专利名称：向日葵中的显性早熟性突变和基因的制作方法
向日葵中的显性早熟性突变和基因
背景技术：
向日葵是为动物和人类两者供应食物的一种重要且有价值的大田作物。植物育种人员的持续目的是开发稳定的、高产率向日葵杂种，它们在农艺学上是可靠的，使得所使用 土地上生成的种子量最大化。为了实现这个目的，向日葵育种人员必须选择和开发这样的 向日葵植物，其具有的性状促成用于生成杂种的卓越亲本品系。向日葵(Helianthus annuus L.)可以通过自花传粉和异花传粉技术两者来育种。 向日葵头部(花序)通常由与共同的基底(花托)相连的约1，000至2，000个个体盘花构 成。圆周周围的花是既没有雄蕊也没有雌蕊的舌状边花。剩余的花是两性的且雄蕊先熟的盘花。当开花起始于自合瓣花冠部分外露的管出现时发生向日葵的天然传粉。管由五个 聚药花药形成，并且花粉在管的内表面上释放。花柱快速延长，并迫使柱头通过该管。柱头 的两个裂片向外张开，并且易于接受花粉，但是最初它们自身的花粉达不到。虽然这很大程 度上阻止个体花的自花传粉，但是花通过昆虫、风和重力而暴露于来自同一头部上的其它 花的花粉。对有前景的高级育种系进行彻底地测试并与代表商业目标区域的环境中的合适 标准品比较至少三年。最好的品系是新商业栽培种的候选；那些在少数几个性状方面仍有 缺陷的品系作为亲本使用以产生供进一步选择用的新种群。这些过程(它们通向最终的上市(marketing)和销售(distribution)步骤)从 进行第一次杂交的时间起通常花费8至12个世代。因此，新栽培种的开发是耗时的过程， 其需要精确的预先计划、资源的有效使用和最低限度的方向变化。最困难的任务是鉴定遗传上卓越的个体，因为对于大多数性状，真实基因型的值 被其它混杂的植物性状或环境因素掩盖。一种鉴定卓越植物的方法是观察其相对于其它实 验植物和广泛种植的标准栽培种的性能(performance)。如果单次观察没有结论，则重复观 察可提供对其遗传价值的更好评估。每年，植物育种人员选择种质来推进到下一世代。将这种种质在独特的且不同的 地理、气候和土壤条件下种植，然后在生长期期间和结束时进行进一步选择。开发出的近交 系是不可预测的。这种不可预测性的产生是由于育种人员的选择发生在独特的环境中，在 DNA水平上没有对照(使用常规的育种流程)，而且产生数百万不同的可能的遗传组合。具 有本领域普通技术的育种人员不能预测最终会开发出的最后所得品系，只是可能以非常粗 略且大体的方式。同一育种人员不能通过使用完全相同的初始亲本和相同的选择技术来产 生相同的品系两次。这种不可预测性导致花费大量的研究资金来开发卓越的新型向日葵近 交系。关于通常用于不同性状和作物的育种方法的描述可以参见数本参考书之一(例 如 Allard, 1960 ；Simmonds, 1979 ；Sneep 等，1979 ；Fehr, 1987)。Heaton等报告了突变向日葵，但是所述突变的基因座是未知的。 T.C.Heaton 等，1981, "Rapid Conversion of Maintainer Lines to CytoplasmicSterility,，，Proceedings Sunflower Forum and Research Workshop,第 23 页。发明概述本发明部分涉及自发向日葵突变的发现。本发明涉及“早熟(early)”突变及相 关近交物/杂种开发。本发明进一步提供了一种单显性基因，其在向日葵近交等位基因系 (isoline)和近等基因杂种中赋予早熟性。没有此基因用于工业中杂种开发的效用的已知 现有教导或提示。本发明还提供了一种新的且独特的向日葵近交系，称作H120R。本发明包括拥有此突变基因的种子、通过种植这些种子生成的植物、和其拥有此 突变基因及相关早熟性性状的子代。本发明还包括用于生成此类向日葵种子和植物(包括 近交物和杂种)的方法。可以通过例如将所述近交系与其自身或者与另一向日葵品系杂交 来生成此类植物。本发明进一步涉及此类植物和用于生成此类向日葵植物的方法，所述向 日葵植物在其遗传物质中还含有一种或多种转基因。还提供了本发明向日葵植物的部分， 诸如例如从近交植物获得的花粉和近交植物的胚珠，其中这些部分包含本发明的早熟性基 因。本发明可以显著降低物候期萌发开花(phenophase emergence flowering)，而不 影响充盈期。本发明还可以显著提高IC。还可以使用本发明来为需要较短成熟的其它地理 环境(geography)对较早熟等位基因系中非常晚熟的、良种近交物进行基因转变。还可以 使用本发明来提高密度耐受性，并用于间作。附图简述
图1显示了 H120R等位基因系的照片，其显示了晚熟阿根廷品系H120R与其早熟 突变型式之间的花发育比较。图2显示了基因型X223 (MG2em)和MG2的(A)叶面积指数和由作物截取的⑶入 射辐射比例(Qd)与离第一次开花的时间之间的关系。当比符号大时，垂直的工形线指明标
准偏差。图3显示了基因型X223(MG2em)和MG2的种子重量与离第一次开花的时间之间的 双线性关系。当比符号大时，垂直的工形线指明标准偏差。图4显示了基因型X223(MG2em)和MG2的收获指数(在合成成本方面校正)与离 第一次开花的时间之间的双线性关系。当比符号大时，垂直的工形线指明标准偏差。图5显示了早期开花(EF)基因的主要基因座的遗传学图。参见实施例8。图6显示了用于标志物开发的策略。图7显示了在本发明的早期开花基因侧翼的标志物。图8显示了加速的渐渗(introgression)策略。序列简述SEQ ID NO :1_60是正向和反向引物，如实施例8中所讨论的。SEQ ID NO :61 是 HA1805 正向引物。SEQ ID NO :62 是 HA1805 反向引物。SEQ ID NO :63是基因组序列，其包含两个单核苷酸多态性(SNP)基因座，如实施 例9中所讨论的；SEQ ID NO 82显示了 SNP，如在早期开花/早熟基因/品系中找到的。SEQ ID NO :64是用于扩增“R” SNP基因座的正向引物。SEQ ID NO :65是用于扩增“R” SNP基因座的反向引物。
SEQ ID NO 66是在R基因座处包含早熟核苷酸/多态性的探针。SEQ ID NO 67是在R基因座处包含野生型核苷酸的探针。SEQ ID NO :68_81是实施例9中所讨论的标志物序列。SEQ ID NO 82是基因组序列，其包含两个单核苷酸多态性(SNP)，如实施例9中 所讨论的；如在早期开花/早熟基因/品系中找到的SNP存在于残基65 ( “Y”基因座)和 125 ( “R”基因座)处。发明详述本发明部分涉及自发向日葵突变的发现。本发明涉及“早熟”突变及相关近交物/ 杂种开发。本发明进一步提供了一种单显性基因，其在向日葵近交物和杂种(包括近交等 位基因系和近等基因杂种)中赋予早熟性。没有关于此基因用于工业中杂种开发的效用的 已知现有教导或提示。本发明还提供了一种新的且独特的向日葵近交系，称作H120R。在 H792A近交物增加区组(increase block)的苗圃行2290141中发现了所述突变。
图1是 H120R等位基因系的照片，其显示了晚熟阿根廷品系H120R与其早熟突变型式之间的花发 育比较。此基因是通过向日葵育种群体中的天然突变产生的。最初使用它来创建超早熟型 式的早熟近交物，其追求对短成熟区的适应。随后，其用于标准化超晚熟近交物的潜在用途 得到理解和应用。由主题基因赋予的主题性状的遗传力表现为质量的(单一的且不完全的显性)。 效果被视为明显显性的，但是存在“基因剂量”效果的一些指征。此基因的插入(例如通过回交)会容许在较早环境中直接使用经基因转变的晚熟 向日葵近交物。它还可以用于其它作物中的转基因研究和开发。所述基因可以容许具有期望性状(数量的和质量的)的晚熟基因型移入较早(较 短季节)环境中。可以对其它作物的转基因开发应用相同的观念。也就是说，也可以对此 性状育种或者以其它方式导入其它非向日葵作物中。例如，凭借成功的应用，可以获得热带 玉米种质供例如美国中部玉米带使用。另外，中部玉米带种质可以向北方移动。早熟基因还可以具有作为回交性状的辅助的效用，它的一些例子包括胞质雄性不 育或咪唑啉酮(imidazilinone) (IMI)抗性。如果用期望的供体性状选择杂合早期开花回 交F1子代，则可以缩短基因转变(conversion)周期。(当选择期望的成熟时，自交会在基 因转变的最终阶段发生。)可以通过育种的回交方法来将此基因转移到其它向日葵近交物。仅需要一种经基 因转变的近交物来开发赋予较早成熟的杂种。对于广泛范围的常规回归亲本成熟，早熟突变基因表现为赋予在到开花的天数上 (并因此在成熟上)的相对成比例减少。成比例开花/成熟修饰是期望的，因为对于所有近 交物，并且因此对于杂种，对于受限制上市区域(restricted marketing area)在相同的天 数中成熟都是不想要的。本发明包括拥有此突变基因的种子、通过种植这些种子产生的植物、和其拥有此 突变基因及相关早熟性性状的子代。本发明还包括用于产生此类向日葵种子和植物(包括 近交物和杂种)的方法。可以通过例如将此类近交系与其自身或与另一向日葵品系杂交来 产生此类植物。本发明进一步涉及此类植物和用于产生在其遗传物质中还含有一种或多种转基因的此类向日葵植物的方法。还提供了本发明的向日葵植物的部分，诸如例如自近交 植物获得的花粉和近交植物的胚珠，其中这些部分包含本发明的早熟性基因。“早熟性”意为到生理学成熟的平均时间(其中生理学成熟定义为完成向日葵植物 种子充盈的时间)，其范围为约60天至约90天之间。在一些实施方案中，这可以从约60天 至约70天。“早期开花”意为到向日葵植物开花的平均时间，其范围为约48天至约66天之间。 在一些实施方案中，这可以从约48天至约55天。通过常规的筛选，预期EM植物可以在早熟性和早期开花方面变化约10%。对于EM和野生型，头部大小(头部外围)、干种子重量和/或产率在统计学上是相 同的。CNE840B是H840B的早熟突变体基因转变。即它们在遗传学上相同，只是CNE840B 具有突变，而H840B没有。CNE840B是H840B (作为回归亲本)x早熟突变供体亲本的回交5 ttj^fe (backcross 5 derivation)。作为本公开内容的一部分，已经根据布达佩斯条约于2007年10月17日保藏了早 熟向日葵品系CNE840B(包含早熟性基因)的至少2500粒种子，并且在没有限制的前提下 (但受制于专利权)通过美国典型培养物保藏中心(ATCC)Manassas，VA 20110-2209使公 众可以获得。保藏物被称为ATCC保藏号PTA-8715。保藏物会在没有限制的前提下在ATCC 保藏机构(其是公共保藏机构)保持30年，或者在最新的要求之后的5年期间，或者达该 专利的有效寿命，以较长者为准，并且在该期间里若其变得不能存活，则会被替换。所保藏的种子是本发明的一部分。明显地，可以从这些种子种植植物，并且此类植 物是本发明的一部分。本发明还涉及这些植物中含有的DNA序列。其相关早熟子代(包括 亲本植物和此类子代植物在杂交中的用途)是本发明的一部分。本发明的检测方法和试剂 盒可以涉及鉴定任何保藏物和/或其子代品系。在其它方面，本发明提供了可再生的细胞(包含此类基因)，用于例如组织培 养。优选地，组织培养物会能够再生具有前述向日葵植物的生理学和形态学特征的植物， 并能够再生与前述近交向日葵植物具有基本上相同基因型的植物。优选地，在此类组织培 养物中的可再生细胞会是胚、花粉、胚珠、叶、茎、皮层、髓(pith)、总苞苞片(involucral bract)、边花、盘花、冠毛(pappi)、瘦果、蜜腺、花间苞片(interfloral bract)、花托、毛状 体柱头、花药、花柱、花丝、萼、果皮、种皮、胚乳、胚、根、根尖、种子等。更进一步，本发明提供 了自本发明的组织培养物再生的早熟的向日葵植物。与回归亲本的68和75天相比，H418R和H120R的早熟等位基因系中到开花的时 间分别是62天和66天。对于牵涉正常的早熟品系向早熟突变体基因转变的比较，在一处 位置，在组1F3早熟突变体衍生(具有非常早熟分离F3衍生中的基因)中开花在种植后少 至35-37天发生，相对于正常(组1衍生)非常早熟(组1)近交物的48天。在另一处位 置，早熟突变体等位基因系及其晚期成熟回归亲本H840B(阿根廷近交物)的到开花天数分 别是64对80。成熟分类从回归亲本的组7 (非常晚)改变成组3的早熟突变体基因转变 (适度早)。主题基因还可以堆叠其它性状。这可以多种方式实现。与其它品系(具有其它性 状)的杂交育种是本领域中已知的。参见例如CLEARFIELD 向日葵(Helianthus annuus)品系X81359。还有，可以对主题性状和/或其它性状进行遗传工程化改造以获得包含期望 性状组合的植物。例如，可以将观赏和食用(confectionary)(用于人类消费)品系和品种 与主题早熟性基因进行渐渗。参见例如Yue等(2007)‘‘Experimenting with marker-assisted selection in confection sunflower germplasm enhancement.，，第 29 届向曰葵石if究石if讨会(Sunflower Research Workshop),2007 年 1 月 10-11 号，Fargo, ND(在网站 sunflowernsa.com/research/ research-workshop/documents/Yue_Experiment_Marker_07. pdf 上可获得)。Miller 等(2006) “Registration of three low cadmium (HA 448，HA 449，and RHA 450)confection sunflower genetic stocks. "Crop Science. 46 :489_490 (2006 年 1 月1日)。"Interspecific hybridisation and cytogenetic studies in ornamental sunflower breeding,，，J. Atlagic等，Australian Journal of Experimental Agriculture 45 (1) 93-97，2005 年 2 月 21 日出版。"Genes for pollen fertility restoration in sunflowers. "Euphytica,第 27 卷，第2期/1978年6月，第617页-第627页。
-些性状和品系的一些其它例子在下列专利参考文献中
美国专利或美国 申请流水号
題目或主题
申请提交曰期
(若可适用的话)
61/015,591
USSN 11/245,991 ( 公布为 2006/0112450A1) 60/721,181
USPNs 4,627,192 和 4，743，402 USPN 5,276,264
Low Saturated-Fat Sunflower and Associated Methods
Sunflower Seed with High Delta-Tocopherol Content
High Oleic Imidazolinone Resistant Sunflower
High Oleic Sunflower
2007 年 12 月 20 曰
2005年10月7日
2005年9月28日
Sunflower Products having Lower Levels of Saturated Fatty Acids Sunflower Seed having Low Saturated Oil Content (also high oleic)
Inbred Sunflower Line H1063R (also high oleic and imidazolinone resistant)通过提及将本文中所提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请、和公开文本以 它们不与本说明书的明确教导矛盾的程度完整收入。以下是例示用于实施本发明的方法的实施例。这些实施例不应解释为限制性的。
USPN 6,977,328
USPN 6,956,156除非另有说明，所有百分比按重量计，而所有溶剂混合物比例按体积计。实施例实施例1 农艺学测试和样品结果此基因是通过向日葵育种群体中的天然突变产生的。最初使用此基因来创建超早 熟型式的早熟近交物，其追求对短成熟区域的适应。随后，其用于标准化超晚熟近交物的潜 在用途得到理解和应用。为了启动向日葵中em基因的表征，进行了一组实验，其使用下列基因型来进行MG2 H757A*H120R 野生型X223 H757A*EM229135R 早熟突变体类型EM229135R = H120Rem(BC2F7 纯合的)一些突出部分如下
权利要求
1.一种早熟的向日葵植物，其包含对所述向日葵植物赋予早期开花和/或早期成熟表 型的突变的、显性单基因，其中所述基因的主要基因座可以经由DNA标志物而定位到连锁 群5的一端。
2.权利要求1的早熟的向日葵植物，其包含如存在于ATCC#PTA-8715中的早熟性基因。
3.由权利要求1的植物产生的种子，其中所述种子包含所述基因。
4.权利要求1的植物的子代植物，其中所述子代植物包含所述基因。
5.一种确定基因组测试样品是否包含能够对植物赋予早期开花和/或早熟性表型的 基因的方法，所述基因组测试样品获自测试植物或所述测试植物的组织、种子、或部分，所 述测试植物包含基因组，并且所述方法包括对所述测试样品测定所述基因组中SEQ ID NO 63或SEQ ID NO :82中的至少一种单核苷酸多态性(SNP)的存在，其中存在所述至少一 种SNP指明所述基因组中存在所述早期开花基因，并且所述基因组中不存在所述至少一种 SNP指明缺乏所述基因的野生型植物。
6.权利要求5的方法，所述方法包括从所述测试植物获得基因组DNA，扩增所述基因组 DNA的区段以形成扩增子，并确定所述扩增子是否包含所述至少一种SNP。
7.权利要求6的方法，所述方法包括对所述扩增子测序。
8.权利要求6的方法，其中使用包含SEQID NO :64和SEQ ID NO 65的引物来扩增所 述基因组DNA以形成所述扩增子。
9.权利要求5的方法，其中如果所述植物包含所述早期开花基因，则所述测试植物包 含SEQ ID NO :66，并且如果所述植物缺乏所述SNP并且是野生型，则所述植物包含SEQ ID NO :67ο
10.权利要求5的方法，其中所述方法包括确定所述测试植物的基因组在SEQID NO 66的第9位是否包含鸟嘌呤，这指明所述早期开花基因。
11.权利要求5的方法，其中所述方法包括确定所述测试植物的基因组在SEQID NO 66的第9位是否包含腺嘌呤，这指明野生型。
12.权利要求5的方法，其中所述方法包括确定所述测试植物的基因组在SEQID NO 67的残基6处是否包含鸟嘌呤，这指明所述早期开花基因。
13.权利要求5的方法，其中所述方法包括确定所述测试植物的基因组在SEQID NO 67的残基6处是否包含腺嘌呤，这指明野生型。
14.权利要求5的方法，其中所述方法包括确定所述测试植物的基因组是否包含SEQ ID N0:82，其中在SEQ ID NO :82的残基65处为胞嘧啶，这指明所述测试植物包含所述早期 开花基因。
15.权利要求5的方法，其中所述方法包括确定所述测试植物的基因组是否包含SEQ ID N0:63，其中在SEQ ID NO :63的残基65处为胸腺嘧啶，这指明野生型。
16.一种产生早熟植物的方法，所述方法包括权利要求5的步骤，选择包含所述基因的 早熟植物，并种植和繁殖所述早熟植物。
17.一种选择性育种的方法，所述方法包括权利要求5的步骤，其进一步包括选择对于 SEQ ID NO :82测试呈阳性的植物，并进一步育种所述阳性植物。
18.权利要求17的方法，所述方法包括将所述阳性植物与另一植物杂交。
19.权利要求17的方法，其中所述植物是向日葵。
20.权利要求18的方法，其中将所述植物与选自下组的品系的向日葵植物杂交观赏 品系和食用品系。
21.一种繁殖植物的方法，所述植物具有早期开花表型，所述方法包括权利要求5的步 骤，所述方法进一步包括种植所述阳性植物，并自交所述阳性植物。
22.一种选择早熟植物的方法，所述方法包括权利要求5的步骤，并选择所述早熟植物 用于进一步育种和/或繁殖。
23.一种包含基因组的植物，其在所述基因组中包含SEQ ID N0:66。
24.权利要求7的植物，所述植物进一步包含稳定掺入所述基因组中的SEQID N0:82。
25.一种包含早期开花基因的植物，所述植物包含基因组，所述基因组包含在所述基因 组中的SEQ ID NO :82中的至少一种单核苷酸多态性(SNP)，所述基因组在SEQ ID NO 82 的残基65处包含胞嘧啶。
26.权利要求25的植物，其中所述基因组包含SEQID NO 82中的两种多态性。
27.权利要求25的植物，其中所述植物是向日葵。
28.权利要求25的植物，其中与所述野生型植物相比，所述植物展现早期开花表型。
29.权利要求25的植物，其中所述植物是能够在35天中开花的向日葵。
30.根据权利要求5鉴定的向日葵植物。
31.权利要求25的植物的部分，所述部分包含所述基因。
32.权利要求31的植物部分，其中所述部分是种子或花粉。
33.一种用于鉴定与早期开花相关的标志物基因座的存在的方法，所述方法包括从权 利要求25的植物获得多核苷酸序列，所述序列对于包含所述基因的植物而言是独特的和 区别性的。
34.权利要求33的方法，其中所述方法包括使用一组引物。
35.一种分离的多核苷酸，其与选自下组的序列(或所述序列的互补物)杂交SEQ ID NO 82,SEQ ID NO 66,SEQ ID NO 63,SEQ ID NO 64,SEQ ID NO:65、和 SEQ ID N0:67，其 中在55°C和0. 2X盐(SSPE或SSC)的条件下维持杂交。
36.权利要求35的多核苷酸，其中所述多核苷酸是探针。
37.权利要求35的多核苷酸，其中所述多核苷酸是引物。
38.一种分离的多核苷酸，其与SEQ ID NO :63相比包含SEQ ID NO :82中存在的至少 一种单核苷酸多态性。
39.一种确定测试植物是否包含早期开花基因的方法，所述测试植物包含基因组，并且 所述方法包括对所述植物测定所述基因组中SEQ ID N0:66或SEQ ID N0:67的存在，其中 所述基因组中存在SEQ ID NO :66指明所述基因组中存在所述早期开花基因，并且所述基因 组中存在SEQ ID NO 67指明野生型植物。
40.一种加速感兴趣的基因向向日葵植物中渐渗的方法，所述方法包括将含有感兴趣基因的供体植物与包含早期开花基因的向日葵植物杂交以获得F1向日 葵植物；将F1植物与具有基因组的良种向日葵亲本植物回交；并将所述回交的子代的一个或多个后续世代回交以重新获得至少一种新的良种亲本 向日葵植物，其包含所述良种向日葵亲本的基因组和所述感兴趣的基因。
41.权利要求40的方法，其中所述新的良种亲本包含早期开花性状和感兴趣的基因两者。
42.权利要求40的方法，其中所述方法进一步包括从新的良种亲本中的所述感兴趣基 因分离出所述早期开花基因。
43.权利要求40的方法，其中所述方法包括使用所述早期开花基因的至少一种分子标志。
44.通过权利要求40的方法产生的植物。
45.权利要求44的植物，其中所述植物是观赏或食用向日葵。
46.一种包含突变的、显性单基因的早熟的向日葵植物，与包含所述基因的野生型型式 的植物相比，其引起早期开花和/或成熟，其中所述基因的主要基因座可以经由微卫星或 SSR标志物而定位到连锁群5的一端。
全文摘要
本发明部分涉及自发向日葵突变的发现。本发明牵涉“早熟”突变及相关近交物/杂种开发。本发明进一步提供了一种单显性基因，其在向日葵近交等位基因系和近等基因杂种中赋予早熟性。没有此基因用于工业中杂种开发的效用的已知现有教导或提示。本发明还提供了一种新的且独特的向日葵近交系，称作H120R。本发明包括拥有此突变基因的种子、通过种植这些种子生成的植物、和其拥有此突变基因及相关早熟性性状的子代。本发明还包括用于生成此类向日葵种子和植物(包括近交物和杂种)的方法。可以通过例如将所述近交系与其自身或者与另一向日葵品系杂交来产生此类植物。
文档编号A01H5/00GK101998824SQ200980112375
公开日2011年3月30日 申请日期2009年2月12日 优先权日2008年2月12日
发明者罗伯特·本森, 詹姆斯·T·格迪斯, 马克·克里斯托弗, 高文祥 申请人:陶氏益农公司