具有肌醇六磷酸酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸的制作方法

专利名称：：具有肌醇六磷酸酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸的制作方法
技术领域：
：本发明涉及具有^L醇六磷酸酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于产生和使用所述多肽的方法。相关领域的描述WO2006/043178公开了一种来自布丘氏菌属Pl-29(ButtiauxellaP1-29)(作为NCIMB41248保藏)的具有WO2006/043178中SEQIDNO:3的氨基酸序列的肌醇六磷酸酶，以及它的某些变体。布丘氏菌属野生型肌醇六磷酸酶的序列及其多种变体已经提交至GENESEQP数据库，具有以下登录号AEH25051、AEH25056、AEH25057、AEH25058、AEH25059、AEH25060、AEH25061、AEH25062、AEH25063、AEH25064、AEH25065、AEH25066、AEH25067、AEH25068、AEH25069、AEH25070、AEH25071、AEH25072、AEH25073、AEH25074、AEH25075和AEH25076。这些肌醇六磷酸酶均与SEQIDN0s:2、4和6中的任何一个具有70。/。以上(above70%)的同一性百分比，然而它们不包含119N、120L和/或121E中的至少一种，如上文所限定。来自变形肥杆菌(Obesumbacteriumproteus)的肌醇六磷酸酶的序列已经提交至UNIPROT数据库，登录号为Q6U677。这种也由Zinin等在FEMSMicrobiologyLetters,236巻，283-290页，2004中进行了描述的肌醇六磷酸酶，与SEQIDNOs:2、4和6具有70%以上的同一性百分比，然而这种肌醇六磷酸酶也不包含119N、120L和/或121E中的至少一种，如上文所限定。本发明的目的是提供具有肌醇六磷酸酶的改进的多肽，和编码所述多肽的多核苷酸。本发明的肌醇六磷酸酶具有改进的比活性(specificactivity),改进的稳定性，如改进的温度和/或pH稳定性，改进的pH活性谱(profile)，改进的温度活性谱，改进的底物谱，改进的在体外在动物饲料中的性能，和/或改进的在体内在动物饲料中的性能。
发明内容在第一方面，本发明涉及具有肌醇六磷酸酶活性并且具有如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列a)当使用Needle程序，用BLOSUM62取代矩阵，10.0的缺口产生罚分(gapopeningpenalty)和0.5的缺口延伸罚分(gapextensionpenalty)与SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和/或SEQIDNO:6的氨基酸1-413比对时，与上述各氨基酸序列具有至少70%同一性；并且b)当如a)中所述与SEQIDNO:2的氨基酸1-413比对并且使用与SEQIDNO:2的氨基酸1-413对应的氨基酸残基编号时，在所示的位置包含以下氨基酸中的至少一种119N、120L和/或121E。在一个具体的实施方案中，所述多肽在所示的位置包含以下氨基酸中的至少一种109Q、111G、119N、120L和/或121E。在另一具体的实施方案中，所述多肽a)与SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和/或SEQIDNO:6的氨基酸1-413具有至少78%同一性，例如，至少80%同一性，至少85%同一性，至少90%同一性，至少95%同一性，至少96%同一性，至少97°/。同一性，至少980/o同一性，至少99%同一性；并且b)在所示的位置包含以下氨基酸中的至少一种109Q、111G、119N、120L、121E和/或193Q。在另一方面，本发明涉及具有肌醇六磷酸酶活性并且具有如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列a)与SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和/或SEQIDNO:6的氨基酸1-413具有至少78%同一性，如，%同一性，至少90%同一性，至少95%同一性，至少96%同一性，至少97%同一性，至少98%同一性，至少99%同一性；并且b)在指定的位置包含以下氨基酸中的至少一种1S、101、38S、66E、71K、81A、109Q、111G、119N、120L、121E、141R、142L、152M、155E、193Q、214V、239K、245D、248E、255A，T、268A,T、277T、283D，E、285K、287D、288A，V、293G、296S、303L、314A、3371、345A、3501、364A、371K、372E、396P、399K、406E和/或413P。在另一方面，本发明涉及具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，其选自下组(i)包含SEQIDNO:2的成熟部分(例如SEQIDNO:2的氨基酸1-413的序列)的多肽；(ii)(i)的变体，其包含以下取代中的至少一种K26E、N37Y、A89T、D92E、T134I,V、H160R、S164F、T17U、T176K、A178P、S188N、D190E、A192G、K207E,T、A209S、D211C、A235V、E248L、Q256H，Y、A261E、N270K、D283N、A288E、I303F和/或N318D;和(iii)(i)或(ii)的变体，其包含以下取代中的至少一种N1S、V9I、T38S、E66Q、Q71K、T81A、R141Q、L142V、T152M、E155D、V214I、K239N、D245E、E248S、A255T、R268A,T、A277T、D283E、N285K、T287D、A288V、D293G、P296S、1303L、S314A、1337V、A345S、V350I、A364S、K371N、E372Q、P396S、K399T、E406V和/或Q413P。在另一方面，本发明涉及具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，其选自下组(i)包含SEQIDNO:4的成熟部分(例如SEQIDNO:4的氨基酸1-413的序列)的多肽；(ii)(i)的变体，其包含以下取代中的至少一种K26E、N37Y、A89T、D92E、T134I,V、H160R、S164F、T17U、T176K、A178P、S188N、D190E、A192G、K207E,T、A209S、D211C、A235V、S248L、Q256H，Y、A261E、N270K、E283N、V288E、I303F和/或N318D;和(iii)(i)或(ii)的变体，其包含以下耳又代中的至少一种S1N、19V、S38T、Q66E、K71Q、T81A、Q141R、V142L、M152T、E155D、1214V、N239K、E245D、S248E、T255A、A268R,T、T277A、E283D、K285N、D287T、V288A、D293G、S296P、簡L、A314S、V337LS345A、1350V、A364S、N371K、E372Q、S396P、T399K、V楊E和/或P413Q。本发明的另一方面涉及具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，其选自下组(i)包含SEQIDNO:6的成熟部分(例如SEQIDNO:6的氨基酸1-413的序列)的多肽；(ii)(i)的变体，其包含以下取代中的至少一种K26E、N37Y、A89T、D92E、T134I,V、H160R、S164F、T17U、T176K、A178P、Sl薩、D190E、A192G、K207E，T、A209S、D211C、A235V、S248L、Q256H,Y、A261E、N270K、E283N、V288E、L303F和/或N318D;和(iii)(i)或(ii)的变体，其包含以下取代中的至少一种N1S、V9I、T38S、E66Q、Q71K、A81T、Q141R、V142L、T152M、D155E、1214V、N239K、E245D、S248E、A255T、T268A，R、T277A、E283D、K285N、D287T、V288A、G293D、P296S、L303I、A314S、V337I、S345A、V350I、S364A、N371K、Q372E、S396P、T399K、V406E和/或Q413P。本发明的另一方面涉及具有如下氨基酸序列的肌醇六磷酸酶，所述氨基酸序列与SEQIDN0:2的氨基酸1-413、SEQIDN0:4的氨基酸1-413或SEQIDNO:6的氨基酸1-413具有至少80%同一性，例如，至少85%同一性，至少卯％同一性，至少95%同一性，至少96%同一性，至少97%同一性，至少98%同一性，至少99%同一性。在另一方面，本发明涉及具有如下氨基酸序列的肌醇六磷酸酶变体，所述氨基酸序列与包含以下GENESEQP序列中任意一个的成熟部分(例如氨基酸34-446的序列)的多肽具有至少70%同一性，至少75%同一性，至少80%同一性，如，至少85%同一性，至少90%同一性，至少95%同一性，至少96%同一性，至少97%同一性，至少98%同一性，至少99%同一性AEH25057、AEH25059、AEH25058、AEH25067、AEH25071、AEH25072、AEH25074、AEH25076、AEH25073、AEH25070、AEH25069、AEH25066、AEH25060、AEH25068、AEH25063、AEH25065、AEH25062、AEH25061、AEH25056、AEH25051或AEH25064;所述变体具有肌醇六磷酸酶活性，并且包含以下取代中的至少一个N1S、VIOI、T38S、Q66E、Q71K、T81A、E109Q、H111G、D119N、1120L、K121E、Q141R、V142L、T152M、D155E、L193Q、1214V、N239K、E245D、S248E、V255A,T、R268A,T、A277T、N283D,E、N285K、T287D、E288A,V、D293G、P296S、簡L、A314S、V337I、S345A、V350I、S364A、N371K、Q372E、S396P、T399K、V406E和/或Q413P。在一个具体的实施方案中，本发明涉及多肽的变体，其包含GENESEQP:AEH25075的成熟部分(例如氨基酸34-446的序列)，所述变体具有肌醇六磷酸酶活性，并且包含以下取代中的至少一种N1S、VIOI、T38S、Q66E、Q71K、T81A、E109Q、H111G、D119N、1120L、K121E、Q141R、V142L、T152M、D155E、L193Q、1214V、N239K、E245D、S248E、V255A，T、R268A，T、A277T、N283D,E、N285K、T287D、E288A，V、D293G、P296S、F303L、A314S、V337I、S345A、V350I、S364A、N371K、Q372E、S396P、T399K、V406E和/或Q413P。在这些方面的每一个中，对于计算同一性和确定氨基酸残基位置，都如上文第一方面中所述生成比对。本发明还涉及编码这些多肽的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体和重组宿主细胞，还涉及用于产生和使用这些多肽的方法。本发明的另一方面涉及包含本发明的肌醇六磷酸酶的动物伺料组合物。本发明还提供使用本发明的肌醇六磷酸酶改进动物饲料的营养价值的方法。本发明的另一方面涉及使用本发明的肌醇六磷酸酶处理蛋白质的方法，所述蛋白质包括植物蛋白。本发明的另一方面涉及产生发酵产物的方法，所述发酵产物诸如，例如，乙醇、啤酒、葡萄酒(wine)，其中所述发酵在本发明的MJ享六磷酸酶存在下进行。附图筒述图1显示对本发明的SEQIDNO:2、SEQIDNO:4和SEQIDNO:6预期的成熟部分连同具有以下GENESEQP登录号的序列的多重比对AEH25051、AEH25056、AEH25057、AEH25058、AEH25059、AEH25060、AEH25061、AEH25062、AEH25063、AEH25064、AEH25065、AEH25066、AEH25067、AEH25068、AEH25069、AEH25070、AEH25071、AEH25072、AEH25073、AEH25074、AEH25075和AEH25076。比只十是4吏用Clustal方法(Higgins,1989,CABIOS5:151-153),使用LASERGENEMEGALIGNtm軟件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI),用同一性表和以下多重比对参数进行的缺口罚分为10,并且缺口长度罚分(gaplengthpenalty)为10。配对比对参数是K元组(Ktuple)=1,缺口罚分=3,窗口(windows)=5,和对角线(diagonals)二5。图2显示UNIPROT登录号Q6U677与SEQIDNO:2的氨基酸1-413的比对。比对是使用Needle程序，使用矩阵BLOSUM62、IO.O的缺口产生罚13分和0.5的缺口延伸罚分进行的。发明详述结构因素(StructuralConsiderations)使用大肠杆菌(E.coli)AppA肌醇六磷酸酶的结构作为模板，通过同源性建才莫建立了本发明的三个肌醇六磷酸酶(SEQIDNOs:2、4和6的成熟部分)的结构(ProteinDataBankid:1DKN;Lim等，Nat.Struct.Biol.(2000)，2巻，108-113页)。位置119-121面对活性部位裂缝(activesitecleft),因此预期在这些位置的特定氨基酸对比活性有影响。对于增加比活性，据估计119N是较好的选择，其次是121E，最后是120L。位置109和111靠近受到少量应力(abitstressed)的区域中的二硫键(disulfide),因此预期在这些位置的特定氨基S吏对稳定性(特别是对热稳定性)有影响。lllG可能优于109Q。位置193是另一个可能影响酶稳定性的区域。193Q可以提供良好的稳定性。相应的肌醇六磷酸酶变体，和其它肌醇六磷酸酶变体(例如，包含一个或多个氨基酸的保守取代、缺失和/或插入的变体)，可以通过本领域已知的方法制备，并且如实验部分中所述进^"测试。肌醇六磷酸酶多肽，同一性的百分比在本文中，肌醇六磷酸酶是具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，即催化肌醇六磷酸盐(phytate)水解成(l)肌醇和/或(2)它的单、二、三、四和/或五磷酸盐和(3)无机磷酸盐的酶。在本文中，术语肌醇六磷酸酶底物包括，但不限于，肌醇六;奔酸和任何肌醇六磷酸盐(肌醇六磷酸的盐)，以及上文(2)中所列的磷酸盐。因特网上的ENZYME站点(www.expasy.ch/enzyme/)是与酶的命名法相关的信息的储藏库。其主要基于国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会(NomenclatureCommitteeoftheInternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology)(IUB-MB)的建议，并描述了各种类型的表征的酶，并为这些酶提供了EC(EnzymeCommission(酶学委员会))号(BairochA.TheENZYMEdatabase,2000,NucleicAcidsRes28:304-305)。同样参见NC-IUBMB,1992的酶命名手册(handbookEnzymeNomenclature)。根据ENZYME网站，已知三种不同类型的肌醇六磷酸酶所谓的3-肌醇六磷酸酶(或称l-肌醇六磷酸酶；力几醇六磷酸酯3-磷酸水解酶(myo-inositolhexaphosphate3-phosphohydrolase))，所谓的4_肌醇六磷酸酶(或称6-月几醇六磷酸酶，基于1L编号系统而非1D编号命名，EC3丄3.26)，和所谓的5-肌醇六磷酸酶(EC3丄3.72)。就本发明而言，全部三种类型均包括在肌醇六磷酸酶的定义中。在一个具体的实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶属于酸性组氨酸磷酸酶家族，该家族包括大肠杆菌(Escherichiacoli)pH2.5酸性磷酸酶(基因appA)以及真菌肌醇六磷酸酶例如泡盛曲霉(Aspergillusawamorii)肌醇六磷酸酶A和B(EC:3.1.3.8)(基因phyA和phyB)。多种组氨酸酸性磷酸酶共享两个具有序列相似性的区域，每个均以保守的组氨酸残基为中心围绕在其周围。这两个组氨酸似乎涉及酶的催化机制。第一组氨酸位于N-末端部分，并且形成磷-组氨酸中间物，而第二个位于C末端部分，并且可能充当质子供体。在另一个具体实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶具有保守的活性部位基序，即R-H-G-V-R-A-P(参见SEQIDNOs:2、4和6的氨基酸18-24)。就本发明而言，肌醇六磷酸酶活性是以FYT单位测定的，一个FYT是在以下条件下每分钟释放1微摩尔无机正磷酸根的酶量pH5.5;温度37。C;底物浓度为10.8mmol/l的肌醇六磷酸钠(C6H6024P6Na,2)。肌醇六磷酸酶活性优选使用本文实施例3中的测定法来测定。其它合适的肌醇六磷酸酶测定法是WO00/20569的实施例1中描述的FYT和FTU测定法。FTU用于测定饲料和预混物(pi'emix)中的肌醇六磷酸酶活性。在一个具体的实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶是分离的。术语"分离的"如用于本文是指这样的多肽，如通过SDS-PAGE测定，所述多肽是至少20%纯的，优选至少40%纯的，更优选至少60%纯的，甚至更优选至少80%纯的，最优选至少90%纯的，并且甚至最优选至少95%纯的，例如，至少96%、97%、98%、99%和更高的纯度。具体而言，优选多肽是"基本上纯的形式(essentiallypureform)",即，所述多肽制备物基本上不含(essentiallyfreeof)其它与该多肽制备物天然结合的(nativelyassociated)多肽物质。例如，这可以通过以公知的重组方法和/或通过经典纯化方法制备多肽来实现。当在本文使用时，术语"成熟部分"是指由细胞分泌的多肽的部分，所述细胞含有编码该多肽的多核苷酸作为其遗传部件(geneticequipment)的部分。通常，成熟多肽部分是指一旦N末端信号肽部分完成了其指导编码多肽进入细胞分泌途径的功能而被切除之后剩余的多肽部分。然而，经验显示在分泌过程中有时也发生少量的C末端截短。术语成熟部分如用于本文也将这样的C末端截短考虑在内(如果它存在的话)。SEQIDNOs:2、4和6的预期信号肽部分是SEQIDNO:2的氨基酸-33至-1、SEQIDNO:4的氨基酸-9至-1(这是部分信号肽)和SEQIDNO:6的氨基酸-33至-1(参见本申请包括的序列表)。由SEQIDNO:7编码的SEQIDNO:8也是信号肽。由于我们目前不清楚任何在分泌过程中发生的C末端截短，所以预期的SEQIDNO，:2、4和6的成熟部分是它们的氨基酸1-413。在本发明的不同方面中，两个氨基酸序列之间的相关性用参数"同一性"来描述。就本发明而言，两个氨基酸序列的比对是通过使用来自EMBOSS软件包(http:〃emboss.org)的Needle程序确定的，优选版本2.8.0。Needle程序执行在Needl謹n,S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453中描述的全局比对算法(globalalignmentalgorithm)。所用的取代矩阵是BLOSUM62,缺口产生罚分(gapopeningpenalty)是10.0,并且缺口延伸罚分(gapextensionpenalty)是0.5。本发明的氨基酸序列("发明序列")和权利要求中涉及的氨基S臾序列(例如SEQIDNO:2的氨基酸l-413)之间的同一性程度，是通过两个序列比对中精确匹配的数目，除以"发明序列"的长度或SEQIDNO:2的氨基酸1-413的长度中最短的一个来计算。结果以百分比同一性表示。当"发明序列"和SEQIDNO:2在重叠的相同位置具有相同的氨基酸残基时发生精确匹配(在下文的比对实例中用T代表这种情况)。序列的长度是序列中的氨基酸残基数(例如SEQIDNO:2的氨基酸1-413的长度是413)。在以下的纯假设性比对实例中，重叠是序列1的氨基酸序列"HTWGER-NL"或序列2的氨基酸序歹寸"HGWGEDANL"。在该实例中，缺口用"-"表示。假设性比对实例序列1:ACMSHTWGER-NLImil序列2:HGWGEDANLAMNPS16在一个具体的实施方案中，多肽的氨基酸序列与或相对于例如SEQIDNO:2的氨基酸1-413的同一性百分比是通过如下来确定的i)使用Needle程序，用BLOSUM62取代矩阵、10.0的缺口产生罚分和0.5的缺口延伸罚分来比对所述两个氨基酸序列；ii)计数比对中精确匹配数；iii)用精确匹配数除以两个氨基酸序列中最短的序列的长度，iv)将iii)除得的结果转换成百分比。在上文的假设性实例中，精确匹配数是6，两个氨基S拼列中最短的序列的长度是12;因此同一性百分比是50%。另一比对实例示于图2，其中将来自变性月巴杆菌(Obesumbacteriumproteus)的肌醇六磷酸酶(UNIPROT:Q6U677)与SEQIDNO:2的氨基酸1.413比对。由这个比对显示，UNIPROT:Q6U677与SEQIDNO:2的氨基酸1-413的同一性百分比是76.3%(315个精确匹配，最短序列的长度是413)。在本发明的肌醇六磷酸酶的具体实施方案中(即根据本发明的不同方面中的任何一个)，与SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一个的同一性程度是至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%。在更进一步的具体实施方案中，同一性程度是至少90.0%、90.2%、90.4%、90.6%、90.8%、91.0%、91.2%、91.4%、91.6%、91.8%、92.0%、92.2%、92.4%、92.6%、92.8%、93.0%、93.2%、93.4%、93.6%、93.8%、94.0%、94.2%、94.4%、94.6%、94.8%、95.0%、95.2%、95.4%、95.6%、95.8%、96.0%、96.2%、96.4%、96.6%、96.8%、97.0%、97.2%、97.4%、97.6%、97.80/o、98.0o/o、98.20/0、98.40/0、98.60/0、98.80/0、99.00/0、99.20/o、99.40/0、99.60/0或至少99.8%。在更进一步的具体实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶具有(或具有氨基酸序列，其差异为)如与SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQlDNO:6的氨基酸1-413中任意一个相比不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9处或不多于10处的变化；如与SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一个相比不多于ll、12、13、14、15、16、17、18、19处或不多于20处的变化；如与SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一个相比不多于21、22、23、24、25、26、27、28、29处或不多于30处的变化；如与SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一个相比不多于31、32、33、34、35、36、37、38、39处或不多于40处的变化；如与SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一个相比不多于41、42、43、44、45、46、47、48、49处或不多于50处的变化；如与SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一个相比不多于51、52、53、54、55、56、57、58、59处或不多于60处的变化；如与SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸卜413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一个相比不多于61、62、63、64、65、66、67、68、69处或不多于70处的变化；如与SEQIDNO:2的氨基S吏1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一个相比不多于71、72、73、74、75、76、77、78、79处或不多于80处的变化；如与SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一个相比不多于81、82、83、84、85、86、87、88、89处或不多于90处的变化；如与SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一个相比不多于91、92、93、94、95、96、97、98、99处或不多于100处的变化；如与SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一个相比不多于IOI、102、103、104、105、106、107、108、109处或不多于110处的变化；如与SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一个相比不多于111、112、113、114、115、116、117、118、119处或不多于120处的变化;或与SEQIDNO:2的氨基酸1_413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一个相比不多于121、122、123或124处的变化。在本发明肌醇六磷酸酶的可供选择的实施方案中，相对于SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一个的同一性程度是至少55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%或至少69%。位置编号本文使用的(即根据本发明不同方面中任何一个方面的)用于限定氨基酸位置的命名法基于源自伽瓦尼布丘氏菌(Buttiauxdlagaviniae)DSM18930的肌醇六磷酸酶的氨基酸序列，即其预期的成熟序列，其为SEQIDNO:2的氨基酸1-413。因此，在本上下文中，用于位置编号的基础是SEQIDNO:2，始于N1并且止于Q413。这种位置编号在图1的比对中显示为第一行，并且在图2的比对中也显示了这种编号方式(比对的上排)。变化，如取代、缺失、插入本发明(即，根据本发明的不同方面中的任何一个方面)的肌醇六磷酸酶，其是野生型或变体，可以相对于模板(即参照或比较性氨基酸序列例如SEQIDNO:2的氨基酸l-413)包含多种类型的变化可以将一个氨基酸用另一个氨基酸取代；可以缺失氨基酸；可以插入氨基酸；以及任何数目的这些变化的任意组合。在本上下文中，术语"插入"意欲还包括N末端和/或C末端延伸，并且术语"缺失"意欲还包括N末端和/或C末端截短。本文用于单变化的通用命名法如下XDcY，其中"X"和"Y"独立地表示单字母氨基酸代码，或"*","D"表示一个数字，且"c"表示按字母顺序计数(a、b、c等等)，其仅在插入中出现。参考下文表l,其中描述了将这种命名法应用于多种类型的变化的纯假设性实例。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>如上文所解释的，位置号("D")从SEQIDNO:2的氨基酸1-413的第一氨基酸残基起计算。在相同序列中的几个变化用7"(斜线)分隔，例如标识"l*/2*/3*，，表示在位置号l、2f^3的氨基酸全部缺失，标识"104A/105F"表示位置号104的氨基S交被A取代，并且位置号105的氨基酸被F取代。可选择的变化用(逗号)分隔，例如，标识"255A,T"表示位置255上的氨基酸被AiT取代。本文在各种其他不胜枚举的可能性中所用的逗号表示它们通常在语法上的作用，即通常是和/或。例如，列举"255A,T，楊E，和/或413P，，中第一个逗号表示二中选一(AiT),而后面的两个逗号应理解为和/或的选择:255A或255T，和/或406E,和/或413P。在本文中，"至少一个"(例如在指定位置的氨基酸，或取代)表示一个或多个，例如1,2，3,4,5,6,7，8,9或10个氨基酸(或取代)；或12,14，15，16,18，20,22，24,25，28或30个氨基酸(或取代)；等等，直至最多的变化数目为125，130,140，150，160,170，180，190或200个。对用什么取代或延伸没有进行任何指定的取代或延伸是指除了在模板中占据该位置的氨基酸以外，插入任何天然的，或非天然的氨基酸。鉴定相应的位置号如上文所解释，本文使用伽瓦尼布丘氏菌DSM18930的成熟肌醇六磷酸酶(SEQIDNO:2)作为位置编号的标准，因此也是命名法的标准。对于另外的肌醇六磷酸酶，其是野生型或变体，对应于SEQIDNO:2中位置D的位置通过如标题为"肌醇六磷酸酶多肽，同一性百分比，，一节中所详细说明的比对两个序列来查找到。从比对中，本发明序列中与SEQIDN0:2的位置D相对应的位置可以清晰地和明白地鉴定出来(在比对中互在对方顶部的那两个4立置(thetwopositionsontopofeachotherinthealignment))。现有一些从上文表1得到的纯假设性实例，其在第三栏中包括多个对两个序列的比对参照表l第一行第三格上排序列是模板，下排是变体。位置号80是指模板中的氨基酸残基G。氨基酸A占据变体中相应的位置。因此，将这种取代命名为G80A。再参照表1第二行第三格上排序列还是模板且下排是变体。位置号80还是指模板中的氨基酸残基G。变体具有两个插入，即TY，在模板的G80之后V81之前。尽管T和Y在变体氨基酸序列中当然也将具有它们自己"真正的"位置号，但是就此处而言，我们总是指模板位置号，而因此T和Y分别称作位置号80a和80b。最后，参照表l最后一行的第三格位置号275是指模板中最后的氨基酸。将C末端延伸ST分别称作位置号275a和275b,尽管它们在变体氨基酸序列中当然也拥有它们自己"真实的"位置号。这样的比对的真实例子在图2中显示，其中将来自变形肥杆菌的肌醇六磷酸酶(UNIPROT:Q6U677)与SEQIDNO:2的氨基酸1-413比对。A人这个比对可以推出，SEQIDNO:2的氨基酸119N、120L和121E分别对应于UNIPROT:Q6U677的119D、120I和120K,等等。不同的实施方案根据本发明的第二方面的多肽具有如下氨基酸序列，所述氨基酸序列a)与SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和/或SEQIDNO:6的氨基酸1-413具有至少78%同一性；并且b)在指定位置包含以下氨基酸中的至少一种1S、101、38S、66E、71K、81A、109Q、lllG、119N、120L、121E、141R、142L、152M、155E、193Q、214V、239K、245D、248E、255A，T、268A，T、277T、283D，E、285K、287D、288A，V、293G、296S、303L、314A、3371、345A、3501、364A、371K、372E、396P、399K、406E和/或413P。在上述b)中指定位置的每种氨基酸不同于布丘氏菌属NCIMB41248野21生型肌醇六磷酸酶及其具有以下GENESEQP登录号的变体AEH25051、AEH25056、AEH25057、AEH25058、AEH25059、AEH25060、AEH25061、AEH25062、AEH25063、AEH25064、AEH25065、AEH25066、AEH25067、AEH25068、AEH25069、AEH25070、AEH25071、AEH25072、AEH25073、AEH25074、AEH25075和AEH25076。在其具体的实施方案中，所述氨基酸序列包含a)1S、101、38S、71K、109Q、111G、119N、120L、121E、152M、155E、193Q、255T、268A、277T、283E、285K、287D、288V、296S、364A、3501、372E和/或413P(i。通过SEQIDN0:4表示)中的至少一种;b)66E、81A、109Q、111G、119N、120L、121E、193Q、255A、268T、277T、283E、285K、287D、288V、293G和/或303L(如通过SEQIDNO:6表示)中的至少一种；和c)66E、109Q、111G、119N、120L、121E、141R、142L、155E、193Q、214V、239K、245D、248E、255A、283D、288A、314S、3371、345A、364A、371K、372E、396P、399K和/或406E(如通过SEQIDNO:2表示)中的至少一种。在另一具体的实施方案中，本发明的多肽在WO2006/043178中7>开的布丘氏菌属野生型和突变体肌醇六磷酸酶的启示下进行了变化，即所述多肽具有如下氨基酸序列，所述氨基酸序列在指定位置包含以下氨基酸中的至少一种26E、37Y、89T、92E、1341,V、160R、164F、1711、176K、178P、188N、190E、192G、207E，T、209S、211C、235V、248L、256H，Y、261E、270K、303F和/或318D。K26E、N37Y、A89T、D92E、T134I,V、H160R、S164F、T17U、T176K、A178P、S188N、D190E、A192G、K207E，T、A209S、D211C、A235V、E248L、Q256H,Y、A261E、N270K、D283N、A288E、I303F和/或N318D。对SEQIDN0:2的成熟部分中的其它优选取代是由SEQIDN0:4和6启示的N1S、V9I、T38S、E66Q、Q71K、T81A、R141Q、L142V、T152M、E155D、V2MI、K239N、D245E、E248S、A255T、R268A，T、A277T、D283E、N285K、T287D、A288V、D293G、P296S、1303L、S314A、B37V、A345S、V350I、A364S、K371N、E372Q、P396S、K399T、E406V和/或Q413P。作为另一个实例，将SEQIDN0:4的成熟部分突变以包含以下耳又^4中的至少一种K26E、N37Y、A89T、D92E、T134I,V、H160R、S164F、T17U、T176K、A178P、S188N、D190E、A192G、K207E，T、A209S、D211C、A235V、S248L、Q256H,Y、A261E、N270K、E283N、V288E、I303F和/或N318D。SEQIDN0:2的成熟部分中的其它优选取代是由SEQIDNO:2和6启发的S1N、19V、S38T、Q66E、K71Q、T81A、Q141R、V142L、M152T、E155D、1214V、N239K、E245D、S248E、T255A、A268R,T、T277A、E283D、K285N、D287T、V288A、D293G、S296P、1303L、A314S、V337I、S345A、1350V、A364S、N371K、E372Q、S396P、T399K、V406E和/或P413Q。在更进一步的实例中，将SEQIDNO:6的成熟部分突变以包含以下取代中的至少一种K26E、N37Y、A89T、D92E、T134I,V、H160R、S164F、T17U、T176K、A178P、S188N、D190E、A192G、K207E，T、A209S、D211C、A235V、S248L、Q256H,Y、A261E、N270K、E283N、V288E、L303F和/或N318D。SEQIDNO:2的成熟部分中的其它优选取代是由SEQIDNO:2和4启发的N1S、V9I、T38S、E66Q、Q71K、A81T、Q141R、V142L、T152M、D155E、1214V、N239K、E245D、S248E、A255T、T268A,R、T277A、E283D、K285N、D287T、V288A、G293D、P296S、L303I、A314S、V337I、S345A、V350I、S364A、N371K、Q372E、S396P、T399K、V406E和/或Q413P。如上文所解释的，本发明不同的方面涉及"具有"如下氨基S银列的多肽，所述氨基酸序列与SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和/或SEQIDNO:6的氨基酸1-413具有详明的同一性程度，所述多肽具有肌醇六磷酸酶活性(下文的"同源多肽")；或者涉及"具有"如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列以最大数目的氨基酸区别于SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413。本发明的多肽优选包含SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413或SEQIDNO:6的氨基酸1-413中的任何一个；或它们的等位变体(allelicvariant);或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段。在另一个优选的实施方案中，本发明的多肽由SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413或SEQIDNO:6的氨基酸1-413中的氨基酸序列；或它们的等位变体(allelicvariant);或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段组成。SEQIDNO:l、3和5的核苦酸序列中的任何一个，或其亚序列，以及SEQIDNO:2、4和6的氨基酸序列，或其片段，可以用于设计核酸探针以23根据本领域公知的方法从不同属或种的菌4朱鉴定和克隆编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的DNA。具体而言，这样的探针可以用于根据标准Southern印迹流程与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，从而从中鉴定并分离相应的基因。DNA和RNA探针均可使用。通常对探针进行标记用于4全测相应的基因(例如，用"P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白进行标记)。因此，可以从制备自这类其它生物的基因组DNA文库筛选与上述探针杂交并且编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的DNA。来自这类其它的生物的基因组DNA或其它DNA可以通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其它分离技术分开。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至并固定在硝酸纤维素或其它合适的载体材料上。为了鉴定与SEQIDNO:l、3或5或其亚序列同源的克隆或DNA，在Southern印迹中4吏用载体材料。在优选的实施方案中，核酸探针包含SEQIDNO:l的核苦酸454-462、SEQIDNO:3的核苦酸384-392或SEQIDNO:5的核苷酸454-462(全部对应于基序119N、120L和121E)。在另一优选的方面，核酸探针是编码SEQIDNO:2、4或6中任何一个的多肽或其亚序列的多核苷酸序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQIDNO:l、3或5。本发明还涉及变体，所述变体在SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413或SEQIDNO:6的氨基酸1-413,或其成熟多肽中包含一个或多个氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。优选地，氨基酸改变对性质是不重要的(ofaminornature),即不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；小缺失，通常为1至大约30个氨基酸；小的氨基或，复基末端延伸，例如氨基末端曱硫氨酸残基；多至约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸区(tract)、抗原表位或结合域。如上所述，片段是包含缺失的变体的优选实例，并且片段优选保持肌醇六磷酸酶活性。保守取代的实例是在以下组内碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specificacitivity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R丄.Hill,1979,于TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最常发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。除了20种标准氨基酸，也可以使用非标准氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-N-曱基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和a-曱基丝氨酸)取代野生型多肽的氨基酸残基。可以用有限数目的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸取代氨基酸残基。"非天然氨基酸"在蛋白质合成之后经过修饰，和/或在它们的侧链中具有不同于标准氨基酸的化学结构。非天然氨基酸可以通过化学方法合成，并且优选地，是商业上可以获得的，并且包括六氢吡啶羧酸、噻唑烷羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脱氢脯氨酸、3-和4-曱基脯氨酸、和3，3-二曱基脯氨酸。亲本多肽中的必需氨基酸可以依照本领域已知的方法鉴定，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变法(Cunningham和Wells，1989，Science244:1081-1085)。在后一技术中，向分子中的每个残基引入单一丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的生物活性(即，肌醇六磷酸酶活性)以鉴定对于所述分子的活性而言关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等，1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。定，如通过以下这些技术如核》兹共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，结合对推定^l妻触位点氨基酸的突变来加以测定。参见例如deVos等，1992，Science255:306-312;Smith等，1992,J.Mol.Biol.224:899-904;Wlodaver等，1992,FEBSLett.309:59-64。也可以从分析与本发明多肽的相关多肽的同一性来推断必需氨基酸的身份。可以使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后进行有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer,1988，Science241:53-57;Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156;WO95/17413;或WO95/22625公开的那些方法来实现和测试单个或多个氨基酸取代。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等，1991,Biochem.30:10832-10837;美国专利第5,223,409号；WO92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等,1986,Gene46:145;Ner等,1988,DNA7:127)。诱变/改组方法可以与高通量、自动化筛选方法组合以4企测宿主细胞表达的克隆的、经诱变多肽的活性。使用本领域的标准方法能够从宿主细胞回收25编码活性多肽的经诱变DNA分子并且快速测序。这些方法允许迅速测定感兴趣的多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且能够应用于结构未知的多肽。本发明的多肽可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，术语"获得自"如用于本文与给定来源有关时应该是指由核苦酸序列编码的多肽是由所述来源产生的，或是由已经插入了来自所述来源的核苷酸序列的菌抹产生的。在优选的方面，获得自给定来源的多肽是胞外分泌的。本发明的多肽可以是细菌多肽。在一个具体的实施方案中，所述多肽能够获得自变形细菌(Proteobacteria);y变形细菌(Gammaproteobacteria);肠杆菌目(Enterobacteriales);肠杆菌牙牛(Enterobacteriaceae);优选来自布丘氏菌属，例如选自以下种乡间布丘氏菌(Buttiauxellaagrestis)、布里纳氏布丘氏菌(Buttiauxellabrennerae)、费拉格布丘氏菌(Buttiauxellaferragutiae)、伽瓦尼布丘氏菌、1尹查德氏布丘氏菌(Buttiauxellaizardii)、诺基亚布丘氏菌(Buttiauxellanoackiae)、瓦姆波德布丘氏菌(Buttiauxellawarmboldiae)、布丘氏菌属菌种B22、布丘氏菌属菌种BTNOl、布丘氏菌属菌种LBV449、布丘氏菌属菌种P5、布丘氏菌属菌种PNBS、布丘氏菌属菌种S212、布丘氏菌属菌种S215、布丘氏菌属菌种S218。http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser。在更优选的方面，多肽是伽瓦尼布丘氏菌或乡间布丘氏菌多肽，最优选是伽瓦尼布丘氏菌DSM18930、乡间布丘氏菌DSM18931或乡间布丘氏菌DSM18932多肽。将会理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfectandimperfectstates),和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamo卬h),无论它们已知的种名。本领域熟练技术人员将容易地识别适合的等同物的同一性。这些种的菌抹在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSMZ)、真菌菌种保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmdcultures)(CBS)和农业研究才几构专利培养物保藏中心北区研究中'"(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。此外，可以使用上述的探针从其它来源，包括自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得这些多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选其它微生物的基因组或cDNA文库来获得所述多核芬酸。一旦用所述探针;险测到编码多肽的多核苦酉拼列，就能够使用本领域普通技术人员熟知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等，1989,见上文)。本发明的多肽还包括融合的多肽或可切割的融合多肽，其中将另一多肽融合在所述多肽或其片段的N末端或C末端。通过将编码另一多肽的核苷酸序列(或其部分)与本发明的核苷酸序列(或其部分)融合来产生融合的多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括将编码所述多肽的编码序列连接，从而使它们符合读框并且使融合的多肽的表达在相同的启动子和终止子的调控下。l务改的性质在本发明的任何方面的具体实施方案中，肌醇六磷酸酶具有修改的，优选是改进的性质。修改的，优选改进的性质的实例是pl、温度和/或pH稳定性、pH活性谱、温度活性谱、底物谱和在体外或体内的在动物饲料中的性能。术语'M务改"和"改进'，意指与另一肌醇六磷酸酶相比较。这些另外的参照或比较的肌醇六磷酸酶的实例是布丘氏菌属NCIMB41248野生型肌醇六磷酸酶及其具有以下GENESEQP登录号的变体AEH25051、AEH25056、AEH25057、AEH25058、AEH25059、AEH25060、AEH25061、AEH25062、AEH25063、AEH25064、AEH25065、AEH25066、AEH25067、AEH25068、AEH25069、AEH25070、AEH25071、AEH25072、AEH25073、AEH25074、AEH25075和AEH25076。本发明的肌醇六磷酸酶在指定位置包含以下氨基酸中的至少一种119N、120L和/或121E，如实验部分所示，所述本发明的肌醇六磷酸酶具有改进的比活性。在一个具体的实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶包含i)119N;ii)121E;iii)120L;iv)119N和121E;v)119N和120L;vi)121E和120L;或vii)119N、120L和121E。在更进一步的具体实施方案中，i)-vii)的肌醇六磷酸酶具有改进的比活性。比活性如下所述测定。本发明的肌醇六磷酸酶在指定位置包含以下氨基酸中的至少一种109Q和/或111G，预期所述本发明的肌醇六磷酸酶具有改进的稳定性，特别是改进的热稳定性。在一个具体的实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶包含i)111G;ii)109Q;或iii)111G和109Q。在更进一步的实施方案中，i)-iii)的肌醇六磷酸酶具有改进的稳定性，优选是改进的热稳定性。热稳定性如下所述测定。还预期包含193Q的本发明的肌醇六磷酸酶具有改进的稳定性，优选具有改进的热稳定性。热稳定性如下所述测定。在指定位置的其它特定氨基酸，以及其它特定氨基酸取代也在本文中公性质例如pl、温度稳定性、pH稳定性、pH活性谱、温度活性谱、底物语和/或改进的在体外或体内在动物飼料中的性能。比活性在一个具体的实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶相对于参照肌醇六磷酸酶具有改进的比活性。更具体地，本发明的肌醇六磷酸酶的比活性相对于用同样方法测定的参照肌醇六磷酸酶的比活性是至少105%。在更进一步的具体实施方案中，相对比活性是至少110、115、120、125、130、140、145、150、160、170、180、l卯、200、220、240、260、280、300、350或甚至400%,仍是相对于用同样方法测定的参照肌醇六磷酸酶的比活性而言。参照肌醇六磷酸酶的实例在上文列出。对于这种实施方案优选的参照肌醇六磷酸酶是GENESEQP:AEH25072(WO2006/043178的表3中公开的变体)和GENESEQP:AEH25051(WO2006/043178的实施例10中公开的来自布丘氏菌属P1-29的野生型肌醇六磷酸酶)。在替换方案中，术语高比活性是指至少240FYT/mg酶蛋白(EP)的比活性。在一个具体的实施方案中，比活性是至少300、350、400、450、500、550、600或至少650FYT/mgEP。比活性是对高度纯化的样品(SDS聚丙烯酰胺凝胶应该显示只有一个组分存在)测量的。优选地，如通过SDS-PAGE测定，酶样品是至少95%纯的。酶蛋白浓度可以通过氨基酸分析来测定，并且肌醇六磷酸酶活性以FYT为单位，如实施例3中所述测定，即在pH5.5和37。C对肌醇六磷酸钠底物测定。比活性是所述的特定肌醇六磷酸酶的特征，并且计算为以每mg肌醇六磷酸酶变体酶蛋白的FYT单位测量的肌醇六磷酸酶活性。进一步的细节参见实施例4。等电点(pl)28在一个具体的实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶的pi范围是i)7.0-8.0;ii)7.2-7.8;或iii)7.4-7.6。pi如实施例5中所述测定。pH谱在一个具体的实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶与对照肌醇六磷酸酶相比具有修改的pH谱。对照肌醇六磷酸酶的实例在上文列出。在一个具体的实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶在pH2.0具有的相对活性是在pH4.5(最适pH)的活性的至少30%，优选至少31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%或至少41%。在其它具体实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶在pH6.0具有的相对活性是在pH4.5(最适pH)的活性的至少10%，优选至少15%、20%、25%、30%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%或至少43%。pH谱(肌醇六磷酸酶活性作为pH的函数)是对高度纯化的样品(SDS聚丙烯酰胺凝胶应该显示只有一个组分存在)测定的。优选地，如通过SDS-PAGE测定，酶样品是至少95%纯的。使用混合緩冲液(buffercocktail)(50mM甘氨酸、50mM乙酸和50mMBis-Tris(二-(2-羟乙基)亚氨基-三(羟曱基)曱烷(Bis陽(2-hydroxyethyl)imino-tris(hydroxymethyl)methan))在2.0-7.5的pH范围测定肌醇六磷酸酶活性，并且在pH5.5和37。C对肌醇六磷酸钠底物进行。优选的测定法是实施例3的测定法，只是将緩冲液替换为上文指定的緩冲液。更多细节参见实施例6。pH稳定性在一个具体的实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶与参照肌醇六磷酸酶相比具有修改的pH稳定性。参照肌醇六磷酸酶的实例在上文列出。在一个具体的实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶在40。C和选自2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的pH温育1W小时之后，相对于0小时(温育开始之前)的肌醇六磷酸酶活性，具有至少50%的残余肌醇六磷酸酶活性，优选至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、82%、84%、86%、90%、92%或至少94%的残余肌醇六磷酸酶活性。在优选的实施方案中，温育pH是i)2.0,ii)3.0，iii)4.0,iv)5.0，v)6.0，vi)7.0,和vii)8.0。在甚至更优选的实施方案中，温育pH是2.0,并且残余活性是至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%,或至少82%。将肌醇六磷酸酶在调节至期望的pH的0.1M甘氨酸、0.1M乙酸、0.1MBis-Tris中温育。在pH5.5和37。C测定对肌醇六磷酸钠底物的肌醇六磷酸酶活性。实施例3的活性测定法，其中将緩冲液替换成上文指定的缓沖液，是优选的测定法。更多细节参见实施例7。在更进一步的具体实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶在40。C和选自2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的pH温育24小时之后，相对于0小时(温育开始之前)的肌醇六磷酸酶活性，具有至少50%的残余肌醇六磷酸酶活性，优选至少51%、52%、54%、56%、58%、60%、62%、64%、66%、68%、70%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、82%、84%、86%，或至少88%的残余肌醇六磷酸酶活性。在优选的实施方案中，温育pH是i)2.0，ii)3.0,iii)4.0，iv)5.0,v)6.0,vi)7.0，和vii)8.0。在甚至更优选的实施方案中，温育pH是2.0，并且残余活性是至少50%、51%、52%、54%,或至少56%。将肌醇六磷酸酶在调节成期望pH的O.IM甘氨酸、0.1M乙酸、O.lMBis-Tris中温育。在pH5.5和37。C测定对肌醇六磷酸钠底物的肌醇六磷酸酶活性。实施例3的活性测定法，其中将缓沖液替换成上文指定的緩冲液，是优选的测定法。更多细节参见实施例7。温度语在一个具体的实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶与参照肌醇六磷酸酶相比具有修改的pH稳定性。参照肌醇六磷酸酶的实例在上文列出。在一个具体的实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶在30。C具有的相对活性是在60°C(最适温度)的活性的至少20%，优选至少22%、24%、26%、28%、30%、32%、34%、36%、38°/。，或至少40%。在另外的具体实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶在70。C具有的相对活性是在60。C(最适温度)的活性的至少10%,优选至少12%、14%、16%、18%、20%、22%,或至少23%。温度谱(肌醇六磷酸酶活性作为温度的函数)是对高度纯化的样品(SDS聚丙烯酰胺凝胶应该显示只有一个组分存在)测定的。优选地，如通过SDS-PAGE测定，酶样品是至少95%纯的。肌醇六磷酸酶活性是在pH4.0,或在pH5.5,在20-90。C的温度范围测定的。在两种情况下均^f吏用0.25M乙酸钠緩冲液。活性是对肌醇六磷酸钠底物测定的。优选的测定法是实施例3的测定法，当然除了温度不同，并且如果期望，pH也不同，参照上文。更多细节参见实施例8。热稳定性在一个具体的实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶与参照肌醇六磷酸酶相比具有修改的，优选改进的热稳定性。参照肌醇六磷酸酶的实例在上文列出。在一个具体的实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶在pH4.5在高温(如65、70、75、80、85、90或95。C)温育期望的时间(如15分钟、30分钟、1小时、P/2小时或2小时)之后，相对于O小时(温育开始之前)的肌醇六磷酸酶活性，具有至少50%的残余肌醇六^#酸酶活性，优选至少55%、60%、65%、70%、75%、800/。、82。/()、84%、86。/o、90。/o、92o/o，或至少94%。在优选的实施方案中，温育时间是l小时，pH是4.5且温度是80。C。将肌醇六磷酸酶在0.25M乙酸钠中温育。在pH5.5和37。C测定对肌醇六磷酸钠底物的肌醇六磷酸酶活性。实施例3的活性测定法是优选的测定法。或者，可以使用差示扫描量热法(DSC)测量法来测定纯化肌醇六磷酸酶蛋白的变性温度Td。Td可指示蛋白质热稳定性Td越高，热稳定性越高。DSC测量法可以在不同的pH值下进行，例如使用来自MicroCal的VP-DSC。扫描可以1.5。C/min的恒定扫描率在20-9(TC进行。优选的pH值是4.0和5.5，优选4.0。在运行DSC之前，将肌醇六磷酸酶脱盐，例如使用在适当緩沖液(例如25mM乙酸钠pH4.0;0.1M乙酸钠，pH5.5)中平衡的NAP-5柱(Pharmacia)。数据处理使用MicroCalOrigin软件(版本4.10)进行，并且将变性温度Td(也称为解链温度，Tm)定义为温语图(thermogram)中峰顶的温度。在一个具体的实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶具有至少60。C的Td,可以如上所述测定。在更进一步的具体实施方案中，Td是至少61、62、64、66、68、70、72、74、76、78,或至少80°C。在动物饲料中的性能在具体实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶如与参照肌醇六磷酸酶相比具有改进的在动物飼料中的性能。参照肌醇六磷酸酶的实例在上文列出。在动物饲料中的性能可以使用模拟单胃动物中胃肠环境的体外模型测定，例:^i。下饲料样品的组成为30%大豆粉和70%玉米粉，并添加CaCl2至每kg饲料5g钙的浓度，制备所述饲料样品并且在40。C和pH3.0预温育30分钟，其后添加胃蛋白酶(3000U/g飼料)和合适剂量的肌醇六磷酸酶(对全部待测试的肌醇六磷酸酶使用相同的剂量以允许比较)，例如，0.25-0.75肌醇六磷31酸酶单位FYT/g饲料。还包括一个无肌醇六磷酸酶活性的空白作为参照。其后将样品在40。C和pH3.0温育60分钟，接着在pH4.0温育30分钟。终止反应，然后通过添加HC1至终浓度0.5M并在40。C温育2小时来提取肌醇六磷酸和肌醇-磷酸(inositol-phosphates),其后进行一个冻融循环，再在40。C温育1小时。月几醇六石粦酸和月几醇画石粦酸通过如Chen等在JournalofChromatographyA(2003)1018巻，41-52页中所述的高效离子层析来分离，并且如Skoglund等于J.Agric.FoodChem.(1997)，45巻，431-436页中所述定量。然后计算用肌醇六磷酸酶处理的样品和未处理的样品之间的肌醇-磷酸结合的磷(IP-P)的差异作为释放的磷。计算指定的肌醇六磷酸酶相对于期望的参照肌醇六磷酸酶的释放的磷的百分比作为指定的肌醇六磷酸酶的相对性能。在一个具体的实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶的体外相对性能是至少105%,优选至少110、120、130、140、150、160、170、180、190或至少200%。多核苷酸、核酸构建体和表达载体本发明还涉及包含编码本发明的多肽的核苷酸序列的多核苷酸。所述多核苷酸优选是基本上纯的(substantiallypure)或是分离的，这是指不含其它外源或不想要的核苷酸的多核苷酸制备物，并且是以适合在基因工程化的蛋白质产生系统中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸按重量计含有最多10%,优选最多8%,更优选最多6%,更优选最多5%,更优选最多4%,更优选最多3%,甚至更优选最多2%,最优选最多1%,并且甚至最优选最多0.5%的与其天然结合的其它多核苷酸物质。然而，基本上纯的多核苦酸可以包括天然存在的5'和3，非翻译区，例如启动子和终止子。优选所述基本上纯的多核苷酸按重量计是至少90%纯的，优选至少92%纯的，更优选至少94%纯的，更优选至少95%纯的，更优选至少96%纯的，更优选至少97%纯的，甚至更优选至少98%纯的，最优选至少99%,并且甚至最优选至少99.5%纯的。本发明的多核苷酸优选是基本上纯的形式。具体而言，优选本文公开的多核苷酸是"基本上纯的形式(essentiallypureform)",即，所述多核苷酸制备物基本上不含与其天然结合的其它多核苷酸物质。在本文中，术语"基本上纯的多核苷酸"与术语"分离的多核苷酸"和"分离形式的多核香酸"同32义。多核苷酸可以是基因组的、cDNA、RNA、半合成、合成来源，或它们的任意组合。本发明还涉及核酸构建体，所述构建体包含本发明的分离的多核苦酸，其与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞内在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。术语"核酸构建体"如用于本文是指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或者修饰所述核酸分子以使其以本来不存在于自然界中(wouldnototherwiseexistinnature)的方式含有核酸的区4更。当核酸构建体包含表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语"表达盒，，(expressioncassette)同义。术语"调控序列'，在本文定义为包括对于编码本发明的多肽的多核苷酸表达是必需的或有利的所有成分。对于编码多肽的核苷酸序列而言每个调控序列可以是天然的或外源的。这样的调控序列包括，但不限于，前导序列，多腺苷酸化序列，前肽序列，启动子，信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子，和转录的和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核香酸序列编码区的连接。调控序列可以是适当的启动子序列，其是由宿主细胞识别用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的核苷S殳序列。用于指导本发明的核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从以下获得的启动子大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)a-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)a-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因，和原核|3-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731》以及tac启动子(DeBoer1983,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21-25)。另American,1980,242:74-94;和Sambrook等'1989，见上文中描述。调控序列也可以是合适的转录终止子序列，是由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码多肽的核苷酸序列的3'末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5，末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核苷酸序列的3'末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的氨基末端相连的氨基酸序列，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷S吏序列的编码序列5，端可固有地包含信号肽编码区，其与编码分泌多肽的编码区的区段一起天然地连接在翻"i,阅读框中。可选的是，编码序列5'端可含有对于所述编码序列编码区时可能是必需的。或者，外源信号肽编码区可以简单地替换天然信号肽编码区以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区可在本发明中使用。对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码区是从如下酶的基因获得的信号肽编码区芽孢杆菌属NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌a-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌{3-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(叩rT，叩rS,叩rM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,MicrobiologicalReviews57:109-137描述。在优选的方面，信号肽编码区是SEQIDNO:7的核苷酸1-81，其编码SEQIDNO:8的氨基酸1-27。调控序列还可以是前肽编码区，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化成成熟活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(api-E)、枯草芽孑包杆菌中性蛋白酶(叩rT)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)a-因子、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉(Myceliophthoratherm叩hila)漆酶(WO95/33836)的基因获得前肽编码区。当信号肽和前肽区二者均出现在多肽的氨基末端时，将前肽区置于紧接着(nextto)多肽氨基末端，并且将信号肽区置于紧接着前肽区的氨基末端。同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列将与调节序列可操作地连接。本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。术语"表达载体"在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核芬酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。上述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷Sl序列。可供选择的是，可以通过在适合的用于表达的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达本发明的核苷酸序列。在产生表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适合的表达调控序列可搡作地连接。术语"表达"包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翁3译、翻译后修饰和分泌。重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。将包含本发明多核苷酸的载体引入宿主细胞中，从而将该载体保留作为染色体整合体(chromosomalintegrant)或作为如前所述的自复制的染色体夕卜载体。术语"宿主细胞"包含亲本细胞的任何子代，其由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不相同。宿主细胞的选择将很大程度依赖于编码多肽的基因和它的来源。载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段35(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(totalDNA),或可以4吏用转座子(transposon)。本发明的载体优选地含有一个或多个选择性标记，其允许简单选择转化的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophytoauxotrophs)等。条件性必需基因(conditionallyessentialgene)可以作为非抗生素的选择性标记发挥功能。细菌的条件性必需非抗生素选择标记的非限定性实例是来自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或其它芽孢杆菌(Bacilli)的dal基因，它们仅当在缺乏D-丙氨酸的条件下培养细菌时是必需的。当在半乳糖存在下培养细胞或在引起半乳糖存在的培养基中培养细胞时，编码涉及UDP-半乳糖的转换(turnover)的酶的基因也可以在细胞中作为条件性必需标记发挥功能。这样的基因的非限定性实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的编码UTP依赖性磷酸酶(EC2.7.7.10)、UDP-葡萄糖依赖性尿苷酰转移酶(EC2.7.7.12)或UDP-半乳糖差向异构酶(EC5丄3.2)的那些基因。在含有木糖作为唯一碳源的基本培养基中培养的细胞中，芽孢杆菌的木糖异构酶基因例如xylA也可以用作选择性标记。在以葡糖酸作为唯一碳源的基本培养基中培养的细胞中，利用葡糖酸所需的基因，gntK,和gntP,也可以用作选择性标记。条件性必需基因的其它实例是本领域已知的。抗生素选择性标记赋予对这些抗生素如氨千青霉素、卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、新霉素、潮霉素或氨曱喋呤的抗性。本发明的载体优选含有允许所述载体整合入宿主细胞基因组或允许所述载体在细胞中独立于基因组进行自主复制的元件。为了整合入宿主细胞基因组，所述载体可以依赖于编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应该优选含有足够数量的与相应靶序列具有高同一性程度的核酸，如100至10,000个^成基对，优选400至10,000个碱基对，并且最优选800至10,000个碱基对，以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的把序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码核香酸序列。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞基因组。为了自主复制，载体可以进一步包含使载体能够在所述的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中发挥功能的介导自主复制的任何质粒复制子。术语"复制起点"或"质粒复制子"在本文定义为使质粒或载体能够在体内复制的核苷酸序列。细菌的复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMM的复制起点。可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸拷贝数的增加可以通过将所述序列的至少一个额外拷贝整合入宿主细胞基因组来获得，或者通过包括与所述多核苷酸一起的可扩增的选择标记基因来获得，其中能够通过在适当的选择剂存在下培养细胞来选择含有所述选择性标记基因的扩增拷贝，并由此含有所述多核苷酸的额外拷贝的细胞。用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员公知的(参见，例如，Sambrook等，l989,见上文)。宿主细胞本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸，将所述重组细胞有利地用于多肽的重组产生。术语"宿主细胞"，如用于本文，包括任何对于使用包含本发明多核苦酸的核酸构建体的转化、转染、转导等易感的(susceptible)纟田月包类型。宿主细胞可以是单细胞微生物，例如原核生物，或非单细胞微生物，例^d，真斗亥生4勿。有用的单细胞微生物是细菌细胞如革兰氏阳性细菌，包括但不限于，芽孢杆菌属细胞，例如，嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、4豆芽孑包才干菌(Bacillusbrevis)、环^]犬芽孑包^干菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孑包杆菌(Bacilluscoagulans)、杣烂芽孑包杆菌(Bacilluslautus)、迟纟爰芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis);或链霉菌属(Streptomyces)细胞，例如，淡紫青链霉菌(Streptomyceslividans)和灰鼠链霉菌(Streptomycesmurinus),或革兰氏阳性细菌如大肠杆菌和H单胞菌属菌种(Pseudomonassp.)。在优选的方面，细菌宿主细胞是迟緩芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在另一优选的方面，芽孢杆菌属细胞是嗜碱的芽孢杆菌属(alkalophilicBacillus)。可以例如通过如下方法实现将载体引入细菌宿主细^^:原生质体转化(参见,例如，Chang和Cohen，1979,MolecularGeneralGenetics168:111-115),孑吏用感受态纟田月包(参见，例如，Young和Spizizin,1961,JournalofBacteriology81:823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971,JournalofMolecularBiology56:209-221),电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques6:742-751)，或接合(参见，例如，Koehler和Thome,1987,JournalofBacteriology169:5771-5278)。宿主细胞也可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。生产的方法本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式能够产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。优选地，所述细胞是布丘氏菌属的细胞，并且更优选是乡间布丘氏菌或珈瓦尼布丘氏菌。本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养宿主细胞；和(b)回收所述多肽。在本发明的产生方法中，使用本领域公知的方法在适合于所述多肽产生的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适的培养基中并在允许所述多肽表达和/或分离的条件下进行的摇瓶培养，和在实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批(fed-batoh)或固态发酵)来培养细胞。利用本领域已知的方法，在合适的营养培养基中进行培养，所述培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基可从供应商处获得，或可以按照公开的成分制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，则可以从培养基直接回收多肽。如果多肽没有分泌，则可以从细胞裂解物中回收。可以使用本领域已知的特别用于所述多肽的方法来检测多肽。这些检测方法可以包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可38多肽的活性。得到的多肽可以用本领域已知方法回收。例如，可以通过常少见的方法乂人营养培养基中回收多肽，所述常规方法包括，但不限于，离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法来纯化，包括但不限于，层析(例如，离子交换，亲和，疏水，层析聚焦，和大小排阻)，电泳方法(例如，制备型等电聚焦)，差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)，SDS-PAGE或提取(参见，例3口，ProteinPurification,J.-C.Janson禾口LarsRyden纟扁，VCHPublishers,NewYork,1989)。典型的纯化方案可以包括离心、除菌过滤(germfiltration)、硫酸铵沉淀0吏用例如80%硫酸铵饱和度)、离心、在50mM乙酸钠緩冲液pH4.5中重悬沉淀、过滤、相对于50mM乙酸钠緩沖液透析和阳离子交换层析(S-琼脂糖，用50mM乙酸钠pH4.5上样，用线性盐梯度(50mM乙酸钠pH4.5+lMNaCl)洗脱)。转基因植物本发明还涉及转基因植物、植物部分或植物细胞，其已经使用编码具有本发明的肌醇六磷酸酶活性的多肽的核苷酸序列转化，从而以可回收的量表达和产生所述多肽。多肽可以从植物或植物部分中回收。可选择地，包含重组多肽的植物或植物部分可以如这样使用，用以改进食物或伺料的质量，例如，改进营养价值，适口性(palatability)和流变性质，或破坏抗营养(antinutritive)因子。在一个具体的实施方案中，多肽靶向种子中的胚乳储藏泡(endospermstoragevacuole)。这可以通过将其合成为具有合适信号肽的前体来获得，参见Horvath等，于PNAS,2000年2月15日，97巻，4号，1914-1919页中。们工程化的变体。单子叶植物的实例为草，例如草地早熟禾(meadowgrass)(蓝草(bluegrass),禾本科(Poa))，牧草(foragegrass)例如羊茅属(Festuca)，黑麦草属(Lolium)，温带草例如剪股颖属(Agrostis),以及谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、黑小麦(triticale)(小麦(小麦属(Triticum))和黑麦(黑麦属(Secale))的稳定杂合体)，以及玉蜀黍(maize)(玉米(com》。双子叶植物的实例为烟草、豆类，例如向日葵(向日葵属(Helianthus))、棉花(棉属(Gossypium))、羽扇豆、马铃薯、糖甜菜(sugarbeet)、豌豆、菜豆(bean)以及大豆，和十字花科植物(十字花科(familyBrassicaceae)),例如花椰菜，油菜籽(rapeseed),以及紧密关联的模式生物拟南芥(Arabidopsisthaliana)。低肌醇六^^粦酸盐才直物如例如美国专利第5,689,054号和美国专利第6,111,168号所述的为基因工程化植物的实例。植物部分的实例为茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子和块茎，以及包含这些部分的独立组织，例如表皮、叶肉、薄壁组织、维管组织、分生组织。特定的植物细胞区室，如叶绿体、质外体(apoplast)、线粒体、液泡、过氣化物酶体，以及细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，不管组织来源如何，均认为是植物部分。同样，植物部分，如为促进本发明的应用而分离的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚，胚乳，糊粉和种皮(seedcoats)。在本发明范围内还包含这些植物、植物部分和植物细胞的后代。可以按照本领域已知的方法构建表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞。简要地，如下构建植物或植物细胞通过将一个或多个编码本发明多肽的表达构建体并入植物宿主基因组，并使得到的经修饰的植物或植物细胞增殖成为转基因植物或植物细胞。方便地，表达构建体是核酸构建体，其包含编码本发明的多肽的核酸序列，所述核酸序列与在所选植物或植物部分中表达该核酸序列所需的合适的调控序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含选择性标记用于鉴定整合了表达构建体的宿主细胞以及对于将构建体引入所述植物所必需的DNA序列(后者依赖于所应用的DNA引入方法)。调控序列，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，例如基于期望何时、何处以及如何表达多肽来确定。例如，编码本发明的多肽的基因的表达可以是组成型或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以耙向特定的细胞区室、组织或植物部分如种子或叶。调控序列是，例如，由Tague等，1988,PlantPhysiology86:506所描述的。对于组成型表达，可以使用下列启动子35S-CaMV启动子(Franck等，1980,Cell21:285-294),玉米泛素1(ChristensenAH,SharrockRA和Quail1992.Maizepolyubiquitingenes:structure,thermalperturbationofexpressionandtranscriptsplicing,andpromoteractivityfollowingtransfertoprotoplastsbyelectroporation)，或稻月几动蛋白1启动子(PlantMo.Biol.18，675-689.;ZhangW,McElroyD,和WuR1991,AnalysisofriceActl5'regionactivityintransgenicriceplants.PlantCell3，1155-1165)。器官特异性的启动子可以是，例如，来自贮存库组织(storagesinktissue)如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards&Comzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或来自代谢库组织(metabolicsinktissue)例如分生组织的启动子(Ito等，1994,PlantMol.Biol.24:863-878)，种子特异性的启动子例如来自稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白或白蛋白的启动子(Wu等，1998，PlantandCellPhysiology39:885-889),来自豆球蛋白B4和来自蚕豆(Viciafaba)的未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等，1998,JournalofPlantPhysiology152:708-711)，来自种子油体蛋白(seedoilbodyprotein)的启动子(Chen等，1998，PlantandCellPhysiology39:935-941),来自欧洲油菜(Brassicanapus)的贝i存蛋白napA启动子，或本领域已知的任何其它种子特异性的启动子，例如，如WO91/14772中所述。此外，启动子可以是叶特异性的启动子例如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等，1993,PlantPhysiology102:991-1000)，小球藻病毒腺嘌呤曱基转移酶基因启动子(Mitra和Higgins,1994，PlantMolecularBiology26:85-93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，MolecularandGeneralGenetics248:668-674)，或损伤诱导型启动子例如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993，PlantMolecularBiology22:573-588)。同样，启动子可以是通过非生物(abiotic)处理例如温度、干旱或盐度变化可诱导的，或是通过外源施加的激活启动子的物质可诱导的，所述物质例如乙醇、雌激素、植物激素如乙烯、脱落酸、赤霉酸和/或重金属。启动子增强元件还可以用于在植物中获得多肽更高的表达。例如，启动子增强元件可以是内含子，其置于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间。例如，Xu等，1993，见上文公开了利用稻肌动蛋白1基因的第一内含子来增强表达。更进一步，可以针对研究的植物种类优化密码子选择以改进表达(参见上文提到的Horvath等)。选择标记基因和表达构建体的任何其它部分可以从本领域可获得的那些选取。按照本领域已知的常规技术将核酸构建体并入植物基因组，这些技术包括农杆菌(Agrobacterium)介导的转化，病毒介导的转化，显微注射，粒子轰41击，生物弹射转化和电穿孑L(Gasser等，1990,Science244:1293;Potrykus,1990:Bio/Technology8:535;Shimamoto等，1989，Nature338:274)。目前，根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的基因转移是用于生成转基因双子叶植物的优选方法(参见综述Hooykas和Schilperoort，1992,PlantMolecularBiology19:15-38)，并且它还可以用于转化单子叶植物，尽管对于这些植物更通常使用其他转化方法。目前，生成转基因单子叶植物的优选方法，除了农杆菌方法外，是对胚愈伤组织或发育中的胚的粒子轰击(用转化DNA涂覆的微细的(microscopic)金或鵠颗粒)(Christou，1992，PlantJournal2:275-281;Shimamoto,1994，CurrentOpinionBiotechnology5:158-162;Vasil等，1992,Bio/Technology10:667-674)。可供选择的单子叶植物转化方法基于原生质体转化，如Omirulleh等，1993，PlaritMolecularBiology21:415-428所述。转化之后，按照本领域公知的方法选择并入了表达构建体的转化体并再中可以选择性地去除选择基因，其利用例如使用两个分离的T-DNA构建体的共转化或者通过特定重组酶对选择基因进行位点特异性切除。本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养转基因植物或植物细胞，所述转基因植物或植物细胞包含编码具有本发明肌醇六磷酸酶活性的多肽的核酸序列；和(b)回收所述多肽。转基因动物本发明还涉及转基因的非人动物以及它们的产品或成分(element)，其实例为体液如乳和血，器官，肉和动物细胞。用于表达蛋白质的技术，例如在哺乳动物细胞中表达蛋白质的技术，是本领域已知的，参见例如手册ProteinExpression:APracticalApproach,Higgins和Hames(编),OxfordUniversityPress(1999)，以及该系列中涉及基因转录、RNA加工和翻译后加工的其他三本手册。一般地说，为了制备转基因动物，用本发明编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的核酸序列转化所选动物的所选细胞，乂人而表达并产生多肽。可以从动物回收多肽，例如从雌性动物的乳中，或可以将多肽表达为有益于动物本身，例如辅助动物的消化。动物的实例在下面标题为动物铜料的部分中提到。为了产生转基因动物以从动物乳中回收多肽，可以将编码多肽的基因插入到所讨论的动物的受精卵中，例如使用包含合适的乳蛋白启动子和编码所述多肽的基因的转基因表达载体。将转基因表达载体显微注射进受精卵，优选永久整合入染色体。一旦卵开始生长和分裂，就将有潜力的胚胎植入代用的母体(surrogatemother),并且鉴定出携带该转基因的动物。获得的动物随即可以通过常规飼养来繁殖(multiply)。多肽可以从动物乳中纯化，参见例如Meade，H.M.等(1999):Expressionofrecombinantproteinsinthemilkoftransgenicanimals,Geneexpressionsystems:Usingnaturefortheartofexpression.LMFernandez和J.P.Hoeffler(编),AcademicPress。在另一方面，为了产生在其体细胞和/或生殖细胞的基因组中携带有包含异源转基因构建体的核酸序列的一^人转基因动物，其中所述异源转基因构建体包含编码多肽的转基因，可以将该转基因与用于多肽的唾液腺特异性表达的第一调控序列可操作地连接，如WO00/064247中所7>开的。组合物和用途在更进一步的方面，本发明涉及包含本发明的多肽的组合物，以及应用这些组合物的方法。多肽组合物可以^接照本领域已知的方法来制备，并且可以以液体或千纽—合物的形式。例如，多肽组合物可以以颗粒或^i颗粒形式存在。将要包4舌在组合物中的多肽可以按照本领域已知的方法来稳定化。本发明的肌醇六磷酸酶可以在任何工业环境中用于降解，例如，肌醇六磷酸盐，肌醇六磷酸和/或肌醇的单，二，三，四和/或五磷酸盐。公知这些化合物的磷酸部分螯合二价和三价的阳离子如金属离子，包括但不限于(i.a.)营养必需离子钙、铁、锌和镁，以及痕量矿物锰、铜和钼。此外，肌醇六石寿酸还在某种程度上通过静电相互作用结合蛋白。因此，本发明的多肽的优选用途是在动物詞料制备物中(包括人类食物)或用于这些制备物的添加剂。在一个具体的实施方案中，本发明的多肽可以用于改进动物饲料的营养价值。改进动物饲料(包括人类食物)的营养价值的非限定性实例是改进饲料消化性；促进动物生长；改进詞料应用；改进蛋白质的生物利用度；提高可消化磷酸盐的水平；改进肌醇六磷酸盐的释放和/或降解；改进痕量矿物质的生物利用度；改进常量(macro)矿物质的生物利用度；消除添加补充性的磷酸盐、痕量矿物质和/或常量矿物质的需要；和/或改进印壳质量。飼料的营可以改进动物的生长速率和/或重量增加(weightgain)和/或铜料转化率(即摄入的饲料重量相对于重量增加)。此外，本发明的多肽可以用于降低粪便中的肌醇六磷酸盐水平。动物、动物饲料和动物饲料添加剂术语动物包括所有动物，包括人类。动物的实例是非反刍动物和反刍动物。反刍动物包括，例如，动物如绵羊，山羊和家畜(cattle)，例如牛(cow)如肉牛(beefcattle)和奶牛(dairycow)。在一个具体的实施方案中，动物是非反刍的动物。非反刍动物包括单胃的动物，例如猪(pigorswine)(包括但不限于，小猪(piglet)，饲育猪(growingpig)和母猪(sow));家禽如火鸡、鸭和鸡(包括但不限于雏鸡(broilerchick),蛋鸡(layers));鱼(包括但不限于鮭鱼(salmon),鳟鱼(trout),罗非鱼(tilapia),鲶鱼(catfish)和鲤鱼(carp));和曱壳类(包括但不卩艮于奸(shrimp)和对虫下(prawn))。术语祠料或祠料组合物是指适合于动物摄入或意在由动物摄入的任何化合物、制备物、混合物或组合物。在按照本发明的用途中，可以在餐前、餐后或与进餐同时向动物喂食多肽。后者是优选的。在一个具体的实施方案中，多肽，以其添加到飼冲+中的形式，或当其包括在饲料添加剂中时，是基本上(substantially)纯的。在一个具体的实施方案中它是确定的(well-defmed)。术语"确定的"意味着肌醇六磷酸酶制备物是至少50%纯的，如由大小排阻层析所测定的(参见WO01/58275的实施例12)。在其它的具体实施方案中，如通过这种方法测定，肌醇六磷酸酶制备物是至少60、70、80、85、88、90、92、94或至少95%纯的。基本上纯的和/或确定的多肽制备物是有利的。例如，以正确剂量向饲料添加基本上不含干扰性或污染性的其它多肽的多肽要容易得多。术语以正确剂量添加具体是指获得恒定(consistent)和不变的(constant)结果的目的，以及基于期望的效果优化剂量的能力。然而，对于在动物詞料中的应用，本发明的肌醇六磷酸酶多肽不需要那么纯；例如它可以包含其它多肽，在此情况下可以称其为肌醇六磷酸酶制备物。肌醇六磷酸酶制备物可以(a)直接添加到飼料(或直接用于蛋白质的处理方法)，或(b)其可以用于一个或多个中间组合物的产生，所述中间组合物如44使用)的饲料添加剂或预混物。上述纯度的程度是指原始多肽制备物的纯度，无论按照上文的(a)或(b)应用。具有这种数量级的纯度的多肽制备物尤其可以应用重组产生方法来获得，而通过传统发酵方法获得它们并不是很容易并且还具有高得多的批次间差异(batch画to-batchvariation)。这样的多肽制备物当然可以与其它多肽混合。多肽可以以任何形式添加到祠料中，作为相对纯的多肽(beitasarelativelypurepolypeptide)，或与意名夂添加到动物伺料中的其他组分混合，即以动物饲料添加剂的形式，如所谓的动物饲料的预混物(pre-mixes)。在进一步的方面本发明涉及在动物饲料中使用的组合物，如动物饲料，和动物饲津+添加剂，例3。予贞'混物。除本发明的多肽之外，本发明的动物伺料添加剂含有至少一种脂溶性维生素，和/或至少一种水溶性维生素，和/或至少一种痕量矿物质。饲料添加剂还可以包含至少一种常量矿物质(macromineral)。另外，任选的，詞料添加剂成分是着色剂，例如类胡萝卜素如(3-胡萝卜素、虾青素和叶黄素；芳香化合物；稳定剂；抗微生物肽；多不饱和脂肪酸；活性氧生成物(reactiveoxygengeneratingspecies);和/或选自下歹寸之中的至少一种其它多肽肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.8或3丄3.26);磷酸酶(EC3丄3.1;EC3丄3.2;EC3丄3.39);木聚糖酶(EC3.2.1.8);半乳聚糖酶(EC3.2丄89);a-半乳糖苦酶(EC3.2丄22);蛋白酶(EC3.4,,);磷脂酶Al(EC3丄1.32);磷脂酶A2(EC3.11.4);溶血磷脂酶(EC31丄5);磷脂酶C(3.1.4.3);磷脂酶D(EC3.1.4.4);淀粉酶，例如，a-淀粉酶(EC3.2.1.1);和/或卩-葡聚糖酶(EC3.2.1.4或EC3.2.1.6)。在具体的实施方案中这些其它的多肽是确定的(如上面对肌醇六磷酸酶制备物所定义的)。本发明的肌醇六磷酸酶还可以与其它肌醇六磷酸酶组合，例如子嚢菌类(ascomycete)肌醇六磷酸酶如曲霉属肌醇六磷酸酶，例如源自无花果曲霉(Aspergillusficuum)、黑曲霉(Aspergillusniger)或泡盛曲霉；或担子菌类(basidiomycete)月几醇六石粦酉臾酶，例i。源自Peniophoralycii,平田头蒜(Agrocybepediades)，織毛检菌(Trametespubescens)或巻边植森(Paxillusinvolutus);或它们具有肌醇六磷酸酶活性的衍生物、片段或变体。因而，在本发明在动物饲料中的用途的优选实施方案中，以及在本发明的动物铜料添加剂和动物饲料的优选实施方案中，将本发明的肌醇六磷酸酶与这些肌醇六磷酸酶组合。抗微生物肽(AMP，s)的实例是CAP18、LeucocinA、Tritrpticin、Protegrin-l、Thanatin、防卫素(Defensin)、乳4失蛋白(Lactoferrin)、Lactoferricin和Ovispirin如Novispirin(RobertLehrer,2000)，Plectasins和他汀类药物(Statins),包括在WO03/044049和WO03/048148中所公开的化合物和多肽，以及保持抗微生物活性的上述各项的变体或片段。抗真菌多肽(AFP，s)的实例是巨大曲霉(Aspergillusgiganteus)和黑曲霉肽，以及保持抗真菌活性的它们的变体和片段，如在WO94/01459和WO02/090384中所公开的。多不饱和脂肪酸的实例是C18、C20和C22多不饱和脂肪酸，如花生四烯酸，二十二碳六歸酸(docosohexaenoicacid),二十碳五烯酸和y-亚油酸。活性氧生成物的实例是化学品如过硼酸盐、过硫酸盐或过石友酸盐；以及多肽如氧化酶、加氧酶或合成酶。通常脂溶性和水溶性维生素，以及痕量矿物质形成意欲向伺料添加的所谓的预混物的部分，而常量矿物质则通常单独添加到如，+中。这些组合物类型中的任一种当富含本发明的多肽时便成为本发明的动物伺料添加剂。在一个具体的实施方案中，意欲将本发明的动物祠料添加剂以0.01至10.0%;更具体为0.05至5.0%;或0.2至1.0%(%表示每100克饲料中添加剂的克数)的水平包含于(或规定为必须包含于)动物饮食或饲料中。在预混物中尤其是这样。下列是这些组分的非排他性实例列表脂溶性维生素的实例是维生素A、维生素D3、维生素E和维生素K,例如维生素K3。水溶性维生素的实例是维生素B12、生物素和胆碱、维生素Bl、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸盐(panthothenate)，例如D-泛酸4丐(Ca-D-panthothenate)。痕量矿物质的实例是锰、锌、铁、铜、碘、硒和钴。常量矿物质的实例是《丐、磷和钠。对这些组分的营养要求(用家禽和小猪/猪为例)在WO01/58275的表A中列出。营养要求意味着这些组分在饮食中应该以指定的浓度"t是供。在另一方面，本发明的动物饲料添加剂包含至少一个在WO01/58275的表A中指定的个体组分。至少一个意味着，一个或多个，一个，或两个，或三个，或四个和以此类推多至全部的十三个，或多至全部的十五个个体组分的任意一种。更具体地，这至少一个的个体组分以一种提供在表A第四列，或第五列，或第六列中指定的范围内的伺料中浓度(in-feed-concentration)的量包括在本发明的添加剂中。本发明还涉及动物饲料组合物。动物饲料组合物或々欠食具有相对高的蛋白质含量。家禽和猪的饮食的特征可以如WO01/58275表B第2-3列中所述。鱼的饮食的特征可以如该表B的第4列中所述。此外这样的鱼类々欠食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。WO01/58275对应于US09/779334，将其通过4是述并入。本发明的动物饲料组合物具有50-800g/kg的粗蛋白含量，并且此外还包含至少一种本文要求保护的多肽。此外，或在(上述的粗蛋白含量的)替换方案中，本发明的动物饲料组合物具有含量为10-30MJ/kg的可代谢能量；和/或0.1-200g/kg的钙含量;和/或0.1-200g/kg的可用磷(availablephosphorus)含量；和/或0.1-100g/kg的曱硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的曱硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的赖氨酸含量。在具体的实施方案中，可代谢能量、粗蛋白、钙、磷、曱硫氨酸、曱硫氨酸加半胱氨酸和/或赖氨酸的含量是在WO01/58275的表B中的范围2、3、4或5(R.2-5)中的任一之内。粗蛋白是以氮(N)乘以因子6.25来计算的，即粗蛋白(g/kg一N(g/kg)x6.25。氮含量由凯氏定氮法测定(A.O.A.C.,1984,OfficialMethodsofAnalysis第14《反，AssociationofOfficialAnalyticalChemists,WashingtonDC)。可代谢能量的计算可以基于NRC出版物猪的营养需求，第九次修订版1988,猪营养学小组委员会，动物营养学委员会，农业部，国家科学委员会。国家学术出版社，华盛顿特区，第2-6页(Nutrientrequirementsinswine,ninthrevisededition1988,subcommitteeonswinenutrition,committeeonanimalnutrition,boardofagriculture,nationalresearchcouncil.NationalAcademyPress,Washington,D.C.,pp.2-6),以及欧洲家禽饲料能量值表(EuropeanTableof47EnergyValuesforPoultryFeed-stuffs),Spelderholt家禽研究与拓展中心(Spelderholtcentreforpoultryresearchandextension),7361DABeekbergen,荷兰。GrafischbedrijfPonsen&looijenbv，Wageningen.ISBN90-71463-12-5。在完整动物饮食中的钙、可用磷和氨基酸的饮食含量的计算是基于饲料表，如Veevoedertabel1997，gegevensoverchemischesamenstelling，verteerbaarheidenvoederwaardevanvoedermiddelen，CentralVeevoederbureau,Runderweg6,8219pkLelystad.ISBN90-72839-13-7。在一个具体的实施方案中，本发明的动物饲料组合物包含至少一种蛋白质。所述蛋白质可以是动物蛋白，例如肉和骨粉,和/或鱼粉；或其可以是植物蛋白。本文所用的术语植物蛋白是指任何化合物、组合物、制备物或混合物，其包括至少一种从植物得到或起源的蛋白质，包括经修饰的蛋白质和蛋白质衍生物。在具体的实施方案中，植物蛋白的蛋白含量是至少10、20、30、40、50或60%(w/w)。植物蛋白可以源自植物蛋白源，如豆类和谷类，例如来自豆科(Fabaceae)(豆科(Leguminosae)),十字花科(Cruciferaceae),藜科(Chenopodiaceae)和禾本科(Poaceae)的植物的材料，例如大豆粉，羽扇豆粉(lupinmeal)和油菜籽粉(rapeseedmeal)。在一个具体的实施方案中，植物蛋白源是来自豆科的一种或多种植物的材料，例如大豆、羽扇豆、豌豆或菜豆。在另一具体的实施方案中，植物蛋白源是来自藜科的一种或多种植物的材料，例如甜菜、糖甜菜、菠菜或昆诺阿藜(quinoa)。植物蛋白源的其它实例是油菜籽、向日葵子(sunflowerseed)、棉籽(cottonseed)和甘蓝(cabbage)。大豆是优选的植物蛋白源。植物蛋白源的其它实例是谷类如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉蜀黍(玉米)、稻、黑小麦和高粱。在更进一步的具体实施方案中，本发明的动物饲料组合物包含0-80%玉米；和/或0-80%高粱；和/或0-70%小麦；和/或0-70%大麦；和/或0-30%燕麦；和/或0-40%大豆粉；和/或0-25%鱼粉；和/或0-25%肉和骨粉；和/或0-20%乳清。可以将动物々大食例如生产为糊状饲料(mashfeed)(非颗粒的(nonpelleted))或颗粒饲料(pelletedfeed)。通常地，将磨碎的伺料混合并根据对所讨论的物种的规范(specification)添加足量的必需维生素和矿物质。多肽可以作为固体或液体多肽制剂添加。例如，固体多肽制剂通常在混合步骤之前或期间添加；液体多肽制备物通常在造粒步骤之后添加。多肽也可以摻合在饲料添加剂或预混物中。饮食中多肽的终浓度在每千克饮食0.01-200mg多肽蛋白的范围内，例如在每千克动物饮食5-30mg多肽蛋白的范围内。本发明的肌醇六磷酸酶应当以有效的量应用，即以足够改进溶解和/或改进伺料营养价值的量应用。目前考虑多肽以一个或多个下列量(剂量范围)来施用:0.01-200;0.01-100;0.5-100;1-50;5-100;10-100;0.05-50或0.10-10——所有这些范围均为每千克伺料中肌醇六磷酸酶多肽蛋白的毫克数(ppm)。对于测定每千克饲料的肌醇六磷酸酶多肽蛋白的毫克数，将肌醇六磷酸酶从饲料组合物中纯化，并且使用相关的测定法来测定经纯化的肌醇六磷酸酶的比活性。像这样的饲料组合物的肌醇六磷酸酶活性也使用相同的测定法来确定，并基于这两种测定，计算以每千克饲料中肌醇六磷酸酶蛋白的毫克表示的剂量。相同的机理适用于测定伺料添加剂中的肌醇六磷酸酶多肽蛋白的毫克数。当然，如果可以获得用于制备祠料添加剂或饲料的肌醇六磷酸酶的样品，则从该样品中测定比活性(无需从饲料组合物或添加剂中纯化肌醇六磷酸酶)。产生发酵产品和副产品的方法本发明的另一方面涉及用于产生发酵产品/副产品的方法，所述发酵产品/副产品诸如,例如，乙醇、啤酒、葡萄酒、干酒糟(distillersdriedgrains(DDG))，其中所述发酵在本发明的肌醇六磷酸酶存在下进行。发酵方法的实例包括，例如，WO01/62947中描述的方法。发酵使用发酵微生物如酵母进行。在一个具体的实施方案中，本发明提供用于产生乙醇的方法，包括在本发明的肌醇六磷酸酶存在下发酵(使用发酵微生物，如酵母)含糖材料(例如，淀粉)。在另一实施方案中，本发明提供用于产生乙醇的方法，包括水解淀粉，例如，通过液化和/或糖化方法、粗淀粉水解方法；在本发明的肌醇六磷酸酶存在下发酵所得淀粉；和产生乙醇。肌醇六磷酸酶可以添加至发酵过程的任何合适的阶段并且可以添加在任何合适的组合物中，包括单独添加或与其它酶组合添加，所述其它酶例如一种或多种a-淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶。在另一实施方案中，本发明提供用于产生乙醇的方法，包括水解生物质(biomass),和在本发明的肌醇六磷酸酶存在下发酵获得的生物质。实施例用作緩沖液和底物的化学剂至少是试剂级的商品。实施例1:克隆和表达布丘氏菌属肌醇六磷酸酶对以下组氨酸酸性磷酸酶(HAP)进行了多重比对appA大肠杆菌(SPTREMBL:Q8GN88),吉伦氏柠檬酸杆菌(Citrobactergillenii)DSM13694肌醇六磷酸酶(geneseqp:aehO4533),无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacteramalonaticus)ATCC25407肌醇六磷酸酶(geneseqp:aeh04535)，布氏柠檬酸4干菌(Citrobacterbraal〈ii)肌醇六磷酸酶(geneseqp:aeh04827),和ypo1648鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)C092(SPTREMBL:Q8ZFP6)。基于共有序列设计了两种简并寡核苷酸引物2123:5'-CATGGTGTGCGNGCNCCNACNAA-3'(SEQIDNO:9,正向引物)2065:5'-CCCACCAGGNGGNGTRTTRTCNGGYTG-3'(SEQIDNO:10,反向引物)，其中Y表示T或C，R表示A或G，且N表示A、C、G或T。将所述引物用于对多个细菌菌种进行PCR筛选，所述筛选在40-50。C的退火温度，但是通常作为降落(touchdown)程序进行，从50。C开始，其后在接下来的IO个循环中每个循环将退火温度降低rC，之后进行标准PCR。在乡间布丘氏菌DSM18932中以大约950bpPCR片段的形式鉴定了部分肌醇六磷酸酶基因。从琼脂糖凝胶分离了PCR片段，并且使用与生成所述片段所用相同的PCR引物对所述片段进行了测序。通过翻译所述核苷酸序列，确认了所述DNA片段是HAP肌醇六磷酸酶基因中的部分。为了获得所述基因的全长核苷酸序列，使用了DNAWalkingSpeedUpKit(步移法加速试剂盒)(DWSK-V102，来自Seegene,Inc.,2ndFl.,MyungjiBldg.，142—21，Samsung-dong,Kangnam—gu,Seoul,135-090,Korea),所述i式剂盒i殳i十用于捕获未知的靶位点。为了这个目的，设计了4个特异性寡核苷酸并与所述试剂盒一起使用2138TSPIN:5'-ATTGCGGAGCAAGCCCTG-3'(SEQIDNO:11)2139TSP2N:5'-TCGCCAGTTTTAAGCGNGCG-3'(SEQIDNO:12)2136TSP1C:5'-TGGAATATGCGCAAGGGATG隱3'(SEQIDNO:13)2137TSP2C:5'-TGGGGGTCAGAGCAAGAGTGGG-3'(SEQIDNO:14)编码乡间布丘氏菌DSM18932的肌醇六磷酸酶的全长核苷酸序列作为SEQIDNO:5示于序列表中，且相应的编码氨基酸序列为SEQIDNO:6。通过SignalPV3.0(参见www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测，SEQIDNO:6的前33个氨基酸(即氨基酸-33至-l)是信号肽。使用上述的同一多重比对设计了两个另外的简并寡核苷酸PCR引物315:5-CGCGTGGTGATTGTGTCCMGNCAYGGNGT-3'(SEQIDNO:15，正向引物)316:5'-CCAGGTTGGTATCATGGCCNGCDATRAA-3'(SEQIDNO:16,反向引物)，其中Y表示T或C，M表示A或C，N表示A、C、G或T,且R表示A或G。在与如上所述相同的条件下使用所述引物对多种细菌菌种进行了PCR筛选。在伽瓦尼布丘氏菌DSM18930中以及在乡间布丘氏菌DSM18931中以大约900bpPCR片段的形式鉴定了部分的肌醇六磷酸酶基因。从琼脂糖凝胶分离了所述两个PCR片段，并且使用引物1978和1979进行了测序1978:5'-CGCGTGGTGATTGTGTCC-3'(SEQIDNO:17)1979:5'-CCAGGTTGGTATCATGGCC-3'(SEQIDNO:18)通过翻译所述核苷酸序列，确认了两个DNA片段均为PCR扩增自HAP肌醇六磷酸酶基因。为每个基因i殳计了四个新的引物用于^安照DNAWalkingSpeedUpKit沐自Seegene，Inc.,2ndFl.,MyungjiBldg.,142-21，Samsung-dong，Kangnam-gu,Seoul,135-090,Korea的DWSK-V102)中给出的说明获得该基因的全长核苷酸序列。51六磷酸酶基因的四个特异性寡核苷酸PCR引物是2029TSP1N:5'漏AAGCTTCGCCAGTTTTAAGCG-3'(SEQIDNO:19)2030TSP2N:5'-TTGAGTTTGGTGTGGGGCAACTG國3'(SEQIDNO:20)2031TSP1C:5'-TGGCAACAAAGTCGCTCTCG誦3'(SEQIDNO:21)2032TSP2C:5'-TCCTGCTGGAATATGCGCAAGG-3'(SEQIDNO:22)设计用于乡间布丘氏菌DSM18931肌醇六磷酸酶基因的四个特异性寡核苦酸PCR引物是2017TSP1N:5'-TTCGCCCGTTTTAAGCGTG-3'(SEQIDNO:23)2018TSP1C:5'-ACTGCCCTGCGATAAAATGCCC-3'(SEQIDNO:24)2019TSP2N:5'-TTTCCTGCTGGAATATGCGC-3'(SEQIDNO:25)2020TSP2C:5'-TTGATGGCGCGCACACCTTAC-3'(SEQIDNO:26)编码伽瓦尼布丘氏菌DSM18930的肌醇六磷酸酶的全长核苷酸序列作为SEQIDNO:l示于序列表中，且相应的编码氨基酸序列为SEQIDNO:2。SEQIDNO:2的前33个氨基酸(即氨基酸-33至-l)预期为信号肽(通过SignalPV3.0予贞测,参见www.cbs.dtu■dk/services/SignalP/)。来自乡间布丘氏菌DSM18931的编码成熟肌醇六磷酸酶的全长核苷酸序列，以及编码信号肽的部分序列，作为SEQIDNO:3示于序列表中。对应的编码氨基酸序列为SEQIDNO:4。SEQIDNO:4的前9个氨基酸(即氨基酸-9至-l)预期为信号肽的部分。如下在枯草芽孢杆菌中表达了三个肌醇六磷酸酶基因将SEQIDNO:7的信号肽编码序列(编码SEQIDNO:8的信号肽并且源自地衣芽孢杆菌蛋白酶)通过PCR以符合读框的方式依次与来自三种肌醇六磷酸酶中每一种的编码成熟肌醇六磷酸酶的基因融合。将编码获得的编码序列的DNA通过同源重组整合到枯草芽孢杆菌宿主细胞基因组上。在三重启动子系统(triplepromotersystem)(如WO99/43835中所述)的调控下表达所述基因构建体，所述三重启动子系统由来自地衣芽孢杆菌(x-淀粉酶基因(amyL)的启动子、来自解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶基因(amyQ)的启动子和包括稳定化序列的苏云金芽孢杆菌cryIIIA启动子组成。使用编码氯霉素乙酰转移酶的基因作为标记，如例如Diderichsen等，AusefblcloningvectorforBacillussubtilis.Plasmid,30,p.312，1993中所述。200880003605.9对于三种构建体的每一种，在PS-1培养基(10%蔗糖，4。/。大豆粉(soybeanflour),l%Na3P04-12H20，0.5%CaCO3，和0.01%Pluronic酸)中培养氯霉素抗性转化体，同时在30°C以250RPM振荡。温育2-5天之后，移出上清液，并通过将20pi上清液施加于在含0.1M乙酸钠pH4.5和0.1%肌醇六磷酸的1%LSB琼脂糖平板中沖压出的4mm直径的孔中来鉴定肌醇六磷酸酶活性。使所述平板在37。C放置过夜，并且将由0.25MCaCl2和500mMMES组成的緩冲液(用4NNaOH调节至pH6.5)倾倒在所述平板上。将所述平板在室温力文置1小时，然后将磷酸肌醇磷酸酶(inositolphosphatephosphatase)或肌醇六磷酸酶活性作为清澈区(clearzone)加以识别。通过DNA测序分析了三种构建体中每一种的几个肌醇六磷酸酶阳性转化体，以确保构建体的DNA序列正确。为三种构建体中的每一种选择了一个正确的克隆。实施例2:布丘氏菌属肌醇六磷酸酶的发酵和纯化将含有乡间布丘氏菌DSM18932肌醇六磷酸酶构建体并且能够表达具有SEQIDNO:6(成熟部分)的肌醇六磷酸酶的枯草芽孢杆菌菌抹在3(TC并以250rpm在SK-lM培养基(酪蛋白酸钠(SodiumCaseinate)(Miprodan30，来自Aria)40g,Maltodextrin(麦芽糊精)01(Glucidex6,目录号332203,来自Roquette),200g，大豆粉50g，Dowfax63N10(—种非离子表面活性剂，来自Dow)O.lml，自来水补足(upto)1000ml,CaC03片0.5g/100ml)中培养6天。将含有乡间布丘氏菌DSM18931肌醇六磷酸酶构建体并且能够表达具有SEQIDNO:4(成熟部分)的肌醇六磷酸酶的枯草芽孢杆菌菌抹在30。C并以250rpm在PS-1培养基中培养5天，所述PS-1培养基在实施例1中描述。将含有乡间布丘氏菌DSM18930肌醇六磷酸酶构建体并且能够表达具有SEQIDNO:2(成熟部分)的肌醇六磷酸酶的枯草芽孢杆菌菌抹在30。C并以250rpm在PS-1培养基中培养5天，所述PS-1培养基在实施例1中描述。将含有SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶的发酵上清液首先在7200rpm和5°C离心2小时，并且经过0.22|im截留(cut-off)的FastPES瓶顶滤器(Bottletopfilter)过滤。然后，如下预处理滤出的上清液用水清洗样品溶液，并且使用装配有10kDa截留超滤膜的超滤装置(Filtron,来自FiltronTechnologyCorporation)浓缩。53然后用6MHC1将pH调节至5.0，这引起了少量沉淀。通过将样品以7200rpm在5°C离心20分钟来去除该沉淀。向含有肌醇六磷酸酶的上清液添加2.5ml1M乙酸钠pH5.0,并且经过0.22pm截留的FastPES瓶顶滤器过滤。在此之后，测得溶液的pH为5.0,并且发现电导率为1.8mS/cm。预处理之后，将肌醇六磷酸酶通过层析在SPS印harose(XK^6柱中约8Sml)上纯化，使用20mM乙酸钠pH5.0作为緩冲液A，并使用20mM乙酸钠+1MNaClpH5,0作为緩冲液B。分析来自柱的级分的肌醇六磷酸酶活性并汇集有活性的级分。对SEQIDNO:4的肌醇六磷酸酶的纯化基本上如上所述进行，只是使用10。/o乙酸来调节pH。同样观察到了一些沉淀,并且通过离心将该沉淀去除。测得溶液的pH为5.0,同时发现柱层析步骤之前电导率为约1.2mS/cm。将含有SEQIDNO:6的肌醇六石岸酸酶的发酵上清液首先以7200rpm并且在5。C离心1小时，再经过四层Whatman玻璃微纤维滤纸(2.7、1.6、1.2和0.7微米)的夹层结构(sandwich)过滤。在此之后，将溶液经过Seitz-EKS深度滤器(depthfilter)加压过滤。向所述溶液添加提供1.5M的终浓度的固体硫酸铵并且使用6MHC1将pH调节至6.0。将含肌醇六磷酸酶的溶液施加于丁基琼脂糖柱(butyl-sepharosecolumn)(XK26柱中约50ml),使用25mMbis-tris+1.5M辟u酸铵pH6.0作为緩冲液A,和25mMbis-trispH6.0作为緩冲液B。然而，酶没有与柱结合，并且几乎全部活性均存在于穿透(flow-through)和洗涤级分中。将穿透和洗涤级分组合，并且添加固体硫酸4妄至约80%饱和度。将溶液在5。C放置过夜从而完成沉淀。分离沉淀(在上清中不存在活性)并且溶解在Milli-Q水中。将这种溶液相对于Milli-Q水透析并将pH调节至4.5。在这之后，通过在SSepharose(XK26柱中约150ml)上的层析纟屯化月几醇六磷酸酶，使用50mM乙酸钠pH4.5作为緩冲液A,和50mM乙酸钠+1MNaClpH4.5作为緩冲液B。分析来自柱的级分的肌醇六磷酸酶活性并且汇集有活性的级分。最后，使用带有30kDa截留膜的Amiconultra-15过滤设备浓缩具有肌醇六磷酸酶活性的级分。对于全部三种肌醇六磷酸酶，从SDS-PAGE所估计的分子量为大约40kDa,并且在所有情况中纯度>95%。实施例3:肌醇六磷酸酶活性测定法可以适合地通过以下测定法来测定月几醇六磷酸酶活性将75微升在0.25M乙酸钠，0.005%(w/v)Tween-20.pH5.5中适当稀释的含肌醇六磷酸酶的酶溶液分配在微量滴定板例如NUNC269620的孔中，并且添加75微升底物(通过将lOOmg来自稻的肌醇六磷酸钠(Aldrich目录号274321)溶解在10ml0.25M乙酸钠緩冲液，pH5.5中来制备)。将平板密封并且在37。C以750rpm振荡温育15分钟。温育之后，添加75微升终止试剂(终止试剂通过将10ml钼酸盐溶液(10%(w/v)七钼酸铵于0.25%(w/v)氨溶液中)；10ml钒酸铵(来自Bie&Berntsen的0.24%商业产品，目录号LAB17650)和20ml21.7%(w/v)硝酸来制备))，在微量滴定板分光光度计上测量了405nm的吸光度。肌醇六磷酸酶活性以FYT单位来表示，一个FYT是在上述条件下每分钟释放1微摩尔无机正磷S臾才艮的酶量。通过参考从无才几磷酸盐的适当稀释液制作的标准曲线或参考从已知活性的肌醇六磷酸酶酶制备物(这样的具有已知活性的标准酶制备物可从NovozymesA/S,Krogshoejvej36,DK-2880Bagsvaerd索取获得)的稀释液制作的标准曲线来获得测量的肌醇六磷酸酶活性的绝对值。实施例4:比活性在乙酸钠緩沖液，pH5.5中确定了来自伽瓦尼布丘氏菌DSM18930、乡间布丘氏菌DSM18931和乡间布丘氏菌DSM18932的肌醇六磷酸酶(分别具有SEQIDNO:2、4和6的成熟部分的氨基酸序歹'j)的比活性。如实施例2中所述，这些肌醇六磷酸酶是高度纯化的，即在SDS聚丙烯酰胺凝胶上仅鉴定出一个组分。蛋白质浓度如下通过氨基酸分析来测定在抽真空的玻璃试管中，将样品的等分试样在6MHC1,0.1%苯酚中在ll(TC水解16小时。使用AppliedBiosystems420A氨基酸分析系统按照制造商的说明操作对获得的氨基酸定量。从氨基酸的量计算水解等分试样中蛋白质的总质量，进而由此计算蛋白质的浓度。以FYT为单位如实施例3中所述确定肌醇六磷酸酶活性，并将以每mg肌醇六磷酸酶酶蛋白的FYT单位测得的肌醇六磷酸酶活性计算为比活性。对于所述三种肌醇六磷酸酶获得的比活性示于表2。所述比活性是在pH5.5和37。C对肌醇六磷酸钠测定的。表2肌醇六磷酸酶比活性(FYT/mg蛋白质)SEQIDNO:2700SEQIDNO:4800SEQIDNO:6650WO2006/043178中描述的来自布丘氏菌属P1-29的野生型(wt)肌醇六磷酸酶在pH3.5和37。C具有约300U/mg的比活性(参见该WO公开的实施例10)。根据其实施例2,在pH3.5和pH5.5的活性比为大约1.3,而根据图2(纯化的肌醇六磷酸酶的pH活性谱)这个比例则为1.5。在任一情况下，当pH3.5的比活性为大约300U/mg时，pH5.5的比活性不高于300/1.3=231U/mg(也许其更应该(rather)是300/1.5=200U/mg)。WO2006/043178也公开了一种变体肌醇六磷酸酶，其在pH4.0和37°C具有的比活性是野生型的比活性的115%。同样使用图2，野生型在pH4.0的比活性不高于80/60x300U/mg=400U/mg。所述变体在pH4.0的比活性则为1.15x400U/mg=460U/mg，而在pH5.5这种变体的比活性是大约40/80x460U/mg=230U/mg(事实上，230恰好是野生型在pH5.5时的200U/mg的115%,如上所计算的)。除了上文已经考虑在内的pH差异，WO2006/043178的测定条件在所有实践方面(forallthepracticalpurposes)均与本发明的相同，可能除了在WO2006/043178中的反应混合物中存在的0.8mMCaCl2。然而，我们在包括甚至更多的Ca"(即lmMCaCl2)的实施例3的测定法中测试了SEQIDNO:2、4和6的肌醇六磷酸酶的活性，但未发现差异。因此，本发明的肌醇六磷酸酶与WO2006/043178中公开的肌醇六磷酸酶相比在pH5.5具有大大改进的比活性。事实上，本发明的肌醇六磷酸酶的比活性在pH3.5-5.5的整个范围内有所改进。这^^下文的实施例6中显而易见，实施例6显示对于本发明的肌醇六磷酸酶，在这个范围内的活性至少与pH5.5的活性一样高。实施例5:pl使用等电聚焦凝胶(来自Invitrogen的NovexpH310正F凝胶，目录号56EC6655A2)，如制造商所述运行，来测定三种肌醇六磷酸酶的等电点pl。乡间布丘氏菌DSM18931和DSM18932肌醇六磷酸酶(SEQIDNOs:4和6)的pI是7.4，而伽瓦尼布丘氏菌DSM18930(SEQIDNO:2)肌醇六磷酸酶的pI是7.6。实施例6:pH谱在2.0-7.5的pH范围内如实施例3中所述测定了三种肌醇六磷酸酶的pH谱(肌醇六磷酸酶活性作为pH的函数)，除了使用緩沖液混合物(50mM甘氨酸，S0mM乙酸和S0mMBis-Tris(二-(2-羟乙基)亚氨基-三(羟曱基)曱烷))代替0.25M乙酸钠pH5.5緩沖液。结果示于下文表3，其相对于每种肌醇六磷酸酶在最适pH(pH4.5)的值。表3:相对于pH的相对肌醇六磷酸酶活性<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>如与WO2006/043178中描述的布丘氏菌属P1-29的野生型(wt)肌醇六磷酸酶的pH活性语(参见其图2)相比，本发明的肌醇六磷酸酶看起来在低pH值以及高pH值都具有更高的相对活性(在pH2.0和pH6.0,本发明的肌醇六磷酸酶的活性与布丘氏菌属Pl-29野生型肌醇六磷酸酶相比分别是其两倍高和八倍高)。实施例7:pH稳定性纯化的SEQIDNOs:2和4的肌醇六磷酸酶在40。C的pH稳定性通过测量在40。C且在不同pH值温育1.5和24小时之后的残余肌醇六磷酸酶活性来确定。将肌醇六磷酸酶在0.1M甘氨酸、O.IM乙酸、O.lMBis-Tris中温育，调节至期望的pH。在0、1.5和24小时之后取回各种温育混合物的样品，通过在0.25M乙酸钠，0.005%(w/v)Tween20，pH5.5中稀释将样品的pH调节至5.5，并且活性标准化的结果示于下表4。<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>在pH2.0-8.0的整个范围内，在1.5小时两种肌醇六磷酸酶均非常稳定，而当温育持续24小时时，在较低的pH值(pH2.0-3.0)观察到了一定的活性损失。实施例8:温度i普在20-90。C的温度范围基本上如实施例3中所述测定了三种肌醇六磷酸酶的温度谱(肌醇六磷酸酶活性作为温度的函数)，但是，将酶反应(100微升含肌醇六磷酸酶的酶溶液+IOO微升底物)在PCR管而非微量滴定板中进行。在期望温度的15分钟反应期之后，将试管冷却至2(TC持续20秒，并且将150微升反应混合物转移至微量滴定板。添加75微升终止试剂，并且在微量滴定板分光光度计中测量了405nm的吸光度。在pH4.0(0.25M乙酸钠)测定了SEQIDNOs:2和4的肌醇六磷酸酶的温度谱，而在pH5.5(0.25M乙酸钠)测定了SEQIDNO:6的肌醇六磷酸酶的温度谱。结果示于下表5中，其为每种肌醇六磷酸酶相对于在最适温度的活性。表5:在pH4.0/5.5的温度谱温度(。c)2030405060708090SEQIDNO:2213643751002396SEQIDNO:4244054821001787SEQIDNO:6223250741001483看起来所有肌醇六磷酸酶都具有约60。C的最适温度，在30-60。C的温度范围相当有活性(fairlyactive),而且它们在20。C以及70。C还显示了尚可的活性(adecentactivity)。在80-90。C的范围，活性不显著。生物材料的保藏以下生物材料已经根据布达佩斯条约的条款保藏在DSMZ(德意志微生物和细胞培养物保藏中心)，InhoffenstraJ3e7B，D-38124Braunschweig,Germany,并且i皮给予了以下保藏号保藏物登录号保藏曰伽瓦尼布丘氏菌DSM189302007年1月15日乡间布丘氏菌DSM189312007年1月15日乡间布丘氏菌DSM189322007年1月15日所述菌抹已在下述条件下保藏确保在本专利申请的未决(pendency)期间，由美国专利商标委员根据美国联邦法规汇编(CFR)第37编第1.14节和美国法典(U.S.C.)第35编第122条确定为有权获取该培养物者，可获取该培养物。所述保藏物代表被保藏菌株的基本上纯的培养物。该培养物可应本主题申请(subjectapplication)之对应申请或其子申请所递交之国家的外国专利法的要求而可以获得。然而，应当理解，保藏物的可获得性并不构成对于实施本主题发明而侵害由政府行为赋予之专利权的许可。上述菌抹是从2005年在丹麦收集的样品中分离的。本发明在此所描述并要求保护的发明的范围不应受限于本文公开的具体方面，因为这些方面意欲说明本发明的几个方面。任何等同的方面意欲在本发明的范围内。事实上，除了本文显示和描述的那些之外，本领域技术人员根据前文的描述显然能想到本发明的各种修改。这样的修改也意欲落入所附权利要求书的范围内。如有沖突，当以包括定义在内的本文公开内容为准。本文引用了多篇参考文献，它们的公开内容通过提述以其整体并入。5910991.204-WOPCT指出(原始为电子形式)(此页不是国际申请的一部分且不算作国际申请的一页)<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>10991.204-WOPCT指出(原始为电子形式)(此页不是国际申请的一部分且不算作国际申请的一页)3如下所做的指示所涉及的保藏的微生物或其他生物材料在说明书中的如下位置提及3-1页493-2行103-3保藏物的鉴定3-3陽l保藏单位名称DSMZ德意志微生物和细胞培养物保藏.中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkultur6nGmbH)3-3-2保藏单位地址MascheroderWeglb，D-38-124Braunschweig,德国3-3層3保藏日2007年1月15日(15.01.2007)3-3-4登录号DSMZDSM189323-5做出指示的指定国所有指定国受理局专用0-4此表与国际申请一起收到(是或否)0-4-]受权官员国际局专用0-5国际局收到此表的日期0-5-1受权官员6权利要求1.一种具有肌醇六磷酸酶活性并且具有如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列a)当使用Needle程序，用BLOSUM62取代矩阵，10.0的缺口产生罚分和0.5的缺口延伸罚分与SEQIDNO2的氨基酸1-413、SEQIDNO4的氨基酸1-413和/或SEQIDNO6的氨基酸1-413比对时，与上述各氨基酸序列具有至少70％同一性；并且b)当如a)中所述与SEQIDNO2的氨基酸1-413比对并且使用与SEQIDNO2的氨基酸1-413对应的氨基酸残基编号时，在所示的位置包含以下氨基酸中的至少一种119N、120L和/或121E。2.—种具有肌醇六磷酸酶活性并且具有如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列a)当使用Needle程序，用BLOSUM62取代矩阵，10.0的缺口产生罚分和0.5的缺口延伸罚分与SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和/或SEQIDNO:6的氨基酸1-413比对时，与上述各氨基酸序列具有至少70%同一性；并且b)当如a)中所述与SEQIDNO:2的氨基酸1-413比对并且使用与SEQIDNO:2的氨基酸1-413对应的氨基酸残基编号时，在所示的位置包含以下氨基酸中的至少一种109Q、lllG、119N、120L和/或121E。3.—种具有肌醇六磷酸酶活性并且具有如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列a)当使用Needle程序，用BLOSUM62取代矩阵，10.0的缺口产生罚分和0.5的缺口延伸罚分与SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和/或SEQIDNO:6的氨基酸1-413比对时，与上述各氨基酸序列具有至少78%同一性；并且b)当如a)中所述与SEQIDNO:2的氨基酸1-413比对并且使用与SEQIDNO:2的氨基酸1-413对应的氨基酸残基编号时，在所示的位置包含以下氨基酸中的至少一种109Q、lllG、119N、120L、121E和/或193Q。4.一种具有肌醇六磷酸酶活性并且具有如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列a)当使用Needle程序，用BLOSUM62取代矩阵，10.0的缺口产生罚分和0.5的缺口延伸罚分与SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和/或SEQIDNO:6的氨基酸1-413比对时，与上述各氨基S吏序列具有至少78%同一性；并且b)当如a)中所述与SEQIDNO:2的氨基酸1-413比对并且使用与SEQIDNO:2的氨基酸1-413对应的氨基酸残基编号时，在所示的位置包含以下氨基酸中的至少一种1S、101、38S、66E、71K、81A、109Q、lllG、119N、120L、121E、141R、142L、152M、155E、193Q、214V、239K、245D、248E、255A，T、268A，T、277T、283D,E、285K、287D、288A，V、293G、296S、303L、314A、3371、345A、3501、364A、371K、372E、396P、399K、406E和/或413P。5.权利要求4的多肽，其氨基酸序列在指定位置包含以下氨基酸中的至少一种1S、101、38S、71K、109Q、lllG、119N、120L、121E、152M、155E、193Q、255T、268A、277T、283E、285K、287D、288V、296S、364A、3501、372E和/或413P。6.权利要求4的多肽，其氨基酸序列在指定位置包含以下氨基酸中的至少一种66E、81A、109Q、lllG、119N、120L、121E、193Q、255A、268T、277T、283E、285K、287D、288V、293G和/或303L。7.权利要求4的多肽，其氨基酸序列在指定位置包含以下氨基酸中的至少一种66E、109Q、lllG、119N、120L、121E、141R、142L、155E、193Q、214V、239K、245D、248E、255A、283D、288A、314S、3371、345A、364A、371K、372E、396P、399K和/或406E。8.权利要求1-7中任一项的多肽，其氨基酸序列在所示的位置包含以下氨基酸中的至少一种26E、37Y、89T、92E、134I,V、160R、164F、1711、176K、178P、l濯、190E、192G、207E,T、209S、211C、235V、248L、256H,Y、261E、270K、303F和/或318D。9.一种肌醇六磷酸酶，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413或SEQIDNO:6的氨基酸1-413具有至少80%同一性。10.权利要求9的肌醇六磷酸酶，其与SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413或SEQIDNO:6的氨基酸1-413具有至少85%同一性，至少90%同一性，至少95%同一性，至少96%同一性，至少97%同一性，至少98%同一性，或至少99%同一性。11.一种具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，选自下组(i)包含SEQIDNO:2的成熟部分的多肽；(ii)(i)的变体，其包含以下if又代中的至少一种K26E、N37Y、A89T、D92E、T134I，V、H160R、S164F、T17U、T176K、A178P、S188N、D190E、A192G、K207E，T、A209S、D211C、A235V、E248L、Q256H,Y、A261E、N270K、D283N、A288E、I303F和/或N318D;和(iii)(i)或(ii)的变体，其包含以下取代中的至少一种N1S、V9I、T38S、E66Q、Q71K、T81A、R141Q、L142V、T152M、E155D、V214I、K239N、D245E、E248S、A255T、R268A,T、A277T、D283E、N285K、T287D、A288V、D293G、P296S、1303L、S314A、1337V、A345S、V350I、A364S、K371N、E372Q、P396S、K399T、E406V和/或Q413P;其中为了确定i)和ii)中的氨基酸残基位置，将所述多肽的氨基酸序列与SEQIDNO:2的氨基酸1-413使用Needle程序，用BLOSUM62取代矩阵、10.0的缺口产生罚分和0.5的缺口延伸罚分进行比对，并且使用与SEQIDNO:2的氨基酸1-413对应的氨基酸残基编号。12.—种具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，选自下组(i)包含SEQIDNO:4的成熟部分的多肽；(ii)(i)的变体，其包含以下取代中的至少一种K26E、N37Y、A89T、D92E、T134I,V、H160R、S164F、T17U、T176K、A178P、S188N、D190E、A192G、K207E,T、A209S、D211C、A235V、S248L、Q256H,Y、A261E、N270K、E283N、V288E、B03F和/或N318D;和(iii)(i)或(ii)的变体，其包含以下取代中的至少一种S1N、19V、S38T、Q66E、K71Q、T81A、Q141R、V142L、M152T、E155D、1214V、N239K、E245D、S248E、T255A、A268R,T、T277A、E283D、K285N、D287T、V288A、D293G、S296P、1303L、A314S、V337I、S345A、1350V、A364S、N371K、E372Q、S396P、T399K、V406E和/或P413Q;其中为了确定i)和ii)中的氨基酸残基位置，将所述多肽的氨基酸序列与SEQIDNO:4的氨基酸1-413使用Needle程序，用BLOSUM62取代矩阵、10.0的缺口产生罚分和0.5的缺口延伸罚分进行比对，并且使用与SEQIDNO:4的氨基酸1-413对应的氨基酸残基编号。13.—种具有月几醇六磷酸酶活性的多肽，选自下组(i)包含SEQIDNO:6的成熟部分的多肽；(ii)(i)的变体，其包含以下取代中的至少一种K26E、N37Y、A89T、D92E、T134I，V、H160R、S164F、T17U、T176K、A178P、S188N、D190E、A192G、K207E，T、A209S、D211C、A235V、S248L、Q256H，Y、A261E、N270K、E283N、V288E、L303F和/或N318D;和(iii)(i)或(ii)的变体，其包含以下取代中的至少一种N1S、V9I、T38S、E66Q、Q71K、A81T、Q141R、V142L、T152M、D155E、1214V、N239K、E245D、S248E、A255T、T268A,R、T277A、E283D、K285N、D287T、V288A、G293D、P296S、L303LA314S、V337I、S345A、V350I、S364A、N371K、Q372E、S396P、T399K、V406E和/或Q413P;其中为了确定i)和ii)中的氨基酸残基位置，将所述多肽的氨基酸序列与SEQIDNO:6的氨基酸1-413使用Needle程序、用BLOSUM62取代矩阵、10.0的缺口产生罚分和0.5的缺口延伸罚分进行比对，并且使用与SEQIDNO:6的氨基酸1-413对应的氨基酸残基编号。14.一种多肽的变体，所述多肽包含以下GENESEQP序列中任一个的成熟部分AEH25057、AEH25059、AEH25058、AEH25067、AEH25071、AEH25072、AEH25074、AEH25076、AEH25073、AEH25070、AEH25069、AEH25066、AEH25060、AEH25068、AEH25063、AEH25065、AEH25062、AEH25061、AEH25056、AEH25051或AEH25064;所述变体具有肌醇六磷酸酶活性，并且包含以下取代中的至少一种N1S、VIOI、T38S、Q66E、Q71K、T81A、E109Q、H111G、Dl丽、1120L、K121E、Q141R、V142L、T152M、D155E、L193Q、1214V、N239K、E245D、S248E、V255A,T、R268A，T、A277T、N283D,E、N285K、T287D、E288A,V、D293G、P296S、B03L、A314S、V337I、S345A、V350I、S364A、N371K、Q372E、S396P、T399K、V406E和/或Q413P;其中为了确定氨基酸残基位置，将所述变体的氨基酸序列与SEQIDN0:2的氨基酸1-413使用Needle程序，用BLOSUM62取代矩阵、10.0的缺口产生罚分和0.5的缺口延伸罚分进行比对，并且使用与SEQIDN0:2的氨基酸1-413对应的氨基酸残基编号。15.—种多肽的变体，所述多肽包含GENESEQP:AEH25075的成熟部分，所述变体具有肌醇六磷酸酶活性并且包含以下取代中的至少一种N1S、VIOI、T38S、Q66E、Q71K、T81A、E109Q、H111G、D119N、1120L、K121E、Q141R、V142L、T152M、D155E、L193Q、1214V、N239K、E245D、S248E、V255A,T、R268A,T、A277T、N283D,E、N285K、T287D、E288A,V、D293G、P296S、F303L、A314S、V337I、S345A、V350I、S364A、N371K、Q372E、S396P、T399K、V406E和/或Q413P;其中为了确定氨基酸残基位置，将所述变体的氨基酸序列与SEQIDNO:2的氨基酸1-413使用Needle程序，用BLOSUM62取代矩阵、10.0的缺口产生罚分和0.5的缺口延伸罚分进行比对，并且使用与SEQIDNO:2的氨基酸1-413对应的氨基酸残基编号。16.—种具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，选自.下组:''(a)多肽，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:2的氨基酸1-413的序列具有至少93.6°/。同一性；(b)变体，其包含对SEQIDNO:2的氨基酸1-413进行的一个或多个氨基酸的保守取代、缺失和/或插入；其中为了计算a)中的同一性，将所述多肽的氨基酸序列与SEQIDNO:2的氨基酸1-413使用Needle程序，用BLOSUM62取代矩阵、10.0的缺口产生罚分和0.5的缺口延伸罚分进行比对。17.—种具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，选自下组(a)多肽，其具有氨基S复序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:4的氨基酸1-413的序列具有至少93.9%同一性；(b)变体，其包含对SEQIDNO:4的氨基酸1-413进行的一个或多个氨基酸的保守取代、缺失和/或插入；其中为了计算a)中的同一性，将所述多肽的氨基酸序列与SEQIDNO:4的氨基酸1-413使用Needle程序，用BLOSUM62取代矩阵、10.0的缺口产生罚分和0.5的缺口延伸罚分进行比对。18.—种具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，选自下组(a)多肽，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:6的氨基酸1-413的序列具有至少95.8%同一性；(b)变体，其包含对SEQIDNO:6的氨基酸1-413进4亍的一个或多个氨基酸的保守取代、缺失和/或插入；其中为了计算a)中的同一性，将所述多肽的氨基酸序列与SEQIDNO:6的氨基酸1-413使用Needle程序，用BLOSUM62取代矩阵、10.0的缺口产生罚分和0.5的缺口延伸罚分进行比对。19.一种多核香酸，其包含编码权利要求1-18中任一项的多肽的核苷酸序列。20.—种核酸构建体，其包含权利要求19的多核苷酸，所述多核苷酸与指导所述多肽在表达宿主中产生的一个或多个调控序列可操作地连接。21.—种重组表达载体，其包含权利要求20的核酸构建体。22.—种重组宿主细胞，其包含权利要求20的核酸构建体。23.—种用于产生权利要求1-18中任一项的多肽的方法，包括(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式能够产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。24.—种用于产生权利要求1-18中任一项的多肽的方法，包括(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞包含核酸构建体，该核酸构建体含有编码所述多肽的核芬酸序列；和(b)回收所述多肽。25.—种转基因植物、植物部分或植物细胞，其已经用编码权利要求1-18中任一项的多肽的多核芬酸转化。26.—种转基因的非人动物或其产品或成分，能够表达权利要求1-18中任一项的jyi醇六^粦酸酶。27.—种组合物，其包含权利要求1-18中任一项的至少一种肌醇六磷酸酶,和(a)至少一种脂溶性维生素；(b)至少一种水溶性维生素；和/或(c)至少一种痕量矿物质。28.权利要求27的组合物，还包含选自以下酶的组的至少一种酶淀粉酶、肌醇六磷酸酶、磷酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、a-半乳糖苦酶、蛋白酶、磷脂酶和/或P-葡聚糖酶。29.权利要求27和28中任一项的组合物，其是动物饲料添加剂。30.—种动物饲料组合物，具有50-800g/kg的粗蛋白含量，并且包括权利要求1-18中任一项的肌醇六磷酸酶。31.—种用于改进动物饲料营养价值的方法，其中向所述饲料添加权利要求1-18中任一项的肌醇六磷酸酶。32.—种用于降低动物粪便中肌醇六磷酸盐水平的方法，包括用有效量的权利要求30的饲料喂食动物。33.—种用于处理植物蛋白的方法，包括向至少一种植物蛋白添加权利要求1-18中任一项的肌醇六磷酸酶的步骤。34.权利要求1-18中任一项的肌醇六磷酸酶或权利要求27-29中任一项的组合物在动物伺料中；在动物詞料的制备中；用于改进动物饲料的营养价值；用于降低动物粪便中的肌醇六磷酸盐水平；用于处理植物蛋白；或用于从肌醇六磷酸酶底物释放磷的用途。35.—种用于产生发酵产物的方法，包括在权利要求1-18的肌醇六磷酸酶存在下发酵糖类材料。36.—种用于产生乙醇的方法，包括在权利要求1-18的肌醇六磷酸酶存在下发酵糖类材料，和产生乙醇。37.权利要求1-18的肌醇六磷酸酶在使用发酵方法制备乙醇中的用途。全文摘要本发明涉及具有肌醇六磷酸酶活性的多肽。这些多肽具有的氨基酸序列与源自细菌布丘氏菌属的三种肌醇六磷酸酶中的任一种具有至少70％的同一性，并且在指定位置包含以下氨基酸中的至少一种119N、120L和/或121E。这些肌醇六磷酸酶具有改进的比活性。还公开了另外的特定氨基酸取代，它们表征并区别本发明的其它具有改进的性质的肌醇六磷酸酶，所述改进的性质例如温度和/或pH稳定性、pH活性谱、温度活性谱、底物谱、改进的在体外或体内在动物饲料中的性能。本发明还涉及编码多肽的分离的多核苷酸，包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于产生和使用所述多肽的方法。文档编号C12N15/82GK101594774SQ200880003605公开日2009年12月2日申请日期2008年1月30日优先权日2007年1月30日发明者伦纳多·德玛利亚,卡斯滕·肖霍尔姆,拉斯·K·斯科夫,泽伦·F·拉森申请人:诺维信公司