专利名称：共表达两种亚型猪流感病毒ha基因重组腺病毒的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种共表达两种亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的制备，特别是涉及ー种共表达HlNl与H3N2亚型猪流感病毒血凝素蛋白重组腺病毒的构建；两种血凝素之间的linker FMDV 2A为重组腺病毒中不同血凝素蛋白的単独表达提供了新的手段，为H3、Hl亚型猪流感病毒双价核酸疫苗的研制提供病毒模型，也为进一歩研究开发基因工程疫苗奠定了基础。
背景技术：
猪流感(swine influenza, SI)是由猪流感病毒(SIV)引起的ー种急性高度接触性传染病，単独感染发病率高、死亡率低，临床上常与猪繁殖与呼吸综合征、猪传染性胸膜肺炎等并发或继发感染，导致患病动物生产性能下降或死亡，给养猪业造成较大经济损失。除此之外，猪作为人流感和禽流感病毒的“混合器”，在流感病毒种间传播及流行病学研究中占据重要地位。近来，HlNU H1N2和H3N2亚型流感病毒一直在世界猪群中共同流行，猪流感的病原学和血清学调查显示，HlNl和H3N2亚型已成为在我国猪群中广泛流行的优势毒株。目前，主要是通过接种疫苗来预防该病的发生。常规灭活疫苗对该病的免疫防制存在不足之处，而弱毒疫苗则存在潜在的生物安全问题。因此，开发新型、高效、廉价、安全的疫苗势在必行。随着分子生物学技术的飞速发展，学者们不断进行着新型基因工程流感疫苗的研究。HA蛋白为SIV的表面糖蛋白，病毒感染后能够诱导机体产生特异性抗HA蛋白的抗体，该抗体具有病毒中和作用，因此，HA基因在流感病毒基因工程疫苗中被作为重要的革巴抗原。腺病毒表达系统具有稳定且易调控、表达外源抗原活性高、免疫途径广泛、安全高效等优点。多种人类和动物病原基因的重组腺病毒的成功构建与应用结果表明重组腺病毒能够诱导机体产生強烈的体液免疫和细胞免疫反应，能够抵御相应病原的致死性侵袭，在动物疫苗方面显示出良好的应用前景。FMDV 2A具有自剪切功能，2个外源基因之间以2A序列连接形成一个完整的0RF。翻译时融合蛋白可在编码2A区域的C端被2A切开，将融合蛋白切割分离为两个独立的蛋白(Mattion et al.，1996)。FMDV 2A基因其短小的基因序列和2A高效的自剪切效率为ニ价基因疫苗的研制提供了新的手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种共表达两种亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的制备，其构建ー株以FMD 2A为linker共表达HlNl与H3N2亚型猪流感病毒血凝素蛋白重组腺病毒，为H3、H1亚型猪流感病毒双价核酸疫苗的研制提供病毒模型，也为SIV腺病毒活载体疫苗的研制奠定基础，采用第三代腺病毒载体，它突出的优点是缺失全部的腺病毒蛋白编码序列，感染后没有病毒蛋白表达，降低了机体的免疫反应和细胞毒性，提高了安全性。
本发明的技术方案是这样实现的共表达两种亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的制备，其特征在于首先分别设计针对HlNl与H3N2亚型猪流感病毒HA蛋白及FMD 2A的基因序列，然后将其与酶切后的腺病毒穿梭载体连接，经PCR和测序鉴定；将鉴定正确的重组穿梭质粒转化入含有腺病毒骨架质粒的大肠杆菌BJ5183感受态进行同源重组，获得重组腺病毒质粒；然后用Pac I线性化后转染293细胞，在293细胞内包装出重组腺病毒；通过荧光显微镜观察、PCR检测，证明血凝素基因已成功克隆入腺病毒载体。并通过小鼠免疫试验验证获得的重组腺病毒可以同时对此两种亚 型猪流感的攻击提供一定的保护。具体步骤如下
1.针对HlNl和H3N2亚型SIVHA基因及FMD 2A基因的设计
从GenBank上下载HlNl和H3N2亚型SIV毒株HAl基因及FMD 2A的序列，扩增基因的特异性引物由上海生エ生物工程技术服务有限公司合成设计。见表I针对HlNl和H3N2亚型SIV毒株HAl基因及FMD 2A基因的引物序列。
2.重组穿梭载体的构建
将扩增得到的H1HA1-2A与酶切线性化的pAdTrack载体16°C连接过夜，将连接产物转化入DH5a感受态细胞中，通过PCR、酶切筛选正确克隆，将得到的重组穿梭载体质粒线性化后与H3HA1连接并转化入DH5a感受态细胞，经鉴定得到重组腺病毒穿梭质粒。如图I所示。3.重组腺病毒质粒的构建及重组腺病毒的获得
将线性化的重组穿梭质粒转化进携带腺病毒骨架质粒的大肠杆菌BJ5183感受态细胞，进行同源重组，得到重组腺病毒质粒。将重组腺病毒质粒线性化后转染293T细胞进行病毒包装，包装后，收获细胞培养物进行纯化和鉴定。如图2所示。4.重组腺病毒的鉴定
使用重组腺病毒原液感染293T细胞，在荧光显微镜下观察重组毒所携帯的GFP蛋白的表达情况，待出现明显细胞病变时收集细胞，反复冻融后，离心后取上清进行PCR鉴定。如图3，4所示。5.重组腺病毒的小鼠免疫试验
用重组病毒免疫6周龄的雌性昆明鼠,两周后再次免疫,ニ免后两周用HlNl和H3N2SIV进行攻毒，测攻毒后免疫保护率。通过检测小鼠对病毒攻击的保护情况评价该重组病毒的免疫原性。本发明的积极效果是将不同亚型SIV HA基因以串联方式插入到同一株腺病毒载体上，即用质粒pUM-T、腺病毒穿梭质粒pAdTrack、腺病毒骨架质粒pAdEasy-Ι等，经一系列中间过程，得到基因表达质粒等中间产物，将最后得到的重组腺病毒质粒转染293细胞；根据腺病毒感染形成的细胞病变及GFP基因表达可见緑色荧光两方面来筛选重组病毒，用PCR鉴定该重组腺病毒。该重组腺病毒为H3、H1亚型猪流感病毒双价核酸疫苗的研制提供病毒模型，也为进一歩研究开发基因工程疫苗奠定了基础。2009年3月至今，流行于全球许多国家人群中的HlNl亚型流感进ー步突出了 SI在人类公共卫生方面具有的潜在危害性，研制高效、安全的疫苗为SI的防制提供物质储备，已经不单单具有兽医学的研究意义，同时对保障人类的生命安全也具有重要意义。
图I为重组腺病毒穿梭载体PCR和酶切鉴定結果，M:DL2000。图2为重组腺病毒质粒PCR和酶切鉴定結果，M:DL15000。图3为重组腺病毒PCR鉴定結果，M:DL15000。图4为重组腺病毒二次接种293T细胞結果。
具体实施例方式下面结合具体实例对本发明做详细说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例I目的基因引物设计及重组穿梭载体构建
根据GenBank数据库提供的HlNl和H3N2亚型SIV HAl及FMD 2A的核酸序列设计引物，并在HA及2A基因上、下游分别引入限制性酶切位点。将H1-2A与经内切酶Sal I和Xho I双酶切后线性化的pAdTrack载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5 α，挑取阳性克隆进行PCR及测序鉴定(上海生エ公司进行测序分析)。鉴定阳性克隆的引物序列
F :5’-ACGCGTCGACAAAATGAAGGCAATACTAGTGTT-3，
R :5’-CGCTCGAGGGGCCCTGGGTTGGACTCGACGTCGCCGGCCAACTTGAG-3，
PCR反应循环条件95°C预变性Imin ;95°C变性30s，60°C退火40s，72°C延伸50s (30个cycles);最后 72°C延伸 IOmin0将鉴定正确的重组载体经Xho I和Xba I线性化后与H3连接，转化DH5 α感受态，挑取阳性克隆进行PCR及测序鉴定(上海生エ公司进行测序分析)。鉴定阳性克隆的引物序列
F :5’-ACGCGTCGACAAAATGAAGGCAATACTAGTGTT-3’，
R :5’-GCTCTAGAGCTCAGCCTCTAGTTTGTTTCT-3’
PCR反应循环条件95°C预变性Imin ;95°C变性30s，59°C退火40s，72°C延伸90s (30个cycles);最后 72°C延伸 IOmin0实施例2重组腺病毒质粒的构建及重组腺病毒的获得
如图1-3所示，将重组腺病毒穿梭质粒用限制性内切酶Pme I线性化、纯化回收后，转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-Ι的BJ5183感受态细胞进行同源重组。Kan抗性筛选后提取质粒，对提取后的质粒用Pac I进行酶切鉴定和PCR鉴定。为了获得大量高质量的重组质粒，将筛选的阳性重组腺病毒质粒转化于宿主菌DH5ci扩增。用核酸内切酶Pac I将从宿主菌DH5 α量扩增的重组腺病毒质粒线性化后，纯化回收。以含10%胎牛血清的DMEM培养基培养293Τ细胞，4Χ IO5/孔接种到六板中，每孔含3mL培养基，在37°C的CO2培养箱中培养16h。将5μ FuGENG HD转染试剂与2Pg纯化回收得到的重组腺病毒质粒DNA溶液加入到500μ1无血清，无双抗的DMEM培养液，混合均匀，室温温育20min。将DNA与混合液转移至293T细胞的培养液中混匀，于37°C、5% CO2细胞培养箱中培养，37°C孵育6h后加入含10%血清的DMEM 3mL,继续培养7 10d，并在荧光显微镜下观察GFP表达状況，了解腺病毒包装过程，待有较明显的荧光或明显的细胞病变后，于-80°C /37°C反复冻融3次，收集于IOmL离心管中，以10000r/min离心IOmin,收集上清即为收获的病毒原液，按I : 10的比例感染新的293T细胞，如此反复制备出3代重组
腺病毒。实施例3重组腺病毒的鉴定
如图4所示，重组腺病毒再次感染293细胞48h后，倒置荧光显微镜下可见GFP表达，证明重组腺病毒基因组中有GFP基因，符合预期結果。按照Wizard SV GenomicDNA Purification System试剂盒操作步骤提取重组腺病毒的基因组DNA,以I μ L (50 IOOng)基因组 DNA 为模板，Mgcl2 I μ L，dNTP I. 5 μ L，DEPC 水 20 μ L，上下游引物各 O. 5 μ L(IOpmoI / μ L), Taq 酶 O. 5 μ L,总体系 25 μ しF:5’-ACGCGTCGACAAAATGAAGGCAATACTAGTGTT-3’
R:5’-GCTCTAGAGCTCAGCCTCTAGTTTGTTTCT-3’PCR反应循环条件95°C预变性Imin ;95°C变性30s，59°C退火40s，72°C延伸90s (30个cycles);最后 72°C延伸 IOmin0
实施例4重组腺病毒的小鼠免疫试验
把7周龄的昆明鼠随机分成3组，每组10只。第一组用rAd-Hl-2A-H3免疫，第二组用rAd-GFP免疫，第三组用PBS免疫。在初免后2周加强免疫一次，采用皮下注射的方式，免疫剂量为IX 108TCID50。在加强免疫后2周，用106EID50的HlNl和H3N2通过滴鼻法对三组攻毒,姆只小鼠50 μ I0
权利要求
1.共表达两种亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的制备，其特征在于首先分别设计针对HlNl和H3N2亚型SIV HA及FMD 2A引物序列，然后将其与酶切后的腺病毒穿梭载体PAdTrack连接，经PCR和测序鉴定；将鉴定正确的重组腺病毒穿梭载体转化入含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-Ι的大肠杆菌BJ5183感受态细胞，进行同源重组，经PCR和酶切鉴定得重组腺病毒质粒；将得到的重组腺病毒质粒线性化后转染293T细胞，进行重组腺病毒的包装；包装后将得到的病毒原液感染293T细胞或MDCK细胞，48h后观察荧光蛋白表达情況，并通过PCR方法鉴定，具体步骤如下I)根据GeneBank上HlNl和H3N2亚型SIV HA及FMD2A序列设计引物；2)HA序列与pAdTrack载体连接，转化，挑去菌落，应用OMEGA质粒提取试剂盒提取质粒，通过PCR，酶切及测序鉴定结果显示该重组腺病毒穿梭质粒构建成功；3)重组腺病毒穿梭质粒与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183感受态中同源重组，得到重组腺病毒质粒后转染293T细胞进行包装；4)将转然后得到的病毒原液感染293T细胞，48h后观察荧光蛋白表达情况，并提取细胞基因组DNA，通过PCR方法检测HA基因序列；5)用重组病毒免疫6周龄的雌性昆明鼠,在ニ免后两周用HlNl和H3N2 SIV进行攻毒,测攻毒后免疫保护率以评价该重组病毒对小鼠的免疫保护效果。
2.根据权利要求I所述的ー种共表达两种亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的制备，其特征在于所述的HA基因与含有CMV启动子的腺病毒穿梭载体pAdTrack组建成重组腺病韋穿梭质粒 pAdTrack_Hl_2A_H3。
3.根据权利要求2所述的ー种共表达两种亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的制备，其特征在于所述的重组腺病毒载体的构建如下1)制备含有腺病毒骨架质粒PAdEasy-I的大肠杆菌BJ5183感受态细胞，2)将得到的重组腺病毒穿梭质粒经限制性内切酶Pme I单酶切后转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-Ι的大肠杆菌BJ5183感受态细胞，进行同源重组，挑取阳性克隆进行PCR及酶切鉴定。
4.根据权利I所述的ー种共表达两种亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的制备，其特征在于两种目的基因之间以FMDV 2A为linker，FMDV 2A具有自剪切功能，翻译时融合蛋白可在编码2A区域的C端被2A切开，分别表达为两个独立的蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种共表达两种亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的制备，其特征在于首先分别设计针对H1N1和H3N2亚型SIVHA及FMD2A引物序列，然后将其与酶切后的腺病毒穿梭载体pAdTrack连接，进行同源重组，经PCR和酶切鉴定得重组腺病毒质粒；将得到的重组腺病毒质粒线性化后转染293T细胞，包装后将得到的病毒原液感染293T细胞或MDCK细胞。该重组腺病毒为H3、H1亚型猪流感病毒双价核酸疫苗的研制提供病毒模型，也为进一步研究开发基因工程疫苗奠定了基础。2009年3月至今，流行于全球许多国家人群中的H1N1亚型流感进一步突出了SI在人类公共卫生方面具有的潜在危害性，研制高效、安全的疫苗为SI的防制提供物质储备。
文档编号C12N15/861GK102719479SQ201210069489
公开日2012年10月10日 申请日期2012年3月16日 优先权日2012年3月16日
发明者丁壮, 丛彦龙, 刘慧 , 朱利塞, 李鑫, 杨建新, 樊娇, 郭育培, 韩明明, 黄志强 申请人:吉林大学