专利名称：含甲型流感病毒核蛋白的融合基因及其构建和表达方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种含甲型流感病毒核蛋白的融合基因PEGFP-N1-NP及其构建和表达方法。
背景技术：
甲型流感病毒是呼吸道感染的重要病原体，多次引起世界性流感大流行1997年香港爆发高致病性H5m禽流感疫情，首次证实禽流感可以感染人类，至今全球已感染562 例，死亡3 例；2009年甲型Hmi流感席卷全球，未来流感流行的病毒株将可能会出现在任何时间、世界的任何地方、以及任何动物来源的流感病毒重配株。甲型流感病毒核蛋白 (NucleoproteinjNP)是由流感病毒基因组第5片段编码的，其开放读码框含1494个核苷酸，在流感病毒的转录、复制及转运中发挥着重要的作用，在各个不同亚型中具有高度保守性并可产生免疫交叉保护。因此，对核蛋白功能的研究，将有助于进一步了解甲型流感病毒的致病机制，为防控流感大流行提供理论依据。为了能够大量获得甲型流感病毒核蛋白，以便进行下一步研究，需要构建甲型流感病毒核蛋白NP基因真核表达载体。真核表达质粒载体pEGFP-Nl表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，构建NP与EGFP的融合基因，可使NP基因表达绿色荧光蛋白。所构建的融合基因可进行真核表达，对甲型流感病毒核蛋白的功能鉴定、药物靶点筛选及其致病机理的进一步研究奠定了重要的实验基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种含甲型流感病毒核蛋白的融合基因 pEGFP-Nl-NP及其构建和表达方法，该融合基因pEGFP_Nl_NP的成功构建和表达可进行RNA 干扰抑制流感病毒NP基因，并在细胞及病毒中进行功能鉴定。为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案
本发明含甲型流感病毒核蛋白的融合基因pEGFP-Nl-NP的核苷酸序列如SEQ ID
NO. 1。上述融合基因的构建方法，包括如下步骤
(1)以甲型流感病毒核蛋白基因为模板，设计含限制性内切酶EcoRI及Sma I酶切位点的引物，PCR扩增，得带有双酶切位点的核蛋白基因；
(2)将核蛋白基因与T载体pMD19-TSimple Vector混合进行T克隆，经0. 8%琼脂糖凝胶电泳鉴定后获得PMD19-T-NP质粒；
(3)将pMD19-T-NP质粒亚克隆至增强型绿色荧光示踪蛋白EGFP的目标载体pEGFP-Nl， 转化大肠杆菌DH-5 α，培养后提取质粒，Sma I、EcoR I双酶切鉴定阳性克隆，即得融合基因 pEGFP-Nl-NP。在上述融合基因的制备方法中，步骤(3)中亚克隆是指采用限制性内切酶Sma I和EcoR I双酶切pEGFP-Nl质粒及pMD19_T_NP质粒分别获得纯化的pEGFP-Nl和目的核蛋白片段，添加到连接反应中连接获得连接反应液。所述培养后提取质粒是将转化后的大肠杆菌DH-5 α接种于含卡那霉素的LB培养板上培养，挑取单克隆菌落至含卡那霉素的 S. 0. C液体培养基上培养。在前述融合基因的构建方法中，步骤(1)中所述PCR扩增的扩增引物为 上游弓I物5，-ccgcgaattcatggcgtctcaaggcaccaaacgat-3，，其中 gaattc 是 EcoR I 的
酶切位点；
下游弓I物5' -cgcgcccgggcattgtcatactcctctgcatt_3'，其中 cccggg 是 Sma I 的酶切位点。在前述的构建方法中，所述模板为甲型流感病毒H9N2核蛋白基因。前述甲型流感病毒核蛋白与绿色荧光蛋白融合基因pEGFP-Nl-NP的表达方法通过Lipofectamine 2000将pEGFP_Nl_NP融合基因转染HEK293T细胞，在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达；用细胞免疫组化方法鉴定甲型流感病毒核蛋白的表达。与现有技术相比，本发明将甲型流感病毒核蛋白与绿色荧光蛋白融合，形成融合基因，该融合基因在转染真核表达细胞后可表达绿色荧光蛋白和甲型流感病毒核蛋白，该融合基因pEGFP-Nl-NP的成功构建和表达可进行RNA干扰抑制流感病毒NP基因，并在细胞及病毒中进行功能鉴定。
图1为本发明融合基因的结构示意图2为目的基因NP PCR扩增结果。其中M 分子质量标准；1 =NP-F, NP-R扩增NP基因片段。图3为NP基因TA克隆质粒电泳结果。其中M 分子质量标准；1_7 可能构建成功的NP基因TA克隆质粒；8、9 未构建成功的NP基因TA克隆质粒。图4为NP基因TA克隆质粒酶切产物电泳结果。其中M 分子质量标准；1-7:构建成功的NP基因TA克隆质粒酶切产物电泳；8、9 未构建成功的NP基因TA克隆质粒酶切产物电泳。图5为NP、EGFP融合基因质粒电泳结果。其中M 分子质量标准；1-4，6-9，11-18 可能构建成功的NP、EGFP融合基因质粒；5、10 未构建成功的NP融合基因。图6为NP、EGFP融合基因质粒酶切产物电泳结果。其中M:分子质量标准; 1-4，6-9，11-18 构建成功的NP、EGFP融合基因质粒酶切产物电泳；5、10 未构建成功的NP 融合基因质粒酶切产物电泳。图7为质粒转染HEK293T细胞后倒置荧光显微镜观察结果(X400)。其中A、D: pEGFP-m 转染 HEK293T 细胞；B、E: pEGFP-Nl-NP 转染 HEK293T 细胞；C、F: HEI^93T 细胞空白转染对照。图8为细胞免疫组化鉴定NP蛋白的表达观察结果(X400)。其中B: pEGFP_Nl_NP 转染HEK293T细胞，加兔抗NP—抗，箭头所指为阳性染色结果；A、C、D、E、F:未见阳性染色结果。
具体实施方式
实施例1 融合基因pEGFP-Nl-NP的构建
1、设计含限制性内切酶EcoR I及Sma I酶切位点的引物
上游弓丨物5' -Ccgcgaattcatggcgtctcaaggcaccaaacgat-Si，其中 gaattc 是 EcoR I 的酶切位点；
下游弓I物5' -CRCRCccRRRcattRtcatactcctctRcatt-3'，其中 cccggg 是 Sma I 的酶切位点。2、PCR扩增NP片段甲型流感病毒核蛋白(NP)基因DNA来源病毒株为Influenza A virus (A/swine/Guangxi/S15/2005(H9N2)) (GenBank: EU086324.1
)，以NP基因DNA为模板，步骤(1)所设计的引物为引物，引入限制性内切酶EcoR I和 Sma I酶切位点，扩增NP基因片段全长为1508bp ； ddH2012. 5μ 1
5 X Buffer5μ 1
MgCl22 μ 1
dNTPmix2 μ 1
DNA Taq 酶0. 5 μ 1
NP-F0· 5 μ 1
NP-R0· 5 μ 1
NP DNA2 μ 1
总反应体系 25 μ 1。PCR 扩增条件如下94°C 3min ；94°C 30s, 59°C 20s, 72°C lmin30s, 共42个循环；72°C延伸7min。0. 8%的琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果(如图2所示)，按美国 Omega公司DNA纯化回收试剂盒说明书切胶、纯化大小为1508bp的NP基因片段。3、NP基因的TA克隆
(1)取步骤2所得的NP基因片段，按宝生物工程(大连)有限公司TA克隆操作说明书与 pMD19-T Simple Vector 混合连接； pMD19-T Simple Vector1 μ 1
NP DNA4 μ 1
Solution I5 μ 1
16°C连接池得连接产物。(2)转化大肠杆菌取100 μ 1大肠杆菌DH-5 α感受态细胞于冰浴中融化，避免感受态细胞长时间暴露于室温；向感受态细胞中加入10 μ 1目的DNA(连接产物)，轻轻旋转离心管使液体混勻，切忌不要吹打或震荡混勻，冰浴30min ；42°C水浴热激90s，快速转移到冰浴中，冰浴:3min，过程中不要摇动离心管；向离心管中加入900μ 1 LB液体培养基，轻轻吹打混勻后置于37°C摇床200rpm震荡培养lh，使质粒抗性标记基因表达，使菌体复苏；紫外灯照射LB (含氨苄青霉素)蓝白斑筛选培养板20min，取100 μ 1已转化的感受态细胞加到板上，用玻璃棒均勻涂布，室温放置直到液体完全吸收后倒置于37°C烘箱中16h。( 3 )菌株筛选挑选培养后菌体晶莹透明体积较大，且周围无其他融合菌落边界清晰的白色单一克隆，用牙签轻沾后扇形涂布于事先分格的LB (含氨苄青霉素)蓝白斑筛选培养板上，标号一一对应，标记清楚以备上溯；37°C烘箱倒置培养16h。(4)质粒抽提挑选单克隆扩增后仍为白色的菌落至含氨苄青霉素的S. 0. C液体
5培养基，37°C摇床200转/分培养12-1他，利用北京天根生物公司的质粒小提试剂盒(离心柱型)提取质粒，按以下步骤进行
①选取单克隆板上长势较好的菌株，取1. 5ml离心管加入ImlS. 0. C含氨苄青霉素液体培养基，用牙签挑取少量菌落于离心管中搅拌，在15ml离心管中加入5mlS. 0. C含氨苄青霉素液体培养基，将混勻的菌液加入15ml离心管中，盖子只螺旋约1/4行程便于通气，37°C 200rpm IMi摇床过夜。②柱平衡步骤向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μ1的平衡液BL， 12，OOOrpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(使用当天处理过的柱子)
③取2 ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12，OOOrpm离心 Imin，尽量吸除上清。④向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μ 溶液Pl (已加入RNaseA)，使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。⑤向离心管中加入250 μ 溶液Ρ2，温和地上下翻转6 — 8次使菌体充分裂解。⑥向离心管中加入350 μ 溶液Ρ3，立即温和地上下翻转6_8次，充分混勻，此时将出现白色絮状沉淀。12，000 rpm离心lOmin，此时在离心管底部形成沉淀。⑦将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)， 注意尽量不要吸出沉淀。12，OOO rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。⑧向吸附柱CP3中加入600μ 1漂洗液PW (使用前已加入无水乙醇)，12000rpm 离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；重复步骤⑧。⑨将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm离心^iiin，将吸附柱中的残余漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残余会影响后续的酶反应(酶切，PCR等)实验，为确保下游实验不受残留乙醇的影响，将吸附柱CP3开盖，至于室温放置lOmin，待吸附柱中残余的漂洗液彻底晾干后再进行后续步骤。⑩将吸附柱CP3置于一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜的中间部位滴加 100 μ 1脱洗缓冲液ΕΒ，室温放置2min，12000rpm离心lmin，将质粒溶液收集到离心管中，-20°C保存备用。(5) TA克隆鉴定0. 8%琼脂糖凝胶电泳，选择目标条带为4200bp的质粒，初步判定为阳性克隆结果。限制性内切酶Sma I ,EcoR I进行质粒酶切鉴定，酶切反应体系如下
IOXBuffer2μ 1
Sma I1 μ 1
ddH2011 μ 1
质粒6μ 1 (lug)
30°C连接Ih后加入以下试剂 EcoR I1 μ 1
IOXBuffer2. 5 μ 1
37°C 连接 Ih。0. 8%琼脂糖凝胶电泳验证(如图3所示)，若在2700bp及1500bp位置存在目标条带，则签定为阳性克隆，命名为PMD19-T-NP。 4、NP基因亚克隆至真核表达质粒载体pEGFP-Nl，构建融合基因表达载体 pEGFP-Nl-NP
(1)限制性内切酶 Sma I、EcoR I 双酶切 pEGFP-Nl 及 pMD19_T_NP
37°C 连接 Ih。0.8%琼脂糖凝胶电泳(如图4所示)，切胶纯化得大小为1500bp目的片段NP及 4700bp质粒pEGFP-Nl大片段。(2)各取2 μ 1纯化后片段NP及pEGFP-Nl，0. 8%琼脂糖凝胶电泳粗略定量；目的片段NP与质粒pEGFP-Nl按摩尔比5:1添加到连接反应中
pEGFP-Nl4 μ 1
NP10 μ 1
Τ4 DNA连接酶1 μ 1
IOXBuffer2μ 1
ddH203 μ 1
16°C反应12-1他。融合基因质粒的电泳结果如图5所示。(3)连接反应液转化大肠杆菌DH-5 α，均勻涂布含卡那霉素的LB培养板上，37°C 培养12-1 ；挑取单克隆菌落至含卡那霉素的LB培养板上，37°C培养12-1 ；挑取经扩增后单克隆菌落至含卡那霉素的S. 0. C液体培养基，37°C摇床200转/分培养12-1他，利用北京天根生物公司的质粒小提试剂盒(离心柱型)提取质粒。Sma I ,EcoR I双酶切鉴定阳性克隆(如图6所示)，即得融合基因pEGFP-Nl-NP，送上海hvitrogen生命技术公司基因测序进一步鉴定，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。实施例2 融合基因pEGFP-Nl-NP的表达
1、质粒转染HEK293T细胞将生长良好的融合度达80%以上的HEK293T细胞接种到6孔板中，培养细胞融合度达70%左右时按美国hvitrogen公司的Lipofectamine 2000说明进行转染，其中两孔为质粒pEGFP-Nl转染HEK293T细胞，两孔为pEGFP-Nl-NP转染HEK293T 细胞，两孔为HEK293T细胞空白对照，以便下步的免疫组化检测。2、倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达质粒转染HEK293T细胞Mh后，在倒置荧光显微镜(Olympus IX71-A12FL/PH)下观察，结果如图7所示。3、NP蛋白表达的鉴定质粒转染细胞24h后倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达，可应用细胞免疫组化的方法鉴定NP蛋白的表达。首先在六孔板中用PBS缓冲液清洗细胞3次，pEGFP-NU pEGFP-Nl-NP及空白细胞对照各一孔中加入兔抗NP —抗(1 =1000, 含0. 5%胎牛血清PBS稀释)，另3孔中加含0. 5%胎牛血清PBS稀释液作为对照，37°C孵育
IOXBuffer Sma I ddH20
质粒(pEGFP-m/pMD I9-T-NP) 30°C连接Ih后加入以下试剂 EcoR I IOXBufferlh，4°C过夜；PBS漂洗3次，加山羊抗兔二抗，37°C孵育Ih ；PBS漂洗3次；DAB试剂盒显色， 5min-lOmin，加蒸馏水漂洗终止显色；苏木素复染，3min-&iiin，蒸馏水漂洗；1%盐酸酒精分化，蒸馏水漂洗，倒置显微镜下观察，结果如图8所示。
权利要求
1.一种含甲型流感病毒核蛋白的融合基因PEGFP-N1-NP的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1。
2.权利要求1所述含甲型流感病毒核蛋白的融合基因的构建方法，其特征在于包括如下步骤(1)以甲型流感病毒核蛋白基因为模板，设计含限制性内切酶EcoRI及Sma I酶切位点的引物，PCR扩增，得带有双酶切位点的核蛋白基因；(2)将核蛋白基因与T载体pMD19-TSimple Vector混合进行T克隆，经0. 8%琼脂糖凝胶电泳鉴定后获得PMD19-T-NP质粒；(3)将pMD19-T-NP质粒亚克隆至增强型绿色荧光示踪蛋白EGFP的目标载体pEGFP-Nl， 转化大肠杆菌DH-5 α，培养后提取质粒，Sma I、EcoR I双酶切鉴定阳性克隆，即得融合基因 pEGFP-Nl-NP。
3.按照权利要求2所述含甲型流感病毒核蛋白的融合基因的构建方法，其特征在于 步骤(3)中亚克隆是指采用限制性内切酶Sma I和EcoR I双酶切pEGFP-Nl质粒及 PMD19-T-NP质粒分别获得纯化的pEGFP-Nl和目的核蛋白片段，添加到连接反应中连接获得连接反应液。
4.按照权利要求2所述含甲型流感病毒核蛋白的融合基因的构建方法，其特征在于 步骤(3)中所述培养后提取质粒是将转化后的大肠杆菌DH-5 α接种于含卡那霉素的LB培养板上培养，挑取单克隆菌落至含卡那霉素的S. 0. C液体培养基上培养。
5.按照权利要求2所述含甲型流感病毒核蛋白的融合基因的构建方法，其特征在于 步骤(1)中所述PCR扩增的扩增引物为上游引物5' -Ccgcgaattcatggcgtctcaaggcaccaaacgat-Si ；下游弓I物5，-cgcgcccgggcattgtcatactcctctgcatt-3，。
6.按照权利要求2述含甲型流感病毒核蛋白的融合基因的构建方法，其特征在于步骤(1)中所述甲型流感病毒为H9N2。
7.权利要求1所述含甲型流感病毒核蛋白的融合基因的表达方法，其特征在于通过 Lipofectamine 2000将pEGFP_Nl_NP融合基因转染HEK293T细胞，在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达；用细胞免疫组化方法鉴定甲型流感病毒核蛋白的表达。
全文摘要
本发明公开了一种含甲型流感病毒核蛋白的融合基因pEGFP-N1-NP及其构建和表达方法，该融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。与现有技术相比，本发明将甲型流感病毒核蛋白与绿色荧光蛋白融合，形成融合基因，该融合基因在转染真核表达细胞后可表达绿色荧光蛋白和甲型流感病毒核蛋白，该融合基因pEGFP-N1-NP的成功构建和表达可进行RNA干扰抑制流感病毒NP基因，并在细胞及病毒中进行功能鉴定。
文档编号C12N15/63GK102321651SQ20111026632
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月9日 优先权日2011年9月9日
发明者刘梅, 刘波, 张建勇, 张泓, 李娜娜, 王建华, 陈玲 申请人:遵义医学院附属医院