专利名称：一种绵羊羊毛卷曲度的分子标记方法
技术领域：
本发明涉及一种分子标记方法。
背景技术：
细毛羊在我国畜牧产业中占有重要地位，细毛羊的主要产品是羊毛。细羊毛作为重要的纺织原料，有较高的经济价值。细毛羊的生产不仅关系到产区的经济发展和社会稳定，而且关系到我国毛纺行业的发展以及进出口贸易平衡。随着国内外对羊毛需求的增加， 高品质细毛羊的培育已成为羊毛业生产以及绵羊育种领域中亟待解决的问题。目前，我国细毛羊生产面临的一个主要问题就是国内细毛羊品种老化，缺少适应当前市场变化需求的新品种。因此寻求一种有效、便捷，并且能够在短时间内加速绵羊育种进程的育种手段便显得尤为重要。SNP作为一种有效的分子生物学标记方法已广泛的应用于动物遗传育种领域。DLX3是同源异型框转录因子DLX基因家族中的一员，在哺乳动物胎盘、皮肤、毛囊、牙齿、骨等多种组织中都有表达。基因敲除小鼠研究表明，DLX3基因缺失会引起毛囊形态、分化以及周期性的改变，并导致毛干和内毛根鞘的形成发生障碍，从而造成全身性脱发。特异性敲除毛囊干细胞中的DLX3基因，会导致毛囊静止期BMP信号通路消失，从而阻碍毛囊再次生长。最近的研究发现，miR-31调控DLX3基因在皮肤和毛囊中的表达，从而对毛发正常生长以及毛纤维形成起到重要的作用。此外，DLX3的SUMO化修饰可以促进DLX3 基因的转录活性，进而影响其对毛发形成的调控。综上所述，DLX3基因与毛囊发育以及毛发形成密切相关。
发明内容
本发明的目的在于提供一种绵羊羊毛卷曲度的分子标记方法。一种绵羊羊毛卷曲度的分子标记方法按以下步骤进行一、采用苯酚/氯仿法从中国美利奴羊的耳组织中提取绵羊基因组DNA，根据绵羊 DLX3基因3' UTR区2 位点设计引物DLX3F1和DLX3R1，然后对绵羊基因组DNA进行PCR 扩增，得到PCR扩增产物，再用限制性内切酶HpylSSI酶切PCR扩增产物，获得酶切产物；二、使用浓度为2% 3%的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳分离，然后根据电泳分离结果进行基因型判定，判定的标准①电泳呈现两条带，大小为^Mbp和214bp，则绵羊 DLX3基因3' UTR区2 位点无突变，PCR扩增产物能被限制性内切酶Hpyl88I完全切开， 将其命名为TT基因型；②电泳呈现一条带，大小为508bp，则绵羊DLX3基因3' UTR区2 位点发生突变，PCR扩增产物不能被限制性内切酶HpylSSI切开，将其命名为CC基因型；③ 电泳呈现三条带，大小为5(^bpJ94bp和214bp，则绵羊DLX3基因3 ‘ UTR区2 位点处于杂合状态，PCR扩增产物不能被限制性内切酶HpylSSI完全切开，将其命名为TC基因型；三、根据中国美利奴羊实验群体的特点，构建基因型效应统计模型Y = μ+G+L+A+e，其中Y为性状的观测值，μ为群体均值，G为基因型效应，L为品系效应，A为年龄效应，e为剩余值效应，然后利用JMP 4. 0统计软件将基因型效应与羊毛性状进行关联分析，并估计性状的最小二乘均值，关联分析结果表明，绵羊DLX3基因3' UTR区2 位点突变引起的基因型效应与羊毛卷曲度显著相关，P = 0.0106 < 0. 05，再进行多重比较，3种基因型中具有TT基因型和TC基因型个体的羊毛卷曲度显著高于CC基因型个体的羊毛卷曲度；四、依据基因型将中国美利奴羊实验群体分为三种类型，从而实现对绵羊羊毛卷曲度的分子标记辅助育种，即完成绵羊羊毛卷曲度的分子标记方法；其中步骤一中DLX3F1 的核苷酸序列为5，-AACCTCTCACGAAGGAACCC_3，，DLX3R1 的核苷酸序列为5 ‘ -AGTCTCACGGTCCAATGTCTTT-3 ‘；步骤二中用限制性内切酶HpylSSI所识别的碱基序列为TCNGA ；步骤三中中国美利奴羊实验群体的特点①、783只中国美利奴羊为新疆军垦型； ②、超细毛品系160只、毛用多胎品系137只、A品系171只、B品系166只、肉用多胎品系 149只；③、均为同性别母羊；④、年龄为2 10岁。本发明关于绵羊羊毛卷曲度的分子标记方法可用于羊毛卷曲度和细度的分子标记辅助育种，可实现种羊的早期选种，出生后即可进行选留，从而降低选育成本、加速高品质细毛羊的育种进程。本发明的操作方法简单、检测条件要求低、准确度高，成本低、效率高、可进行自动化检测。
图1为具体实施方式
一中酶切产物进行电泳分离的电泳图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一绵羊羊毛卷曲度的分子标记方法按以下步骤进行一、采用苯酚/氯仿法从中国美利奴羊的耳组织中提取绵羊基因组DNA，根据绵羊 DLX3基因3' UTR区2 位点设计引物DLX3F1和DLX3R1，然后对绵羊基因组DNA进行PCR 扩增，得到PCR扩增产物，再用限制性内切酶HpylSSI酶切PCR扩增产物，获得酶切产物；二、使用浓度为2% 3%的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳分离，然后根据电泳分离结果进行基因型判定，判定的标准①电泳呈现两条带，大小为^Mbp和214bp，则绵羊 DLX3基因3' UTR区2 位点无突变，PCR扩增产物能被限制性内切酶Hpyl88I完全切开， 将其命名为TT基因型；②电泳呈现一条带，大小为508bp，则绵羊DLX3基因3' UTR区2 位点发生突变，PCR扩增产物不能被限制性内切酶HpylSSI切开，将其命名为CC基因型；③ 电泳呈现三条带，大小为5(^bpJ94bp和214bp，则绵羊DLX3基因3 ‘ UTR区2 位点处于杂合状态，PCR扩增产物不能被限制性内切酶HpylSSI完全切开，将其命名为TC基因型；三、根据中国美利奴羊实验群体的特点，构建基因型效应统计模型Y = μ+G+L+A+e，其中Y为性状的观测值，μ为群体均值，G为基因型效应，L为品系效应，A为年龄效应，e为剩余值效应，然后利用JMP 4. 0统计软件将基因型效应与羊毛性状进行关联分析，并估计性状的最小二乘均值，关联分析结果表明，绵羊DLX3基因3 ‘ UTR区2 位点突变引起的基因型效应与羊毛卷曲度显著相关P = O. 0106 < 0. 05，再进行多重比较，3种基因型中具有TT基因型和TC基因型个体的羊毛卷曲度显著高于CC基因型个体的羊毛卷曲度；四、依据基因型将中国美利奴羊实验群体分为三种类型，从而实现对绵羊羊毛卷曲度的分子标记辅助育种，即完成绵羊羊毛卷曲度的分子标记方法；其中步骤一中DLX3F1 的核苷酸序列为5，-AACCTCTCACGAAGGAACCC_3，，DLX3R1 的核苷酸序列为5 ‘ -AGTCTCACGGTCCAATGTCTTT-3 ‘；步骤二中用限制性内切酶HpylSSI所识别的碱基序列为TCNGA ；步骤三中中国美利奴羊实验群体的特点①、783只中国美利奴羊为新疆军垦型； ②、超细毛品系160只、毛用多胎品系137只、A品系171只、B品系166只、肉用多胎品系 149只；③、均为同性别母羊；④、年龄为2 10岁。本实施方式中羊毛卷曲度是指沿羊毛长度方向上每厘米的卷曲程度。本实施方式中PCR扩增产物中的绵羊基因组序列如SEQ ID No. 3所示。本实施方式中步骤二中3种基因型的电泳图如图1所示。本实施方式中涉及引物合成由上海英俊生物有限公司完成。本实施方式在具体操作中涉及使用的试剂盒均按说明书操作。本实施方式中提取绵羊基因组DNA (1)取中国美利奴羊(新疆军垦型)耳组织5g，剔除结缔组织，将组织块用70%酒精清洗、消毒，置入Eppendorf管内，用剪刀剪碎，或研磨碎；(2)待Eppendorf管内的酒精完全挥发后，加入分离缓冲液700μ 1，悬浮剪碎的组织后，加入蛋白酶K(20mg/ml)5. 0μ 1，55°C作用8_12h，直到无组织块为止；(3)将消化好的组织液取出，加入等量组织液的饱和酚，混勻lOmin，4 V， 12000rpm, IOmin 离心；(4)取上清液，加等量的苯酚/氯仿，轻轻混勻lOmin，4°C，12000rpm, IOmin离心；(5)取上清液，加等量的氯仿，混勻lOmin，4°C，12000rpm, IOmin离心；(6)取上清液，加2倍量的无水乙醇沉淀，颠倒混勻后，室温下静置10-20min，DNA 沉淀形成白色絮状物；(7)弃去上清，再加70%的乙醇清洗，弃去上清，在吸水纸上吸去多余液体，自然风干后，加适量的TE溶解，-20°C保存。(8)若DNA溶液中有不溶解颗粒，可在5000rpm短暂离心，取上清；如要除去其中的RNA，可加5μ 1 RNaseA(10yg/y 1)，37°C保温30min，用酚抽提后，按步骤4-7重新沉淀 DNA。本实施方式中3种基因型对新疆军垦型中国美利奴羊实验群体羊毛卷曲度的遗传贡献率利用SAS 9. 1. 3软件的VARCOMP过程估计方差组分，并计算各SNP及单倍型对卷曲度的遗传贡献率，结果表明绵羊DLX3基因3' UTR区2 位点对羊毛卷曲度的遗传贡献率为0. 9174%，对于微效多基因控制的性状来说，DLX3基因3' UTR区228T位点对羊毛卷曲度的遗传贡献率几乎达到了 1%，因此用该基因对羊毛卷曲度进行标记辅助选择，会获得较大的遗传进展。本实施方式中依据基因型将中国美利奴羊实验群体分为三种类型，从而完成对绵羊羊毛卷曲度的分子标记辅助育种，这样就可以根据绵羊的基因型确定其是否选留，来满足实际生产需要。本实施方式中羊毛性状测定根据国家纤维检验标准并参考国际毛纺织组织 (IffTO)纤维检测标准，对绵羊体侧部毛样进行卷曲度的测定，即以每厘米的卷曲度来表示卷曲的程度叫卷曲度，单位是(卷曲个/2. 5cm)。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中PCR扩增的反应体系为10 μ L反应体系，由下列成分组成
成分用量绵羊基因组DNAΙμ ΙΟμΜ 引物 DLX3F1Ιμ ΙΟμΜ 引物 DLX3R1Ιμ 10 X扩增缓冲液Ιμ 2.5mM dNTP Mixture0.8|iL5υ/μ Easy-Taq0.1 μ 去离子水6.7|iLPCR扩增条件为94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，共 33个循环，再72 °C延伸7min，4°C保温。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中酶切的体系如下
成分用量IOxNEB缓冲液Ιμ PCR产物2μ1限制性内切酶88 I0.3μ1去离子水6.7μ1酶切条件为37°C酶切过夜。其它与具体实施方式
--相同。
权利要求
1.一种绵羊羊毛卷曲度的分子标记方法，其特征在于绵羊羊毛卷曲度的分子标记方法按以下步骤进行一、采用苯酚/氯仿法从中国美利奴羊的耳组织中提取绵羊基因组DNA，根据绵羊DLX3 基因3 ‘ UTR区2 位点设计引物DLX3F1和DLX3R1，然后对绵羊基因组DNA进行PCR扩增， 得到PCR扩增产物，再用限制性内切酶HpylSSI酶切PCR扩增产物，获得酶切产物；二、使用浓度为2% 3%的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳分离，然后根据电泳分离结果进行基因型判定，判定的标准①电泳呈现两条带，大小为和214bp，则绵羊DLX3 基因3' UTR区2 位点无突变，PCR扩增产物能被限制性内切酶HpylSSI完全切开，将其命名为TT基因型；②电泳呈现一条带，大小为508bp，则绵羊DLX3基因3' UTR区2 位点发生突变，PCR扩增产物不能被限制性内切酶HpylSSI切开，将其命名为CC基因型；③电泳呈现三条带，大小为50m3pJ94bp和214bp，则绵羊DLX3基因3 ‘ UTR区2 位点处于杂合状态，PCR扩增产物不能被限制性内切酶HpylSSI完全切开，将其命名为TC基因型；三、根据中国美利奴羊实验群体的特点，构建基因型效应统计模型Υ= μ +G+L+A+e, 其中Y为性状的观测值，U为群体均值，G为基因型效应，L为品系效应，A为年龄效应，e为剩余值效应，然后利用JMP 4. 0统计软件将基因型效应与羊毛性状进行关联分析，并估计性状的最小二乘均值，关联分析结果表明，绵羊DLX3基因3 ‘ UTR区2 位点突变引起的基因型效应与羊毛卷曲度显著相关，P = 0.0106 < 0. 05，再进行多重比较，3种基因型中具有 TT基因型和TC基因型个体的羊毛卷曲度显著高于CC基因型个体的羊毛卷曲度；四、依据基因型将中国美利奴羊实验群体分为三种类型，从而实现对绵羊羊毛卷曲度的分子标记辅助育种，即完成绵羊羊毛卷曲度的分子标记方法；其中步骤一中DLX3F1的核苷酸序列为5’-AACCTCTCACGAAGGAACCC-3’，DLX3Rl的核苷酸序列为5 ‘ -AGTCTCACGGTCCAATGTCTTT-3 ‘；步骤二中用限制性内切酶HpylSSI所识别的碱基序列为TCNGA ；步骤三中中国美利奴羊实验群体的特点①、783只中国美利奴羊为新疆军垦型；②、 超细毛品系160只、毛用多胎品系137只、A品系171只、B品系166只、肉用多胎品系149 只；③、均为同性别母羊；④、年龄为2 10岁。
2.根据权利要求1所述的一种绵羊羊毛卷曲度的分子标记方法，其特征在于步骤一中PCR扩增的反应体系为10 μ L反应体系，由下列成分组成成分用量绵羊基因组DNAΙμ ΙΟμΜ 引物 DLX3F1Ιμ ΙΟμΜ 引物 DLX3R1Ιμ 10 X扩增缓冲液Ιμ 2.5mM dNTP Mixture0.8|iL5υ/μ Easy-Taq0.1 μ 去离子水6.7|iLPCR扩增条件为94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸3Os，共33个循环，再72 °C延伸7min，4°C保温。
3.根据权利要求1所述的一种绵羊羊毛卷曲度的分子标记方法，其特征在于步骤一中酶切的体系如下成分用量IOxNEB缓冲液Ιμ PCR产物2μ1限制性内切酶好炒188 10.3μ1去离子水6.7μ1酶切条件为37°C酶切过夜。
全文摘要
一种绵羊羊毛卷曲度的分子标记方法，它涉及一种分子标记方法。方法一、提取绵羊基因组DNA进行PCR扩增，然后酶切，得酶切产物；二、酶切产物电泳分离，根据电泳分离结果进行基因型判定；三、进行关联分析，并估计性状的最小二乘均值，结果为3种基因型中具有TT基因型和TC基因型个体的羊毛卷曲度显著高于CC基因型个体的羊毛卷曲度；四、依据步骤三中的结果将实验群体分为三种类型，即完成本发明。本发明可用于羊毛卷曲度和细度的分子标记辅助育种，可实现种羊的早期选种，出生后即可进行选留，从而降低选育成本、加速高品质细毛羊的育种进程；操作简单、准确度高、效率高、可自动化检测。
文档编号C12Q1/68GK102286628SQ201110265430
公开日2011年12月21日 申请日期2011年9月8日 优先权日2011年9月8日
发明者李辉, 王宁, 荣恩光 申请人:东北农业大学