用于猪繁殖与呼吸系统综合征病毒培养的细胞株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于猪繁殖与呼吸系统综合征病毒（PRRSV）培养的细胞株及其应用。该细胞株对PRRSV高度敏感且稳定，并能持续稳定增殖高滴度PRRSV。该细胞株无支原体、细菌、真菌、外源病毒的污染，并且不存在三致的危险，安全性高。将该细胞株用于PRRSV的增殖培养，其较之Marc145母细胞更有利于PRRSV的复制与增殖。因此，采用该细胞株进行高滴度PRRSV的增殖培养有利于获得有关PRRSV研究与疫病防治方面的更全面信息，进行更加直接有效的研究。对PRRSV高敏感的猴肾细胞系Marc145-1株及高滴度PRRSV的增殖方法在PRRSV研究与疫病防治过程中具有广阔的开发和应用前景。
【专利说明】用于猪繁殖与呼吸系统综合征病毒培养的细胞株及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于畜牧类生物制药【技术领域】，涉及一种用于猪繁殖与呼吸系统综合征病毒培养的细胞株，以及该细胞株在猪繁殖与呼吸系统综合征病毒培养中的应用。
【背景技术】
[0002]猪繁殖与呼吸系统综合征是由猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(Porcinreproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的一种猪的高度传染性疾病，又称猪蓝耳病。本病以妊娠母猪的繁殖障碍(流产、死胎、木乃伊胎)及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道症状为特征。该病自1987年在美国被发现以来，曾经迅速传遍世界各个养猪国家，在猪群密集、流动频繁的地区更易流行，造成了严重的经济损失。近几年，该病在我国呈现明显的高发趋势，能引起不同品种、不同日龄、不同饲养管理模式的保育猪、仔猪和怀孕猪高发病率、高死亡率，给我国的养猪业造成了不可估量的损失。
[0003]PRRSV病毒的稳定性受PH和温度的影响较大，在PH小于5或大于7的条件下，其感染力降低95%以上；在PH7.5的培养液中可于_20°C和_80°C长期保存，在4°C则缓慢失去感染力；对有机溶剂敏感，对常用的化学消毒剂抵抗力不强。
[0004]PRRSV病毒能在多种细胞上生长，但Marcl45是目前各实验室培养PRRSV最常用的细胞。用Marcl45细胞接种猪繁殖与呼吸系统综合征病毒，细胞病变以聚集为特征，由于细胞病变死亡，病毒无法继续繁殖，经过反复冻融收获病毒液，病毒液只能收获一次，收获量小，病毒滴度低，强毒病毒含量在106_°~107_°TCID5(l/ml,弱毒毒株病毒含量在108_°~108 5TCID5Q/ml。可见，现有的Marcl45细胞虽然适合PRRSV的增殖，但是病毒滴度比较低，病毒含量不能满足疫苗和诊断抗原的制备。
[0005]因此，目前存在的问题是为了获得关于疫苗、诊断试剂盒等治疗手段的更全面信息，进行更加直接有效的研究，需要克隆出一株对PRRSV高度敏感且稳定，并能持续稳定增殖高滴度PRRSV的Marc 145细胞株。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种用于PRRSV培养的细胞株，该细胞株对PRRSV高度敏感且稳定，并能持续稳定增殖高滴度PRRSV。该细胞株无支原体、细菌、真菌、外源病毒的污染，并且不存在三致的危险，安全性高。
[0007]本发明还进一步提供了一种上述细胞株在猪繁殖与呼吸系统综合征病毒培养中的应用。该细胞株较之Marcl45母细胞更有利于PRRSV的复制与增殖，采用该细胞株进行高滴度PRRSV的增殖培养有利于获得有关PRRSV研究与疫病防治方面的更全面信息，进行更加直接有效的研究。
[0008]为此，本发明提供了一种用于PRRSV培养的细胞株，其中，所述细胞株为猴肾细胞系 Marc 145-1 株(Monke y kidney cell line strain Marcl45_l),其保藏编号为:CCTCCN0:C2012185，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年12月10日。上述培养为增殖培养。
[0009]本发明中，所用术语“猴肾细胞系Marcl45_l株”是指从猴肾细胞系Marcl45母细胞克隆获得的新细胞株，也称为Marcl45-1细胞，简称Marcl45_l。
[0010]本发明中，所述猴肾细胞系Marcl45-1株具有以下特征:
[0011](1)从形态上观察，猴肾细胞系Marc 145-1株比Marc 145母细胞形态规则，细胞之间界限明显，整齐，细胞折光性强，胞质饱满，核质清晰。细胞易于传代和瓶壁分离。细胞变小，密度增大。
[0012](2)对PRRSV具有高敏感性；
[0013](3)病毒增殖过程中细胞的病变特征表现为细胞崩解，收获的病毒液为Marcl45母细胞的4倍，病毒滴度提高f 2个滴度，并且这种敏感性可以稳定遗传；
[0014](4)细胞生长速度变快，倍增时间提前了 Id (天)。
[0015]在本发明的一个【具体实施方式】中，所述猴肾细胞系Marcl45-1株通过以下方法构建完成，其包括:
[0016]步骤一，Marc 145细胞有限稀释法克隆培养
[0017]将实验室保存的无支原体、细菌、真菌、外源病毒污染的Marcl45细胞(哈尔滨兽医研究所)经胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，细胞计数后进行连续梯度稀释，然后分别接种于96孔细胞培养板，37°C 5%C02培养箱培养l(Tl4d，挑选有单个细胞生长的细胞孔中的细胞转入24孔板培养，并依次将细胞扩大培养到12孔板、6孔板、T25细胞培养瓶，获得亚克隆细胞株；
[0018]步骤二，对猪繁殖与呼吸系统综合征病毒敏感的Marcl45细胞株的筛选。
[0019]挑选细胞状态比较好的几株克隆细胞分别接种于96孔细胞培养板内，待细胞长满单层接种猪繁殖与呼吸系统综合征病毒，于37°C 5%C02培养箱培养48h，观察细胞病变，并以未接毒的细胞作为阴性对照，挑选病变最明显的Marcl45细胞株进行传代，获得Marcl45-1株，即，猴肾细胞系Marcl45_l株，并用液氮保存。
[0020]本发明还提供了一种根据本发明所述的细胞株在猪繁殖与呼吸系统综合征病毒培养中的应用，其包括:
[0021]步骤B，将猪繁殖与呼吸系统综合征病毒接种于猴肾细胞系Marcl45-1株进行培养;
[0022]步骤C，收获病毒液。
[0023]根据本发明，在步骤B中，所述的培养为增殖培养。
[0024]在本发明的一个优选实施例中，在步骤B之前还包括步骤A，培养猴肾细胞系Marcl45-1株。在步骤A中，所述的培养为增殖培养。
[0025]在本发明的另一个优选实施例中，在步骤C之后还包括步骤D，对步骤C中收获的病毒液进行毒价测定。
[0026]根据本发明，所述猪繁殖与呼吸系统综合征病毒包括猪繁殖与呼吸系统综合征病毒强毒株NVDC-JXAl株、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒弱毒株NVDC-JXAl-R株、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒弱毒株ATCCVR-2332株、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒弱毒株CH-1R株以及猪繁殖与呼吸系统综合征病毒弱毒株HBR株。
[0027]优选地，所述猪繁殖与呼吸系统综合征病毒包括猪繁殖与呼吸系统综合征病毒强毒株NVDC-JXAl株、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒弱毒株NVDC-JXAl-R株及猪繁殖以及呼吸系统综合征病毒CH-1R株。
[0028]在本发明的一个具体实施例中，采用猴肾细胞系Marcl45_l株对猪繁殖与呼吸系统综合征病毒NVDC-JXAl株的增殖培养。将猴肾细胞系Marcl45-1株接种于细胞培养瓶，加入含8%胎牛血清的DMEM细胞生长液，于37°C 5%C02条件下48h可以长成单层，0.001M0I接种猪繁殖与呼吸系统综合征病毒NVDC-JXAl株，加入含2%胎牛血清的DMEM维持液，于37°C培养36~48h有80%的细胞出现细胞病变，以细胞崩解为主要特征，分别收获上清液和细胞中的病毒，猪繁殖与呼吸系统综合征病毒NVDC-JXAl株的滴度均可以达到IO8 tlTCID5ci/ml ο
[0029]在本发明的一个具体实施例中，采用猴肾细胞系Marcl45_l株对猪繁殖与呼吸系统综合征病毒NVDC-JXAl-R株的增殖培养，收获的猪繁殖与呼吸系统综合征病毒NVDC-JXA1-R株病毒液的滴度均可以达到109_ 5TCID5ciAil。
[0030]在本发明的一个具体实施例中，采用猴肾细胞系Marcl45_l株对猪繁殖与呼吸系统综合征病毒CH-1R株的增殖培养，收获的猪繁殖与呼吸系统综合征病毒CH-1R株病毒液的滴度均可以达到109_ 5TCID5tZml。
[0031]根据本发明的猴肾细胞系Marcl45-1株形态均一，生长性能好，生长曲线呈“S”型，细胞形态和生长速度稳定，可连续传代，在连续传代过程中，每隔5代对其进行纯净性、病毒敏感性检测，每隔10代对其进行“致畸、致瘤、致病变”试验，结果表明，该细胞株无支原体、细菌、真菌、外源病毒的污染，并且不存在三致的危险，安全性高。 [0032]该猴肾细胞系Marcl45_l株在接种PRRSV后，病变特征发生了一些变化，表现为细胞崩解，且收获的病毒液为Marcl45母细胞的4倍,病毒滴度测定表明，猴肾细胞系Marcl45-1株较之Marcl45母细胞更有利于PRRSV的复制与增殖，PRRSV病毒含量提高了1-2个滴度，并且这种敏感性可以稳定遗传，在传代至50代内没有丢失，仍能保持这种对病毒的高敏感性。经检测，猴肾细胞系Marcl45-1株没有细菌、真菌、支原体以及常见的几种交叉感染病毒等外源污染。因此，采用该细胞株进行高滴度PRRSV的增殖培养有利于获得有关PRRSV研究与疫病防治方面的更全面信息，进行更加直接有效的研究。对PRRSV高敏感的猴肾细胞系Marcl45-1株及高滴度PRRSV的增殖方法在PRRSV研究与疫病防治过程中具有广阔的开发和应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1为实施例2中Marcl45母细胞和Marcl45_l细胞生长曲线比对结果。
[0034]图1中的坐标轴含义如下:纵坐标活细胞总数(个/孔)；横坐标为时间(d)。
[0035]mmm
[0036]猴肾细胞系Marcl45_l 株(Monkey kidney cell line strain Marc 145-1),由普莱柯生物工程股份有限公司筛选获得，已在中国典型培养物保藏中心(简称=CCTCC ;地址:湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)进行保藏，保藏日期:2012年12月10日，保藏编号:CCTCC N0:C2012185o
【具体实施方式】[0037]为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
[0038]实施例
[0039]实施例1:Marcl45细胞系的克隆和筛选
[0040]1.Marc 145细胞有限稀释法克隆培养
[0041]将实验室保存的无支原体、细菌、真菌、外源病毒污染的Marcl45细胞(哈尔滨兽医研究所)经胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，细胞计数后进行连续梯度稀释，然后分别接种于96孔细胞培养板，370C 5%的CO2培养箱培养l(Tl4d，挑选有单个细胞生长的细胞孔中的细胞转入24孔板培养，并依次将细胞扩大培养到12孔板、6孔板、T25细胞培养瓶，获得亚克隆细胞株；
[0042]2.对猪繁殖与呼吸系统综合征病毒敏感的Marcl45细胞株的筛选
[0043]挑选细胞状态比较好的几株克隆细胞分别接种于96孔细胞培养板内，待细胞长满单层接种NVDC-JXAl病毒(0.001M0I)，37°C吸附lh，接毒后48h观察细胞病变，并以未接毒的细胞作为阴性对照，挑选病变最明显的Marcl45细胞克隆株进行传代，获得Marcl45克隆细胞，亦即猴肾细胞系Marcl45-1株，并用液氮保存。
[0044]实施例2:猴肾细胞系Marcl45_l株的生物学性状研究 [0045]1.细胞形态学
[0046]分别接长成单层的Marcl45母细胞和猴肾细胞系Marcl45_l株制备成细胞悬液，经细胞计数后，按照8 X IO4个/cm2接种于T25细胞培养瓶，加入含8%~?Ο%胎牛血清的DMEM生长液，于37°C 5%C02条件下培养48h，观察两者的细胞形态。细胞贴壁良好、形态饱满、界限清晰，表面光滑。猴肾细胞系Marcl45-1株较Marcl45母细胞变小，密度增大，细胞之间的界限更明显、整齐，细胞折光性强，胞质饱满，核质清晰。
[0047]2.细胞动力学检测
[0048]将长满单层的Marcl45母细胞和猴肾细胞系Marcl45_l株制备成细胞悬液，经细胞计数后，按照8 X IO4个/cm2接种于24孔细胞培养板，加入含8%~10%胎牛血清的DMEM生长液，于37°C 5%C02条件下培养。24h后取3瓶细胞，制成细胞悬液，分别进行计数，三次测定结果取平均值。以后每隔24h取3瓶细胞计数一次，连续计数7d。
[0049]根据细胞计数结果(见表1)，以活细胞总数(个/孔)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线(见图1)。
[0050]用下列公式计算细胞的比生长速率(μ )和分裂指数(Cd)。
「 nInXn-1nX11-1
[0051]μ =-
tn - tn -1
[0052]其中，X代表每毫升活细胞数目；t代表采样的时间点；n代表采样点。
[0053]
细胞培养最后的密度
—°82 细胞接种的密度
[0054]表1细胞动力学检测对比结果
[0055]
【权利要求】
1.一种用于猪繁殖与呼吸系统综合征病毒培养的细胞株，其中，所述细胞株为猴肾细胞系 Marcl45_l 株(Monkey kidney cell line strain Marcl45_l),其保藏编号为:CCTCCN0:C2012185，保藏于中国典型培养物保藏中心。
2.根据权利要求1所述的细胞株，其特征在于:所述培养为增殖培养。
3.一种根据权利要求1或2所述的细胞株在猪繁殖与呼吸系统综合征病毒培养中的应用，其包括: 步骤B，将猪繁殖与呼吸系统综合征病毒接种到猴肾细胞系Marcl45-1株进行培养； 步骤C,收获病毒液。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:在步骤B中，所述的培养为增殖培养。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:在步骤B之前还包括步骤A，培养猴肾细胞系 Marcl45_l 株。
6.根据权利要求 5所述的应用，其特征在于:在步骤A中，所述的培养为增殖培养。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:在步骤C之后还包括步骤D，对步骤C中收获的病毒液进行毒价测定。
8.根据权利要求3~7中任意一项所述的应用，其特征在于:所述猪繁殖与呼吸系统综合征病毒包括猪繁殖与呼吸系统综合征病毒强毒株NVDC-JXAl株、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒弱毒株NVDC-JXAl-R株、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒弱毒株ATCCVR-2332株、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒弱毒株CH-1R株以及猪繁殖与呼吸系统综合征病毒弱毒株HBR株。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:所述猪繁殖与呼吸系统综合征病毒包括猪繁殖与呼吸系统综合征病毒强毒株NVDC-JXAl株、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒弱毒株NVDC-JXA1-R株及猪繁殖以及呼吸系统综合征病毒CH-1R株。
【文档编号】C12R1/93GK103966157SQ201310046123
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年2月5日 优先权日:2013年2月5日
【发明者】张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司