专利名称：琥珀酸高产菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于工业菌筛选及应用技术领域，具体涉及琥珀酸高产菌株的筛选及其应用，即利用基因工程方法，同时结合代谢工程改造和传统诱变技术获得高产菌株，并将筛选到的大肠杆菌用于琥珀酸的发酵生产。
背景技术：
琥珀酸又称丁二酸，广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品、塑料等行业， 也可以作为C4平台化合物，合成一些重要的化工产品如丁二醇、四氢呋喃、Y-丁内酯、 η-甲基吡咯烷酮(NMD)、2_吡咯烷酮等，还可用来合成可降解的生物聚合物，如聚丁烯琥珀酸(PBS)和聚酰胺(过程工程学报0007)4,840-846)。目前琥珀酸的市场需求量高达 2. 7 X107t/a (Appl Microbiol Biotechnol2007，76，727-740)。传统上，琥珀酸是使用化学法合成；但因为石油价格的持续上涨，微生物发酵法生产琥珀酸的研究越来越引起人们的兴趣。目前的生物法生产的琥珀酸成本在0.55-1. 1$/Kg，完全可以与化学路线竞争。因此很多大公司都积极投入研发力量，进行生物法琥珀酸的生产和应用开发，如日本的 Mitsubishi Chemical和荷兰的帝斯曼DSM等。在众多的琥珀酸生产菌中，目前研究最多的是ActincAacillus succinogenes， Mannheimia succiniciproducens, Anaerobiospirillum succiniciproducens 禾口大肠杆菌 (Appl Microbiol Biotechnol 2007，76，727-740)。大肠杆菌(Escherichia coli)是兼性厌氧菌，在厌氧条件下进行混合酸发酵，主要的发酵产物有乳酸、乙酸、乙醇、甲酸、琥珀酸等，但琥珀酸的产量很低，但是大肠杆菌由于遗传背景清楚，遗传操作工具丰富，很多研究组对其进行代谢工程改造用于生产琥珀酸。目前在工程菌上已开展了一些工作，包括通过降低乳酸脱氢酶活性来减少副产物乳酸的生成(JP11-206385A)，使用乙酰磷酸转移酶(pta)和乳酸脱氢酶(Idh)缺陷的大肠杆菌生产琥珀酸(W0 99/06532)。在大肠杆菌突变株AFPlll (ptsG，pflAB，IdhA)中过量表达外源丙酮酸羧化酶(Pyc)，在复合培养基中好氧厌氧两步法生产琥珀酸，产量达99. 2g/ L，生产速率为 1. 30g/L/h,副产物乙酸为 9. 7g/L，乙醇为 4. 7g/L。(Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (2002) 28, 325-332) 大肠杆菌突变株 SBS550MG(adhE， IdhA, iclR, ack-pta)和 SBS990MG (adhE，IdhA, ack-pta)过量表达外源丙酮酸羧化酶，在复合培养基中好氧生长的菌体离心重悬至OD值为10，琥珀酸对葡萄糖的摩尔得率分别达到1. 6和1. 5mol/mol,乙酸副产物分别为0. 13和0. 26mol/mol,甲酸副产物分别为0. 08和 0. 09mol/moL· SBS550MG过表达外源pyc，在LB培养基中补充葡萄糖，接种量OD值为17， 厌氧发酵约95小时，琥珀酸产量约为40g/L，甲酸副产物约2. 5g/L(CN1202930A)。大肠杆菌突变株KJ32(ldhA，ackA, adhE, focA, pflB, mgsA)经过代谢进化后基本培养基厌氧发酵 120 小时，琥珀酸产量 733mM，主要有乙酸副产物 250mM ；KJ73 (ldhA, ackA, adhE, focA, pflB, mgsA,poxB)经过代谢进化后基本培养基厌氧发酵96h，琥珀酸产量668mM，主要有乙酸副产物183mM(US20100184171)。因此，已有的工程菌都存在大量的副产物，副产物的存在，不仅降低了碳的有效转化效率，并且大幅增加分离提取工艺的复杂度、废水废液量，造成琥珀酸整体生产成本居高不下，妨碍生物法琥珀酸的工业化进程。因此，如何筛选出既能保持琥珀酸产量，又能有效减少副产物的发酵菌株就成为目前研究的热点。
发明内容
本发明的目的是提供琥珀酸高产菌株及其应用，即通过理性设计与非理性诱变相结合获得能够有效减少副产物的琥珀酸生产菌，并利用该菌株生产琥珀酸，以弥补现有技术的不足。本发明的方法首先通过基因敲除的手段获得adhE、ackA、pta、focA、pflB、iclR、 ldhA、p0XB、pepC功能缺失的产琥珀酸的大肠杆菌，然后再对基因敲除的大肠杆菌进行非理性诱变获得产琥珀酸量更高、副产物更少的菌株，并将筛选出的菌株用于发酵生产琥珀酸。本发明的一个方面是通过理性设计来构建一种生产琥珀酸的大肠杆菌，所述的大肠杆菌被修饰以去除或降低adhE、ackA、pta、focA、pflB、iclR、ldhA，poXB.pepc基因的活性。上述的大肠杆菌为SLEcS14大肠埃希氏菌菌株(Escherichia coli)，已于2011年 8月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，保藏号为CGMCC No. 5107本发明的另一方面是对去除或降低adhE、ackA、pta、foca、pfIB、iclR、ldhA，poXB、 pepc基因活性的产琥珀酸的大肠杆菌进行紫外诱变，再用以葡萄糖为唯一碳源的培养基筛选，获得能够在基本培养基上以葡萄糖为唯一碳源厌氧发酵高产琥珀酸的工程菌株。上述获得的工程菌株SLEcS15大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，已于2011年8 月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1 号院，其保藏编号为=CGMCC No. 5108。对SLEcS15再次诱变筛选获得了生长速度更快的工程菌株SLEcS16大肠埃希氏菌 (Escherichia coli)，其保藏编号为CGMCC No. 5109。本发明所构建筛选的菌株用于琥珀酸的生产。本发明的又一个目的是提供一种发酵方法，即通过厌氧发酵或两阶段发酵来提高琥珀酸的产量，减少副产物的量。本发明以产琥珀酸的大肠杆菌为出发菌株，通过理性设计敲除乳酸、甲酸、乙酸、 乙醇的产生途径、乙醛酸途径的阻遏调控基因，并敲除没有能量优势的大肠杆菌主要C4回补酶 P印等 9 个基因，包括有 adhE、ackA、pta、focA、pflB、iclR、ldhA、ροχΒ、ρ印c 基因，从而获得理论上以葡萄糖为唯一碳源，在基本培养基中厌氧发酵，只产生琥珀酸而没有其它副产物的工程菌。再通过非理性的紫外诱变和生长筛选相结合的代谢进化，获得产琥珀酸的SLECS16突变株。该突变株在以葡萄糖为碳源的全合成培养基中只有非常少量的乙酸和乳酸产生，没有乙醇和甲酸产生，琥珀酸比副产物为56 1。本发明利用理性设计与非理性进化相结合获得优良的产琥珀酸突变株，并且可用全合成培养基，几乎没有通常琥珀酸发酵中的其它杂酸产生，对于琥珀酸生产的下游的分离提取有显著帮助，可明显降低琥珀酸的生产成本。
图1 大肠杆菌产琥珀酸体系的设计和构建示意图，其中列出了 9个基因在代谢途径中所处的位置。
具体实施例方式本发明首先通过代谢途径分析，确定来敲除乳酸、甲酸、乙酸、乙醇代谢途径和乙醛酸途径的阻遏调控基因，并敲除没有能量优势的大肠杆菌主要C4回补酶pep等9个基因，包括adhE、ackA、pta、focA、pf IB、iclR、ldhA、poxB、pepc,从而获得理论上以葡萄糖为唯一碳源，在基本培养基上厌氧发酵时只产生琥珀酸，而没有其它副产物的工程菌。9个基因敲除的突变体构建是通过pDS132自杀质粒的无痕敲除系统 (Plasmid(2004)51,246-255)获得，通过特定引物扩增目标敲除基因的两个旁侧同源臂，通过Mel和^CbaI克隆至pDS132质粒，再发生两次同源重组以敲除目标基因。PDS132具有氯霉素抗性、sacB反向筛选标记用于筛选发生两次重组的转化菌株。通过基因组和代谢途径分析，理性敲除以上9个基因获得的突变菌株只能在丰富培养基中通过好养厌氧两阶段发酵产琥珀酸，但具有以葡萄糖为唯一碳源厌氧发酵产生琥珀酸的潜力，所以通过传统紫外诱变和在厌氧瓶中以葡萄糖为唯一碳源基本培养基筛选相结合的菌株进化模式，对敲除以上9个基因获得的突变菌株再次诱变筛选，从而获得能够在基本培养基上以葡萄糖为唯一碳源厌氧发酵高产琥珀酸的工程菌株。下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，但实例仅限于说明，并不限于此，其中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的 《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。实施例1 理性设计获得用于琥珀酸生产的工程菌株采用pDS132无痕敲除系统依次敲除大肠杆菌MG1655中的以下9个基因adhE、 ackA、pta、focA、pflB、iclR、ldhA、poxB、pepc。参照pDS132无痕敲除系统的文献进行操作，每个基因的敲除、筛选的方法和步骤都是一样的。具体操作如下对于adhE基因的敲除，首先分别用序列为SEQ ID NO=I的引物l(adhE_l)和序列为SEQ ID NO :2(adhE-2)的引物2 ；序列为SEQ ID NO :3的引物3 (adhE-3)与序列为SEQ ID NO 4的引物4(adhE-4)从大肠杆菌MG1655的基因组DNA中分别扩增两个约为11Λ的同源臂，然后通过引物1和引物4，以左右同源臂为模板，通过融合PCR融合获得约为21Λ的融合片段，将21Λ的融合片段通过McI和^CbaI位点克隆至PDS132质粒；将带有融合片段的pDS132质粒转化MG1655，再通过Cm抗性筛选在一个同源臂上发生同源交换的转化子， 转化子用引物1和4的PCR来验证时既有野生型条带又有突变体条带；然后将所得正确的转化子在不含Cm抗生素的LB培养基中过夜培养，利用sacB基因在10%蔗糖无NaCl的LB 平板上筛选突变体，最后在通过1和4引物验证为只有突变体条带的突变体，即得adhE基因敲除的菌株。对于iclR基因的敲除首先分别用序列为SEQ ID NO :5的引物iclR_l和序列为SEQ ID NO 6的引物iclR-2 ；序列为SEQ ID NO 7的引物iclR-3与序列为SEQ ID NO 8的引物iclR-4从大肠杆菌MG1655的基因组DNA中分别扩增左右同源臂，然后通过引物iclR-Ι和引物iclR-4，以左右同源臂为模板，通过融合PCR融合获得融合片段，将融合片段通过限制性内切酶McI和^CbaI位点克隆至pDS132质粒；将带有融合片段的PDS132质粒转化至已敲出了 adhE基因的MG1655菌株中，再通过Cm抗性筛选在一个同源臂上发生同源交换的转化子，转化子用引物iclR-Ι和引物iclR-4的PCR来验证时既有野生型条带又有突变体条带；然后将所得正确的转化子在不含Cm抗生素的LB培养基中过夜培养，利用sacB 基因在10%蔗糖无NaCl的LB平板上筛选突变体，最后在通过iclR_l和引物iclR_4验证为只有突变体条带的突变体，即得adhE+iclR基因敲除的菌株。对于ackA、pta、focA、pflB、ldhA、poxB和ρ印c基因，按照iclR基因的敲除方法依次敲除，其中由于ackA和pta，及focA和pflB是紧挨着的，所以是同时敲除的，所用到的引物列于表1中，其中标号1和2的引物用于扩增一侧的同源臂，标号3和4的用于扩增另一侧的同源臂。
权利要求
1.一种生产琥珀酸的大肠杆菌，所述的大肠杆菌被修饰以去除或降低adhE、ackA、 pta、focA、pflB、iclR、IdhA, poXB 和 ρ印c 基因的活性。
2.如权利要求1所述的大肠杆菌，其保藏编号为CGMCCNo. 5107。
3.—种生产琥珀酸的大肠杆菌，其特征在于所述的大肠杆菌是对权利要求1或2所述的大肠杆菌进行紫外诱变，再用以葡萄糖为唯一碳源的培养基进行筛选，从而获得的能够在基本培养基上以葡萄糖为唯一碳源、厌氧发酵生产琥珀酸的工程菌株。
4.如权利要求3所述的大肠杆菌，其保藏编号为CGMCCNo. 5108。
5.权利要求4所述的大肠杆菌进行紫外诱变获得的菌株，其保藏编号为CGMCC No.5109。
6.权利要求5所述的菌株用于生产琥珀酸。
7.如权利要求6所述的生产琥珀酸，其特征在于所述的生产琥珀酸是通过厌氧发酵实现。
8.如权利要求6所述的生产琥珀酸，其特征在于所述的琥珀酸的生产是通过好氧厌氧两阶段发酵来提高琥珀酸的产量。
全文摘要
本发明涉及一种琥珀酸高产菌株及其应用，所述的大肠杆菌被修饰以去除或降低adhE、ackA、pta、focA、pflB、iclR、ldhA，poxB和pepc基因的活性；再对基因敲除的菌株进行紫外诱变，用以葡萄糖为唯一碳源的培养基进行筛选，从而获得的能够在基本培养基上以葡萄糖为唯一碳源、厌氧发酵生产琥珀酸的工程菌株。本发明以产琥珀酸大肠杆菌为出发菌株，通过理性设计获得理论上以葡萄糖为唯一碳源，在基本培养基中厌氧发酵，只产生琥珀酸而没有其它副产物的工程菌。再通过非理性的紫外诱变和生长筛选相结合的代谢进化，获得产琥珀酸的突变株。本发明的菌株在琥珀酸发酵中基本没有其它杂酸产生，可明显降低琥珀酸的生产成本。
文档编号C12N15/01GK102286415SQ20111026435
公开日2011年12月21日 申请日期2011年9月7日 优先权日2011年9月7日
发明者刘娇, 孙村民, 孙际宾, 郑平 申请人:天津工业生物技术研究所