专利名称：循环血中微量乳腺癌细胞的特异性检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及核酸检测方法技术领域，具体而言，本发明涉及检测、鉴定和/或定量人循环血中微量乳腺癌细胞的特异性检测方法。另外，本发明还涉及用于该方法的试剂盒、 中间产物以及其应用等。
背景技术：
乳腺癌是妇女最常见的致死性癌症之一，手术切除是乳腺癌综合治疗方法中的首选，但乳腺癌切除后的复发率高、转移率高癌细胞易于从原发灶进入外周血发生肿瘤转移，而肿瘤转移是乳腺癌治疗失败的主要原因。大量实验已经证实循环血中肿瘤细胞 (Circulating Tumor Cells,CTC)检测将有助于乳腺癌早期诊断、复发转移监控、判断患者预后、指导术后辅助治疗等。人乳腺球蛋白(Mammaglobin，MAM)是近年来发现的一种乳腺组织特异性蛋白标志物，在乳腺原发、转移及其外周血癌细胞中特异性表达(Watson et al.，1999，Watson and Fleming, 1996，Carter et al.，2002，Zuo et al. , 1998)。在国际上利用抗 MAM 抗体对人乳腺球蛋白的特异性检测已获得专利，如US6566072 (Mark A. Watson, Timothy P. Fleming, Washington University，2003)。目前国内也有针对人乳腺球蛋白的特异性检测专利中国专利(申请)CN03117222.9公开了一种人MAM剪接变异蛋白，利用该蛋白制备单克隆抗体并用于检测MAM ；中国专利(申请)CN200510106613. 4公开了利用抗体标记的乳胶颗粒来检测MAM的方法及其试剂盒。这些方法都是利用抗体进行MAM检测的，因此检测的准确度对其中的抗体的特异性要求非常高，否则会出现大量假阳性的结果，另外由于抗体试剂本身生产成本高、抗体必须在适宜的条件下保存、运输和使用以防止抗体效价变低，这大大增加了检测成本和检测结果的不确定性。Watson等首先建立用RT-PCR来检测人 MAM mRNA 的方法(Watson et al.，1999)；中国专利 CN200710303872. 5 建立利用 RT-PCR来检测人MAM mRNA表达的方法及其试剂盒。但是，该方法需要利用昂贵的RT-PCR设备，此外完成RT-PCR的过程非常耗时，RT-PCR检测的敏感性和特异性对检测试剂的质量、检测环境纯净度(无DNA交叉污染)依赖很大，否则易出现检测敏感度下降或假阳性结果。这些都是多数基层医院难以克服的。上世纪90年代初，Tuerk和Gold创立了指数富集式配基系统化筛选(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,简禾尔为 SELEX)技术，通过多轮的体外选择和扩增，能够从随机寡核苷酸文库中筛选出特异性适配体(aptamer)，参见 (Tuerk and Gold, 1990)。目前，人们已经发现了许多分子的特异性适配体，如微生物的适配体、生物大分子(如，血管内皮生长因子，血小板来源的生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、L-选择素、角化细胞生长因子、γ干扰素、肿瘤坏死因子等细胞因子)的适配体、小分子的适配体，能够特异结合相应微生物、生物大分子、小分子等靶分子，参见CN1490054A、
5CN1550501A、CN1563401A、CN101148666A、CN101835904A、生物工程学报，20 (4) :627-632,
等。适配体的优势在于对靶分子的识别具有很高的亲和力，其解离常数甚至可以达到 50pmol/L lOnmol/L。另外，由于适配体本身的化学结构是单链核酸，适配体与靶分子的结合可受杂质分子的干扰，尤其是当靶分子和杂质分子都是单链核酸(如，scDNA, mRNA)的情况下，由于核酸链本身存在配对二聚的性质，将增加干扰的情况发生。这些不利因素影响了适配体检测的准确性和精度，使其难以推广进行商业化使用，因此目前基于抗体的ELISA 检测或者耗时的PCR检测等仍旧在实践中投入使用。
发明内容
本发明所要解决的第一问题在于克服现有人乳腺球蛋白的特异性检测对环境纯净度要求高、对抗体特异性要求非常高且假阳性率偏高的问题，提供一种循环血中微量乳腺癌细胞的特异性检测方法，该方法使用简便、灵敏、特异性强、重复性好、出结果快捷、无需复杂仪器及特别技巧，而且可以利用未经精度提纯的待测样品直接检测，不会出现适配体与靶分子(MAM mRNA)和其他非特异核酸序列互相干扰的情况。本发明所要解决的又一技术问题在于提供一种循环血中微量乳腺癌细胞的特异性检测试剂盒。本发明所要解决的又一技术问题在于提供一种循环血中微量乳腺癌细胞的特异性检测试剂盒在制备用于本发明第一个方面方法的制品中的应用。本发明所要解决的又一技术问题在于提供一种循环血中微量乳腺癌细胞的特异性检测中的中间产物结合物。为了解决现有技术中的这些问题，在第一个方面，本发明提供的技术方案是本发明提供了一种循环血中微量乳腺癌细胞的特异性检测方法，包括以下步骤，
(1)从乳腺细胞，包括癌细胞和正常细胞中提取乳腺球蛋白mRNA；
(2)准备与磁性颗粒偶联的第一适配体和与纳米金颗粒偶联的第二适配体，其中第一适配体和第二适配体是分别与乳腺球蛋白mRNA的不同部位特异结合的适配体，而且第一适配体和第二适配体无互补核酸序列而且无相互杂交结合的潜在可能性；
(3)将步骤(1)中的偶联的适配体与待检测、鉴定和/或定量的样品混合及进行磁性分离，
(4)检测磁性分离产物。优选地，本发明第一个方面的方法中，其中步骤C3)为，将与磁性颗粒偶联的第一适配体、纳米金颗粒偶联的第二适配体同时与待检测、鉴定和/或定量的样品混合及进行磁性分离，
优选地，本发明第一个方面的方法中，其中步骤(3)为
①将磁性颗粒偶联的第一适配体与待检测、鉴定和/或定量的样品混合；
②进行磁性分离，收集磁力吸附所得的产物；和
③混合磁力吸附所得的产物和与纳米金颗粒偶联的第二适配体，然后进行磁性分离。优选地，本发明第一个方面的方法中，其中乳腺球蛋白是人乳腺球蛋白，优选其 mRNA 如 SEQ ID No. 1 所示。优选地，本发明第一个方面的方法中，其中第一适配体和第二适配体之一的结合部位位于人乳腺球蛋白mRNA的第1-30位上，而且第一适配体和第二适配体之另一的结合部位位于人乳腺球蛋白mRNA的第470-490位上。更优选，其中第一适配体与乳腺球蛋白 mRNA的同一性小于30%，而且第二适配体与乳腺球蛋白mRNA的同一性小于30%，最优选第一适配体如SEQ ID No. 2所示，是5，-aaggaagccgctgtc_ 3，，而且第二适配体如SEQ ID No. 3 所示，是5’-aataaacatgatagc- 3’。尤其是如本发明具体实施方式
所述的方法制备的与磁性颗粒偶联的第一适配体和与纳米金颗粒偶联的第二适配体。优选地，本发明第一个方面的方法中，其中第二适配体是用检测标记物标记的。其中，检测标记物是生物素Biotin、放射性同位素、金属标记物、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶、抗原或抗体、配体或受体中的一种或多种组合，最优选是生物素Biotin。优选地，本发明第一个方面的方法中，其中第二适配体是通过亲和素与链球菌亲和素-辣根过氧化酶包被的纳米金颗粒偶联的。优选地，本发明第一个方面的方法中，其中磁性分离产物是磁力吸附所得的产物。优选地，本发明第一个方面的方法中，其中磁性分离产物是经过洗涤的。优选地，本发明第一个方面的方法中，其中进行步骤(3)的温度为20-42°C，优选为 37°C。优选地，本发明第一个方面的方法中，其中步骤(3)的缓冲液为Tris-HCl、PBS或含Mg离子的PBS，优选为含Mg离子的PBS。在第二个方面，本发明提供了一种循环血中微量乳腺癌细胞的特异性检测方法的试剂盒，其包括与磁性颗粒偶联的第一适配体和与纳米金颗粒偶联的第二适配体，其中第一适配体与第二适配体是分别与乳腺球蛋白mRNA的不同部位特异结合的适配体，而且第一适配体与第二适配体无互补核酸序列而且无相互杂交结合的潜能。优选地，本发明第二个方面的试剂盒中，其中第一适配体和第二适配体之一的结合部位位于人乳腺球蛋白mRNA的第1-30位上，而且第一适配体和第二适配体之另一的结合部位位于人乳腺球蛋白mRNA的第470-490位上。优选地，本发明第二个方面的试剂盒中，其中第一适配体与乳腺球蛋白mRNA的同一性小于30%，而且第二适配体与乳腺球蛋白mRNA的同一性小于30%，最优选第一适配体如 SEQ ID No. 2 所示，是 5，-aaggaagccgctgtc- 3，，而且第二适配体如 SEQ ID No. 3 所示，是 5' —aataaacatgatagc— 3'0优选地，本发明第二个方面的试剂盒中，其中第二适配体是用检测标记物标记的。 其中，检测标记物是生物素、放射性同位素、金属标记物、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶、抗原或抗体、配体或受体中的一种或多种组合，最优选是生物素。优选地，本发明第二个方面的试剂盒中，其中第二适配体是通过生物素与链球菌亲和素-辣根过氧化酶包被的纳米金颗粒偶联的。优选地，本发明第二个方面的试剂盒中，还包括能检测检测标记物的试剂，如辣根过氧化物酶显色底物。优选地，本发明第二个方面的试剂盒中，其还包括缓冲液，优选缓冲液为 Tris-HCl、PBS或含Mg离子的PBS，更优选为含Mg离子的PBS。优选地，本发明第二个方面的试剂盒中，其还包括磁性分离装置。在第三个方面，本发明提供了本发明第二个方面的试剂盒在制备用于本发明第一个方面的方法的制品中的应用。在第四个方面，本发明提供了一种结合物，由与磁性颗粒偶联的第一适配体、与检测标记物偶联的第二适配体和乳腺球蛋白mRNA结合而成，其中第一适配体与第二适配体是分别与乳腺球蛋白mRNA的不同部位特异结合的适配体，而且第一适配体与第二适配体无互补核酸序列而且无相互杂交结合的潜能。优选其中，乳腺球蛋白是人乳腺球蛋白，更优选其mRNA如SEQ ID NO 1所示。优选地，本发明第四个方面的结合物中，其中第一适配体和第二适配体之一的结合部位位于人乳腺球蛋白mRNA的第1-30位上，而且第一适配体和第二适配体之另一的结合部位位于人乳腺球蛋白mRNA的第470-490位上。优选本发明第四个方面的结合物中，其中第一适配体与乳腺球蛋白mRNA的同一性小于30%，而且第二适配体与乳腺球蛋白mRNA的同一性小于30%，最优选第一适配体如 SEQ ID No. 2 所示，是 5，-aaggaagccgctgtc- 3，，而且第二适配体如 SEQ ID No. 3 所示，是 5' —aataaacatgatagc— 3'0优选地，本发明第四个方面的结合物中，其中第二适配体是用检测标记物标记的。优选地，本发明第四个方面的结合物中，其中检测标记物是生物素、放射性同位素、金属标记物、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶、抗原或抗体、配体或受体中的一种或多种组合，最优选是生物素。优选地，本发明第四个方面的结合物中，其中第二适配体是通过生物素与链球菌亲和素-辣根过氧化酶包被的纳米金颗粒偶联的。优选地，本发明第四个方面的结合物中，其能在20-42°C，优选为37°C的温度下结
I=I O在第五个方面，本发明提供了乳腺球蛋白mRNA适配体，其选自SEQ ID No. 2的5’-aaggaagccgctgtc-3 ‘禾口 SEQ ID No. 3 BfW 5' _ BBtBBBcatgBtBgc_3，。
在本文中，术语“检测”具有本领域技术人员所熟知的含义，包括鉴定目标产物的存在性和定量目标产物的数量。本发明的检测方法所得到的最终结果是乳腺球蛋白mRNA的存在性或数量。由于少数健康个体的乳腺中也存在少量乳腺球蛋白mRNA见(Watson and Fleming, 1996)，因此鉴定乳腺球蛋白mRNA无法直接得出是否患有乳腺肿瘤或者有乳腺肿瘤发生倾向的结果；由于本发明的实施者不一定是临床医师，因此并不清楚病人在被取 “样品”之前是否经过治疗以及治疗的程度，因此定量得到的乳腺球蛋白mRNA的数量无法直接得出是否患有乳腺肿瘤或者有乳腺肿瘤复发、转移发生倾向的结果。本发明的第一个方面的方法仅仅可以看作诊断过程中的一个中间步骤，得到的是“样品”中的乳腺球蛋白mRNA 结果而已，本身并不能直接得出是否患有乳腺肿瘤或者有乳腺肿瘤复发、转移发生倾向等诊断结果。另外，由于个体的遗传差异，造成每个病人个体的乳腺球蛋白mRNA水平有一定差异，另外病人的年龄、月经生理状态也可造成血中乳腺球蛋白mRNA水平的差异，如果要直接判断是否患有乳腺肿瘤或者有乳腺肿瘤复发、转移发生倾向等诊断结果，必须将本发明的第一个方面的方法得到的结果与相应的健康对照或个体在治疗前、后的血中乳腺球蛋白mRNA水平进行比较，并且由有经验的医师判断相应的个体是否足以扣除个体遗传、年龄、月经生理状态等因素对乳腺球蛋白mRNA的系统性影响，才能尝试得到诊断结果。因此，本发明的第一个方面的方法不包括与相应的健康对照及个体治疗前后进行比较的过程。即使根据本发明的具体实施方式
，不同病人个体的不同乳腺癌细胞系的乳腺球蛋白mRNA水平也存在着极大地差异，某些甚至与本底值相似，可以作为阴性对照，由此无法直接得出诊断结果。在本文中，术语“样品”指的是潜在可能含有乳腺球蛋白mRNA的离体循环血样品， 优选是来自人的样品。尽管用抽提出血总RNA的纯化样品也能够在本发明中使用，但是，本发明的样品优选是未经提纯的、含有血总RNA的裂解液体样品。本领域技术人员知晓将固体的有核血细胞裂解或抽提、纯化并保持其中mRNA成分不被降解的细胞分子生物学技术。 本发明的样品可以是经过处理的样品，如稀释处理、血细胞裂解处理以及PCR扩增等，也可以是未经处理的样品。经过处理的样品可以进一步纯化，以富集mRNA。因为对人体取样需要有资质的医师根据个体具体情况而定，所以本发明的第一个方面的方法不包括取样和任选的样品处理的过程，由于不清楚样品是否经过处理以及处理的程度，因此无法直接得出是否患有乳腺肿瘤或者有乳腺肿瘤复发、转移发生倾向等诊断结果。本发明的第一个方面的方法不包括取样和任选的样品处理的过程。在本专利申请中，乳腺球蛋白(简称为MAM)优选是人乳腺球蛋白，更优选是mRNA 如SEQ ID N0:1所示的人乳腺球蛋白cDNA序列。乳腺球蛋白仅仅在乳腺及乳癌细胞内表达，因此检测循环血中乳腺球蛋白mRNA可以用于判断所检测的样品是否存在乳腺及乳癌细胞。在本专利申请中，用于区别不同适配体的标号，即“第一”、“第二”等术语，仅仅用于代表不同的化学实体，并不限定这些化学实体的结构特征。这些术语在本文中区别的化学实体主要是适配体，如DNA适配体、RNA适配体或带有检测标记物和/或磁性颗粒的适配体等。在本文中，DNA和RNA用本领域技术人员所熟知的符号来表示其序列，如无特别说明， 序列表示的是从5’端至3’端方向的序列顺序。与磁性颗粒偶联的第一适配体和与检测纳米金颗粒偶联的第二适配体的摩尔比优选为0. 5^5 :1，最优选为1 :1。由于本发明中使用了两个适配体，这两个适配体必须结合到了同一靶分子上，才能得到检测结果，因而检测结果非常特异；如果俘获探针或磁性颗粒偶联的第一适配体和非特异靶分子结合，但与检测纳米金颗粒偶联的第二适配体同时结合该非特异靶分子可能性很小，因而在检测的时候仍可以消除非特异结合的影响。这样的适配体双保险，使得本发明的方法在检测乳腺球蛋白 mRNA时大大降低了假阳性的结果，提高了准确性。由于本发明中使用了与检测纳米金颗粒偶联的第二适配体，其中纳米金颗粒包被有多个链球菌亲和素-辣根过氧化酶分子，经与辣根过氧化物酶底物显色反应，可增强对乳腺球蛋白mRNA的检测灵敏度。本专利申请中的术语“适配体”是本领域技术人员所熟知的，指的是能够与特定的靶分子(乳腺球蛋白mRNA)结合的单链核酸，包括DNA或RNA。通过SELEX可以获得特定靶分子的适配体。由于本发明第一方面的方法中使用了两个适配体，为了使得到的适配体互不干扰，本发明人研究发现，第一适配体与第二适配体无互补核酸序列而且无相互杂交结合的潜能，例如第一适配体与第二适配体的同一性小于50%，优选小于40%，更优选小于30%。 由于靶分子(乳腺球蛋白mRNA)的化学分类也属于核酸，为了避免靶分子本身的干扰，本发明人研究发现，第一适配体与乳腺球蛋白mRNA的同一性小于30%，优选小于20%，更优选小于10% ；第二适配体与乳腺球蛋白mRNA的同一性小于30%，优选小于20%，更优选小于10%。
9其中，可以采用默认的BLAST算法来确定核酸序列之间的同一性，这对于本领域技术人员来说是熟知的。在本发明的具体实施方式
中，第一适配体是5’ - aaggaagccgctgtc-3’，而 ^Ι—χδΚΙΦ^ 5' - aataaacatgatagc-3' 在本专利申请中，方法步骤中的“无相互杂交结合的潜在可能性”是指详细分析第一、第二适配体核酸序列，显示二者之间无明显的核酸互补序列存在，混合后不会杂交形成稳定的适配体结合体，不会影响适配体与靶分子的结合。在本专利申请中，磁性颗粒优选是磁性纳米颗粒(简称为MNP)，即纳米级粒径的颗粒，其带有磁性，可以通过磁力分离装置分离。磁性颗粒包括磁性金属的纳米颗粒、量子点或纳米点等。所述颗粒优选是超顺磁性的，包括US6057107B、US6^8222B、US65M79;3B等记载的颗粒。优选选用可以通过商业渠道获得产品。在本发明中，优选第一适配体与磁性颗粒通过化学反应偶联。在本专利申请中，与检测纳米金颗粒偶联的第二适配体上的标记物是可以检测的物质，例如可以通过激光、放射性激发、化学发光(包括荧光)、电发光、电化学发光、酶催化显色或本领域技术人员已知的任何方法来实现。示例性的测标记物包括但不限于生物素、 放射性同位素、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶、抗原或抗体、配体或受体中的一种或多种组合。放射性同位素的合适的例子有32P、125I、35S、M等。通过化学合成、PCR、缺口平移等常规方法，能够制备出放射性标记的第二单链核酸。化学发光基团有鲁米诺等； 化学荧光基团包括罗丹明、FITC、TRITC等。将生物素(Biotin)标记到第二单链核酸上是通过常规的化学合成方法进行的，上述带有生物素标记物的单链核酸及其制备和检测方法是公知的，可参见(Tabor and Boyle, 2001)综述。通过化学合成方法，可以将链球菌亲和素-辣根过氧化酶分子包被在纳米金颗粒上，其方法可参见(Long and Keating, 2006， Mayer et al.，2000, Tang et al.，2008)等文献。上述带有生物素标记物的单链核酸与链球菌亲和素-辣根过氧化酶包被的纳米金颗粒可以特异、高亲和性地结合，而形成具有检测功能的第二适配体复合物。目前已经有大量的商品化的辣根过氧化酶检测试剂盒可供使用，如 Sigma-Aldrich 公司出售的 Mi^ptavidin Peroxidase，Pierces (USA)公司出售的 Supersignal West Pico Horseradish Peroxidase (HRP) Detection 试剂盒等。在本发明的具体实施方式
中，利用纳米金颗粒能结合较多酶分子的性质，检测标记物采用纳米金颗粒和辣根过氧化物酶的偶联产物，大大增强了对乳腺球蛋白mRNA的检测灵敏度。在本专利申请中，磁性分离产物是磁力吸附所得的产物，也可以是未被磁力吸附的产物，但是优选是磁力吸附所得的产物。能够被磁力吸附并被检测得到的产物必然是结合了第一和第二适配体的产物。通过磁力分离装置，能够被磁力所吸附的物质可以附着在试管壁上，而未被磁力所吸附的物质则仍旧留存于溶液中，当吸取溶液后，这两种物质就可以被分开，从而达到分离的目的。在理论上，磁力吸附所得的产物与未被磁力吸附的产物中检测标记物的总合等于混合初始加入的俘获探针或与磁性颗粒偶联的第一适配体的量，两者可以根据混合初始加入的检测标记物的量来换算。优选在磁性分离的步骤中，最后洗涤磁性分离产物，即磁性分离产物是经过洗涤的。本发明的结合物能在20-42°C的温度下孵育结合而不分离，优选在37°C的温度下孵育，这一温度通常是为了避免适配体与非特异靶分子杂交而采用的杂交温度；为方便操作的进行，容许试验环境的温度有1_2°C的偏差，但须在小于45°C的温度下进行，优选在37°C的温度下进行。如超过此温度，如50°C，可能导致适配体与特异靶分子结合，从而降低检测的灵敏度。在本文中，如未加说明，混合指的是混合的动作以及混合后放置(孵育)的过程。本发明的方法操作时间短。其中最占时间的混合步骤中放置的时间小于60分钟， 优选30-45分钟，如30、35、40分钟。
相比于现有技术中的解决方案，本发明的有益效果是
1、操作简单，检测时间短。由于本发明的方法实际上只需要将试剂和带检测的样品简单混合放置后用磁力分离器吸附并检测，除去检测步骤，其他步骤操作简单、方便，耗时短， 尤其相对于常规RT-PCR检测MAM mRNA来说，时间短得多。无需复杂仪器及特别技巧，尤其是该方法可以利用未经精度提纯的待测样品直接检测这样极大地方便了检测操作，节省了试剂使用并加快了检测进程，可以推广进行实际的产业应用。2、特异性强、重复性好、准确率高，有效减少了假阳性结果。由于本发明是用两个互不干扰的适配体，采用双保险，因而能保持结果的正确，大大降低了假阳性结果出现的几率，使得本发明适宜实际推广。本发明的方法可以利用未经精度提纯的待测样品直接检测而仍旧能保持实用的灵敏度和特异性，不会出现适配体与靶分子(MAM mRNA)和其他非特异核酸序列互相干扰的情况。3、相对较高的检测灵敏度，与常规的RT-PCR检测MAM mRNA相当。4、商品化容易，检测成本低。由于试剂本身可以通过已经商业化的方法来制备，而且检测中所需的仪器也可以购买得到，因此可以快速在大、中、小型医院、甚至诊所普及应用；其中所使用的仪器包括磁力分离装置，较之常规RT-PCR检测中使用的PCR仪便宜得多， 因而易商业化推广。5、产品质量稳定，储存条件要求不高。适配体比蛋白抗体更稳定，不易变性，容易长时间保存，这造成产品的有效期将大大延长。6、成本低，由于适配体可大量化学合成，因而产品生产成本较抗体检测方法或 RT-PCR方法可以大幅降低。
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述
图1显示了不同浓度的与磁性颗粒偶联的第一适配体对显色反应强度的影响。图2显示了不同加入量的与纳米金颗粒偶联的第二适配体对显色反应强度的影响。图3显示了不同实验孵育温度对显色反应强度的影响。图4显示了不同实验缓冲液对显色反应强度的影响。图5显示了本发明的方法检测按比例稀释的MDA-MB361/231细胞总RNA中的MAM mRNA的结果。
具体实施例方式为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。以下将以举例形式进行说明，如有未详尽之处，可以参见常用的实验手册，如《分子克隆实验手册》以及所用试剂和仪器的厂商说明书。其中，所有化学试剂均采用分析级， 实验用水经Milli-XQ过滤，各试剂均和材料可以商用渠道获得，具体而言具有羧基末端的磁性小体(1.5 μΜ, 20 mg/mL)购自Polysciences公司(美国)；1_乙基-3_(3_ 二甲基氨丙基)碳二亚胺(简称为EDC)购自Alfa Aesar公司(美国)；纳米金颗粒(粒径为5nm，IOnm, 30nm和50nm)、链球菌亲和素(str印tavidin)包被的金纳米颗粒(粒径为 IOnm和40nm)均购自BB International (美国)；小牛血清蛋白、链球菌亲和素-辣根过氧化酶(SM38)购自Sigma-Aldrich (美国)；辣根过氧化酶底物试剂盒购自Millipore Corporation (美国);核酸引物、第一适配体及生物素化第二适配体委托Sigma-Aldrich公司(USA)合成,其序列如下5，- aaggaagccgctgtc-3，禾口 5，- aataaacatgatagc-3，；人乳腺癌细胞系MDA-MB361 (MAM mRNA表达阳性)和MDA-MB231 (MAM mRNA表达阴性)，均可购自美国典型微生物保藏中心(ATCC)，培养其的培养基均为添加10%胎牛血清牛血清(Gibco 公司)、L-谷氨酸(Gibco公司)、50 U / ml的青霉素和5微克/毫升链霉素(Gibco公司) 的Dulbecco改良fegle的培养基(DMEM培养基；Sigma - Aldrich公司)；细胞总RNA提取试剂为TRIzoI试剂，RT-PCR反应相关试剂购自(Gibco公司，美国)。
实施例1检测用MAM mRNA样品及其对照的制备
体外培养MDA-MB361细胞，贴壁细胞经胰酶消化使细胞悬浮，离心去培养液，再加入生理盐水，制备单细胞悬液，经细胞计数取一定量细胞(107)进行实验。根据厂商说明，用细胞总RNA提取试剂提取MDA-MB361细胞用细胞总RNA (MAM mRNA表达阳性)，测量260和 280纳米处光密度(OD值)以定量总RNA的量。然后将总RNA用TE缓冲液(pH7. 2)进行梯度稀释，各稀释度的溶液等体积中分别包含来自相当于IO5 (A组)、104 (B组)、103 (C组)、 IO2 (D组)和IO1 (E组)个MDA-MB361乳腺癌细胞的总RNA量。依照上述方法，提取MAM mRNA表达阴性的MDA-MB231细胞的总RNA，经稀释后各稀释度的溶液等体积中分别包含来自相当于IO5 (A。组)、104 (B0组)、103 (Cc^i)UO2 (Dtl组) 和IO1 (E0组)个MDA-MB231乳腺癌细胞的总RNA量。
实施例2适配体的合成与制备
取12微升具有羧基末端的磁性小体溶液置于1. 5ml离心管中，用0. IM咪唑缓冲液洗涤三次(每次加入150微升0. IM咪唑缓冲液(ρΗ7. 0)混合均勻后离心，弃上清)，加入300微升含0. 03M EDC的0. IM咪唑缓冲液(pH7. 0)，缓慢摇动离心管20分钟，然后再将12 pmol 的第一适配体(5’ - aaggaagccgctgtc-3’)加入，混合37 °C孵育1小时，期间连续缓慢摇动离心管。将离心管置于磁性分离器上施加磁力，吸干上清液并用洗涤溶液洗涤三次(每次加入300微升洗涤溶液(含IOOmM NaCl的PBS溶液，pH7. 2)并吸干)，用以除去未结合的游离的第一适配体，然后加入240微升溶解液(20mM Tris-HCl, pH8. 0,0. 5 M NaCl)将其溶解。由此制得与磁性颗粒偶联的第一适配体。取40nm粒径的纳米金颗粒溶液(pH8. 2，9xl010颗粒/ml，8微升纳米金溶液大约1. 5 pmol)与3微升链球菌亲和素-辣根过氧化酶(lmg/ml)混勻，加水至100微升，室温静置2小时后，加22微升5% (g/v) PEG20000,经9000 χ g离心45分钟将链球菌亲和素-辣根过氧化酶标记的纳米金颗粒沉淀，用Iml PBS (pH7. 2)再悬浮、洗涤后，再离心沉淀，反复三次，融于10微升PBS中。取足量(10微升，2 pmol)的生物素标记的第二适配体 (5，- aataaacatgatagc-3，)与之混合，40°C孵育M小时，然后加入Iml PBS，以沘00 χ g 离心45分钟，吸干上清液以去除未结合的游离的第二适配体，然后加入600微升溶液(45 mmol NaCl,30%蔗糖、0. 25%Tween_20、0. 25%SDS)将红色的沉淀溶解，由此制得与纳米金颗粒偶联的第二适配体。
实施例3第一适配体和第二适配体浓度的确定
在一系列反应试管中，加入已知含有靶分子(MAM mRNA)的MDA-MB361细胞总RNA(1微克)，同根据实施例2制备的与磁性颗粒偶联的第一适配体(2-20微升，1-10 pmol)混合，加入PBS (0. 1M，pH7. 2)至100微升，于37° C孵育60分钟；然后将试管置于磁性分离器上施加磁力，吸干上清液并用洗涤溶液洗涤三次(每次加入300微升洗涤溶液(含IOOmM NaCl 的PBS溶液，pH7. 2)并吸干)，加入95微升PBS缓冲液、混勻，再加入5微升根据实施例2制备的与纳米金颗粒偶联的第二适配体，于37° C温孵育60分钟，然后将试管置于磁性分离器上施加磁力，吸干上清液，并用如上述洗涤溶液洗涤三次。然后根据厂商说明，加入辣根过氧化酶底物试剂盒的反应底物溶液并测量显色反应强度(测定450nm处吸收光谱)。结果如图1所示，当与磁性颗粒偶联的第一适配体的(终)浓度取1 pmol时，显色反应强度最高，因此确定与磁性颗粒偶联的第一适配体的最适(终)浓度为1 pmol。同样，在一系列反应试管中加入已知含有靶分子(MAM mRNA)的MDA-MB361细胞总 RNA (1微克)，同2微升根据实施例2制备的与磁性颗粒偶联的第一适配体(lpmol )，加入 PBS (0.1 Μ, pH 7. 2)100微升，再分别加入不同量的根据实施例2制备的与纳米金颗粒偶联的第二适配体1- 9微升，于37°C孵育60分钟，然后将试管置于磁性分离器上施加磁力， 吸干上清液。然后根据厂商说明，加入辣根过氧化酶底物试剂盒的反应底物溶液并测量显色反应强度(测定450nm处吸收光谱)。结果如图2所示，当与纳米金颗粒偶联的第二适配体取5微升时，显色反应强度最高，因此确定与纳米金颗粒偶联的第二适配体的最适加入剂量为5微升。
实施例4实验温度和缓冲体系的确定
根据实施例3确定的浓度，对实验的温度进行了测试。实验是根据实施例3确定的方法进行的，唯一不同的是，在22 - 52°C，每间隔5°C进行。实验结果显示，在有靶分子的情况下(如图3所示)，在22 - 37°C间显色反应强度值逐渐增加，直至加温到37°C达最高值，随后进入平台期(略有下降)，在加温到42°C时开始急剧下降；在没有靶分子的情况下(结果未显示)，在22 - 42°C间结合反应强度值一直维持在低水平几乎没有可检测到的峰值。因而确定实验温度以37° C为最佳温度。取根据实施例3确定的浓度以及上述反应温度，对实验的缓冲体系进行了测试，唯一不同的是，分别用三种缓冲液进行实验测试TE (TriS-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7.5)，PBS (0.1 Μ, pH 7. 2)和含 0.001 M MgCl2 的 PBS。结果如图 4 所示，使用含 MgCl2 的PBS时，显色反应强度最高，因此确定实验的缓冲体系以含0.001 M Mg2+的PBS为最佳缓冲液。
实施例5检测样品中乳腺球蛋白mRNA的浓度
根据实施例3-4确定的条件，对实施例1制备的已知含有靶分子(MAM mRNA)的 MDA-MB361细胞总RNA (A、B、C、D、E组稀释液)和表达靶分子(MAM mRNA)阴性的MDA-MB231 细胞总RNA (&▲、(；、％、&组稀释液)，分别进行上述实验检测(即把上述实验的总RNA (1 微克)替换为这些稀释液)，根据显色反应的强弱来判断靶RNA分子的存在性。结果如图5所示，表达靶分子(MAM mRNA)阴性的MDA-MB231细胞总RNA的检测结果很极底，可以作为阴性对照使用，将其检测线作为检测的标准基线(高于此线为检测结果阳性)；而在对MDA-MB361系列稀释RNA样品的三次重复检测中，即使最低的稀释度的样品检测值也显著大于最高稀释度的阴性对照的结果，即均可在1 :105及其以上的稀释液中检测出MAM mRNA，其灵敏度至少可达到十万分之一级别的稀释度。我们另行测试了 1 :106稀释液，发现比较难以区分。
比较例1与用RT-PCR检测乳腺球蛋白(mammaglobin，MAM) mRNA的方法的比较按照常规RT-PCR检测方法进行，其包括取总RNA、3 μ g核糖核酸随机六聚体和DEPC 水，总体积为20 μ 1，72° C加热10分钟；加入逆转录混合物(含有4μ 1的5 X cDNA反转录缓冲液-250 mM Tris-HCl pH值 8. 3，氯化钾 375mmol，15mmol 氯化镁，IOpmol 的 dNTPs， 20 U的RNAase抑制剂和200U逆转录酶(Gibco公司)。最后的混合物在37° C孵育1. 5 h后，95° C 5分钟灭活。然后进行巢式PCR反应，该PCR反应分两步进行。第一步反应总体积为 25 微升，含 2. 5μ lcDNA、5y L IX PCR 缓冲液(200 mM Tris - HCl pH {t 8. 4, 氯化钾 500mM，2mmol 氯化镁、600 nM 引物、200 uMdNTPs、Taq 酶 1 U (Gibco 公司)。PCR 反应条件设置如下在94° Cl分钟；25个周期扩增(94° 045秒，581 60秒和72° C 30 秒)，在 72° C 延伸 10 分钟；MAM外引物序列为5' -cagcggcttccttgatccttg-3 ‘， 5 ‘ -tagcaggtttcaacaattgtc-3 ‘；第二步取5微升PCR产物作模板，定量PCR再经如上同样的PCR反应扩增25个周期，其内引物序列为5' -agcactgctacgcaggctct-3 ‘， 5' -ataagaaagagaaggtgtgg-3‘，在所有定量PCR反应中均有相应看家基因(GAPDH)同时扩增以对cDNA的质量进行评估。PCR反应完成后，经溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳证实， PCR扩增的特异性产物为2(^bp，可用于检测MAM mRNA。A、B、C、D、E这些样品的RT-PCR定量的荧光信号，经三次重复实验RT-PCR的方法可100%地在1 IO5稀释液中检测出MAM mRNA, 其灵敏度也达到了十万分之一；但是我们对1 :106稀释液进行了重复实验，但其中只有50% 的RT-PCR实验可检测出MAM mRNA,也难以准确分辨1 :106稀释液中的MAM mRNA。这表明，本发明的方法可以有效地替代昂贵和操作复杂的RT-PCR检测，而检测灵敏度基本相当。上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.循环血中微量乳腺癌细胞的特异性检测方法，其步骤包括，(1)从乳腺细胞，包括癌细胞和正常细胞中提取乳腺球蛋白mRNA；(2)准备与磁性颗粒偶联的第一适配体和与纳米金颗粒偶联的第二适配体，其中第一适配体和第二适配体是分别与乳腺球蛋白mRNA的不同部位特异结合的适配体，而且第一适配体和第二适配体无互补核酸序列而且无相互杂交结合的潜在可能性；(3)将步骤(1)中的偶联的适配体与待检测、鉴定和/或定量的样品混合及进行磁性分1 ，(4)检测磁性分离产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(3)为将与磁性颗粒偶联的第一适配体、纳米金颗粒偶联的第二适配体同时与待检测、鉴定和/或定量的样品混合及进行磁性分离。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤( 为①将磁性颗粒偶联的第一适配体与待检测、鉴定和/或定量的样品混合；②进行磁性分离，收集磁力吸附所得的产物；和③混合磁力吸附所得的产物和与纳米金颗粒偶联的第二适配体，然后进行磁性分离。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中乳腺球蛋白是人乳腺球蛋白，其mRNA优选如SEQ ID No. :1所示。
5.根据权利要求4所述的方法，其中第一适配体和第二适配体之一的结合部位位于人乳腺球蛋白mRNA的第1-30位上，而且第一适配体和第二适配体之另一的结合部位位于人乳腺球蛋白mRNA的第470-490位上。
6.根据权利要求5所述的方法，其中第一适配体与乳腺球蛋白mRNA的同一性小于30%，而且第二适配体与乳腺球蛋白mRNA的同一性小于30%，最优选第一适配体如SEQ ID No. 2 所示，是 5，-aaggaagccgctgtc- 3，，而且第二适配体如 SEQ ID No. 3 所示，是 5' —aataaacatgatagc— 3'0
7.根据权利要求1、2、3、5或6任一项所述的方法，其中第二适配体是用检测标记物标记的，如生物素、放射性同位素、金属标记物、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶、 抗原或抗体、配体或受体中的一种或多种组合。
8.根据权利要求7所述的方法，其中检测标记物是生物素。
9.根据权利要求8所述的方法，其中第二适配体是通过生物素与链球菌亲和素-辣根过氧化酶包被的纳米金颗粒偶联。
10.根据权利要求1_3、5、6、8、9任一项所述的方法，其中磁性分离产物是磁力吸附所得的产物。
11.根据权利要求1-3、5、6、8、9任一项所述的方法，其中磁性分离产物是经过洗涤的。
12.根据权利要求1_3、5、6、8、9任一项所述的方法，其中进行步骤(3)的温度为 20-42 0C ο
13.根据权利要求12所述的方法，其中进行步骤(3)的温度优选为37°C。
14.根据权利要求1-3、5、6、8、9任一项所述的方法，其中步骤(3)的缓冲液为 Tris-HCl.PBS 或含 Mg 离子的 PBS。
15.循环血中微量乳腺癌细胞的特异性检测试剂盒，其包括与磁性颗粒偶联的第一适配体和与纳米金颗粒偶联的第二适配体，其中第一适配体与第二适配体是分别与乳腺球蛋白mRNA的不同部位特异结合的适配体，而且第一适配体与第二适配体无互补核酸序列而且无相互杂交结合的潜能。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中第一适配体和第二适配体之一的结合部位位于人乳腺球蛋白mRNA的第1-30位上，而且第一适配体和第二适配体之另一的结合部位位于人乳腺球蛋白mRNA的第470-490位上。
17.根据权利要求15所述的试剂盒，其中第一适配体与乳腺球蛋白mRNA的同一性小于30%，而且第二适配体与乳腺球蛋白mRNA的同一性小于30%，最优选第一适配体如SEQ ID No. 2 所示，是 5，-aaggaagccgctgtc- 3，，而且第二适配体如 SEQ ID No. 3 所示，是 5' —aataaacatgatagc— 3'0
18.权利要求15-17任一项所述的试剂盒，其中第二适配体是用检测标记物标记的。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中检测标记物是生物素、放射性同位素、金属标记物、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶、抗原或抗体、配体或受体中的一种或多种组合。
20.根据权利要求18所述的试剂盒，其中第二适配体是通过生物素与链球菌亲和素-辣根过氧化酶包被的纳米金颗粒偶联。
21.根据权利要求19-20任一项所述的试剂盒，其还包括能检测检测标记物的试剂。
22.根据权利要求19-20任一项所述的试剂盒，其还包括缓冲液，优选缓冲液为 Tris-HCl.PBS 或含 Mg 离子的 PBS。
23.根据权利要求15-17、19、20任一项所述的试剂盒，其还包括磁性分离装置。
24.根据权利要求15-17、19、20任一项所述的试剂盒在制备用于权利要求1所述方法的制品中的应用。
25.—种结合物，其由与磁性颗粒偶联的第一适配体、与检测标记物偶联的第二适配体和乳腺球蛋白mRNA结合而成，其中第一适配体与第二适配体是分别与乳腺球蛋白mRNA的不同部位特异结合的适配体，而且第一适配体与第二适配体无互补核酸序列而且无相互杂交结合的潜能。
26.根据权利要求25所述的结合物，其中乳腺球蛋白是人乳腺球蛋白，优选其mRNA如 SEQ ID NO 1 所示。
27.根据权利要求25J6任一项所述的结合物，其中第一适配体和第二适配体之一的结合部位位于人乳腺球蛋白mRNA的第1-30位上，而且第一适配体和第二适配体之另一的结合部位位于人乳腺球蛋白mRNA的第470-490位上。
28.根据权利要求27所述的结合物，其中第一适配体与乳腺球蛋白mRNA的同一性小于30%，而且第二适配体与乳腺球蛋白mRNA的同一性小于30%，最优选第一适配体如SEQ ID No. 2 所示，是 5，-aaggaagccgctgtc- 3，，而且第二适配体如 SEQ ID No. 3 所示，是 5' -aataaacatgatagc- 3'0
29.根据权利要求25J6任一项所述的结合物，其中第二适配体是用检测标记物标记的。
30.根据权利要求四所述的结合物，其中检测标记物是生物素(Biotin)、放射性同位素、金属标记物、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶、抗原或抗体、配体或受体中的一种或多种组合。
31.根据权利要求25、26、观任一项所述的结合物，其中第二适配体是通过生物素与链球菌亲和素-辣根过氧化酶包被的纳米金颗粒偶联。
32.根据权利要求2546任一项所述的结合物，能在20-42°C的温度下结合。
33.一种乳腺球蛋白mRNA的适配体，其选自SEQ ID No. 2的5’ - aaggaagccgctgtc-3'禾口如 SEQ ID No. 3 的 5' - aataaacatgatagc- 3'。
全文摘要
本发明提供了循环血中微量乳腺癌细胞的特异性检测方法，将与磁性颗粒偶联的第一适配体和与纳米金颗粒偶联的第二适配体，分别或同时与待测样品混合后来检测、鉴定和/或定量靶分子。另外，本发明还涉及用于该方法的待检血样预处理试剂、中间产物、检测试剂盒等。该方法使用简便、灵敏、特异性强、重复性好、出结果快捷、无需复杂仪器及特别技巧，尤其是该方法可以利用未经精度提纯的待测样品直接检测而仍旧能保持实用的灵敏度和特异性，这样极大地方便了检测操作，节省了试剂使用并加快了检测进程，可以推广进行实际的产业应用。
文档编号C12Q1/68GK102296119SQ20111026490
公开日2011年12月28日 申请日期2011年9月8日 优先权日2011年9月8日
发明者李为, 游绍进 申请人:苏州友林生物科技有限公司