专利名称：苹果酸酶突变体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于代谢工程和酶的定向进化领域，具体涉及一种苹果酸酶突变体及其应用，即利用代谢工程改造的重组大肠杆菌定向进化苹果酸酶，并将获得的定向进化苹果酸酶用于提高大肠杆菌琥珀酸的产量。
背景技术：
苹果酸酶催化可逆反应丙酮酸+NADH+ CO2 ^苹果酸+NAD+，
苹果酸酶在中央代谢途径的三碳(O)和四碳(C4)化合物的相互转换过程中扮演着重要的角色，是固定(X)2的C4回补途径的重要一员。与其它二氧化碳固定C4回补途径相比，苹果酸酶催化的反应途径具有明显的能量经济性，对研究生命碳循环、发展碳负性工业过程有着重要的意义。微生物的固碳C4回补途径，主要包括由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(P印C)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PepCK)、丙酮酸羧化酶(Pyc)、和苹果酸酶(Mae)等催化的四条途径。 苹果酸酶Mae催化丙酮酸羧化固定(X)2实现C4回补，从磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)开始计算可以净产生一个ATP，最大限度的回收了能量供细胞使用，因此具有能量经济性。同时，该反应不与大肠杆菌中主要的糖运输途径PTS系统竞争PEP (其底物之一是丙酮酸)，因此该反应具有明显的代谢循环优势。而其它几个C4回补酶都有各自的不足磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化磷酸烯醇式丙酮酸和HCO3-反应生成草酰乙酸和磷酸，没有ATP的产生；磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶催化PEP羧化生成草酰乙酸并净产生一个ATP，但是，该反应依赖于高浓度的PEP，与主要葡萄糖转运系统PTS系统消耗PEP相矛盾；丙酮酸羧化酶催化丙酮酸羧化生成草酰乙酸，并消耗一个ATP，从PEP开始计算相当于没有净能量的产生，且该酶在大肠杆菌等一些微生物中不存在。因此，如何提高发酵菌中苹果酸酶Mae的含量或效率就成为研究的一个重要方面。例如，Stols L等利用pTRC99a质粒载体在一个大肠杆菌突变株中过表达MaeA，通过色谱柱纯化了该酶，并且分别在Mn2+和Mg2+存在下测定了其对丙酮酸和苹果酸的Km值， 发现Mn2+是更好的激活金属离子。ImM的Mn2+存在下，该酶对丙酮酸的Km值为16mM，而对苹果酸的Km值为0. ^mM(Stols and Donnelly 1997)。Jinxia Wang等也表达纯化了大肠杆菌的MaeA，在最适pH7. 2条件下测定了苹果酸和NAD+的Km值，分别为0. 42mM和0. 097mM, 并且发现高浓度的底物苹果酸和NAD+都对脱羧反应酶活具有抑制作用(Wang，Tan et al. 2007)。i^derico P. Bologna等研究大肠杆菌的MaeA时发现其催化脱羧反应的效率约是羧化反应的30倍，而且发现脱羧反应的最适pH为7. 5，而羧化反应的最适pH为7. 0，该酶对苹果酸和丙酮酸的Km值分别为0. 66mM和2. 59mM(Bologna，Andreo et al. 2007)。尽管酶的动力学研究表明在生理条件下苹果酸酶倾向催化苹果酸脱羧反应；但羧化反应的标准自由能变化为-2kCal/mol，所以热力学应该更有利于羧化反应的进行。已有研究表明在生物体内苹果酸酶可以催化丙酮酸羧化反应，参与C4回补途径。Stols等人报道在丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脱氢酶双突变的大肠杆菌NZmil菌株中过表达大肠杆菌NAD依赖的苹果酸酶，解决了原菌株在厌氧条件下丙酮酸过量积累造成的细胞毒性问题。 ^lle等人在丙酮酸羧化酶缺陷的酿酒酵母中过表达大肠杆菌NAD依赖的苹果酸酶，获得了更高ATP产量的葡萄糖厌氧发酵菌株，证实了苹果酸酶催化的逆反应替代丙酮酸羧化酶发挥C4回补功能和有助于ATP积累的优势(Zelle，Harrison et al. 2011)。现有的研究表明大肠杆菌NAD依赖的苹果酸酶可以发挥C4回补功能。因此，改造苹果酸酶的催化性能， 强化苹果酸酶的表达，将之应用于代谢工程改造微生物，可望构建出具有高效C4回补途径的工程菌株。发明目的本发明的目的在提供一种苹果酸酶突变体及其应用，即通过进化方法快速并高通量的定向进化苹果酸酶，增加进化机率并应用于琥珀酸等的生产。本发明的一个苹果酸酶突变体，其蛋白序列为SEQ ID NO :1，具体就是69位氨基酸密码子由原来的ACC变成了 AGC，氨基酸由Thr变成了 kr。本发明还包括编码序列为SEQ ID NO 1的苹果酸酶突变体的基因核苷酸，所述的基因序列的密码子为大肠杆菌的优势密码子。本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID NO 1的苹果酸酶突变体基因的质粒，例如 PSLS16。上述的基因，其序列为SEQ ID NO :2。本发明的另一个苹果酸酶突变体，其序列为SEQ ID NO :3，具体就是181位氨基酸密码子由GCC变成了 ACC，氨基酸由Ala变成Thr，其质粒命名为pSLS17。本发明还包括编码序列为SEQ ID NO :3的苹果酸酶突变体的基因编码核苷酸序列，所述的基因序列的密码子为大肠杆菌的优势密码子。本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID NO :3的苹果酸酶突变体基因的质粒，例如 PSLS17。上述的基因，其序列为SEQ ID NO :4。上述的质粒转入产琥珀酸的大肠杆菌中，用于提高琥珀酸的产量。本发明运用代谢进化与随机突变相结合的定向进化方法筛选出苹果酸酶突变体， 所筛选出的突变体能有效的提高大肠杆菌琥珀酸的产量，具有较好的经济应用前景。
图1大肠杆菌C4回补进化体系的构建图。图2本发明的苹果酸酶突变体质粒构建和筛选过程示意图。
具体实施例方式本发明实施例中涉及到的培养基配方如下LBi音养基(IL) :10g tryptone,5g yeast extract, 5g NaCl0NBS培养基配方如下
权利要求
1.一种苹果酸酶突变体，其蛋白序列为SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3。
2.一种核苷酸，其特征在于，该核苷酸用于编码权利要求1所述的苹果酸酶突变体。
3.一种用于表达权利要求1所述的苹果酸酶突变体的质粒，其特征在于该质粒携带有权利要求2所述的核苷酸。
4.如权利要求3所述的质粒，其特征在于该质粒所携带核苷酸的序列为SEQIDNO :2。
5.如权利要求3所述的质粒，其特征在于该质粒所携带核苷酸的序列为SEQIDNO :4。
6.一种提高菌株产琥珀酸量的方法，其特征在于是在产琥珀酸的菌株中表达权利要求 1所述的苹果酸酶突变体。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述的表达苹果酸酶突变体是将权利要求3 所述的质粒转入菌株中。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述的菌株其保藏编号为CGMCCN0.5108。
全文摘要
本发明涉及一种苹果酸酶突变体及其应用，即通过进化方法快速定向进化苹果酸酶，增加了进化机率并能够有效应用于琥珀酸等的生产。本发明筛选出的苹果酸酶突变体，其蛋白序列为SEQ ID NO1或SEQ ID NO3。所筛选出的酶突变体能有效的提高产琥珀酸的大肠杆菌中琥珀酸的产量，具有很好的经济应用前景。
文档编号C12R1/19GK102311943SQ20111026479
公开日2012年1月11日 申请日期2011年9月7日 优先权日2011年9月7日
发明者刘娇, 孙际宾, 郑平 申请人:天津工业生物技术研究所