A型流感病毒PB基因有干扰作用的siRNA序列的设计及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了四条对流感病毒PB基因复制有抑制作用的siRNA；通过鸡胚实验测HA滴度的方法确定了siRNA对流感病毒干扰的有效性。
【专利说明】A型流感病毒PB基因有干扰作用的s i RNA序列的设计及应用
【技术领域】
[0001 ] 本专利涉及对A型流感病毒PB基因有干扰作用的siRNA序列的设计及应用，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]流行性感冒(Influenza)，在流行性感冒病毒，是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒，在分类学上，流感病毒属于正黏液病毒科，它会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传播，在世界各地常会有周期性的大流行。目前在全球甲型流感的不同亚型对人类及陆地和水生动物(禽，鸭，鹅)均造成大规模的感染和瘟疫。
[0003]流行性感冒是由甲型流感病毒的一种亚型引起的传染性疾病综合征，广泛在人类和动物中传播。在禽类引起的禽流感被国际兽疫局定为A类传染病。禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性三大类。非致病性禽流感不会引起明显症状，仅使染病的禽鸟体内产生病毒抗体。低致病性禽流感可使禽类出现轻度呼吸道症状，食量减少、产蛋量下降，出现零星死亡。高致病性禽流感最为严重，发病率和死亡率高，感染的鸡群常常“全军覆没”。最早的禽流感记录在1887年，意大利发生鸡群大量死亡，当时被称为鸡瘟。到1955年，科学家证实其致病病毒为甲 型流感病毒。此后，这种流行性疾病被更名为禽流感。就最近5年的记录，1999年3月至11月，英国伦巴第地区暴发禽流感，到次年3月1300万只病禽被捕杀。2002年10月，美国加州暴发禽流感，当年12月疫情扩散到内华达州和亚利桑那州。到2003年3月，仅加州就销毁326多万只鸡；4月，荷兰发生禽流感，人类感染者达80人，并出现死亡病例。自2003年12月以来，禽流感在亚洲十多个国家和地区肆虐，造成数千万只家禽被宰杀销毁，染病死亡者已达数十人。我国近几年连续发生禽流感疫情。造成禽类大面积死亡，经济损失严重。禽流感被发现100多年来，人类并没有掌握有效的预防和治疗方法，仅能以消毒、隔离、大量宰杀禽畜的方法防止其蔓延。因此，提高有效的预防和治疗方法和措施是非常重要的。
[0004]我国富源辽阔，农业占我国的总产值的70%，养殖业是我国农民的经济来源的重要部分。伴随着禽流行性感冒的发生和造成禽类的大面积死亡，我国的预防疫苗的生产远远不能满足现有的养殖业的市场需要，我国目前使用的禽流感疫苗对于禽病的疫情发作预防和隔离性很小，疫苗效果不好。因此，加大力度进行疫苗及预防性生物制剂的研制，是当前疫情的需要，是发展我国国民经济的需要。
[0005]流感病毒[1]属正粘液病毒科(Orthomyxoviridae),分甲、乙、丙三型，多为球形，直径80~120nm，有时呈丝状。三型病毒具有相似的生化和生物学特征。病毒由三层构成，内层为病毒核衣壳，含核蛋白(NP)、P蛋白和病毒RNA。NP是可溶性抗原(S抗原)，具有型特异性，抗原性稳定。P蛋白(PA、PB1、PB2)可能是RNA转录和复制所需的多聚酶。流感病毒RNA分节段，甲型和乙型由8个节段、丙型由7个节段构成。中层为病毒包膜，由两层组成，内层为基质蛋白M1，抗原性稳定，也具有型特异性；包膜外层来源于宿主细胞膜的脂质双层膜，M2为嵌于包膜中的膜蛋白，形成膜通道，利于脱壳及HA的产生。外层为两种不同糖蛋白构成的福射状突起，即血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)。HA能引起红细胞凝集，是病毒吸咐于敏感细胞表面的工具，NA则能水解粘液蛋白，水解细胞表面受体特异性糖蛋白末端的N-乙酰神经氨酸，是病毒复制完成后脱离细胞表面的工具。HA和NA均有变异特性，故只有株特异的抗原性，其抗体具有保护作用。
[0006]根据NP和MP的不同，将流感病毒分为甲(A)、乙⑶、丙(C)三型。A型流感病毒按HA和NA抗原不同，可分为若干亚型。目前已发现HA有15种(Hl~H15)、NA有9种(NI~N9)抗原，所构成的亚型均可从禽类中分离到。至今人群中有甲型Hl~2的组合和NI~2的组合，但已有新出现的H5N1亚型和H9N2亚型禽流感病毒可感染人和动物的报道。因此，研究预防和资料流感的药物具有重要意义。
[0007]RNA干扰(RNAinterference, RNAi)既目的RNA与同源的祀目标mRNA结合，阻断病毒翻译蛋白质是解决流感病毒流行的重要手段和方法，其作用原理为:iRNA形成阶段。RNAi的诱导物在细胞质内被RNaseIII Dicer切割成为21_23nt的小分子干扰RNA，;@RNA诱导的沉默复合物(RNA-1nduced Silencing Complex, RISC)的形成阶段。siRNA 与 RNAi特异性酶(如A go-2)结合，形成RISC，具有特异性的核酸内切酶活性能特异性地降解与siRNA同源的mRNA ;③效应阶段。RISC中siRNA变性，双链解开，卸下正义RNA，反义RNA仍结合在复合物上，并引导RISC与同源的靶目标mRNA结合，在核酸内切酶的作用下，将靶目标mRNA切断(切割位置在siRNA的中央，距离5'端10_nt)，从而阻断了其翻译成蛋白质，表现为基因沉默。
[0008]作为一种快速、有效、特异的抑制基因表达的工具，对许多疾病的治疗有重要的意义
【发明内容】
[0009]本发明四条对A型流感病毒复制有抑制作用的siRNA编码序列。所述的四条对A型流感病毒复制有抑制作用的siRNA的序列分别如序列表400〈1>，400〈2>，400〈3>，400〈4>所示。
[0010]本发明所述的四条siRNA的动物水平的实验结果表明，对流感病毒H1N1，H9N2，H3N2的病毒复制有抑制作用。
【具体实施方式】
[0011 ] 实施例1:鸡胚实验验证重组质粒干扰H9N2流感病毒增殖作用
[0012]H9N2病毒毒力ED50108/0.Iml,将H9N2病毒稀释含有100个ED5tl病毒液，体积0.1ml，注射到9日龄SPF鸡胚尿囊腔中，同时注射SiRNA载体质粒6微克，33°C培养72小时，取尿囊液，测血凝效价。
[0013]实施例2:鸡胚实验验证重组质粒干扰HlNl流感病毒增殖作用
[0014]HlNl病毒毒力ED50108_6/0.1ml，将HlNl病毒稀释含有100个ED5tl病毒液，体积0.1ml，注射到9日龄SPF鸡胚尿囊腔中，同时注射SiRNA载体质粒6微克，33°C培养72小时，取尿囊液，测血凝效价。
[0015]实施例3:鸡胚实验验证重组质粒干扰H3N2流感病毒增殖作用[0016]H3N2病毒毒力ED5tlIO7 70.1ml,将HlNl病毒稀释含有100个ED5tl病毒液，体积
0.1ml，注射到9日龄SPF鸡胚尿囊腔中，同时注射SiRNA载体质粒6微克，33°C培养72小
时，取尿囊液，测血凝效价。
[0017]实施例4:尿囊液病毒滴度检测
[0018]1.微量血凝板的每孔中滴加PH7.2PBS100 μ L，⑵吸取被检尿囊液样品100 μ L，
倍比稀释12孔，第12孔弃掉100 μ L。每孔中加入0.1 %红细胞悬液100 μ L。
[0019]2.设阴性对照和流感病毒阳性对照。
[0020](4)置微型振荡器上振荡Imin混匀。
[0021](5)放室温下(18~20°C )30min，观察结果。
[0022]经三次重复实验，序列表所述的四条序列〈400>1，400〈2>，400〈3>，400〈4>对
[0023]流感病毒复制的抑制率如下:
[0024]
【权利要求】
1.一种对流感病毒PB基因复制有干扰作用的SiRNA，其核苷酸序列如序列表400〈1>，400〈2>，400〈3>，400〈4>，所示。
2.权利要求 1、对所述的siRNA作为抑制流感病毒PB基因沉默的靶向基因的应用。
【文档编号】C12N15/113GK103966214SQ201310048360
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年2月6日 优先权日:2013年2月6日
【发明者】任政华, 霍晋 申请人:霍晋