专利名称：用慢病毒检测hiv耐药表型的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种慢病毒载体系统的构建、慢病毒颗粒的制备及检测Hiv耐药表型的方法。
背景技术：
艾滋病是全球和我国的重要传染病之一，截止到2009年底，全球有3330多万艾滋病感染者，且以每天14000例新发感染者数量迅速增加。截至2009年10月，我国累计报告艾滋病病例319877例，其中包括102323艾滋病人，死亡49845例。而据2010年卫生部等单位对中国艾滋病疫情的估计，中国现存艾滋病病毒感染者和病人约74万，其中，艾滋病病
人为10. 5万人；估计2010年当年新发艾滋病病毒感染者4. 8万人。随着艾滋病流行的快速增长及每年新发感染者人数的不断上升，国家不断加大防治力度，每年在治病人数也在逐年递增，同时由于治疗引起的耐药情况也随即出现并开始成为普遍关注的问题。由于国外大量研究发现尽早开始治疗可延长感染者向病人发展的时间从而延长患者生命，不少国家已经将提供艾滋病治疗的入选标准降低，我国也将免费治疗指标从原来的CD4 < 200拷贝/mL改成了⑶4 < 350拷贝/mL的国际推荐标准，最近还在酝酿进一步调整为⑶4 < 500拷贝/mL。大量增加的治疗病人引发的耐药，以及治疗病人耐药毒株的进一步传播导致的原发耐药，成为艾滋病防治领域不得不面临和必须重视的问题，艾滋病病毒耐药性也逐渐成为威胁中国乃至全世界对抗艾滋病病毒的主要因素。目前，全世界流行的艾滋病病毒主要为HIV-I型，HIV-I分为M、O、N三组，其中HIV-IM组又是全球主要流行株。由于HIV-I的高度变异性，其在全世界、各地区及在不同个体间存在广泛的遗传学差异，根据病毒基因变异度，全世界流行的HIV-IM组至少可以为9个亚型(A、B、C、D、F、G、H、J、K)和 14 个重组流行株(Circulating recombinants forms,CRFs)，不同亚型间，HIV-I膜蛋白基因(env)的核苷酸差异约为20%-30%，聚合酶基因(pol)约为15%，pol基因的逆转录酶(RT)和蛋白酶(PI)编码区在不同亚型间的核苷酸差异约为10%-12%，氨基酸序列差异约为5% -6%。RT和PI蛋白中氨基酸残基的变化和差异将导致氨基酸替换和RT、PI蛋白的某些结构域局部立体构像的改变，由于RT和PI是目前几乎所有艾滋病抗病毒药物(逆转酶抑制剂和蛋白酶抑制剂)的靶基因，RT和PI基因核苷酸变化和其编码的氨基酸残基替换，以及由此可能导致的空间立体构像变化，是抗病毒治疗应答差异、临床治疗失败和耐药性产生的主要原因。西欧、美国、澳大利亚等工业化国家中，90 %以上的艾滋病患者中的流行感染毒株为HIV-IB亚型，其他亚型和重组流行株相对少见，与此相反，目前在我国流行的HIV-I毒株绝大多数系非 HIV-IB 亚型，以 HIV-1B’ (泰国 B)、CRF01_AE、CRF07/08_BC、HIV_1C 等为主，HIV-IB (欧美B)流行株并不常见。深圳的流行株以CRFO 1_AE (约占50 % )，CRF07_BC (35 % )和B亚型(15%)为主，其它亚型偶有发现。迄今为止，美国FDA批准生产上市的18种针对RT和PI的抗艾滋病病毒药物，全部是根据在欧美国家流行的HIV-IB亚型毒株设计研制出来，并据此分析艾滋病患者的药物敏感度、耐受性产生、基因型变化等；而非B亚型因其RT、PI基因的核苷酸和氨基酸序列与B亚型存在差别，亦将影响药物治疗敏感性和耐受性形成等，但相关数据尚不充分.我国由于出现耐药主要集中在90年代经输献血感染并接受早期抗病毒治疗的人群，而这一类人群主要感染亚型是B亚型，所以，国内的耐药研究也主要针对B亚型进行。近年来，随着其它亚型毒株流行的逐渐扩张，非B亚型毒株耐药相关研究开始成为大家关注的热点。因此，识别分析非HIV-IB亚型相关的药物耐受性突变，对于监测药物抗性株的进化和传播、确定艾滋病人抗病毒治疗策略和调整治疗方案，以及防止耐药性突变株的流行等具有十分重要的意义。随着我国艾滋病流行形势的日趋严峻，艾滋病病人逐年增多，2004年我国制定了针对艾滋病人“四免一关怀”政策，同时药物的国产化，使得大部分艾滋病患者(非HIV-IB亚型)获得临床治疗成为现实，另一方面，由于国内有经验的艾滋病临床专业技术人员(特 别是农村地区)匮乏可能导致不规范治疗，以及随着治疗时间的延长等原因，艾滋病病毒耐受性突变将不可避免地出现，并将成为我国艾滋病防治工作中必须面临的新的重要问题。然而，迄今为止，我国HI V-I主要流行亚型的RT和PI基因耐药性突变模型的本底资料仍不清楚，抗病毒治疗后耐药性突变位点特征和出现频率不明，RT和PI耐药性突变的亚型特异性数据不详，因此，相关研究是我国艾滋病预防控制、防止耐药性突变株传播和指导临床抗病毒治疗工作中迫切需要解决的关键技术。随着HAART治疗的广泛开展，病毒变异和耐药株将会不断出现，甚至对一个药物的耐药可引起多种药物的交叉耐药，因此近年来各国相继建立起病毒变异和耐药的检测方法，目前常用的方法包括HIV基因型耐药检测，表型耐药检测和虚拟表型耐药检测。
①HIV-I耐药基因型检测法为基于对耐药相关基因突变的检测，有助于预测某些药物的治疗效果。通过从病人血液标本中分离到的HIV基因物质，应用核酸酸序列分析或杂交技术以确定病毒变异的位点，并可参考已有数据库按不同亚型进行比较。在确认变异后，与既往耐药或交叉耐药研究比较，间接地估计药物耐药情况。此法简单快速，费用低。缺点是能确认所分离到的基因变异，但无法指出药物耐药的程度，更不能解释某些耐药突变之间的相关性，如各突变之间是否有协同或者抵抗作用；同时，严重依赖于国外相关数据库，而如前文所述，由于国内外流行毒株、治疗方案多有不同，数据库信息并不完全匹配，且对于一些新靶点治疗药物(如整合酶抑制剂)，信息收集常常不全，也不能进行检测；
②HIV-I耐药表型检测包括传统的共培养方法和重组病毒表型检测方法,是基于体外培养技术，通过检测抑制病毒生长所需的药物浓度(IC5tl或IC9tl)，并与参考株进行比较，判定病毒对药物的敏感程度。此法能直接测出感染毒株对药物的敏感度，并能揭示事先存在或交叉的耐药情况，有利于指导HIV-I感染者有效地用药。目前商业上使用的检测主要有 3 种AntivirogramTM(Tibotec-Virco), Pheno Sense TM(Monogram Biosciences)和Phenoscript (Viralliance).这些方法均是基于将逆转录-PCR扩增的患者HIV-I蛋白酶(PR)和逆转录酶(RT)区基因插入载体中，通过产生的重组病毒进行表型耐药检测。其最大优点是可以获得各种药物耐药量度数据，不足之处为试验慢且费用昂贵(收费在1000美金以上)，技术要求高，多种影响因素导致重复性差，多需在P3级生物安全实验室中进行。因此，其在临床上的应用受到限制。③虚拟表型分析指从一个包含基因型、表型和临床信息的庞大数据库找到与临床样本关连的数据，从而确定其表型的方法。其前提是建立包含相互关联的临床资料、基因型和表型耐药信息的HIV耐药变异数据库。当向数据库提交一待分析序列时，数据库会查找与该序列最匹配的HIV序列，根据其匹配序列的临床以及耐药检测情况来推断待分析序列耐药变异情况。虚拟表型是体外表型分析的一个辅助工具，而不能成为它的替代品。国外多个专家小组推荐对所有抗病毒治疗失败的患者在确定新的治疗方案前进行耐药检测，表型耐药检测临床上主要针对两类人群开展，一类是出现临床治疗失败(即病毒未抑制)，而通过耐药基因型检测未发现耐药位点的治疗病人。可以直接定量分析出病人对哪些药物敏感，哪些药物耐受，并进一步研究新的耐药突变位点和多位点的协同作用，分析耐药产生的机制。另一类是出现临床治疗失败而通过耐药基因型检测对所有药物均耐药的病人。进行表型耐药检测可定量分析病人对各种治疗药物的耐受程度，帮助他们筛选相对敏感的药物确定合适治疗组方以延续生命。此外，表型检测还可以应用于新药开发的临床耐药试验，检测接受新型药物治疗产生耐药的病人，发现相应药物的耐药突变位点。
发明内容
本发明拟采用一种新的高效低毒慢病毒载体系统，建立检测HIV表型检测方法。 如上所述的慢病毒载体系统，其特征是装载有患者感染的HIV-I病毒Pol基因区和EGFP或者荧光素酶。如上所述的慢病毒载体系统，其特征是以EGFP或者荧光素酶作为报告基团。如上所述的慢病毒载体系统，其特征是在体外包装成具有单次感染能力的假病毒。如上所述的慢病毒载体系统，其特征是具有单次感染能力。如上所述的慢病毒载体系统，其特征是5 ’ LTR的U3区被RSV的enhancer/promoter取代,使载体的复制不再依赖Tat。如上所述的慢病毒载体系统，其特征是3’ LTR的U3增强子区缺失，使其不再有启动/增强活性，成为自灭活(self-inactivating，SIN)载体。如上所述的慢病毒载体系统，其特征是不具有复制能力，即该病毒基因组整合到细胞基因组后，不会产生新的子代病毒，也降低了对周围基因的意外激活，因此具有很好的安全性。如上所述的慢病毒载体系统，其特征是病毒的env基因被来自水泡口炎病毒(Vesicular StomatitisVirus)的VSV-G代替，使病毒能感染更多种细胞(包括分裂和非分裂细胞)，且病毒更趋稳定；如上所述的慢病毒载体系统，其特征是HIV-I的所有辅助蛋白和调节蛋白基因(tat, vrf, vpr, vpu and nef等)均被删除,从载体基因组中缺失。如上所述的慢病毒载体系统，其特征是3个蛋白Gag/MCS、Rev、VSV-G (代替HIV-1的Env)分别独立放置在3个质粒上(pGag/Pol、pRev、pVSV_G)，且互相之间没有任何同源序列(见附
图1)，大大降低了复制型慢病毒(RCL)产生的几率。如上所述的慢病毒载体系统，其特征是pGag/Pol质粒上具有多克隆酶切位点(MCS)，并且其读码框与gag —致。如上所述的慢病毒载体系统,其特征是报告基因EGFP或者Luc位于质粒pLentiEGFP/Luc上(如附图I所示)，且由SV40启动子控制报告基因EGFP或者Luc。如上所述的慢病毒载体系统，其特征是包装好的假病毒结构如附图2所示。如上所述的检测方法，其基本步骤是将HIV-I的pol基因区插入到慢病毒载体中，再将慢病毒载体感染细 胞，在细胞内完成慢病毒的包装工作，收集细胞上清，浓缩、纯化得到高浓度的慢病毒颗粒，最后用所得慢病毒颗粒感染细胞，测定耐药性。如上所述的检测方法，其特征是采用RT-PCR技术扩增HIV-I的pol基因区，目的基因片断覆盖蛋白酶区4-99位氨基酸和逆转录酶区38-320位氨基酸的基因区域。如上所述的检测方法，其特征是将RT-PCR扩增所得片段插入到慢病毒载体pGap的MCS位置。此法能直接测出感染毒株对药物的敏感度，并能揭示事先存在或交叉的耐药情况，有利于指导HIV-I感染者有效地用药。本方法简便易行，费用也较低，具有良好的应用前景。下面结合附图对本发明做进一步说明。图I是四个质粒图谱 图2是假病毒结构图
具体实施例方式尽管本发明的内容是结合本实例进行说明，但是不能认为是对本发明专利的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样属本发明的保护范围。实施例I逆转录PCR(RT-PCR)扩增HIV-1的pol基因区，并测序
I)病毒RNA提取试剂盒提取待检HIV样本病毒RNA ；2) RT-PCR 扩增扩增体系
剂名称体积(
IOXPCRBuffer 2.5_
25mM dNTPs ~0.2"
100 μ MPrimerF O. I
100 μ MPrimerR O. I
水9
5U/μ L Taq 酶 ^O. 2"
RNA—5"
Total25扩增条件50°C 30min ；95°C IOmin ；95°C 15s,56°C 30s, 72°C 2min ； 72°C IOminJS 个循环。3)目的基因测序。实施例2待测HIV-lpol区的装载常规基因亚克隆方法将待测HIV-lpol区基因装载到载体质粒pGag中，构建pGag/Pol质粒。实施例3pGag/Pol纯化提取
I)无内毒素高纯质粒大量抽提纯化试剂盒纯化pGag/Pol质粒。2)测定质粒浓度、纯度及内毒素。实施例4慢病毒包装l)pLenti-EGFP、pGag/Pol、pRev、pVSV_G 四质粒共转染 293T 细胞；2)培养48 72h，收集培养上清；3)病毒载体的纯化和浓缩(超离和/或超滤)；4)分装、_80 V 保存。实施例5病毒滴度测定
I)物理滴度p24ELISA 法 / 或 RNA qRT-PCR 法；2)活性滴度感染293T后，用荧光FACS计数法/或qPCR法进行测定。实施例5细胞感染I)按实验需要将细胞铺板(24或96孔板)，细胞数以第2天密度约50%为宜，37°C培养过夜；2)感染前，从冰箱取出并在37°C水浴中快速融化病毒，用新鲜完全培养基稀释成所需浓度，加入细胞中；3)加入Polybrene,终浓度6mg/ml,轻轻摇勻,37°C培养过夜；4)感染后第二天，吸去含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液，37°C继续培养。实施例6HIV耐药表型检测在假病毒包装和感染过程中加入不同浓度的抗HIV药物，采用荧光显微镜检测和流式细胞仪定量检测，分析不同药物对假病毒的抑制作用。
权利要求
1.本发明拟采用一种新的高效低毒慢病毒载体系统，建立检测Hiv表型检测方法。
2.如权利I所述的慢病毒载体系统，其特征是装载有患者感染的HIV-I病毒Pol基因区和EGFP或者荧光素酶。
3.如权利I所述的慢病毒载体系统，其特征是以EGFP或者荧光素酶作为报告基团。
4.如权利I所述的慢病毒载体系统，其特征是在体外包装成具有单次感染能力的假病毒。
5.如权利I所述的慢病毒载体系统，其特征是具有单次感染能力。
6.如权利I所述的慢病毒载体系统，其特征是5’LTR的U3区被RSV的enhancer/promoter取代,使载体的复制不再依赖Tat。
7.如权利I所述的慢病毒载体系统，其特征是3’LTR的U3增强子区缺失，使其不再有启动/增强活性，成为自灭活(self-inactivating, SIN)载体。
8.如权利I所述的慢病毒载体系统，其特征是不具有复制能力，即该病毒基因组整合到细胞基因组后，不会产生新的子代病毒，也降低了对周围基因的意外激活，因此具有很好的安全性。
9.如权利I所述的慢病毒载体系统，其特征是病毒的env基因被来自水泡口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus)的VSV-G代替，使病毒能感染更多种细胞(包括分裂和非分裂细胞)，且病毒更趋稳定。
10.如权利I所述的慢病毒载体系统，其特征是HIV-I的所有辅助蛋白和调节蛋白基因(tat, vrf, vpr, vpu and nef等)均被删除,从载体基因组中缺失。
11.如权利I所述的慢病毒载体系统，其特征是3个蛋白Gag/MCS、Rev、VSV-G(代替HIV-I的Env)分别独立放置在3个质粒上(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)，且互相之间没有任何同源序列(见附图I)，大大降低了复制型慢病毒(RCL)产生的几率。
12.如权利I所述的慢病毒载体系统，其特征是pGag/Pol质粒上具有多克隆酶切位点(MCS)，并且其读码框与gag —致。
13.如权利I所述的慢病毒载体系统，其特征是报告基因EGFP或者Luc位于质粒pLenti EGFP/Luc上(见附图I)，且由SV40启动子控制报告基因EGFP或者Luc。
14.如权利I所述的慢病毒载体系统，其特征是包装好的假病毒结构如附图2所示。
15.如权利I所述的检测方法，其基本步骤是将HIV-I的pol基因区插入到慢病毒载体中，再将慢病毒载体感染细胞，在细胞内完成慢病毒的包装工作，收集细胞上清，浓缩、纯化得到高浓度的慢病毒颗粒，最后用所得慢病毒颗粒感染细胞，测定耐药性。
16.如权利I所述的检测方法，其特征是采用RT-PCR技术扩增HIV-I的pol基因区，目的基因片断覆盖蛋白酶区4-99位氨基酸和逆转录酶区38-320位氨基酸的基因区域。
17.如权利I所述的检测方法，其特征是将RT-PCR扩增所得片段插入到慢病毒载体pGap的MCS位置。
全文摘要
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种新的慢病毒载体系统的构建、慢病毒颗粒的制备及检测HIV耐药表型的方法，用于HIV耐药表型检测。此法能直接测出感染毒株对药物的敏感度，并能揭示事先存在或交叉的耐药情况，有利于指导HIV-1感染者有效地用药。本方法简便易行，费用也较低，具有良好的应用前景。
文档编号C12Q1/02GK102876714SQ20111026458
公开日2013年1月16日 申请日期2011年9月7日 优先权日2011年9月7日
发明者朱海, 王西丽, 李金峰, 付辉, 林季敏, 苟晨 申请人:深圳市易瑞生物技术有限公司