克隆载体的制作方法

专利名称：克隆载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及适于PCR产物克隆的载体、使用该载体的克隆方法、该载体的制造方法以及含有该载体的试剂盒。
背景技术：
迄今为止，作为目的基因的分离方法已知有利用PCR的方法。在该方法中，首先通过PCR扩增含目的基因的DNA或其片段，将得到的PCR产物组装到克隆用质粒载体中，进一步使用该质粒载体使宿主转化从而形成转化体的单菌落。接下来，由所形成的单菌落精制质粒，对插入到质粒中的DNA片段进行确认。通过这样做，可得到插入有目的基因或其片段的质粒。在PCR法所用的酶中，已知代表性的Taq DNA聚合酶中存在这样的副反应活性在复制后的DNA产物的3'末端以非模板依赖性的方式添加1个脱氧腺苷(dA)残基。因此， 使用存在这样副反应活性的DNA聚合酶扩增的双链DNA片段的大部分具有添加了 1个脱氧腺苷残基的3'端突出结构。已开发了利用Taq DNA聚合酶并利用开环载体(T载体)的TA克隆法，其中所述开环载体在两个3'末端具有突出的1个脱氧胸腺嘧啶核苷(dT)残基(非专利文献1)。通过采用TA克隆法，可在不进行PCR产物的限制性酶处理和末端平滑化处理的情况下得到插入有PCR产物的重组质粒。然而，传统的TA克隆法存在缺点。在TA克隆中，在含有插入有PCR片段的质粒的转化体鉴别中，通常利用半乳糖苷酶基因的α-互补性，g卩，所谓的蓝白筛选。然而，有时存在以下情况在相对于衍生自半乳糖苷酶的α肽基因的碱基序列通过读码框插入 PCR片段时，引起作为融合蛋白的α肽的表达。在这种情况下，导致呈现弱蓝色的假阴性菌落的生成。另外，在通常的TA克隆法中，不能控制插入到载体中的目的基因的方向性。为了消除该缺点制作了改良型T-载体。例如，在专利文献1中披露了将生成第一限制性酶切位点的引物对与T-载体相组合的方法，其中这样设计所述T-载体仅在使用所述引物对沿逆向插入PCR扩增产物时出现第二限制性酶切位点。在该方法中，使用切断第二限制性酶切位点的限制性酶仅切断沿逆向插入的质粒，由此可以仅得到这样的转化体其保持有沿期望方向插入有DNA片段的质粒。然而在该方法中，连接反应之后需要进一步进行限制性酶处理，操作变烦杂。最近，有人报道了这样的方法为了控制在TA克隆法中生成假阴性菌落，利用致死基因作为选择标记(非专利文献2、。然而，在该方法中，不能控制插入到载体中的目的基因的方向性。由以上可知，目前尚不存在这样的克隆载体，其简便地控制PCR扩增产物这样的 DNA片段的插入方向，同时可容易地选择仅插入有目的DNA片段的克隆。现有技术文献
专利文献专利文献1 国际公开第2005/021747号小册子非专利文献非专利文献1 :BioTechniques，1995 年，第 19 卷，第 1 期，第 34-35 页非专利文献2 =Molecular Biology Reports, 2009 年，第 36 卷，第 7 期，第 1793-1798 页

发明内容
发明要解决的课题本发明的目的是提供克服了上述缺点的TA克隆用载体、使用该载体的克隆方法、 该载体的制造方法以及含有该载体的试剂盒。解决课题的手段本发明人发现，借助于这样的载体可解决上述课题从而本发明完成，该载体在末端配置了核酸序列缺失的活性丧失耐药性基因，其中所述核酸序列对在耐药性基因产物的耐药性发挥中不可缺少的C末端部分的氨基酸或N末端部分的氨基酸进行编码。SP，本发明涉及[1] 一种载体，其为由直链状双链DNA形成的克隆用载体，所述直链状双链DNA在两个3'末端具有突出的1个脱氧胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶核苷残基，该载体的特征在于，其保持有对耐药性基因产物的部分序列进行编码的核酸，所述核酸为缺失了这样的核酸序列的活性丧失耐药性基因，该核酸序列对在所述耐药性基因产物的耐药性发挥中不可缺少的 C末端部分的氨基酸或N末端部分的氨基酸进行编码，此外，所述核酸配置在所述双链DNA 中任一者的末端，使得在将其中末端部分含有所述活性丧失耐药性基因中所缺失的核酸序列的插入DNA片段连接到载体时，构成了对没有缺失的耐药性基因产物进行编码的核酸。[2]上述[1]中记载的载体，其中，所述活性丧失耐药性基因为缺失了这样的核酸序列的活性丧失耐药性基因，该核酸序列对耐药性基因产物的C末端部分的氨基酸进行编码。[3]上述[2]中记载的载体，其中，所述活性丧失耐药性基因由对缺失了 C末端氨基酸的β-内酰胺酶的氨基酸序列进行编码的核酸序列构成。[4]上述[3]中记载的载体，其中，所述活性丧失耐药性基因由对序列表的序列号 17中记载的氨基酸序列进行编码的核酸序列构成。[5]上述[1]中记载的载体，还包括第2耐药性基因，所述第2耐药性基因示出与前述耐药性基因不同的对药剂的耐药性。[6]上述[1]中记载的载体，其由由序列表的序列号5中记载的核酸序列所形成的 DNA和由序列表的序列号18中记载的核酸序列所形成的DNA形成。[7] 一种克隆DNA的方法，包括以下步骤(a) (d) (a)以DNA为模板，使用第一引物、与第一引物相对的第二引物、以及DNA聚合酶进行PCR的步骤；(b)将通过步骤(a)得到的PCR产物与上述[1]至[6]中任一项记载的载体连接，得到环状DNA的步骤；(c)采用由步骤(b)得到的环状DNA对宿主细胞进行转形的步骤；以及(d)利用这样的药剂进行药剂选择，由此选择具有环状DNA的转化体的步骤，其中所述药剂是没有缺失的耐药性基因产物对其示出耐药性的药剂，并且所述环状DNA是通过将PCR产物沿期望方向插入载体中而成的；其中，第一引物在3'末端侧具有与前述DNA互补的核酸序列，并且当上述[1]至 [6]中记载的载体中的活性丧失耐药性基因为缺失了对耐药性基因产物的C末端部分的氨基酸进行编码的核酸序列的基因时，所述第一引物在5'末端侧具有所缺失的核酸序列，当上述[1]至[6]中记载的载体中的活性丧失耐药性基因为缺失了对耐药性基因产物的N末端部分的氨基酸进行编码的核酸序列的基因时，所述第一引物在5'末端侧具有从所缺失的核酸序列的互补链序列脱除了 5'末端的脱氧胸腺嘧啶核苷后的核酸序列。[8]上述[7]的克隆方法，其中步骤(a)中的DNA聚合酶具有在反应产物的3‘末端以非模板依赖性的方式添加1个脱氧腺苷碱基的活性。[9]上述[7]的克隆方法，其中，在步骤(a)中还包括在反应产物的3'末端添加 1个脱氧腺苷碱基的步骤。[10] 一种载体的制造方法，包括下列步骤通过限制性酶PmaCI切断具有序列表的序列号19中记载的核酸序列的环状双链DNA的步骤，以及通过具有末端脱氧核苷酸转移酶活性的酶在切断后的双链DNA的两个3'末端添加突出的1个脱氧胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶核苷残基从而得到[1]中记载的载体的步骤。[11] 一种试剂盒，其为克隆用试剂盒，含有[1]至[6]中任意一项所述的载体以及 DNA连接酶。发明效果根据本发明，可以提供这样一种载体，通过简单操作即能够仅选择出沿期望方向插入有目的基因的克隆。另外，根据本发明，在对含有插入有目的基因的质粒的转化体进行鉴定时，不需要X-Gal或IPTG等，从而简化了准备操作。此外，本发明的载体也在对富含AT 的DNA片段进行的克隆中发挥作用。


图1为示出实施例2(1)中经过使用了本发明载体的TA克隆而得到的转化体的菌落PCR结果的图。图2为示出实施例2(1)中经过使用了传统T-载体的TA克隆而得到的转化体的菌落PCR结果的图。图3为示出实施例2(3)中经过使用了本发明载体的TA克隆而得到的转化体的菌落PCR结果的图。图4为示出实施例2(3)中经过使用了传统T-载体的TA克隆而得到的转化体的菌落PCR结果的图。图5为示出pUC19_bla Δ W 290-T DNA的结构的图。
具体实施例方式(1)本发明的克隆载体本发明的克隆载体由直链状双链DNA构成，所述直链状双链DNA在两个3 ‘末端具有突出的1个脱氧胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶核苷残基，该载体保持有对耐药性基因产物的部分序列进行编码的核酸，所述核酸为缺失了这样的核酸序列的活性丧失耐药性基因，该核酸序列对在所述耐药性基因产物的耐药性发挥中不可缺少的C末端部分的氨基酸或N末端部分的氨基酸进行编码，此外，所述核酸配置在所述双链DNA中任一者的末端，使得在将其中末端部分含有所述活性丧失耐药性基因中所缺失的核酸序列的插入DNA片段连接到载体时，构成对没有缺失的耐药性基因产物进行编码的核酸。本文中，所谓“缺失”是指在配置在所述直链状双链DNA末端的耐药性基因中，只保持有对在耐药性发挥中不可缺少的部分之外的其它区域进行编码的核酸序列。所谓“所述核酸配置在所述双链DNA中任一者的末端，使得在将其中末端部分含有所述活性丧失耐药性基因中所缺失的核酸序列的插入DNA片段连接到载体时，构成对没有缺失的耐药性基因产物进行编码的核酸”是指为了使所述活性丧失耐药性基因的核酸序列缺失侧的末端成为所述双链DNA中任一者的末端，将所述核酸如上配置。然而，配置所述活性丧失耐药性基因侧的双链DNA末端中3'末端的突出的1个脱氧胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶核苷残基，以构成所述活性丧失耐药性基因或其互补链的一部分。通过将在末端部分含有所述活性丧失耐药性基因中缺失的核酸序列的部分序列的DNA片段连接到本发明的克隆用载体，构成了对没有缺失的耐药性基因产物进行编码的核酸。对赋予针对特定药剂的耐药性的所述耐药性基因没有限定，只要其对能够使宿主对抑制宿主生长的药剂具有耐药性的蛋白质进行编码即可。例如，本发明中可以使用付与针对氨苄西林、氯霉素、红霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、潮霉素、大观霉素、链霉素、四环素等的耐药性的基因。优选地，本发明中可使用耐氨苄西林性基因(β -内酰胺酶基因)， 更优选可使用来自大肠杆菌的内酰胺酶基因。作为在所述活性丧失耐药性基因中缺失的、并且在耐药性基因产物的耐药性发挥中不可缺少的C末端部分的氨基酸或N末端部分的氨基酸，可以列举优选从耐药性基因产物的耐药性发挥中不可缺少的C末端或N末端起的1 5个氨基酸残基，更优选从耐药性基因产物的耐药性发挥中不可缺少的C末端或N末端起的1 3个氨基酸残基，进一步优选耐药性基因产物的耐药性发挥中不可缺少的C末端或N末端的氨基酸残基。另外，本说明书中，所谓“对在所述活性丧失耐药性基因中缺失的并且对耐药性基因产物的耐药性发挥中不可缺少的C末端部分的氨基酸或N末端部分的氨基酸进行编码的核酸序列”，并不局限于包含所有对这样的氨基酸进行编码的密码子的那些核酸序列，只要是在由于该缺失而丧失耐药性基因产物的耐药性的范围内，可以是对于上述氨基酸中的一个氨基酸缺少了对其进行编码的密码子的一部分核酸序列的那些核酸序列。例如，存在以下情况在所述活性丧失耐药性基因中缺失的、并且在耐药性基因产物的耐药性发挥中不可缺少的C末端部分的氨基酸或N末端部分的氨基酸为C末端的苯丙氨酸，对其进行编码的密码子为5' -TTC-3'， 同时其中5' -TC-3'亦为在所述活性丧失耐药性基因中缺失的并且对耐药性基因产物的耐药性发挥中不可缺少的C末端部分的氨基酸或N末端部分的氨基酸进行编码的核酸序列。作为在所述活性丧失耐药性基因中缺失的并且对耐药性基因产物的耐药性发挥中不可缺少的C末端部分的氨基酸或N末端部分的氨基酸进行编码的核酸序列，本发明中对其没有特别限定，但优选对耐药性基因产物的C末端部分的氨基酸进行编码的核酸序列。作为这样的核酸序列缺失的活性丧失耐药性基因，可列举(例如)序列表的序列号17中所示核酸序列这样的对C末端氨基酸缺失的β-内酰胺酶的氨基酸序列进行编码的核酸序列。含有序列表的序列号17中所示核酸序列的载体例如可由以下方法制备。将5 ‘ -CATTGG-3 ‘改性成作为PmaCI限制性酶切断部位的5 ‘ -CACGTG-3 ‘，其中 5' -CATTGG-3'是对作为β-内酰胺酶C末端的第290位氨基酸残基(色氨酸残基，下文有时标记为W290)和其前面的第289位氨基酸残基(组氨酸残基，下文有时标记为! 89) 进行编码的核酸序列。被这样制备的改性内酰胺酶基因所编码的多肽不能分解内酰胺类抗生素(例如氨苄西林)。当用PmaCI切断其中插入有该改性β-内酰胺酶基因、且在所述基因以外的区域中不具有PmaCI切断部位的载体时，生成了编码W290的序列缺失的 β -内酰胺酶基因位于末端的直链状双链DNA。此外，利用已知方法将1个脱氧胸腺嘧啶核苷(或者尿嘧啶核苷)残基添加到如上得到的双链DNA的两个3'末端，由此可以制备出适宜与在3'末端具有1个脱氧腺嘌呤核苷残基的PCR产物连接的直链状载体。在此，虽然使用序列表的序列号17中所示的核酸序列进行了说明，但本发明的直链状载体不限于上述具体例子，通过考虑耐药性基因的C末端部分或N末端部分的氨基酸序列，并适当地选择使用已知的限制性酶，可利用同样的方法制备直链状载体。作为本发明的载体，本发明中对其没有特别限定，可使用质粒载体、噬菌体载体、 噬菌粒载体。作为质粒载体，可使用保持有在所用宿主中发挥作用的复制起点(在大肠杆菌情况中为PUC orLpACYCori等)的质粒载体。在本发明的载体中，除了表达所搭载的耐药性基因用的启动子序列之外，还可含有(例如)控制被克隆的DNA片段上的基因表达用的启动子序列和操纵子序列等。此外，本发明的载体还可以具有第2耐药性基因，其示出与前述耐药性基因不同的对药剂的耐药性。在使用(例如)耐氨苄西林性基因作为前述耐药性基因的情况下，作为第2耐药性基因，本发明中对其没有特别限定，可以列举付与针对氯霉素、红霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、潮霉素、大观霉素、链霉素、四环素等的耐药性的基因，其中优选列举耐卡那霉素性基因。作为本发明载体的优选例子，可列举具有图5所示结构的载体。作为本发明载体的进一步具体例子，可列举由序列表的序列号5中记载的核酸序列形成的DNA、以及序列表的序列号18中记载的核酸序列形成的DNA形成的载体。通过将本发明的载体用于下面所述的本发明的克隆方法，可抑制获得转化体时出现假阳性克隆，并可提高阳性克隆的获得效率。本说明书中，所谓“阳性克隆的获得效率”是指在保持插入有期望插入片段的环状DNA的所期待克隆范围内，实际上保持插入了期望插入片段的环状DNA的克隆所占的比例，其中所述期望插入片段是通过与在TA克隆中使用的载体相对应的筛选方法(蓝白筛选或药剂选择等)，从通过由TA克隆得到的环状DNA所转化而得到的转化体中选择的。阳性克隆的获得效率的测定方法可根据本申请实施例2至4 中记载的方法进行测定。此外，通过将本发明的载体用于下面所述的本发明的克隆方法，可得到插入片段仅沿任意方向插入的环状DNA。(2)本发明的克隆方法本发明的克隆方法包括以下步骤(a)以DNA为模板，使用第一引物、与第一引物相对的第二引物、以及DNA聚合酶进行PCR的步骤；(b)将通过步骤(a)得到的PCR产物与本发明的载体连接，得到环状DNA的步骤；(c)采用通过步骤(b)得到的环状DNA对宿主细胞进行转形的步骤；以及(d)利用这样的药剂进行药剂选择，由此选择具有环状DNA的转化体的步骤，其中所述药剂是没有缺失的耐药性基因产物对其示出耐药性的药剂，并且所述环状DNA是通过将PCR产物沿期望方向插入载体而成的；其中，第一引物在3'末端侧具有与前述DNA互补的核酸序列，并且当本发明载体中的活性丧失耐药性基因为缺失了对耐药性基因产物的C末端部分的氨基酸进行编码的核酸序列的基因时，所述第一引物在5' 末端侧具有所缺失的核酸序列，当本发明载体中的活性丧失耐药性基因为缺失了对耐药性基因产物的N末端部分的氨基酸进行编码的核酸序列的基因时，所述第一引物在5'末端侧具有从所缺失的核酸序列的互补链序列脱除了 5'末端的脱氧胸腺嘧啶核苷后的核酸序列。可这样设计所述第一引物中在活性丧失耐药性基因中所缺失的并且对在耐药性发挥中必不可少的C末端部分的氨基酸或N末端部分的氨基酸进行编码的核酸序列或其互补链序列，使得在将通过使用该第一引物的PCR得到的扩增产物与本发明的克隆载体连接时，生成了对没有缺失的耐药性基因产物进行编码的序列。例如，在使用由序列表的序列号5中记载的核酸序列DNA和序列表的序列号18中记载的核酸序列DNA所形成的载体的情况中，可使用在5'末端含有5' -GGTAA-3'的核酸序列引物。前述没有缺失的耐药性基因产物的氨基酸序列或对其进行编码的核酸序列可以是与天然型序列不同的序列，只要基因产物能够发挥耐药性即可。本发明人发现将内酰胺酶的第290位氨基酸置换为苯丙氨酸而得到的变异体(W^K)F)与野生型β-内酰胺酶一样对氨苄西林发挥出耐药性。根据该发现，例如，在将由序列表的序列号5中记载的核酸序列DNA和序列表的序列号18中记载的核酸序列DNA所形成的载体作为载体时，可使用在5'末端含有5' -ΤΤΤΑΑ-3'或 5' -TCTAA-3'的核酸序列引物。另外，第1引物的3'末端侧的序列可具有与模板DNA互补、且作为PCR引物的足够长的核酸序列。对前述第2引物没有特别限定，只要其为在第1引物的伸长链中可退火的引物即可，第2引物可通过已知技术来适当地设计。在仅获得PCR片段沿特定方向插入的环状DNA 的情况下，对第2引物没有特别限定，例如，可以将与第1引物的伸长链的一部分互补的核酸序列所形成的引物设计为第2引物。在获得PCR产物分别沿不同方向插入的2种环状 DNA的情况下，与第1引物一样，可设计第2引物，使得其包含在活性丧失耐药性基因中所缺失的并且对在耐药性发挥中不可缺少的C末端部分的氨基酸或N末端部分的氨基酸进行编码的核酸序列或其互补序列。作为前述DNA聚合酶，可列举作为代表性的耐热性DNA聚合酶的Pol I型DNA聚合酶，或含有上述聚合酶的混合型DNA聚合酶。对于利用与Pol I型DNA聚合酶一起广泛使用的α型DNA聚合酶进行PCR扩增后的DNA片段，已知由于该DNA聚合酶具有3'核酸外切酶活性，在3 ‘末端不具有dA突出的DNA片段占多数，但在PCR反应后通过进行如下处理通过Pol I型DNA聚合酶等将dA突出添加到3'末端，则可以通过TA克隆法进行克隆。作为在通过α型DNA聚合酶进行PCR扩增后的DNA片段的3'末端得到dA突出的方法，可列举用具有向Taq DNA聚合酶或末端脱氧核苷酸转移酶之类的核酸序列的3'末端添加碱基这样活性的酶进行处理的方法。使用通过上述处理得到的DNA片段和本发明载体的克隆方法也是本发明的一个实施方案。使用上述引物对以及DNA聚合酶来实施本发明的克隆方法中的PCR反应。模板 DNA、引物、镁离子、4种脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶的使用量、以及热变性/退火/扩链反应各工艺的温度及时间、以及这些工艺的循环数等可以参考(例如)Baetlett JMS及 StirlingD 编著的"PCR Protocols”(第 2 版，Humana Press 出版，2003 年)等来任意设定。在上述步骤(b)中的PCR产物与本发明的克隆载体的连接中，可以利用DNA连接酶或市售的连接试剂盒(ligation kit)。虽然本发明中没有特别限定，但是作为DNA连接酶可以例举得自T4噬菌体的DNA连接酶，作为连接试剂盒可以例举DNA Ligation kit ver. 1 (夕力，A 4才株式会社制)、DNA Ligation kit ver. 2 (夕力，4才株式会社制) 和DNA Ligation Kit<Mighty MixX夕力，广4才株式会社制)。此外，当与本发明的克隆载体连接时，PCR产物可以进行精制，也可以将PCR后的反应液不经过精制直接用于与本发明的克隆载体连接。作为上述步骤(C)中的宿主细胞，本发明中对其没有特别限定，可以例举大肠菌、 枯草菌、酵母和昆虫细胞，其中更优选大肠菌。上述步骤(c)中的转化采用常规方法即可， 例如可以利用使用了化学感受态细胞(chemical competent cell)的方法、或电穿孔法。关于在上述步骤(d)的药剂选择中所使用的选择药剂，使用没有缺失的耐药性基因产物对其示出耐药性的药剂即可。例如，当没有缺失的耐药性基因产物为内酰胺酶时，可以使用氨苄西林作为选择药剂。另外，当本发明的克隆载体具有第2耐药性基因时， 可以并用第2耐药性基因的基因产物对其示出耐药性的药剂。这里，下面示出本发明的克隆方法的一个实施方案。这里虽然使用β-内酰胺酶基因进行了说明，但本发明的克隆方法不限于下面的具体例子，可基于所用的耐药性基因的核酸序列设计合适的引物对，由此通过与以下方法相同的方法、或者本领域技术人员显而易见的方法来进行克隆。首先，制备用于扩增作为克隆目标的基因的引物对。在该引物对中，预先在其中一个引物的5'末端侧添加碱基序列GGTAA，该碱基序列GGTAA使得对β -内酰胺酶基因的C 末端氨基酸Trp(W^K))进行编码的核酸序列及其下游的终止密码子生成。或者，可添加使得氨基酸Wie(F290)及其下游的终止密码子生成的碱基序列TTTAA或TCTA。使用该引物及与之相对的另一引物，通过Pol I型DNA聚合酶进行PCR。通过这样做，可获得在所述扩增片段的任意一个末端添加有GGTAA、TTTAA或TCTAA之类的序列、并且在两个3'末端添加有突出的脱氧腺苷的DNA片段。通过将这样获得的DNA片段提供给与本发明载体的连接反应中，可得到仅沿期望方向插入了 DNA片段的环状DNA。在本发明中，也可使用在5'末端含有上述添加序列的2个对向引物来实施PCR。 在这种情况下，可获得在两个5'末端添加了 GGTAA、TTTAA或TCTAA之类的序列、并且在两个3'末端添加了突出的脱氧腺苷的DNA片段。通过将这样获得的DNA片段提供给与本发明载体的连接反应中，可得到沿不同方向插入了 DNA片段的2种环状DNA。通过将前述DNA片段提供给与本发明载体(其保持有W290缺失了的β -内酰胺酶基因)的连接反应中并进行连接，制得环状化的载体。在与本发明载体的连接反应中， 可以不对上述DNA片段进行精制就使用，或者可以使用离心柱等精制后的DNA片段。通过用这样得到的环状化载体对宿主进行转化，并通过只选择已获得了氨苄西林耐药性的转化体，可得到沿期望方向插入了核酸片段的克隆。因为本发明的克隆方法可获得仅沿期望方向插入了 DNA片段的环状DNA，因此在仅对特定部分的序列分析中是有用的。例如，在以细菌鉴定和分类为目的、对16S核糖体 RNA基因的5'侧数百个碱基进行序列分析时，在不能控制DNA片段的方向性的情况下，不需要分析的3'侧区域被测序的克隆也被进行序列分析。然而，通过使用本发明的载体，可消除上述问题。因此，在前述这样的辨别中可以迅速且安全地进行解析。另外，被在实验胚胎学领域中广泛使用的亚硫酸氢盐处理过的DNA具有富含AT的核酸序列，但本发明的克隆方法在这样的富含AT的DNA片段克隆中也是有用的。因为本发明的克隆方法可在高的阳性克隆获得效率下进行TA克隆，并且能够控制所插入的DNA片段的方向性，因此在以插入片段的序列分析为目的进行克隆的情况中， 也可防止对身份不明的克隆进行碱基序列分析，从而可降低碱基序列分析的成本。对可通过本发明的载体进行克隆的DNA(核酸片段)没有特别限定。可以是多肽编码的基因、编码功能性RNA(rRNA、miRNA等)的基因或其片段，还可以是(例如)顺式作用性碱基序列要素(启动子、增强子、沉默子等基因表达控制序列或其候选)。另外，也可以将功能不明的核酸序列作为标的核酸序列进行克隆并进行碱基序列分析。(3)本发明的载体的制造方法对制造本发明的载体的方法没有特别限定，只要是能够构建本发明载体结构的制造方法即可。对在两个3'末端具有突出的1个dT残基的载体制造方法也没有特别限定， 可利用如下方法:使用可以在)(cmI、MboII、HphI、MnlI、AhdI、Eamll05I等的3'末端制得 1个碱基突出末端的限制性酶制备3' dT突出末端的方法；以及通过可以制备AluI、DpnI、 RsaI、Afel、DraI、EcoRV、HaeIII, PamCI等的平滑末端的限制性酶进行处理后，使用具有向 Taq DNA聚合酶或末端脱氧核苷酸转移酶之类的DNA片段的3'末端添加碱基的活性的酶， 来制备3' dT突出末端的方法。前述限制性酶可根据对载体中所搭载的耐药性基因进行编码的核酸序列来进行选择，但是在找不到合适的限制性酶的情况下，可在不失去本发明载体的机能的范围内(例如，不使氨基酸序列改变)改变所述核酸的碱基序列，来创建限制性酶切断部位。作为本发明的载体制造方法，本发明中对其没有特别限定，但可列举包括下述步骤的方法通过限制性酶PmaCI切断具有序列表的序列号19中记载的核酸序列的环状双链 DNA的步骤；以及通过具有末端脱氧核苷酸转移酶活性的酶将突出的1个脱氧胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶核苷添加到被切断的双链DNA的两个3'末端从而得到本发明载体的步骤。这里，以下示出了本发明的载体制造方法的一个实施方案，其在氨苄西林的存在下可选择性地获得插入了核酸片段的克隆。首先，预先将内酰胺酶基因以外的其它耐药性基因(第二耐药性基因)导入到含有β-内酰胺酶基因的载体中。导入时，可以利用限制性酶位点，也可以利用PCR之类的核酸扩增方法。接下来使得与在导入后载体中存在的内酰胺酶基因C末端Trp及终止密码子相对应的部分缺失。作为缺失方法，可适当地利用inverse-PCR法。对该方法没有特别限定，优选使用在前述PCR中其5'末端添加有限制性酶PmaCI识别位点的引物对的方法。通过限制性酶PmaCI切断该扩增片段，接下来通过连接反应进行自环化，之后对宿主进行转化，并将前述第二耐药性基因作为标记物来选择转化体。通过所得到的转化体，选择保持有含C末端Trp缺失了的内酰胺酶基因的载体的转化体。通过限制性酶PmaCI将由该转化体制备的载体再消化，进一步通过DNA聚合酶或末端脱氧核苷酸转移酶将1个突出的dT残基添加到两个3'末端。由此可制备本发明的载体。(4)本发明的试剂盒剂盒含有本发明的载体和DNA连接酶。作为前述DNA连接酶，可列举 T4DNA连接酶。在本发明的试剂盒中，可进一步含有适于通过DNA连接酶进行的连接反应 (连接反应)的组成的缓冲液。此外，在本发明的试剂盒中可以含有用于向通过α型DNA 聚合酶进行PCR扩增得到的DNA片段的3'末端添加dA的试剂(TaqDNA聚合酶或者末端脱氧核苷酸转移酶等)。对试剂盒没有特别限定，优选将本发明的载体和市售的DNA连接试剂盒组合得到的试剂盒，例如与DNA Ligation kit ver. 1 (夕力，八^才株式会社制)、DNA Ligation kit ver. 2 (夕力，八4才株式会社制)或DNA Ligation Kit<Mighty MixX夕力，八4才株式会社制)等组合得到的试剂盒。通过使用本发明的试剂盒，可利用最少的劳动和时间克隆多数未知基因。尤其是， 可用作亚硫酸氢盐处理过的核酸片段之类的富含AT的核酸片段的克隆试剂盒。实施例下面列举实施例来对本发明进行更具体地说明，但本发明不仅仅限于下面的实施例。另外，在本说明书记载的操作中，关于质粒的制备、限制性酶消化等基本操作，依照 2001 年 Cold Spring Harbor Laboratory 发行、J. Sambrook 等编辑的“分子克隆实验室手册第 3 版(Molecular Cloning :A Laboratory Manual 3rd ed.) ”中记载的方法进行。实施例1(1)载体的构建本发明的载体通过以下方法构建。首先，通过限制性酶Nde I和PvuII (两者均由夕力，K ^才株式会社制)将PUC19载体(夕力，才株式会社制)消化。之后进行平滑末端化和BAP处理。将这样得到的DNA片段通过常规方法进行精制。接下来合成双链DNA，该双链DNA具有在序列表的序列号5中记载的核酸序列中从第999位碱基到第213 位碱基的核酸序列。接下来，将该双链DNA插入到用限制性酶Nde I和Pvu II切断的pUC 19DNA中。将这样构建的质粒DNA命名为pUC19_Kana DNA。以上述pUC19-Kana DNA为模板进行反向PCR。首先，合成分别具有序列表的序列号3、4中记载的碱基序列的AMP-F引物和AMP-R引物。对这些引物进行设计，使得在这些引物的5'末端侧生成限制性酶PmaCI位点。使用该引物对的PCR在下列反应液组成中进行。即，100 μ L反应液中含有ZXI^rimeStar Max Premix 50 μ L、上述引物各20pmol、以及 2ng模板DNA。另外，PCR条件为将98°C 10秒、(98°C 10秒、55°C 5秒、72°C 40秒)作为1 个循环，反应30个循环。PCR结束后，用限制性酶DpnI(宝生物工程(大连)有限公司制) 将扩增产物消化。之后，通过限制性酶PmaCI (夕”)” *株式会社制)消化，并使用DNA ligation kit( ^ ^ 7 *株式会社制)进行自连接反应。反应结束后，使用所得到的环状DNA对大肠杆菌JM109( ^ ^ 7 *株式会社制)转化。在对所得到的转化体进行培养后，通过常规方法制备质粒，并将该质粒命名为pUC19-blaAW290。该质粒具有对C末端色氨酸(距离N末端第290位氨基酸，对应的碱基序列为TCG)缺失了的β -内酰胺酶进行编码的核酸序列。该C末端缺失的β-内酰胺酶实际上不具有β-内酰胺酶活性。(2)氨苄西林感受性的确认关于上述(1)中制备的质粒pUC19_blaAW290，确认了氨苄西林感受性。S卩，制备含有浓度为50μ g/mL的卡那霉素和浓度分别为0、20、40、60、80、100μ g/mL的氨苄西林的共6种琼脂糖LB平板。将经质粒pUC19-blaAW290转化后的大肠杆菌JM109播种到上述平板中，在37°C下培养一夜后，计算菌落数。结果，当氨苄西林浓度为40 μ g/mL以上时，没有观察到菌落生长。由此，经质粒pUC19-blaAW290转化后的大肠杆菌为氨苄西林感受性这一事实得到确认。(3)质粒 pUC19_bla Δ W290 的 Τ-载体化对通过上述( 确认了氨苄西林感受性的质粒pUC19_blaAW290进行T-载体化。 首先，用限制性酶PmaCI将质粒pUC19-blaAW290消化后，通过除去琼脂糖凝胶来进行精制。接下来，向精制后的DNA片段中加入Taq DNA聚合酶和dTTP，使得在两个3 ‘末端添加 1个脱氧胸腺嘧啶核苷残基。将如此获得的直链状双链DNA片段命名为pUC19-blaAW290-T DNA。该双链DNA由由序列表的序列号5中记载的核酸序列形成的DNA和由序列表的序列号18中记载的核酸序列形成的DNA构成。实施例2关于实施例1中制备的pUC19-blaAW290_T DNA，通过TA克隆法插入各种链长的PCR片段，以讨论阳性克隆获得效率。(l)500bp PCR片段的阳性克隆获得效率讨论合成分别具有序列表的序列号6、7中记载的核酸序列的500bp_F引物和500bp-R 引物。接下来，将大肠杆菌JM 109基因组DNA作为模板，使用这些引物进行PCR。PCR在以下反应液组成中进行。即，在50 μ L反应液中，含有2XEx Taq Premix( ^ ^ 7 才株式会社制)25 μ L、上述引物各20pmol、以及50ng模板DNA。另外，PCR条件为将94°C 1分钟、 (980C 15秒、59°C 30秒、72°C 30秒)作为1个循环，30个循环反应后，在72°C下保持5分钟。对反应后的扩增片段进行琼脂糖凝胶回收。将含有50ng精制后的扩增片段、50ng的pUC19_bla Δ W290-TDNA和5 μ L的DNA Ligation kit ver. 1 (夕力，八4才株式会社制)溶液I的10 μ L反应液在16°C下保持1 小时。作为对照，使用PMD19-T载体(宝生物工程(大连)有限公司制)代替pUC 19-bla AW290-TDNA，除此之外与上述一样实施反应。接下来，使用反应完成后的各反应液来转化大肠杆菌。在将所得到的转化体播种到含100 μ g/mL浓度的氨苄西林的AIX平板上之后， 在37°C下培养一晚。对由此形成的克隆的一部分，使用由序列表的序列号8中记载的碱基序列形成的引物和由序列表序列号9中记载的碱基序列形成的引物进行菌落PCR。将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，所得到的结果在图1和图2中示出。如图1所示，在使用本发明载体的情况下，确认了在32个克隆中，32个克隆(阳性克隆获得效率100%)中存在目的插入片段。另一方面，如图2所示，在使用常规技术的 T-载体的情况下，确认了在32个克隆中，沈个克隆(阳性克隆获得效率81%)中存在目的插入片段。因此，证实了本发明载体的阳性克隆获得效率非常高。(2) Ikbp PCR片段的阳性克隆获得效率的讨论合成分别具有序列表的序列号10、11中记载的碱基序列的IK-F引物和IK-R引物。将大肠杆菌JM109基因组DNA作为模板，使用这些引物进行PCR。PCR的反应液组成和 PCR条件与上述(1)相同。对反应后的扩增片段进行琼脂糖凝胶回收。将含有50ng精制后的扩增片段、50ng的pUC19_bla Δ W290-TDNA和5 μ L的DNA Ligation kit ver. 1 (夕力，八4 t株式会社制)溶液I的10 μ L反应液在16°C下保持1
1小时。作为对照，除了使用PMD19-T载体代替pUC19-bla Aff290-T DNA之外，实施与上述一样的反应。反应结束后，使用该反应液来转化大肠杆菌。在将所得到的转化体播种到AIX 平板上后，在37°C下培养一夜。关于生长的白色克隆，使用由序列表的序列号8中记载的碱基序列形成的引物和由序列表的序列号9中记载的碱基序列形成的引物进行菌落PCR。结果，本发明载体的阳性克隆获得效率为100%，与此相对的是，在传统技术的T-载体的情况中，阳性克隆获得效率为90%。因此证实了，即使在插入片段为IlAp的情况下，本发明载体的阳性克隆获得效率也非常高。(3)2kbp PCR片段的阳性克隆获得效率的讨论合成分别具有序列表的序列号12、13中记载的碱基序列的I-F引物和I-R引物。将大肠杆菌JM109基因组DNA作为模板，使用这些引物进行PCR。PCR的反应液组成和 PCR条件与上述(1)相同。对反应后的扩增片段进行琼脂糖凝胶回收。将含有200ng精制后的扩增片段、50ng的pUC19_bla Δ W290-TDNA和5 μ L的DNA Ligation kit ver. 1 (夕力，八4 t株式会社制)溶液I的10 μ L反应液在16°C下保持1 小时。作为对照，除了使用PMD19-T载体代替pUC19-bla Aff290-T DNA之外，实施与上述一样的反应。反应结束后，使用该反应液转化大肠杆菌。在将所得到的转化体播种到AIX 平板上后，在37°C下培养一夜。关于生长的白色克隆，使用由序列表的序列号8中记载的碱基序列形成的引物和由序列号9中记载的碱基序列形成的引物进行菌落PCR。结果在图3 和图4中示出。如图3所示，在使用本发明载体的情况下，确认了在15个克隆中，13个克隆(阳性克隆获得效率87%)中存在目的插入片段。另一方面，如图4所示，在使用常规技术的 T-载体的情况下，确认了在15个克隆中，10个克隆(阳性克隆获得效率67%)中存在目的插入片段。因此证实了，即使在插入片段为21Λρ的情况下，本发明载体的阳性克隆获得效率仍然非常高。实施例3关于本发明载体和插入片段的关系进行讨论。在本实施例中，使用在上述实施例 2(1)以及实施例2 (3)中制备的500bp PCR扩增片段和21Λρ PCR扩增片段。制备6种10 μ L 的反应液，这些反应液分别含有相对于IOOng的500bp或21Λρ扩增片段为25ng、50ng或 IOOng的本发明载体、以及DNA Ligation kit ver. 1 ( ^ ^ 7 t株式会社制)溶液I， 将这些溶液在16°C下保持1小时。转化以及培养条件与实施例2(1)中相同。结果，在插入 500bp PCR片段的情况下，可以确认随着载体浓度的增大，获得的克隆数得到提高。另一方面，在插入21Λρ PCR片段的情况下，可以确认在载体量为50ng时，得到最多的克隆数。实施例4在亚硫酸氢盐处理过的DNA片段中，GC含量变为富含AT。在本实施例中，针对富含AT的扩增片段的克隆进行了讨论，所述富含AT的扩增片段是通过在实验胚胎学中广泛使用的亚硫酸氢盐PCR法得到的。合成由序列表的序列号14中记载的碱基序列形成的引物和由序列号15中记载的碱基序列形成的引物。将亚硫酸氢盐处理过的人基因组DNA作为模板，使用这些引物进行PCR。PCR在以下反应液组成中进行。即，100 μ L反应液中，含有2XTaq Hot Start Premix (夕力，广4才株式会社制)25 μ L、上述引物各20pmol、以及50ng模板DNA。另夕卜，PCR条件为将95°C 30秒、(95°C 30秒、53°C 30秒、72°C 30秒)作为1个循环，反应30个循环。反应后，通过除去琼脂糖凝胶来精制扩增片段。另外，该扩增片段为377bp，并且通过亚硫酸氢盐处理，GC含量从32%降低为四％。将含有IOOng精制后的扩增片段、50ng 的 pUC19-bla Δ W290-T DNA 禾口 5 μ L 的 DNALigation kit ver. 1 (夕力，八 4 才株式会社制)溶液I的10 μ L反应液在16°C下保持1小时。作为对照，除了使用PMD19-T载体代替 pUC19-bla AW290-T DNA之外，实施与上述一样的反应。反应结束后，使用该反应液转化大肠杆菌。在将所得到的转化体播种到AIX平板上后，在37°C下培养一夜。关于生长的白色克隆，使用由序列表的序列号8中记载的碱基序列形成的引物和由序列号9中记载的碱基序列形成的引物进行菌落PCR。结果，本发明载体的阳性克隆获得效率为87.5%，与此相对的是，在传统技术的T-载体中，阳性克隆获得效率为12. 5%至18. 75%。因此证实了，即使在富含AT的插入片段的情况下，本发明载体的阳性克隆获得效率也非常高。实施例5合成具有序列表的序列号16中记载的碱基序列的2k_Rl弓丨物。将大肠杆菌JM109 基因组DNA作为模板，将实施例2的业-F引物和上述业-Rl引物作为引物对进行PCR。PCR 的反应液组成和反应条件与实施例2中记载的条件相同。反应后，通过除去琼脂糖凝胶来精制扩增片段。该扩增片段为21Λρ。使用精制后的扩增片段和pUC19-blaAW290-T DNA, 在下表1中记载的反应液I的组成中，在16°C下进行1小时的连接反应。作为对照，除了使用pMD 19-T载体代替pUC19-blaAW290-T DNA之外，实施与上述一样的反应。表 权利要求
1.一种载体，其为由直链状双链DNA形成的克隆用载体，所述直链状双链DNA在两个 3'末端具有突出的1个脱氧胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶核苷残基，该载体的特征在于，其保持有对耐药性基因产物的部分序列进行编码的核酸，所述核酸为缺失了这样的核酸序列的活性丧失耐药性基因，该核酸序列对在所述耐药性基因产物的耐药性发挥中不可缺少的C末端部分的氨基酸或N末端部分的氨基酸进行编码，此外，所述核酸配置在所述双链DNA中任一者的末端，使得在将其中末端部分含有所述活性丧失耐药性基因中所缺失的核酸序列的插入DNA片段连接到载体时，构成了对没有缺失的耐药性基因产物进行编码的核酸。
2.权利要求1所述的载体，其中，所述活性丧失耐药性基因为缺失了这样的核酸序列的活性丧失耐药性基因，该核酸序列对耐药性基因产物的C末端部分的氨基酸进行编码。
3.权利要求2所述的载体，其中，所述活性丧失耐药性基因由对缺失了C末端氨基酸的 β-内酰胺酶的氨基酸序列进行编码的核酸序列形成。
4.权利要求3所述的载体，其中，所述活性丧失耐药性基因由对序列表的序列号17中记载的氨基酸序列进行编码的核酸序列形成。
5.权利要求1所述的载体，还包括第2耐药性基因，所述第2耐药性基因示出与前述耐药性基因不同的对药剂的耐药性。
6.权利要求1所述的载体，其由由序列表的序列号5中记载的核酸序列形成的DNA以及由序列表的序列号18中记载的核酸序列形成的DNA形成。
7.一种克隆DNA的方法，包括以下步骤(a) (d)(a)以DNA为模板，使用第一引物、与第一引物相对的第二引物、以及DNA聚合酶进行 PCR的步骤；(b)将通过步骤(a)得到的PCR产物与权利要求1 6中任一项所述的载体连接，得到环状DNA的步骤；(c)采用通过步骤(b)得到的环状DNA对宿主细胞进行转化的步骤；以及(d)利用没有缺失的耐药性基因产物对其示出耐药性的药剂进行药剂选择，由此选择具有环状DNA的转化体的步骤，其中所述环状DNA是通过将PCR产物沿期望方向插入载体而成的；其中，所述第一引物在3'末端侧具有与前述DNA互补的核酸序列，并且当权利要求 1 6中记载的载体中的活性丧失耐药性基因是缺失了对耐药性基因产物的C末端部分的氨基酸进行编码的核酸序列的基因时，所述第一引物在5'末端侧具有所缺失的核酸序列， 当权利要求1 6中记载的载体中的活性丧失耐药性基因是缺失了对耐药性基因产物的N 末端部分的氨基酸进行编码的核酸序列的基因时，所述第一引物在5'末端侧具有从所缺失的核酸序列的互补链序列脱除了 5'末端的脱氧胸腺嘧啶核苷后的核酸序列。
8.权利要求7所述的克隆方法，其中步骤(a)中的DNA聚合酶具有在反应产物的3' 末端以非模板依赖性的方式添加1个脱氧腺苷碱基的活性。
9.权利要求7所述的克隆方法，其中，在步骤(a)中还包括在反应产物的3'末端添加 1个脱氧腺苷碱基的步骤。
10.一种载体的制造方法，包括下列步骤通过限制性酶PmaCI切断具有序列表的序列号19中记载的核酸序列的环状双链DNA的步骤；以及通过具有末端脱氧核苷酸转移酶活性的酶，在切断后的双链DNA的两个3'末端添加突出的1个脱氧胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶核苷残基从而得到权利要求1中所述的载体的步骤。
11. 一种试剂盒，其为克隆用试剂盒，含有权利要求1 6中任意一项所述的载体以及 DNA连接酶。
全文摘要
本发明提供一种TA克隆用载体、使用该载体的克隆方法、该载体的制造方法以及含有该载体的试剂盒，所述TA克隆用载体在以简便的方式控制PCR扩增产物之类的DNA片段的插入方向的同时，可容易地选择仅插入有目的DNA片段的克隆。本发明提供一种载体，该载体在其末端配置有核酸序列缺失了的活性丧失耐药性基因，其中所述核酸序列对在耐药性基因产物的耐药性发挥中不可缺少的C末端部分的氨基酸或N末端部分的氨基酸进行编码；本发明还提供使用该载体的克隆方法、该载体的制造方法和含有该载体的试剂盒。
文档编号C12N15/64GK102382851SQ20111026453
公开日2012年3月21日 申请日期2011年9月1日 优先权日2010年9月3日
发明者棚濑智雄 申请人:宝生物工程株式会社