一种制备长心卡帕藻原生质体的方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，具体的说是一种利用篮子鱼内脏提取液制备长心卡帕藻原生质体的方法。取杂食性热带篮子鱼，预先饲喂长心卡帕藻诱导其产消化卡拉胶的酶类，然后以篮子鱼内脏为原料制备混合酶液，进而利用该混合酶液降解长心卡帕藻的细胞壁及其细胞间质组分，从中获取游离的原生质体。本发明可为借助传统原生质体细胞融合、愈伤组织诱导与分化，人工培育长心卡帕藻新品系，提供育苗和育种新途径与相关支撑技术。
【专利说明】一种制备长心卡帕藻原生质体的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体的说是一种利用篮子鱼内脏提取液制备长心卡帕藻原生质体的方法。
【背景技术】
[0002]长心卡帕藻是国际上产K-卡拉胶的重要热带红藻资源。K-卡拉胶是海藻细胞粘性多糖，由D-半乳糖及其衍生物组成的大分子构成，具有广阔的市场开发和应用前景。卡拉胶具有凝胶和保水特性，具有一定硬度，因此是支撑奶制品、火腿、冰淇淋等食品制造行业的重要加工原料，在食品、化工等领域有非常广泛的应用前景。卡拉胶在医药上也有较好的应用前景，研究表明皮下注射卡拉胶可刺激结缔组织可逆生长，并能刺激骨胶原的生长，增加骨骼对钙的吸收。有报道研究表明麒麟菜提取物对风湿性关节炎有疗效，对胃溃疡和十二指肠溃疡也有治疗作用，在抗血凝及免疫方面也具有重要的生理活性等。近年来，卡拉胶在医药工业中应用越来越广泛，可用于植物性薄膜包衣和胶囊，可有效发挥其具有无交联反应、药物吸湿低、无动物源传染病风险、不易与含醛基药物反应、以及易于废弃材料再利用和利润高等诸多优点，K-卡拉胶是制备药材包衣和胶囊的最好植物性原料之
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[0003]国际上长心卡帕藻栽培多在热带和亚热带地区进行，长心卡帕藻主产区在印度尼西亚和菲律宾等东南亚国家和地区。除我国海南外，在菲律宾、印度尼西亚、马来西亚、越南等东南亚国家和斐济等太平洋岛域，以及中南美洲的墨西哥、巴西，和非洲的肯尼亚、坦桑尼亚等热带国家和地区，上述产胶海藻都已经实现了人工规模化栽培，共同支撑着国际上逐年增长的卡拉胶市场需求。目前，这些红藻原料只有很少一部分来自于珊瑚礁等热带海洋自然生境中的海菜，大多数源自于人工栽培海菜，而该藻的规模化人工栽培主要依赖于营养繁殖，其孢子繁殖和有性生殖方式已经严重退化，生产过程中难以发现。
[0004]应当指出，至今为止，长心卡帕藻一直沿用人工选育的野生种苗为苗源，然而该藻长期营养繁殖方式栽培已经造成种质退化，海菜生长速度减缓、产胶性能降低和抗病能力下降。由于藻种无性和有性繁殖高度退化，只能依赖于营养繁殖方式扩大栽培，其遗传育种和育苗工作步履艰难，在国内外尚没有实质性突破。如何开展新品种培育，恢复和提高种质优良生产性状是该领域关注的研究热点问题。
[0005]通过制备原生质体，进而结合细胞融合和愈伤组织等生物技术培育优良品种，目前已在许多生物物种中得到证实和应用，能否适用于长心卡帕藻种质种苗培育，目前尚难评论。但无论如何，制备长心卡帕藻原生质体是通过该途径培育种苗的基础和第一步工作，受该藻细胞壁中含有大量K -卡拉胶的限制，传统酶解技术效果不明显。
【发明内容】
[0006]本发明目的在于提供一种制备长心卡帕藻原生质体的方法。
[0007]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:[0008]一种制备长心卡帕藻原生质体的方法，以经长心卡帕藻饲喂诱导的杂食性热带篮子鱼消化内脏器官为原料，提取混合消化酶液，再由所得混合酶液降解长心卡帕藻细胞壁及其细胞间质组分，从中获取游离的长心卡帕藻原生质体。
[0009]所述原料为预先用富含K -卡拉胶的长心卡帕藻饲喂篮子鱼7天以上，而后收集篮子鱼消化内脏器官组织。
[0010]所述原料在50mM和pH值6.0±0.1的磷酸缓钠盐缓冲液中冰冻研磨、均浆，再经过滤去除杂质，即得到混合消化酶液。
[0011]所述混合消化酶液中加入渗透剂和膜稳定剂共同作为酶解液，而后与长心卡帕藻混合在25±2°c条件下，连续轻微震荡酶解10-12小时，即可获得游离的长心卡帕藻原生质体。
[0012]所述混合消化酶液中加入渗透剂、膜稳定剂、以及强化作用效果的纤维素酶和果胶酶共同作为酶解液，而后与长心卡帕藻混合在25±2°C条件下，连续轻微震荡酶解10-12小时，即可获得到游离的长心卡帕藻原生质体。
[0013]将上述酶解后酶解液中加入洗脱液在25±2°C条件下，震荡酶解1±0.2小时，酶解后过滤，滤液离心，弃去最上层的清液，再加入洗脱液悬浮并充分混匀，再次离心收集沉淀，沉淀再经洗脱液悬浮即为长心卡帕藻原生质体；其中洗脱液为含0.6M甘露醇和5mM氯化钙的F/2培养基溶液；酶解液与粉碎后的长心卡帕藻泥体积比为:3:1。
[0014]本发明所具有的优点:针对长心卡帕藻有性和无性繁殖高度退化，培育新品种困难问题，采用本发明利用摄食该藻的篮子鱼诱导和制备消化酶解粗提液的方法，可有效获得长心卡帕藻原生质体；有望结合细胞融合和愈伤组织等技术，进而形成培育藻株的新途径，实现该藻种质种苗培育。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为本发明实施例提供的通过篮子鱼内脏提取液酶解所制备的长心卡帕藻原生质体效果图。其中，图中A为通过本发明方式所得的制备较完整的原生质体，B为制备不完全、仍存有一定细胞壁的长心卡帕藻原生质体。
[0016]图2为本发明实施例提供的长心卡帕藻原生质体样品经伊文思蓝染色后的效果图。图中颜色较深原生质体，示染料大量进入细胞，表明其结构已破损，而颜色较浅的原生质体，示染料不能自由进入细胞，表明其结构完整。
【具体实施方式】
[0017]实施例1
[0018]所需溶液配制:配制pH为6.0的50mM磷酸钠盐缓冲液，取lmol/L磷酸二氢钠
4.4mI和lmol/L磷酸氢二钠0.6ml混匀,用蒸懼水将混合液定容至100ml,作为储备液放入4度冰箱中储存备用。
[0019]消毒海水溶 液的配制:取50mg氯霉素,加入到100mL无菌海水中。
[0020]洗脱液的配制:取109.3g甘露醇(0.6M)和554.9mg氯化钙(5mM)，依次溶入含I升F/2培养基(培养基配方参见表1)的锥形瓶(2L)中，然后放入灭菌锅中，在高温(121 °C )、高压(102.9kPa)条件下灭菌25min，待冷却后转入储液瓶，待用。[0021]实验材料准备:取IOg健康的长心卡帕藻鲜藻藻体，在无菌海水中冲洗干净，然后用消毒纸巾吸干，并转入消毒培养基溶液中处理0.5-0.8h，再用无菌海水冲洗，最后用组织均浆器将藻体打碎均浆，备用。
[0022]篮子鱼内脏提取液的制备:取20只热带篮子鱼，每天人工投喂长心卡帕藻150-200g鲜菜。饲喂一周后，分别选取其胃和肝脏内脏，并存放在低温冰冻条件下备用。将篮子鱼的胃和肝脏放入4°C预冷的小烧杯中，按每g内脏加20ml磷酸缓钠盐冲液，磷酸缓钠盐冲液浓度为50mM，其pH值为6.0。利用组织匀浆器研磨篮子鱼内脏，提取液分别用20微米、8微米和I微米的滤纸过滤。向过滤后的粗提液中添加0.5%的纤维素酶(solarbio)、
0.珏^的果胶酶^。]^!^;^)、。.6M的甘露醇和5mM的氯化钙，备用。
[0023]酶解:将上述均浆后的藻泥和粗提酶解液按照1:3的体积比例混匀(即Iml藻泥与3ml提酶解液混合)，然后置于摇床上震荡酶解。酶解过程中采用摇床连续震荡，震荡速度100转/分钟，酶解温度25°C。酶解半天(约11-12小时)后，向6-8毫升酶解液中加入3ml洗脱液，再放回摇床继续在25°C条件酶解。I小时后，用孔径500微米的筛絹过滤酶解液，去粗大藻块，将滤液转入离心管中，在200g (湘仪TGL-16M)下离心5min。弃去离心管最上层的清液5ml，并向离心管内加入5ml洗脱液，悬浮混匀。然后，在200g下再次离心5min，弃上清，向离心管中加入1ml洗脱液重新悬浮，可获得完整的长心卡帕藻原生质体。
[0024]上述所得原生质体状态和活性的鉴定: [0025]去壁状态鉴定，其中形态变化状况具体分为:
[0026]原生质体为完整:细胞出现吸水膨大、甚至完全涨大破裂，并且在细胞破碎后无细胞壁残余存在。
[0027]细胞壁残存:细胞出现小幅变化或不对称性膨胀，并且在涨大破裂后仍然残存细胞壁。
[0028]完整带细胞壁的细胞:未见待测样品细胞出现涨大。
[0029]具体鉴定，以蒸馏水处理上述所得原生质体样品，在显徽镜下观察细胞形态变化状况(参见图1)。由图中可见细胞出现吸水膨大、甚至完全涨大破裂，并且在细胞破碎后无细胞壁残余存在，则表明上述所得原生质体样品为完整的。
[0030]原生质体存活状况鉴定:其中存活状况由染色后具体分为:
[0031]染色后为深色，说明染料可进入细胞内，表明样品原生质体已经存在一定程度的破损；
[0032]染色后为较浅，说明染料不能自由进入细胞内，表明所获得的样品细胞为完整原生质体。
[0033]具体鉴定，取0.5%伊文思蓝染液，对上述实施例所得原生质体进行染色，然后借助显微镜对待测样品进行镜检可见(参见图2)染色后的颜色较浅，表明所获得的样品细胞为完整的原生质体。
[0034]将上述所得原生质体再借助传统原生质体细胞融合、愈伤组织诱导与分化，可人工培育长心卡帕藻新品系的育苗和育种。
[0035]所述f/2培养基配制方法:
[0036]A.钠盐储液
【权利要求】
1.一种制备长心卡帕藻原生质体的方法，其特征在于:以经长心卡帕藻饲喂诱导的杂食性热带篮子鱼消化内脏器官为原料，提取混合消化酶液，再由所得混合酶液降解长心卡帕藻细胞壁及其细胞间质组分，从中获取游离的长心卡帕藻原生质体。
2.按权利要求1所述的制备长心卡帕藻原生质体的方法，其特征在于:所述原料为预先用富含K -卡拉胶的长心卡帕藻饲喂篮子鱼7天以上，而后收集篮子鱼消化内脏器官组织。
3.按权利要求1或2所述的制备长心卡帕藻原生质体的方法，其特征在于:所述原料在50mM和pH值6.0±0.1的磷酸缓钠盐缓冲液中冰冻研磨、均浆，再经过滤去除杂质，即得到混合消化酶液。
4.按权利要求1所述的制备长心卡帕藻原生质体的方法，其特征在于:所述混合消化酶液中加入渗透剂和膜稳定剂共同作为酶解液，而后与长心卡帕藻混合在25±2°C条件下，连续轻微震荡酶解10-12小时，即可获得游离的长心卡帕藻原生质体。
5.按权利要求1所述的制备长心卡帕藻原生质体的方法，其特征在于:所述混合消化酶液中加入渗透剂、膜稳定剂、以及强化作用效果的纤维素酶和果胶酶共同作为酶解液，而后与长心卡帕藻混合在25±2°C条件下，连续轻微震荡酶解10-12小时，即可获得到游离的长心卡帕藻原生质体。
6.按权利要求1、4或5所述的制备长心卡帕藻原生质体的方法，其特征在于:将上述酶解后酶解液中加入洗脱液在25±2°C条件下，震荡酶解1±0.2小时，酶解后过滤，滤液离心，弃去最上层的清液，再加入洗脱液悬浮并充分混匀，再次离心收集沉淀，沉淀再经洗脱液悬浮即为长心卡帕藻原生质体；其中洗脱液为含0.6M甘露醇和5mM氯化钙的F/2培养基溶液；酶解液与粉碎后的长心卡帕藻泥体积比为3:1。
【文档编号】C12N5/04GK103966154SQ201310045707
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年2月5日 优先权日:2013年2月5日
【发明者】刘建国, 李俊鹏, 庞通, 李虎, 林伟 申请人:中国科学院海洋研究所