平放置 在塑料容器中；第二 [2]发生在静止3-7天后(130)，然后将成熟胚胎转移到用于引发萌发 过程的凝胶培养介质中。萌发的体细胞胚将在适当的培养介质组合物和光照条件下开始出 根(140)。第三手工转移[3]是将形成有小根的芽转移至根部分浸没在液体发芽介质(150)中的直立位置。第四[4]和最终转移是当发芽胚胎有主根和小侧根时，将其转移到盆中固 体培养基中用以进一步植物形成(160)。表1.
图1附图标记说明
权利要求
1.一种将悬浮在液体中的植物胚胎簇分散成单个植物胚胎的方法，所述方法包括至少 一个分散序列，其包括以下步骤i)使所述胚胎簇经受流体力学力，以引起轴向拉伸应变和径向压缩应变；ii)使所述胚胎簇经受流体力学力以引起来自流体力学力的轴向压缩应变和径向拉伸 应变；顺序重复所述步骤，直至所述单个胚胎彼此分离。
2.根据权利要求1所述的方法，其中拉伸和压缩应变的强度随每个重复序列而增加。
3.一种用于分离包含在胚胎簇中的单个胚胎的分散器，其特征在于，其包括具有至少 一个收缩的流道，使得流过所述流道的胚胎簇首先经受轴向拉伸应变和径向压缩应变，然 后经受来自流体力学力的轴向压缩应变和径向拉伸应变。
4.根据权利要求3所述的分散器，其中所述流道包括至少两个收缩，每个收缩的内径 等于或小于紧邻其上游的所述收缩的内径。
5.根据权利要求3-4中任一项所述的分散器，其中所述流道包括在各个收缩之间具有 恒定截面积的中间部分。
6.根据权利要求5所述的分散器，其中每个中间部分的内径等于或小于紧邻其上游的 所述中间部分的内径。
7.根据权利要求5-6中任一项所述的分散器，其中每个中间部分具有至少等于待分散 胚胎簇的长度。
8.根据权利要求7所述的分散器，其中每个中间部分的长度为2.5mm-60mm，优选为约 5mm-约 30mmο
9.根据权利要求3-8中任一项所述的分散器，其中所述收缩的数目是1-100，优选 5-20，最优选约10。
10.根据权利要求3-9中任一项所述的分散器，其中所述收缩的截面积为 0. 75-1300mm2，优选 3_32mm2。
11.根据权利要求3-10中任一项所述的分散器，其中所述流道具有轴对称横截面。
12.根据权利要求3-10中任一项所述的分散器，其中所述流道具有基本圆形或椭圆形 的横截面。
13.根据权利要求3-10中任一项所述的分散器，其中至少部分所述流道具有非轴对称 横截面，如矩形横截面。
14.根据权利要求13所述的分散器，其中每个非轴对称收缩的具有最大尺寸的横截面 定向为使得每个收缩的最大尺寸相对于序列中下一个非轴对称收缩的最大尺寸旋转至少 30度，优选约90度。
15.根据权利要求13所述的分散器，其中每个收缩的横截面呈现为具有第一和第二边 的矩形，其中所述第一边长于所述第二边，并且所述收缩定向为使得每个收缩的第一边垂 直于序列中具有矩形横截面的下一个收缩的第一边。
全文摘要
公开了一种将悬浮在液体中的体细胞植物胚胎簇分散的方法。所述方法包括i)使胚胎簇经受流体力学力以引起轴向拉伸应变和径向压缩应变；ii)使胚胎簇经受流体力学力以引起来自流体力学力的轴向压缩应变和径向拉伸应变；和iii)顺序重复所述步骤，直至单个胚胎彼此分离。该设备可包括具有至少一个收缩的流道，使得流过所述流道的胚胎簇首先经受轴向拉伸应变和径向压缩应变，然后经受来自流体力学力的轴向压缩应变和径向拉伸应变。
文档编号A01H4/00GK101998823SQ200980112745
公开日2011年3月30日 申请日期2009年4月9日 优先权日2008年4月10日
发明者西鲁斯·K·艾敦 申请人:佐治亚科技研究公司