蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1及其基因和应用的制作方法

蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1及其基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子，该半胱氨酸蛋白酶抑制分子为镰形扇头蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1。本发明还公开了镰形扇头蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1基因，包含编码SEQ?ID?NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。本发明镰形扇头蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1，具有显著的半胱氨酸蛋白酶抑制活性和抗弓形虫感染能力，适于制备抗寄生虫药物。
【专利说明】蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1及其基因和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程【技术领域】，尤其涉及一种蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子及其基因和应用。
【背景技术】
[0002]半胱氨酸蛋白酶在寄生虫生理代谢上具有重要功能，被认为是一个有前途的抗寄生虫药物靶标。化学类半胱氨酸蛋白酶抑制剂已有应用于治疗锥虫和疟原虫的报道。生物体内也存在与化学类抑制剂功能相似的抑制分子，它们与半胱氨酸蛋白酶产生可逆的紧密结合并高效抑制酶活性，被称为半胱氨酸蛋白酶抑制分子(cystatin)。研究发现，蜱体内的半胱氨酸蛋白酶抑制分子十分丰富，由于其对半胱氨酸蛋白酶普遍有较好的抑制活性，可能具有开发为抗寄生虫药物的价值。此外，研究发现，人源半胱氨酸蛋白酶抑制分子cystatin C和cystatin M显示抑制肿瘤的侵袭和转移的作用，表明这类生物分子还具有潜在的抗癌药物开发潜力。
[0003]蜱，俗称蜱虫，是一种常见的动物体表寄生虫，也经常叮咬人，并传播疾病。镰形扇头蝶(Rhipicephalus haemaphysaloide)分布于东南亚和我国南方，是我国优势蝶种,在牛、羊、犬、猪以及野兔等野生动物体表寄生吸血，也侵袭人。到目前为止，国内外尚没有镰形扇头蜱体内半胱氨酸蛋白酶抑制分子的研究报道。

【发明内容】

[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子及其基因，该半胱氨酸蛋白酶抑制分子为镰形扇头蝶半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1,可用于制备抗寄生虫的药物。
[0005]此外，还需要提供一种蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子在制备抗寄生虫药物中的应用。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
[0007]在本发明的一个方面，提供了一种蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子，所述半胱氨酸蛋白酶抑制分子为镰形扇头蝶半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1,其氨基酸序列选自:
[0008](1)SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列；
[0009](2) SEQ ID N0.1所示氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一个或多个氨基酸所得到的具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，且与SEQ ID N0.1具有95%以上同源性的氨基酸序列。
[0010]优选的，所述镰形扇头蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1的氨基酸序列如SEQID N0.1 所示。
[0011]在本发明的另一方面，提供了一种蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子基因，所述基因为镰形扇头蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1基因，包含:编码SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。[0012]优选的，所述RHcyst-1基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0013]在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述镰形扇头蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1基因的重组载体。
[0014]所述重组载体包括重组克隆载体或重组表达载体。
[0015]在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述重组载体的宿主细胞。
[0016]在本发明的另一方面，还提供了一种蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子重组蛋白的制备方法，包括以下步骤:
[0017]构建含镰形扇头蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1基因的重组表达载体，该RHcyst-1基因包含编码SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的核苷酸序列；
[0018]将所述重组表达载体转化入大肠杆菌宿主细胞；
[0019]培养包含重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞，并在合适条件下，诱导该重组表达载体表达镰形扇头蝶半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1重组蛋白。
[0020]在本发明的另一方面，还提供了一种上述蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子在制备抗寄生虫药物中的应用。 [0021]所述寄生虫包括弓形虫、锥虫、或疟原虫。优选的，所述抗寄生虫药物为抗弓形虫药物。
[0022]在本发明的另一方面，还提供了一种上述蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子在制备半胱氨酸蛋白酶抑制剂中的应用。
[0023]本发明镰形扇头蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子，由酶的抑制试验表明具有显著的半胱氨酸蛋白酶抑制活性，经抗弓形虫感染试验证明具有一定的抗弓形虫感染能力，适于制备抗寄生虫药物和半胱氨酸蛋白酶抑制剂。
【专利附图】

【附图说明】
[0024]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0025]图1是本发明实施例1的RHcyst-1保守片段的扩增结果图；
[0026]图2是本发明实施例1的RHcyst-1的3’ RACE第一轮(A)和第二轮(B)PCR产物电泳结果图；
[0027]图3是本发明实施例1的RHcyst-1的5’ RACE第一轮(A)和第二轮(B)PCR产物电泳结果图；
[0028]图4是本发明实施例1的RHcyst-1全长基因PCR扩增电泳结果图；
[0029]图5是本发明实施例1的RHcyst-1与三个已知硬蝶家族Icystatin的氨基酸序列比对图；
[0030]图6是本发明实施例2的RHcyst-l/pGEX-4T-l重组质粒的双酶切鉴定图；
[0031]图7是本发明实施例2的RHcyst-1重组蛋白诱导表达的SDS-PAGE电泳图；
[0032]图8是本发明实施例2的RHcyst-1重组蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图；
[0033]图9是本发明实施例2的BCA标准曲线图；
[0034]图10是本发明实施例3的RHcyst-1酶活抑制曲线图；
[0035]图11是本发明实施例4弓形虫感染小鼠的RHcyst-1治疗试验结果图。【具体实施方式】
[0036]下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京:科学出版社，2002)中所述的方法进行。
[0037]本发明首次从镰形扇头蜱体内获得一个新的半胱氨酸蛋白酶抑制分子，命名为RHcyst-1 (镰形扇头蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子)，将其基因编码区克隆到表达载体，在大肠杆菌中进行重组表达，由酶的抑制试验表明本发明的RHcyst-1重组蛋白能对六种半胱氨酸蛋白酶产生有效的抑制作用，通过抗弓形虫感染试验证明本发明的RHcyst-1重组蛋白具有一定的抗弓形虫感染能力。
[0038]实施例1镰形扇头蝶半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1的基因克隆和序列分析
[0039]1.半饱血镰形扇头蜱雌蜱总RNA的提取
[0040]将镰形扇头蜱按雌雄2: I的比例接种于兔耳上，4天后从兔耳上取下半饱血的雌蜱。在经灭菌处理的研钵上用液氮进行研磨，后加入1ml的Trizol试剂充分研磨后转移至一个无核酸酶的EP管中。用经典Trizol法提取获得的4只镰形扇头蜱半饱血雌蜱的总RNA，浓度为11.3ug/ul，0D260/0D280数值为1.942，在浓度和纯度上都能满足后续实验的要求。
[0041]2.保守片段的扩增
[0042]2.1引物设计
[0043]对已知的几个与镰形扇头蝶近亲缘蝶种的家族Icystatin分子的核苷酸序列和氨基酸序列进行分析，以微小牛蜱的一个家族lcystatin(登录号:DQ646915)为参照，在几个蝶种的家族Icystatin的保守区域设计引物。
[0044]家族Icystatin保守区引物设计如下:
[0045]上游:5，-AAGGATGCCGATGACACAGTC-3，(SEQID N0.3)；
[0046]下游:5，-CCCTGGAAAGCCTTGTGCGC-3，(SEQID N0.4)。
[0047]2.2保守片段的扩增
[0048]将上述提取的总RNA用反转录试剂盒(Takara)反转为cDNA，并以该cDNA为模板，用上面设计的引物进行PCR反应，反应条件为:94°C 3分钟；再940C 30秒，48°C 30秒及720C 40秒，进行35个循环；最后72°C 7分钟。结果见图1，扩增出来的RHcyst-1保守片段长度为197bp。
[0049]2.3保守片段的克隆测序
[0050]PCR扩增后的产物经琼脂糖凝胶跑电泳后，用胶回收试剂盒(Axygen)对胶块中的DNA片段进行回收纯化，将纯化DNA与PMD-18T载体连接，转化到感受态细胞DH5 α中，在含有Amp抗性的琼脂糖培养基上挑选单菌落，通过PCR鉴定其插入片段大小。在确定T载体插入片段大小无误后，将菌株送至测序公司(上海Invitrogen公司)测序。
[0051]上述TA克隆测序得到RHcyst-1保守片段的序列(SEQ ID N0.5)，经NCBI BLAST分析发现其与微小牛蜱的家族Icystatin(登录号:DQ646915)具有92%的同源性。
[0052]3.3’端快速扩增
[0053]3.1引物设计
[0054]对于镰形扇头蜱的家族Icystatin分子，利用上述得到的保守区域的核苷酸序列进行3’端快速扩增的引物设计。
[0055]家族I的3’ RACE引物:
[0056]RHcyst-1-3R-GSPl:5’ -CAGGGAGATTTGCGAAAAGG-3’ (SEQ ID N0.6)；
[0057]RHcyst-1-3R-GSP2:5，-CGCCGAAGTGGAGACGAAGC-3，(SEQ ID N0.7)。
[0058]3.2cDNA第一链的合成
[0059]按cDNA 末端快速扩增的 3 ' RACE 系统(3' RACE System for Rapid Amplifixation of cDNA Ends, Invitrogen)的操作说明，将上述步骤I提取的总RNA与一个包含多聚胸腺嘧啶核苷酸(Oligo dT)的锚定引物(AP)在反转录酶的作用下反转生成cDNA与RNA杂交链，而后杂交链在RNA酶的作用下形成cDNA单链。
[0060]3.33’端的扩增
[0061]按操作说明对目的基因的3’端进行扩增，以3.2合成的cDNA第一链为模板，上游引物是3.1中所设计的基因特异性引物(GSP)，下游引物是能够与锚定引物(AP)带入的锚定序列互补配对的AUAP引物。
[0062]RHcyst-1 第一轮 PCR 反应条件:94°C 3 分钟；再 94°C 30 秒，53°C 30 秒及 72°C 45秒，进行35个循环；最后72 °C 7分钟。
[0063]RHcyst-1 第 二轮 PCR 反应条件:94°C 3 分钟；再 94°C 30 秒，55°C 30 秒及 72°C 45秒，进行35个循环；最后72 °C 7分钟。
[0064]结果:运用3’端快速扩增方法经两轮PCR，可以得到RHcyst-1的一个大约300bp左右的3’端片段(见图2)。
[0065]3.43’端片段的克隆测序
[0066]方法同2.3。TA克隆测序得到RHcyst-1的3，端片段的序列(SEQ ID N0.8)。
[0067]4.5’端快速扩增
[0068]4.1引物设计
[0069]利用已经得到的RHcyst-1的3’端核苷酸序列设计5’端快速扩增的基因特异性引物。
[0070]RHcyst-1-5R-GSPl:5，-CGTGGATGTGCTGGTTATTAC-3，(SEQ ID N0.9)；
[0071]RHcyst-1-5R-GSP2:5’ -CCTTTACAAAATAGTTGATGCCG-3’ (SEQ ID N0.10)。
[0072]4.2cDNA第一链的合成
[0073]按cDNA 末端快速扩增的 5 ' RACE 系统(5 ' RACE System for RapidAmplification of cDNA Ends, Invitrogen)的操作说明，将上述步骤I中提取的总RNA与
4.1设计的基因特异性引物(GSPl)在反转录酶的作用下反转生成cDNA与RNA杂交链，而后杂交链在RNA酶的作用下形成cDNA单链。
[0074]4.3cDNA第一链的纯化
[0075]按cDNA末端快速扩增的5' RACE系统(Invitrogen)中关于cDNA第一链纯化的操作说明对cDNA第一链进行纯化。
[0076]4.4cDNA 的加尾
[0077]按cDNA末端快速扩增的5, RACE系统(Invitrogen)的操作说明，将4.3纯化的cDNA与dCTP在末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的作用下，在cDNA的5’末端加上多聚胞嘧啶核苷酸(Oligo dC)的尾巴。[0078]4.55’端的扩增
[0079]按操作说明对目的基因的5’端进行扩增，为了提高目的基因的特异性和产量采用嵌套式PCR的方式进行扩增。第一轮PCR是以4.4加尾的cDNA为模板，上游引物是一个包含多聚鸟嘌呤核苷酸(Oligo dG)的锚定引物(AAP)，下游引物是4.1中根据3’端序列所设计的基因特异性引物(GSP2)。嵌套式第二轮PCR是以第一轮PCR产物为模板，上游引物是能与锚定引物(AAP)带入的锚定序列互补配对的AUAP引物，下游引物还是基因特异性引物(GSP2)。
[0080]RHcyst-1 第一轮 PCR 反应条件:94°C 3 分钟；再 94°C 30 秒，50°C 30 秒及 72°C 45秒，进行35个循环；最后72 °C 7分钟。
[0081]RHcyst-1 第二轮 PCR 反应条件:94°C 3 分钟；再 94°C 30 秒，51 °C 30 秒及 72°C 45秒，进行35个循环；最后72 °C 7分钟。
[0082]结果:运 用5’端快速扩增方法经两轮PCR，可以得到RHcyst-1的一个大约270bp左右的5’端片段(见图3)。
[0083]4.65’端片段的克隆测序
[0084]方法同2.3。TA克隆测序得到RHcyst-1的5，端片段的序列(SEQ ID N0.11)。
[0085]5.全长基因的扩增
[0086]5.1引物设计
[0087]通过对目的基因的3’端和5’端序列的拼接可以得到全长基因的序列，在序列的5’末端设计上游引物以便于从3.2中合成的cDNA中扩增出全长基因。
[0088]RHcyst-1:5，-GTAGCAGCGCGCGCGATTAGT-3，(SEQ ID N0.12)。
[0089]5.2全长基因扩增
[0090]以3.2合成的3’ RACE cDNA第一链为模板，5.1设计的引物为上游引物，AUAP为下游引物，对RHcyst-1的全长进行扩增。
[0091]RHcyst-1PCR 反应条件:94°C 3 分钟；再 94°C 35 秒，53°C 35 秒及 72°C 45 秒，进行35个循环；最后72 °C 7分钟。
[0092]PCR扩增结果如图4所示，得到大约500bp左右的RHcyst-1全长基因序列。
[0093]5.3全长基因的克隆测序
[0094]方法同2.3。
[0095]5.4全长基因的序列分析
[0096]应用Genetyx(version7)软件进行序列比对和预测蛋白分子大小及等电点。
[0097]利用丹麦科技大学(DTU)的CBS服务器进行信号肽(signal peptide)预测，进入Prediction Serves 页面。网址:http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/
[0098]应用NCBI (美国国家生物技术信息中心)站点的ORF Finder软件分析基因的ORF, BLAST在线服务分析基因的同源性。网址:http://www.ncb1.nlm.nih.gov/
[0099]应用smart Main page软件分析基因的功能域。网址:http://smart.embl-heidelberg.de/
[0100]通过对RHcyst-1的全长基因序列进行分析，可以得知:RHcyst_l全长基因为47Ibp (SEQ ID N0.2)，具有一个编码98个氨基酸的开放阅读框(SEQ ID N0.1)，没有信号肽序列。和绝大多数的家族Icystatin —样，RHcyst-1具有N端保守甘氨酸和QXVXG保守位点。推测RHcyst-1的蛋白大小约为llkDa，等电点为5.66。RHcyst-1与其它蜱的家族Icystatin具有很高的同源性,与微小牛蝶(Bmcystatin,登录号:ABG36931)、变异革蝶(DvM602，登录号:ACF35512)及长角血蜱(Hlcyst-1，登录号:ABZ89553)的家族 Icystatin氨基酸序列同源性分别为90%、86%和81% (见图5)。
[0101]实施例2镰形扇头蝶半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1的原核表达与纯化
[0102]1.表达质粒构建
[0103]根据RHcyst-1全长序列的分析结果,在RHcyst-1基因ORF两端设计添加有合适酶切位点的基因特异性引物。引物序列如下:
[0104]RHcyst-1express F:5’ ~CTGAATTCATGCCTCTCTGTGGTGG~3，(SEQ ID NO13)；
[0105]RHcyst-1express R:5，-TCGTCGACTCACTGGAAATGCTCGAG-3，(SEQ ID N0.14)。
[0106]PCR扩增RHcyst-1基因全长编码区(SEQ ID N0.1所示序列)，克隆到pGEX_4T_l载体，构建表达重组质粒RHcyst-l/pGEX-4T-l，经双酶切(Sal I和EcoR I)和测序鉴定目的片段准确插入。图6为RHcyst-l/pGEX-4T-l重组质粒的双酶切鉴定图，由图6可知RHcyst-1目的片段插入准确。
[0107]2.重组蛋白表达形式分析
[0108]2.1IPTG的诱导表达
[0109]将构建的RHcyst-l/pGEX-4T_l重组质粒转化至BL21 (DE3)感受态细胞中，通过PCR的方法筛选出阳性株。再将转化重组质粒的BL21(DE3)阳性菌株接种至两个装有20mlLB培养基(Amp抗性)的50ml离心管中，37°C 200转振荡培养大约2h。测定菌液0D600数值，在数值达到0.4到0.6之间时，接种转化RHcyst-1重组质粒的菌液加入20ullM IPTG，另外一管不加作为未诱导对照。然后将表达RHcyst-1重组蛋白的培养液37°C下200转振荡培养8h。最后4°C下10000rpm5min离心,去上清收集菌体。
[0110]2.2SDS-PAGE鉴定重组蛋白
[0111]超声裂解菌体收集上清和沉淀，用常规的12% SDS-PAGE电泳分析蛋白的表达情况，结果如图7所示，RHcyst-1重组蛋白主要以上清表达为主，在图7中，1:未诱导菌体裂解沉淀；2:诱导菌体裂解沉淀；3:未诱导菌体裂解上清；4:诱导菌体裂解上清。
[0112]3.蛋白纯化及定量
[0113]3.1蛋白纯化
[0114]表达的RHcyst-1重组蛋白带有GST标签，可用GST树脂对其进行纯化。纯化的蛋白液装入经去离子水煮沸处理的透析袋中，两头用透析袋夹夹紧，浸没于IL PBS缓冲液中，4°C透析12h，然后更换PBS缓冲液再透析12h。经透析处理蛋白液进行SDS-PAGE电泳鉴定蛋白大小和纯度。结果见图8，在图8中，1:未诱导菌体裂解上清；2:诱导菌体裂解上清；3和4:纯化的RHcyst-1重组蛋白。
[0115]3.2蛋白定量
[0116]根据BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA Protein AssayKit, Piarca)操作说明对RHcyst-1重组蛋白进行定量,具体步骤如下:
[0117]①将A液和B液按50:1的比列配制成反应液。
[0118] ②取25ul待测样品和各种梯度的标准蛋白滴加在ELISA板孔中，每个样品作一复孔。[0119]③ 用8道移液器向每孔加入200ul的反应液，振荡混匀。
[0120]④盖上ELISA板上盖，37°C反应30min。
[0121]⑤用酶标仪测定562nm波长的OD值。
[0122]⑥根据各种梯度的标准蛋白所测OD值，制成标准曲线，输出函数关系式，输入待测样品的OD值，求得待测样品的浓度。
[0123]标准曲线如图9所示，根据该标准曲线及其导出的函数关系式，计算得到纯化的RHcyst-1重组蛋白浓度为1823ug/ml。
[0124]实施例3重组蛋白rRHcyst-Ι的酶活性分析实验
[0125]1.方法:通过测定与成此75^-1作用后组织蛋白酶1^8、(:、!1、5、木瓜蛋白酶和其对应突光底物反应的剩余活性来验证rRHcyst-Ι对木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶的抑制活性。具体方法如下:
[0126](I)按 IOOmM NaACUOOmM NaCl、ImM EDTAUmg/ml 半胱氨酸和 0.005 %TritonX-1OO的配方配制半胱氨酸蛋白酶反应液,调节pH至5.5。
[0127](2)用半胱氨酸蛋白酶反应液将六种半胱氨酸蛋白酶配制成1.5uM，将它们的对应荧光底物配制成0.5mM。
[0128](3)用 PBS 将纯化好的 RHcyst-1 重组蛋白配制成 12uM、6uM、3uM、1.5uM、0.75uM、
0.375uM和OuM的浓度梯度。
[0129](4)在96孔黑色微孔板中依次加入七个浓度梯度的RHcyst-1重组蛋白20ul (每个浓度做3个重复孔)，然后分别加入20ul的1.5uM待测的半胱氨酸蛋白酶，送至恒温箱37°C 反应 30min。
[0130](5)避光条件下向每孔加入IOOul的对应突光底物，补加60ul反应液，添加一个只加IOOul反应液和IOOul底物液的孔作为背景，37°C反应15min，送至酶标仪在激发波长(入ex) 360nm和发射波长(λ em) 460nm的条件下检测每孔OD值。
[0131](6)各组OD数值均减去背景孔的OD值，用各个浓度组的OD值除于rRHcyst-Ι的OuM的OD值计算半胱氨酸蛋白酶的剩余活性，以此绘制RHcyst-1酶活抑制曲线。
[0132]2.结果:RHcyst_l的酶活抑制曲线如图10所示，由图10可知,rRHcyst-Ι能对六种半胱氨酸蛋白酶产生有效的抑制并呈现显著的浓度依赖关系，但抑制效果不尽相同，其中对组织蛋白酶S的抑制活性最高，在0.25倍摩尔浓度的情况下就能对其酶活性达到90%以上的抑制。
[0133]实施例4重组蛋白rRHcyst-Ι的抗弓形虫感染实验
[0134](I)试验动物为昆明系小鼠，25克左右体重，雄性。弓形虫为国际标准株RH株，小鼠感染后收集腹水采集虫体。
[0135](2)RHcyst-1重组蛋白溶解在PBS缓冲液中，试验分为高剂量组(200ug/只)、中剂量组(IOOug/只)、低剂量组(50ug/只)、蛋白对照组(GST蛋白)和空白对照组(PBS)，每组20只试验用鼠，每只鼠腹腔接种10000条弓形虫。重组蛋白分别在感染弓形虫后的第2天和第4天经腹腔注射进行治疗，然后观察小鼠死亡率和死亡时间，组间平均死亡时间经t检验分析差异显著性来评估疗效有无。
[0136]弓形虫感染的小鼠模型是弓形虫研究和药效评价的常用模型，考虑到蛋白代谢特征，本试验在感染后第2天和第4天进行连续给药，以各组小鼠死亡率和死亡时间评价药效。RHcyst-1重组蛋白治疗结果见图11，各剂量组和对照组小鼠均在15天内全部死亡，死亡率100%;但死亡时间在5-15天之间不等，GST蛋白对照组与不治疗空白对照组间无显著差异(平均死亡时间分别为6.5天和6.4天)，但对照组与重组蛋白治疗组间小鼠存活时间长度存在显著差异(50ug/只组、IOOug/只组、200ug/只组，平均死亡时间分别为8.5天、
9.9天和8.9天)，表明重组RHcyst-1显著延长小鼠存活时间，具有一定抗弓形虫感染的能力。
[0137]以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
[0138]序列表
[0139]〈110〉中国农业科学院上海兽医研究所
[0140]〈120〉蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1及其基因和应用
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[0145]<212>PRT
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[0147]<400>1
[0148]Met Pro Leu Cys Gly Gly Leu Ser Glu Glu Val Lys Asp Ala Asp Asp
[0149]I51015
[0150]Thr Val Arg Glu He Cys Glu Lys Val Arg Ala Glu Val Glu Thr Lys
[0151]202530
[0152]Leu Gly Lys Cys Phe Pro Glu Phe Thr Pro Leu Lys Tyr Arg Thr Gln
[0153]354045
[0154]Leu Val Asn Gly He Asn Tyr Phe Val Lys Val His Val Gly Asn Asn
[0155]505560
[0156]Gln His He His Val Arg Ala His Lys Ala Phe Gln Gly Glu He Ser
[0157]65707580
[0158]Phe Ser Ala Val Gln Glu Glu Lys Thr Leu Glu Asp Pro Leu Glu His
[0159]859095
[0160]Phe Gln
[0161]<210>2
[0162]〈211M71
[0163]<212>DNA
[0164]<213>Rhipicephalus haemaphysaloide
[0165]〈220〉
[0166]<221>CDS
【权利要求】
1.一种蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子，其特征在于，所述半胱氨酸蛋白酶抑制分子为镰形扇头蝶半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1,其氨基酸序列选自: (1)SEQID N0.1所示的氨基酸序列； (2)SEQ ID N0.1所示氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一个或多个氨基酸所得到的具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，且与SEQ ID N0.1具有95%以上同源性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子，其特征在于，所述镰形扇头蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.—种蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子基因，其特征在于，所述基因为镰形扇头蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1基因，包含:编码SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子基因，其特征在于，所述RHcyst-1基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
5.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求3所述的镰形扇头蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1基因。
6.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求5所述的重组载体。
7.—种蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 构建含镰形扇头蝶半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1基因的重组表达载体，该RHcyst-1基因包含编码SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的核苷酸序列； 将所述重组表达载体转化入大肠杆菌宿主细胞； 培养包含重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞，并在合适条件下，诱导该重组表达载体表达镰形扇头蝶半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1重组蛋白。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述RHcyst-1基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2 所示。
9.权利要求1所述的蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子在制备抗寄生虫药物中的应用。
10.权利要求1所述的蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子在制备半胱氨酸蛋白酶抑制剂中的应用。
【文档编号】C12N15/63GK103965351SQ201310044561
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年2月4日 优先权日:2013年2月4日
【发明者】周金林, 王玉俭, 周勇志, 曹杰, 张厚双, 龚海燕 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所