专利名称：一种大动物胰岛消化分离装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种大动物胰腺中胰岛的消化分离的装置，具体涉及一种可进行进行犬、猪、猕猴或人的胰岛消化和分离的成套设备，用于将胰岛消化和离心洗涤，为下一步纯化胰岛做准备。
背景技术：
糖尿病是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征。糖尿病是世界范围内最常见的流行病之一，且已经成为继心血管、肿瘤之后的第三大威胁人类健康的非传染病。由于生活环境等因素的改变，糖尿病的患病人数日益增多。正因如此，彻底治愈糖尿病是医学领域急待解决的重要课题。在工业化国家中糖尿病已是占重要地位的一种代谢紊乱的疾病。胰岛素的发现和应用延长和挽救了无数I型和II型糖尿病患者的生存期限，但单纯胰岛素治疗依然不能阻止糖尿病并发症的发生。自加拿大阿尔贝塔大学医学院成功完成了世界上首次人胰岛移植实验以来，胰岛移植就渐渐地做为治疗糖尿病的方法之一受到广泛的关注和肯定，并被认为是临床替代外源性胰岛治疗I型糖尿病和严重II型糖尿病最有希望的方法。但如果胰岛细胞存在数量不足，质量不稳定等问题，将使胰岛移植在糖尿病的治疗上效果下降。胰岛分离纯化为胰岛移植是否成功的最关键的一步，先进的胰岛分离纯化技术解决胰岛收获量少，质量不稳定等问题，其中胰岛分离的过程是对胰岛数量及质量起着决定性作用。如何将胰岛从胰腺组织中分离纯化出来，成为了胰岛移植研究的一个重要内容。小动物如啮齿类大鼠、小鼠的胰岛消化分离设备简单，只需15至50ml离心管、恒温水浴、离心机即可以完成，但大动物因为胰腺量较大，所以装置相对要复杂一些。目前国内实验室大动物胰岛分离大多处于人工分离，消化、终止过程全凭文献研究所得适当时间间隔及以往实验经验，而自动胰岛分离仪器如COBE 2991、Ricordi Chamber，价格不菲，国内一般实验室难以承受，因此国内的胰岛分离实验一直未有太大的进展。本发明根据胰岛分离纯化的原理，参考Ricodi等人的文献，利用已有的实验室仪器，自制大动物半自动胰岛消化分离设备，为进一步进行大动物的胰岛移植实验奠定基础。胰岛消化分离的程序是使用胶原酶将胰腺组织中的胰岛消化和分离出来，获得数量完整可用的胰岛的关键条件包括胶原酶的活性和过程的控制。过程的控制包括消化过程 PH的调节、及时的消化终止、消化后组织的洗涤除去胶原酶、胰岛从胰腺组织中分散脱开等过程。因此整套消化分离装置必须包含一个消化筒，一个终止筒和一些连通管道。虽然胰岛消化分离的过程中操作者的经验非常重要，但操作者的经验主要体现在对消化终点的判断上，如果我们能够及时将消化完成的胰腺组织终止了消化，则其在接下来进一步的被消化过程就可以顺利停止，有助于提高胰岛的活性和保持其完整性。
发明内容
针对目前胰岛移植研究的日益深入，大动物胰岛消化分离设备完全依赖进口、价格昂贵，购买困难等问题，我们设计了此种简易的大动物胰岛消化分离设备，对于促进国内外胰岛移植研究，具有一定的应用价值。本大动物胰岛消化分离装置也为进行人的胰岛移植实验研究奠定了基础。本发明专利的目的在于提供一种原理简单，制备容易、使用方便，消化分离结果可靠的大动物胰岛消化分离装置，使用此装置进行大动物胰岛的消化分离，能够得到数量较大、活性较高的大动物胰岛。本发明是采用下述方案实现的，一种大动物胰岛消化分离装置是由一个消化筒， 一个恒温水浴筒，一个万向摇床，一个终止筒，一个冰浴筒，一个蠕动泵驱动器和3根硅胶管连接组成。所述的一种大动物胰岛消化分离装置中的消化筒为100 2000ml的底部为圆锥形的圆柱形带盖塑料桶，用60 10目不锈钢丝网铺入塑料桶内，将塑料桶分割成1 2 1 20的空间。在筒的顶部和底部圆底面上各钻一个孔，孔径2 10mm，插入与孔对应大小的中空的硅胶管，在筒的顶部再加一个孔，作为加液孔，孔径1 10mm，用硅橡胶塞封堵。所述的一种大动物胰岛消化分离装置中的终止筒为15 500ml底部圆锥形的圆柱形带盖塑料筒，分别于筒的顶部钻一个孔，孔径2 10mm，插入与孔对应大小的中空的硅胶管，用孔径为60 10目不锈钢丝网铺入塑料桶内，将塑料桶分割成1 2 1 20的空间，在筛网上面离筛网5 20mm的筒壁处钻一个孔，孔径2 10mm，插入与孔对应大小的中空的硅胶管，再在圆锥形底部钻一个孔，孔径2 10mm，插入与孔对应大小的中空的硅胶管，底部的硅胶管连接收集杯。所述种大动物胰岛消化分离装置的组装，将消化筒放入恒温水浴筒中，水浴筒中倒入适量40°C的水，淹没过2/3的消化筒，水浴筒置于摇床上，消化筒底部的硅胶管连接到终止筒顶部的孔，终止筒筛网上面孔的硅胶管，连接经过蠕动泵后又连接至消化筒顶部的孔，放在万向摇床上，终止筒插入冰浴筒中至1/5 4/5筒身埋入冰浴筒。本发明由于采用上述方案，将大动物的胰腺组织经灌注了胶原酶或直接剪碎后外加胶原酶后，放置于此消化筒的筛网上面，在消化筒、终止筒和硅胶管中充满胶原酶液，开启摇床和蠕动泵后，就可以达到既快速消化胰腺组织，又能够保证消化后的胰腺组织能够迅速终止消化，并与未消化完全的组织完全分开。本发明原理简单，制备容易、使用方便，消化分离结果可靠，可达到规模化批量生产，起到促进胰岛移植研究的作用。
附图1为本发明结构示意图
具体实施例方式见图1，本发明的大动物胰腺消化分离的装置由消化筒1，消化筒筛网2，恒温水浴筒3，摇床4，终止筒5，终止筒筛网6，冰浴筒7，蠕动泵8，硅胶管路系统9和加液孔10组成。 所述大动物胰腺消化分离的装置中消化筒1内筛网上放置待消化的动物胰腺组织，放置后在装置中通过加液孔10向装置中充入无菌的胶原酶溶液，在恒温水浴筒3中加入温水，在冰浴筒7中加入碎冰，开启蠕动泵8，就启动了大动物胰腺的消化分离程序。实施例1本发明实施例1的一种大动物胰岛消化分离装置如下消化筒1体积为300ml，消化筒筛网2孔径为18目，筛网将消化筒分隔成1 4的两个空间，终止筒5体积为50ml，终止筒筛网6孔径为M目，加液孔10孔径为3mm组成，消化筒和终止筒上连接硅胶管的孔直径均为7mm，所述大动物胰腺消化分离的装置中消化筒 1内筛网上放置待消化的动物胰腺组织，放置后在装置中通过加液孔10向装置中充入无菌的胶原酶溶液。所述的一种大动物胰岛消化分离装置进行成年杂种猪胰腺胰岛消化结果如下(1)胰岛灌注除去覆在胰腺组织上的血块及被膜，用冷的D-Hanks液清洗，称取约 30g胰腺组织，找出胰岛的主胰管，用针筒将由快至慢灌注冷胶原酶V 0.8mg/ml(4°C )，可见胰腺组织开始逐渐膨胀，灌注充足后可见呈透亮淡粉色充盈且均勻分布的葡萄状组织。(2)胰岛消化分离将膨胀后的胰腺组织放入消化筒1的筛网2上，同时放入3 4 粒直径IOmm玻璃珠。往加液孔中注入胶原酶V液，摇床调到lOOrpm，蠕动泵130rpm，进行循环消化分离。消化期间恒温水浴筒温度约40°C，以此可以保持消化筒内温度为约37°C， 在消化8 IOmin后，根据消化进程，每隔IOmin抽取样品0. 5ml，并加人0. 5 2ml双硫腙 (DTZ)染色，观察消化进度。消化30min左右，胰腺组织大部分已消化至终止筒中，并呈糜状，打开终止筒底部硅胶管的阀门，使终止筒内的胰腺组织流入到收集杯中，加冷Hanks液 50ml稀释消化后的组织，稍后关闭蠕动泵及摇床。将收集杯中的沉淀及溶液分装于50ml离心管，IOOOrpm, 5min离心，弃上清液。沉淀用Hanks液振摇剧烈至分散后，用玻璃滴管吹打 7-8次使组织悬液充分分散，IOOOrpm, 5min离心，弃去上清。同上法将沉淀洗入15ml离心管，1200rpm, 5min离心，尽量倒干上清液。(3)胰岛纯化Ficoll-PaqueTMPLUS溶液纯化法在沉淀中加入5ml FicolI-PaqueTM PLUS溶液，吹打使其充分混勻，在其液面上小心加入Hanks液2ml， 2000rpm离心lOmin，吸取Hanks和Ficoll交界层液面的组织悬块，即为纯化的胰岛。实验结果将分离纯化的胰岛经DTZ染色后，可见胰岛呈猩红色，并呈不规则形状，胰岛边缘清晰，直径大部分为50 300 μ m。用带目镜测微仪的光学显微镜对镜检计数的DTZ阳性细胞团测量其直径，并取其它文献的数据进行比较，结果见下表。表1使用本发明的大动物胰岛消化分离装置前后猪胰岛量对比表格
权利要求
1.一种大动物胰岛消化分离装置，其特征在于其组成为一个消化筒，一个恒温水浴筒，一个万向摇床，一个终止筒，一个冰浴筒，一个蠕动泵驱动器和3根硅胶管连接组成。
2.根据权利要求1所述的一种大动物胰岛消化分离装置，其特征在于消化筒为 100 2000ml的底部为圆锥形的圆柱形带盖塑料桶，用60 10目不锈钢丝网铺入塑料桶内，将塑料桶分割成1 2 1 20的空间，在筒的顶部和底部圆底面上各钻一个孔，孔径 2 10mm，插入与孔对应大小的中空的硅胶管，在筒的顶部再加一个孔，作为加液孔，孔径 1 10mm，用硅橡胶塞封堵。
3.根据权利要求1所述的一种大动物胰岛消化分离装置，其特征在于终止筒为15 500ml底部圆锥形的圆柱形带盖塑料筒，筒的顶部有一个孔，孔径2 10mm，连接有与孔对应大小的中空的硅胶管，用网孔大小为60 10目的不锈钢丝网铺入塑料桶内，将塑料桶分割成1 2 1 20的空间，在筛网上面离筛网5 20mm的筒壁处有一个孔，孔径2 10mm，连接有与孔对应大小的中空的硅胶管，再在圆锥形底部钻一个孔，孔径2 10mm，连接有与孔对应大小的中空的硅胶管，底部的硅胶管连接收集杯。
4.根据权利要求1所述的一种大动物胰岛消化分离装置，其特征在于一种大动物胰岛消化分离装置的组装为将消化筒放入恒温水浴筒中，水浴筒中倒入适量40°C的水，淹没过2/3的消化筒，水浴筒置于摇床上，消化筒底部的硅胶管连接到终止筒顶部的孔，终止筒筛网上面孔的硅胶管，连接经过蠕动泵后又连接至消化筒顶部的孔，终止筒插入冰浴筒中至1/5 4/5的筒身埋入冰浴筒。
全文摘要
一种大动物胰岛消化分离装置，其组成为一个消化筒，一个恒温水浴筒，一个万向摇床，一个终止筒，一个冰浴筒，一个蠕动泵驱动器和3根硅胶管连接组成。本发明解决了目前大动物胰岛移植研究中消化分离设备完全依赖进口、价格昂贵，购买困难等问题，并尽可能的保存了大动物胰岛的高完整性、高活率和高数量，我们设计了此种简易的大动物胰岛消化分离设备，节省了胰岛移植的费用，降低了研究成本，对于促进国内外胰岛移植研究，具有一定的应用价值。本发明原理简单，制备容易、使用方便，消化分离结果可靠，可达到规模化批量生产，起到促进胰岛移植研究的作用。
文档编号C12M3/08GK102304477SQ201110265910
公开日2012年1月4日 申请日期2011年9月2日 优先权日2011年9月2日
发明者傅红兴, 朱雁林, 李慧, 赵应征 申请人:温州医学院