用于检测蛋白质互作的荧光素酶互补图像检测方法及载体试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明用于检测蛋白质互作的荧光素酶互补图像检测方法及载体试剂盒，属于蛋白质研究技术，其特征在于，将gateway技术引入到荧光素酶互补图像检测方法中，得到了荧光素酶互补图像检测的gateway表达载体、试剂盒及优化的蛋白质互作检测方法，用于高效快速高通量地检测蛋白质之间的互作。
【专利说明】用于检测蛋白质互作的荧光素酶互补图像检测方法及载体试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及蛋白质研究技术，特别是一种用于检测蛋白质互作的荧光素酶互补图像检测方法及载体试剂盒。
【背景技术】
[0002]目前用于蛋白质互作的检测技术有酵母双杂交技术(Yeast two hybrid, Y2H)、突光共振能量转移技术(FRET)、化学发光共振能量转移技术(BRET)和双分子荧光互补技术(BiFC)等等。
[0003]酵母双杂交系统(Y2H)利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白一蛋白的相互作用。荧光能量共振转移(FRET)是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象，当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在IOnm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多(荧光猝灭)，而受体发射的荧光却大大增强(敏化荧光)。可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。当供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠，并且两个探针的距离在IOnm范围以内时，就会产生FRET现象。而在生物体内，如果两个蛋白质分子的距离在IOnm之内，一般认为这两个蛋白质分子存在直接相互作用。双分子荧光互补技术(BiFC)是将荧光蛋白在某些特定的位点切开，形成不发荧光的N和C端2个多肽，称为N片段(N-fragment)和C片段(C-fragment)。这2个片段在细胞内共表达或体外混合时，不能自发地组装成完整的荧光蛋白，在该荧光蛋白的激发光激发时不能产生荧光。但是，当这2个荧光蛋白的片段分别连接到I组有相互作用的目标蛋白上，在细胞内共表达或体外混合这2个融合蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，荧光蛋白的2个片段在空间上互相靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，并在该荧光蛋白的激发光激发下，发射`荧光，作为报告蛋白，直接反映目标蛋白质蛋白质之间的相互作用。
[0004]基于双分子荧光互补技术，发明人的前期研究中提出荧光素酶互补图像检测技术 LCI 技术(Huamin Chen,et al;2008, Firefly Luciferase ComplementationImaging Assay for Protein-Protein interaction in Plants.Plant Physiology.Vol.146，pp.368^376)，当检测两种目标蛋白是否互作时，将荧光素酶分成N端(NLuc)片段2~416和C端(CLuc) 398~550两部分作为报告蛋白，将编码N端(NLuc)片段和C端(CLuc)片段的基因分别构建到不同的表达载体上得到N端载体和C端载体，在N端载体上N端(NLuc)片段的氨基端载入一种目标待检测蛋白的基因得N端检测载体，在C端载体上C端(CLuc)片段的羧基端载入另一种目标蛋白的基因得C端检测载体。将N端检测载体和C端检测载体的表产物混合在一起，目标蛋白下游两部分报告蛋白不会自发地装配起来，仅仅当与这两部分报告融合的目标蛋白之间可以互作时，两部分报告蛋白才能够正确地组装并产生活性，在加入发光底物后，可以通过特定仪器来检测其化学发光情况，如果发光情况判断两种目标蛋白之间是否存在互作。LCI技术可以利用原生质体表达系统，也可以利用农杆菌介导的瞬时表达系统来完成蛋白互作的检测或验证，LCI检测的是群体细胞的结果，而非单一细胞内的结果，因此有效避免了细胞个体所造成的假象，排除了细胞自发荧光的干扰。
[0005]但前期LCI表达载体其多克隆酶切位点单一，当进行蛋白质互作验证时，待测定基因克隆入表达载体具有很多局限性，仅仅适合于2个待测蛋白互作的验证，不方便于高通量的蛋白质互作筛选。
[0006]Gateway技术(Invitrogen):能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统，并且大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，去除了冗长的亚克隆步骤，同时克隆效率高达95%或更高。当基因在目的表达载体之间快速简便地穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框，因此Gateway技术被多数实验室广泛使用。
[0007]目前尚未见到将gateway技术与LCI技术相结合的报道。
【发明内容】
[0008]本发明根据上述领域的空白，提供一种简捷、方便，同时也可以方便地适用于大规模的蛋白互作筛选和验证的方法及相应的LCI表达载体试剂盒。
[0009]本发明的技术方案如下:
[0010]用于检测蛋白质互作的荧光素酶互补图像检测的表达载体，N端载体为表达荧光素酶N端2~416位多肽片段Nluc的pNG或pUC-Nluc-G，C端载体为表达荧光素酶C端398~550位多肽片段Cluc的pCG或pUC-Cluc-G，
[0011]所述pNG及pUC-Nluc-G的构建过程如下:用限制性内切酶Kpn1-Sal I消化PUC-Nluc切除多克隆位点序列，采用T4DNApo I ymerase同时对3 ’ -突出末端切割，对5 ’ -突出末端进行补平；然后利用碱性磷酸酶对其末端进行去磷酸化处理，获得pUC-Nluc-KS ；pUC-Nluc-KS 与 RFC2.1 片段连接得 pUC-Nluc-G ;用限制性酶 HindII1-SacI 消化pUC-Nluc-G 质粒形成 pUC-Nluc-G`-HS ;用限制性酶 HindII1-SacI 消化 pCAMBIA-nLUC 质粒切除nLUC片段，回收载体片段PCAMBIA-35S-HS ;连接pUC-Nluc-G-HS片段和载体片段PCAMBIA-35S-HS 得到 pNG ；
[0012]所述pCG的构建过程如下:用限制性内切酶Kpn1-PstI消化pUC_Cluc切除多克隆位点序列，采用T4DNAp0lymeraSe同时对3’突出末端切割，对5’突出末端进行补平；然后利用碱性磷酸酶对其末端进行去磷酸化处理，获得pUC-Cluc-KP ；pUC-Cluc-KP与RFC2.1片段连接得pUC-Cluc-G ;用限制性酶HindII1-SacI消化pUC-Cluc-G质粒形成pUC-Cluc-G-HS ;用限制性酶HindII1-SacI消化pCAMBIA_cLUC质粒切除cLUC片段，回收载体片段 PCAMBIA-35S-HS ;连接 pUC-Cluc-G-HS 片段和载体片段 pCAMBIA_35S_HS 得到 pCG.。
[0013]一种用于检测蛋白质互作的荧光素酶互补图像检测方法，其步骤如下:
[0014]( I)预备N端载体和C端载体，
[0015](2)构建待测基因的入门表达载体，
[0016](3)构建融合表达载体:通过LR反应将一种入门表达载体中的待测蛋白基因重组克隆到PNG载体上所述N端2~416位多肽片段的氨基端得到N端LCI融合表达载体；另一种入门表达载体中的待测蛋白基因通过LR反应重组克隆到pCG载体上所述C端398~550位多肽片段的羧基端得到C端LCI融合表达载体；[0017](4)转化瞬时表达系统:所述N端载体为pUC-Nluc-G，所述C端载体为pUC-Cluc-G，所述瞬时表达系统指原生质体瞬时发表系统，将步骤(2)制备得到的N端LCI融合表达载体和C端LCI融合表达载体的质粒共转化到原生质体中进行瞬时表达，
[0018]或者，所述瞬时表达系统指烟草瞬时表达系统，所述N端载体为pNG，所述C端载体为pCG ;将步骤(2)制备得到的N端LCI融合表达载体和C端LCI融合表达载体分别转化农杆菌中，培养农杆菌，得到转化有不同待测蛋白基因的N端农杆菌菌株和C端农杆菌菌株，按比例混合所述N端农杆菌菌株和所述C端农杆菌菌株的菌液，将混合菌液注射到烟草叶片中进行瞬时表达，
[0019](5)加入荧光素酶底物检测发光情况:所述原生质体中加0.2%-0.5%的lmg/mL荧光素酶底物D-Luciferin钾盐,所述烟草叶面上喷lmg/mL突光素酶底物D-Luciferin钾盐，检测发光情况，如果有发光，即说明待测蛋白之间存在互作。
[0020]所述指农杆菌为菌株GV3101。
[0021]所述按比例混合指两株农杆菌菌液相同浓度下按体积比1:1混合。
[0022]当所述所述瞬时表达系统指烟草瞬时表达系统时，瞬时表达指注射农杆菌至饱和状态烟草叶片置于24~28°C条件下培养2-5天。
[0023]所述检测发光情况采用超敏化学发光检测系统，微孔板发光检测仪。
[0024]所述混合菌液的OD值不高于1.2。
[0025]一种从cDNA文库中高通量筛选互作蛋白的方法，其特征在于采用基于N端载体为pNG，C端载体为pCG的荧光素酶互补图像检测方法，步骤如下:
[0026]步骤1:构建cDNA文库构建:合成两端分别带有BamHI和SalI酶切位点的双链cDNA，，通过amH1-Sall消化cDNA和p`NG或pCG，连接酶切产物得到cDNA文库入门载体，cDNA文库入门载体转化E.coli得到cDNA文库；
[0027]步骤2:通过BP反应构建诱饵蛋白基因的入门载体:
[0028]步骤3:通过LR反应将入门载体中的诱饵蛋白基因重组克隆到pCG或pNG构建诱饵蛋白融合表达载体，并转化农杆菌，选出阳性单菌落诱饵蛋白农杆菌菌株；
[0029]步骤4:提取cDNA文库中的质粒，将质粒转化到农杆菌中，分离并培养单菌落，获得一批cDNA文库农杆菌菌株；
[0030]当诱饵蛋白融合表达载体所用的载体为PNG时，cDNA文库融合表达载体所用的载体为pCG，当诱饵蛋白融合表达载体所用的载体为pCG时，cDNA文库融合表达载体所用的载体为PNG ；
[0031]步骤5:每株cDNA文库农杆菌的菌液分别与诱饵蛋白农杆菌的菌液混合，将混合的农杆菌菌液注射到烟草叶片中进行瞬时表达；
[0032]步骤6:通过检测烟草叶片中的荧光活性，找出与所述诱饵蛋白的互作蛋白，然后找出表达互作蛋白的cDNA文库农杆菌菌株；
[0033]步骤7:以表达互作蛋白的cDNA文库农杆菌菌株为DNA模板进行PCR扩增，对扩增产物进行测序得到互作蛋白的基因信息。
[0034]所述表达互作蛋白的cDNA文库农杆菌菌株所用的载体为pNG时，PCR扩增米用的引物为 NG-S-F:gacgagctcgatcaaacaag / NG-S-Ritcttcatagccttatgcag ；表达互作蛋白的cDNA文库农杆菌菌株所用的载体为pCG时，PCR扩增采用的引物为CG-S-F:tcttaccggaaaactcgac/G-S-R:atcgaaccactttgtacaag。
[0035]用于检测蛋白质互作的试剂盒，其特征在于:含有荧光素酶互补图像检测的表达载体 pCG/pNG 或 pUC-Nluc-G/pUC-Cluc-G。
[0036]本发明首次将gateway技术与LCI技术结合起来，引入了目前多数实验室都已采用的Gateway技术,构建成了适用于LCI技术Gateway载体,优化后的LCI表达载体,不仅便于构建验证互作的2个蛋白表达载体，同时也可以适用于蛋白互作的高通量筛选的表达载体。
[0037]本发明提供的用于检测蛋白质互作的荧光素酶互补图像检测方法基于Huamin Chen, et al;2008, Firefly Luciferase Complementation Imaging Assay forProtein-Protein interaction in Plants.Plant Physiology.Vol.146, pp.368^376 中提到的荧光素酶互补图像检测方法，是对其中的荧光素酶互补表达载体(LCI载体)进行改造，采用该文章发表的35S::Nluc、35S::Cluc为出发载体先构建其Gateway的目标载体pUC-Nluc-G和pUC-Cluc-G,然后再通过亚克隆构建最终的Gateway表达载体pNG和pCG,使得荧光素酶互补图像检测方法在检测蛋白质互作过程中，将蛋白质基因构建到LCI载体的过程更方便。其中PNG表达荧光素酶2~416位氨基酸残基构成的片段，pCG表达荧光素酶398~550位氨基酸残基构成的片段。
[0038]本发明提供的LCI技术Gateway载体用于检测蛋白质互作的原理与现有技术Huamin Chen, et al;2008,Firefly Luciferase Complementation Imaging Assay forProtein-Proteininteraction in Plants.Plant `Physiology.Vol.146，pp.368~376 中记载的一样，如同【背景技术】中的描述，在此不再赘述。其改进之处在于本发明构建的LCI技术Gateway载体能够更易于构建待测蛋白融合表达载体，这种改进使得蛋白质互作检测过程效率更高。该改进使得LCI技术可用于高通量检测蛋白质互作，例如检测/筛查cDNA文库中与特定诱饵蛋白互作的蛋白基因。
[0039]本发明还提供了检测蛋白质互作技术的荧光检测方法。
[0040]基于本发明提供的荧光素酶互补图像检测方法的表达载体，还可以做成试剂盒便于销售。
[0041]本发明中涉及的专业术语解释:
[0042]LR反应:指将含目的蛋白基因的入门载体(具有attL重组位点)与Gateway最终表达载体(具有attR重组位点，如本发明中的pNG/pCG)在LR Clonase? II enzyme mix的作用下进行重组反应的过程。最终将目的蛋白基因转入最终表达载体中(详见InvitrogenGateway Clone Technology)。执行LR反应的前提是,实验者已经有了含待测蛋白基因的入门载体。
[0043]入门载体:通过BP反应(attB重组位点与attP重组位点发生重组)获得两端含有特异重组位点attB的目的基因入门载体(详见Invitrogen Gateway Clone Technology)。
【专利附图】
【附图说明】
[0044]图l.pNG载体示意图。
[0045]图2.pCG载体示意图。
[0046]图3.35S::Nluc (pUC-Nluc)载体不意图。[0047]图4a.pUC-Nluc-G 载体示意图。
[0048]图4b.pUC-Nluc-G 验证不意图。
[0049]M:1Kb plus marker ；
[0050]P:未进行酶切的质粒；
[0051]1、2表示酶切验证的pUC-Nluc-Gl和pUC_Nluc_G2载体质粒；
[0052]H-X:表示 HindIII/Xbal 双酶切 pUC-Nluc-Gl 和 pUC_Nluc_G2 ；
[0053]ECoRI,表示 HindIII/Xbal 双酶切 pUC-Nluc-Gl 和 pUC_Nluc_G2 ；
[0054]其中HindIII酶切位点位于pCAMBIA_35S_HS载体中，XbaI位于RFC2.1片段中，H-X 双酶切 pUC-Nluc-Gl 和 pUC_Nluc_G2 后产生 2.8Kb 和 4.4Kb ；
[0055]ECoRI在pCAMBIA-35S-HS载体和RFC2.1片段中各有一个酶切位点，切出1.3Kb和
5.8Kb。质粒2因为浓度大，酶切消化不充分，电泳效果稍有偏差。
[0056]酶切验证结果表明质粒pUC-Nluc-Gl和pUC_Nluc_G2都是正确的pUC-Nluc-G。
[0057]图5.pCAMBIA-Nluc (pCAMBIA1300_Nluc)载体示意图。
[0058]构建融合表达载体时，可以使用SacI，Kpn1、BamHI, XhoI和SalI等限制酶切位点，但SalI是必需使用的(即插入片段的3‘_必须用SalI限制性酶切位点，为了保证Nluc片段蛋白正确的编码顺序。)·[0059]图6.pNG验证示意图。
[0060]M:1Kb plus marker ；
[0061]P:未进行酶切的质粒；
[0062]P-X:用PstI和XhoI进行双酶切；
[0063]1、2:酶切验证的pNGl和pNG2载体质粒。
[0064]其中PstI在pCAMBIA-35S-HS和RFC2.1中各有I个酶切位点；XhoI在PCAMBIA-35S-HS中有2个酶切位点，P-X双酶切后产生1.0KbU.4Kb,3.5Kb和7.4Kb，如P-X消化后的质粒2，因此质粒pNG2是正确的pNG载体质粒。
[0065]图7.35S::Cluc (pUC-Cluc)载体不意图。
[0066]图8a.pUC-Cluc-G载体结构不意图。
[0067]图8b.pUC-Cluc-G 验证不意图。
[0068]M:1Kb plus marker ；
[0069]P:未进行酶切的质粒载体；
[0070]1、2:酶切验证的 pUC-Cluc-Gl 和 pUC_Cluc_G2 载体质粒；
[0071]H-X =HindIII 和 XbaI 双酶切。
[0072]其中HindIII酶切位点位于pUC-cLUC-HS载体中，XbaI位于RFC2.1片段中，H-X双酶切后产生1.4Kb和4.9Kb的片段；
[0073]ECoRI在pUC-cLUC-HS载体和RFC2.1片段中各有一个酶切位点，酶切消化产生1.8Kb和4.5Kb的片段。酶切验证结果显示质粒pUC-Cluc-Gl和pUC-Cluc_G2都是正确的pUC-cLUC-G 载体。
[0074]图9.pCAMBIA-Cluc (pCAMBIA1300_Cluc)载体示意图。
[0075]构建融合表达载体时，可以使用Kpnl，BamHI, XhoI, SalI和PstI等限制酶切位点，但KpnI是必需使用的(即插入片段的5 必须用KpnI限制性酶切位点，为了保证目的蛋白正确的编码顺序)。
[0076]图10.pCG验证示意图。
[0077]M:1Kb plus marker ；
[0078]P:未进行酶切的质粒；
[0079]E-H:用 ECoRI 和 HindIII 进行双酶切；
[0080]1、2:酶切验证的pCGl和pCG2载体质粒。
[0081]ECoRI 在 pCAMBIA1300-HS 和 RFC2.1 中各有 I 个酶切位点；HindIII 仅在PCAMBIA-35S-HS中有I个酶切位点，E-H双酶切后产生1.8Kb、l.9Kb和8.9Kb的片段(如E-H消化后的质粒1、2，因为片段1.8Kb和1.9Kb太接近，电泳难以区分，所以，E-H消化后仅可看见2个片段。)；
[0082]P-X:用PstI和XhoI进行双酶切；PstI仅在RFC2.1中有I个酶切位点；XhoI在PCAMBIA-35S-HS中有2个酶切位点，P-X双酶切后产生1.0Kb,4.0Kb和7.5Kb的片段(如P-X消化后的质粒1、2)。酶切 验证表明质粒pCGl和pCG2都是正确的pCG载体质粒。
[0083]图11.AtSGTla入门载体的测序验证示意图。
[0084]测序引物:通用引物M13-F (5’ -GTAAAACGACGGCCAG-3’华大基因提供);通用引物M13-R (5' -CAGGAAACAGCTATGAC-3'华大基因提供)
[0085]构建入门载体时由于pDONR载体上的ccdB基因具有负选择压力，在转化BP反应产物时，极少产生假阳性，因此直接测序验证序列的正确性，不再进行酶切验证。
[0086]图12.AtRARl入门载体的测序验证示意图。
[0087]测序引物:通用引物M13-R (5' -CAGGAAACAGCTATGAC-3'华大基因提供)
[0088]图13.AtR77入门载体的测序验证示意图。
[0089]测序引物:通用引物M13-R (5' -CAGGAAACAGCTATGAC-3'华大基因提供)
[0090]图14.pNG和pCG表达载体的验证。
[0091]其中:叶片的左上、左下、右上和右下分别标有11、12、21、22数字，分别表示数字对应部位注射的农杆菌含有不同的表达载体，具体为:11表示农杆菌含有PNL-AtSGTla和pCL-AtRARl两个表达载体；12表示农杆菌含有pNL_AtSGTla和pCL_AtR77两个表达载体；21表示农杆菌含有pNG-AtSGTla和pCG_AtRARl两个表达载体；22表示农杆菌含有pNG-AtSGTla和pCG_AtR77两个表达载体。
[0092]图15.GloMax发光检测仪验证pNG/pCG表达载体。
[0093]pNL/pCL:指采用前期的表达载体系统，pNL-AtSGTla 与 pCL-AtRARl、pCL_AtR77 间的互作；
[0094]pNG/pCG:指采用改造后的表达载体系统。pNG-AtSGTla 与 pCG-AtRARl、pCG_AtR77间的互作。
[0095]图16.pNG/pCG BamH1-SalI 酶切位点示意图。
【具体实施方式】
[0096]以下通过【具体实施方式】说明本发明的原理和效果。
[0097]生物材料发放声明:
[0098]本发明所用的以下生物材料均为现有技术中有记载或可以商购获得的，本实验室也有保存， 申请人:保证自申请日起20年内可向公众发放用于验证试验。
[0099]35S::Nluc / 35S::Clue, pCAMBIA-Nluc / pCAMBIA-Cluc，pNL/pCL, pNL-AtSGTla与 pCL-AtRARl、pCL_AtR77 为已知载体，记载于 Huamin Chen, et al; 2008, FireflyLuciferase Complementation Imaging Assay for Protein-Protein interaction inPlants.Plant Physiology.Vol.146, pp.368~376。
[0100]RFC2.1 片段:购于 Invitrogen (Catalog n0.11828-029)。
[0101]One Shot? ccdB Survival?2TlR感受态细胞，可耐 ccdB基因:Invitrogen Catalogn0.11828-029)。
[0102]LR Clonase? II Enzyme Mix:1nvitrogen Cat.N0.11791-20/11791-100):
[0103]突光素酶底物:D_Luciferin钾盐(D-Luciferin, potassium salt),购于北京泛博生物化学有限公司。
[0104]实施例1.LCI技术Gateway载体的构建:(Nluc位于重组位点的C-端)
[0105]1.LpNG (图1)的构建
[0106]步骤1.用限制性内切酶Kpn1-SalI消化pUC-Nluc (即35S::Nluc)(图3)，切除多克隆位点序列，对获得片段进行末端抹平处理以便于插入RFC2.1重组片段。
[0107]步骤2.利用T4DNApolymerase(NEB)同时对步骤I的酶切回收验证片段的3，-突出末端切割(KpnI形成末端),对5’ -突出末端进行补平(Sail形成末端);然后利用碱性磷酸酶对其末端进行去磷酸 化处理，防止连接反应中形成自连，获得pUC-Nluc-KS。
[0108]步骤3.RFC2.1 重组位点克隆入 pUC-Nluc-KS:将 pUC-Nluc-KS 与 RFC2.1 片段(见Invitrogen)相连接，连接产物转化One Shot? ccdB Survival?2TlK感受态细胞(Invitrogen,可耐ccdB基因)，筛选阳性克隆并验证,验证图片见图4b,形成pUC-Nluc-G(图 4a)。
[0109]步骤4.pUC-Nluc-G的消化:用限制性酶HindIIΙ-Sacl消化pUC-Nluc-G质粒。消化后形成3.5kb和3.7kb两个片段，难以分离回收，因此利用碱性磷酸酶对其末端进行去磷酸化处理(防止片段自连或两片段的重新组装)，形成pUC-Nluc-G-HS。
[0110]步骤5.pCAMBIA-Nluc(图 5)的消化:用限制性酶HindII1-SacI 消化pCAMBIA-Nluc质粒切除了含有nLUC的片段，并回收其载体片段PCAMBIA-35S-HS。
[0111]步骤6.PCAMBIA-35S-HS 和 pUC-Nluc-G-HS 连接，连接产物转化 One Shot?ccdB Survival?2TlE感受态细胞。通过KanE (来自pCAMBIA_35S_HS片段)和CMe (来自pUC-Nluc-G-HS片段)抗性筛选阳性克隆，并进行验证，验证图片见图6。验证无误的即为最终的PNG表达载体。
[0112]1.2.PCG (图 2)的构建
[0113]pCG的构建:(Cluc位于重组位点的N-端)
[0114]步骤1.用限制性内切酶Kpn1-PstI消化pUC_Cluc (即35S::Cluc)(图7)，切除多克隆位点序列，对获得片段进行末端抹平处理以便于插入RFC2.1重组片段。
[0115]步骤2.利用T4DNA polymerase (NEB)同时对Kpnl、PstI消化产物的3’ -突出末端进行切割，形成平末端；然后利用碱性磷酸酶对其片段末端进行去磷酸化处理，防止连接反应中形成自连，获得pUC-Cluc-KP。
[0116]步骤3.RFC2.1 重组位点克隆入 pUC-Cluc-KP:将 pUC-Cluc-KP 与 RFC2.1 片段(见Invitrogen)相连接，连接产物转化One Shot? ccdB Survival?2TlK感受态细胞(Invitrogen,可耐ccdB基因)，筛选阳性克隆并验证,验证图片见图8b,形成pUC-Cluc-G(图 8a)。
[0117]步骤4.pUC-Cluc-G的消化:用限制性酶HindII1-SacI消化pUC_Cluc_G质粒形成
3.5kb和2.9kb两种片段，纯化回收2.9kb片段，即pUC-Cluc-G-HS;
[0118]步骤5.pCAMBIA-Cluc 图 9 的消化:用限制性酶 HindII1-SacI 消化 pCAMBIA-Cluc质粒切除了含有cLUC的片段，并回收其载体片段PCAMBIA-35S-HS。
[0119]步骤6.pCAMBIA-35S-HS 和 pUC-Cluc-G-HS 连接，连接产物转化 One Shot'ccdB Survival?2TlE感受态细胞。通过KanE (来自pCAMBIA_35S_HS片段)和CMe (来自pUC-Nluc-G-HS片段)筛选阳性克隆，并进行验证，验证图片见图10，验证无误的即为最终的PCG表达载体(图2)。
[0120]注:本发明中所用到的酶试剂的使用均依照试剂说明书中建议的进行。
[0121]实施例2.LCI技术Gateway载体用于检测蛋白质基因AtSGTla与AtRARl之间的互作构建融合载体，并导入农杆菌GV3101或GV2260等(均可)。
[0122]目的:检测AtSGTla和AtRARl之间的互作，以AtSGTla和AtR77的互作为负对照。AtR77仅包含AtRARl的N端77个氨基酸。
[0123]以原有的LCI表达载体pCAMBIA-Nluc和pCAMBIA-Cluc为对照，验证pNG和pCG表达载体在LCI技术上的适用性。
[0124]步骤1.构建目的基因的入门载体(详见invitrogen Catalog nos.12535-019说明书)
[0125]AtSGTla基因、AtRARl基因、AtR77基因的入门载体构建过程:
[0126](I)带attB重组位点目的基因的PCR扩增
[0127]通过采用带attB重组位点的引物扩增待测基因，使目的基因带有attB重组位点以便于进行BP反应。
[0128]本实验以已知载体质粒pNL-AtSGTla与pCL-AtRARl、pCL_AtR77 (记载于Huamin Chen, et al;2008, Firefly Luciferase Complementation Imaging Assay forProtein-Protein interaction in Plants.Plant Physiology.Vol.146，pp.368~376)为模板，以以下带有attB重组位点(斜体下划线部分)的引物进行PCR扩增得到用于构建入门载体的目的基因::
【权利要求】
1.用于检测蛋白质互作的荧光素酶互补图像检测的表达载体，N端载体为表达荧光素酶N端2~416位多肽片段Nluc的pNG或pUC-Nluc_G，C端载体为表达荧光素酶C端398~550位多肽片段Cluc的pCG或pUC-Cluc-G， 所述PNG及pUC-Nluc-G的构建过程如下:用限制性内切酶Kpn1-Sal I消化pUC-Nluc切除多克隆位点序列，采用T4DNApoIymerase同时对3 ’ -突出末端切割，对5 ’ -突出末端进行补平；然后利用碱性磷酸酶对其末端进行去磷酸化处理，获得pUC-Nluc-KS ；pUC-Nluc-KS与RFC2.1片段连接得pUC-Nluc-G ;用限制性酶HindII1-SacI消化pUC-Nluc-G质粒形成pUC-Nluc-G-HS ;用限制性酶HindII1-SacI消化pCAMBIA-nLUC质粒切除nLUC片段，回收载体片段 PCAMBIA-35S-HS ;连接 pUC-Nluc-G-HS 片段和载体片段 pCAMBIA_35S_HS 得到 pNG ； 所述PCG的构建过程如下:用限制性内切酶Kpn1-PstI消化pUC_Cluc切除多克隆位点序列，采用T4DNAp0lymeraSe同时对3’突出末端切割，对5’突出末端进行补平；然后利用碱性磷酸酶对其末端进行去磷酸化处理，获得pUC-Cluc-KP ；pUC-Cluc-KP与RFC2.1片段连接得PUC-Cluc-G ;用限制性酶HindII1-SacI 消化pUC-Cluc-G质粒形成pUC-Cluc-G-HS ；用限制性酶HindII1-SacI消化pCAMBIA_cLUC质粒切除cLUC片段，回收载体片段PCAMBIA-35S-HS ;连接 pUC-Cluc-G-HS 片段和载体片段 pCAMBIA_35S_HS 得到 pCG.。
2.一种用于检测蛋白质互作的荧光素酶互补图像检测方法，其步骤如下: (1)预备N端载体和C端载体， (2)构建待测基因的入门表达载体， (3)构建融合表达载体:通过LR反应将一种入门表达载体中的待测蛋白基因重组克隆到PNG载体上所述N端2~416位多肽片段的氨基端得到N端LCI融合表达载体；另一种入门表达载体中的待测蛋白基因通过LR反应重组克隆到pCG载体上所述C端398飞50位多肽片段的羧基端得到C端LCI融合表达载体，` (4)转化瞬时表达系统:所述N端载体为pUC-Nluc-G，所述C端载体为pUC-Cluc-G，所述瞬时表达系统指原生质体瞬时发表系统，将步骤(2)制备得到的N端LCI融合表达载体和C端LCI融合表达载体的质粒共转化到原生质体中进行瞬时表达， 或者，所述瞬时表达系统指烟草瞬时表达系统，所述N端载体为pNG，所述C端载体为PCG ;将步骤(2)制备得到的N端LCI融合表达载体和C端LCI融合表达载体分别转化农杆菌中，培养农杆菌，得到转化有不同待测蛋白基因的N端农杆菌菌株和C端农杆菌菌株，按比例混合所述N端农杆菌菌株和所述C端农杆菌菌株的菌液，将混合菌液注射到烟草叶片中进彳丁瞬时表达， (5)加入突光素酶底物检测发光情况:所述原生质体中加0.2%-0.5%的lmg/mL突光素酶底物D-Luciferin钾盐,所述烟草叶面上喷lmg/mL突光素酶底物D-Luciferin钾盐,检测发光情况，如果有发光，即说明待测蛋白之间存在互作。
3.根据权利要求2所述的检测方法，所述指农杆菌为菌株GV3101。
4.根据权利要求2所述的检测方法，所述按比例混合指两株农杆菌菌液相同浓度下按体积比1:1混合。
5.根据权利要求2所述的检测方法，当所述所述瞬时表达系统指烟草瞬时表达系统时，瞬时表达指注射农杆菌至饱和状态烟草叶片置于24~28°C条件下培养2-5天。
6.根据权利要求2所述的检测方法，所述检测发光情况采用超敏化学发光检测系统，微孔板发光检测仪。
7.根据权利要求2所述的检测方法，所述混合菌液的OD值不高于1.2。
8.—种从cDNA文库中高通量筛选互作蛋白的方法，其特征在于采用基于N端载体为pNG，C端载体为pCG的荧光素酶互补图像检测方法，步骤如下: 步骤1:构建cDNA文库构建:合成两端分别带有BamHI和SalI酶切位点的双链cDNA，，通过amH1-Sall消化cDNA和pNG或pCG，连接酶切产物得到cDNA文库入门载体，cDNA文库入门载体转化E.coli得到cDNA文库； 步骤2:通过BP反应构建诱饵蛋白基因的入门载体: 步骤3:通过LR反应将入门载体中的诱饵蛋白基因重组克隆到pCG或pNG构建诱饵蛋白融合表达载体，并转化农杆菌，选出阳性单菌落诱饵蛋白农杆菌菌株； 步骤4:提取cDNA文库中的质粒，将质粒转化到农杆菌中，分离并培养单菌落，获得一批cDNA文库农杆菌菌株； 当诱饵蛋白融合表达载体所用的载体为PNG时，cDNA文库融合表达载体所用的载体为PCG，当诱饵蛋白融合表达载体所用的载体为pCG时，cDNA文库融合表达载体所用的载体为pNG ； 步骤5:每株cDNA文库农杆菌的菌液分别与诱饵蛋白农杆菌的菌液混合，将混合的农杆菌菌液注射到烟草叶片中进行瞬时表达； 步骤6:通过检测烟草叶片中的荧光活性，找出与所述诱饵蛋白的互作蛋白，然后找出表达互作蛋白的cDNA文库农·杆菌菌株； 步骤7:以表达互作蛋白的cDNA文库农杆菌菌株为DNA模板进行PCR扩增，对扩增产物进行测序得到互作蛋白的基因信息。
9.根据权利要求8所述的方法，所述表达互作蛋白的cDNA文库农杆菌菌株所用的载体为pNG时，PCR扩增采用的引物为NG-S-F: gacgagctcgatcaaacaag /NG-S-Ritcttcatagccttatgcag ;表达互作蛋白的cDNA文库农杆菌菌株所用的载体为pCG时，PCR 扩增米用的引物为 CG-S-F: tcttaccggaaaactcgac/G-S-R:atcgaaccactttgtacaag。
10.用于检测蛋白质互作的试剂盒，其特征在于:含有荧光素酶互补图像检测的表达载体 pCG/pNG 或 pUC-Nluc-G/pUC-Cluc-G。
【文档编号】C12N15/84GK103849645SQ201310046363
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2013年2月5日 优先权日:2013年2月5日
【发明者】陈华民, 周俭民, 何晨阳, 田芳 申请人:中国农业科学院植物保护研究所